ES2902701T3 - Métodos para la selección y/o procesamiento de partículas para lisis selectiva y/u optimizada de células - Google Patents

Abstract

Método para la selección o procesamiento de primeras partículas sensibles a la aplicación de un estímulo externo, que comprende el paso de producir, al aplicar el estímulo externo, la ruptura/lisis de al menos una primera partícula seleccionada, el método que comprende los pasos de: a) proporcionar un arreglo de electrodos (EL), cada electrodo que tiene dimensiones comparables o menores que aquellas de las primeras partículas (CÉLULA) y cada electrodo es un electrodo seleccionable; b) energizar selectivamente el arreglo de electrodos para aplicar a todos los electrodos un primer patrón de voltajes para generar un primer campo de fuerza (FMAN) que tiene primeros puntos de equilibrio estable (MPEQ) cada uno colocado en una primera posición, donde las primeras partículas se atraen hacia los primeros puntos de equilibrio estable y se ubican en la primera posición; c) aplicar a todos los electrodos (EL) del arreglo un segundo patrón de voltajes, diferente del primer patrón de voltajes, para generar un segundo campo de fuerza (FZAP) que tiene por lo menos un segundo punto de equilibrio estable (ZPEQ) colocado en una segunda posición en un espacio entre por lo menos dos electrodos (EL) adyacentes entre sí y a la por lo menos una primera partícula seleccionada que se va a lisar; donde la por lo menos una primera partícula seleccionada (CÉLULA) que se va a lisar se atrae al por lo menos un segundo punto de equilibrio estable (ZPEQ) y se desplaza a la segunda posición; y donde: i) el segundo campo de fuerza (FZAP) aplica, solo en la segunda posición en la que se genera al menos un segundo punto de equilibrio estable (ZPEQ), un estímulo para lisar la por lo menos una primera partícula (CÉLULA) seleccionada que se va a lisar y el segundo campo de fuerza (FZAP) que se diseña de modo que al menos una primera partícula que no se selecciona que se va a lisar permanezca en la primera posición; ii) el primer patrón de voltajes y el segundo patrón de voltajes se aplican en una secuencia de tiempo a los mismos electrodos (EL).

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para la selección y/o procesamiento de partículas para lisis selectiva y/u optimizada de células

La presente invención se refiere a métodos para la selección y/o el procesamiento de partículas, en particular partículas compuestas de células o que incluyen células y/o material celular, para la lisis selectiva y/u optimizada de células, y se aplica principalmente en la implementación de protocolos con resolución en una sola célula. El término "procesamiento" de células aquí y más adelante significa cualquier tipo de operación que se puede llevar a cabo en una sola partícula o célula, o en un grupo de las mismas.

Estado de la técnica

La patente PCT/WO 00/69565 a G. Medoro describe un aparato y un método para la manipulación e identificación/reconocimiento de partículas que hacen uso de jaulas cerradas con potencial dilectroforético y posibles sensores integrados. El método descrito enseña cómo controlar la posición de cada partícula independientemente de todas las demás en un espacio bidimensional. La fuerza utilizada para atrapar las partículas suspendidas en un medio fluido es dilectroforesis negativa. El control individual de las operaciones de manipulación se logra mediante la programación de elementos de memoria y circuitos asociados con cada elemento de un arreglo de electrodos y sensores integrados en el mismo sustrato. El dispositivo permite aislar las células, pero requiere que se muevan hacia una segunda microcámara, aislada fluidamente de la primera. Además, no se contempla ningún método para transformar las células.

La patente de los Estados Unidos 6.294.063 a Becker et al. describe un método y aparato para la manipulación de paquetes de material biológico sólido, líquido o gaseoso por medio de una distribución de fuerzas programables. La patente también menciona el uso de sensores. En este caso también el aislamiento de las células puede tener lugar sólo al mover las células físicamente a través de todo el dispositivo.

Una fuerza adicional para la manipulación de partículas es la fuerza de fricción viscosa generada por flujos electrohidrodinámicos (EHD), tal como flujos electrotérmicos (ETF) o electro-ósmosis de CA. En NG. Green, A. Ramos y H. Morgan, J. Phys. D: Appl. Phys. 33 (2000) el EHD se utilizan para desplazar partículas. Por ejemplo, PCT WO 2004/071668 A1 describe un aparato para concentrar partículas en electrodos, aprovechando los flujos electrodinámicos mencionados anteriormente.

La solicitud de patente internacional WO 2007/010367 A2, Medoro et al. , enumera algunos métodos para manipular partículas con arreglos de electrodos, y algunos métodos y aparatos para identificarlos.

En cambio, la solicitud de patente internacional WO 03/014739 A1 describe un método en el que las primeras entidades biológicas se pueden transformar al ponerse en contacto con segundas entidades biológicas (por ejemplo, liposomas que contienen ADN o microesferas), donde las primeras entidades biológicas se inmovilizan en una superficie definida por una matriz de primeros electrodos que se pueden activar y dirigir al menos en parte de forma selectiva, se colocan frente a al menos un segundo electrodo y se ponen en contacto con las segundas entidades biológicas desplazadas por medio de jaulas de dilectroforesis.

La solicitud de patente WO 2007/049103 A1 a nombre del mismo Solicitante se refiere a un método y aparato para la caracterización y/o recuento de partículas por medio de campos de fuerza variables en el tiempo no uniformes y sensores ópticos o impedenziométricos integrados. Los campos de fuerza pueden tener dilectroforesis positiva o negativa, electroforesis o movimientos electrohidrodinámicos, caracterizados por un conjunto de puntos de equilibrio estables para las partículas (sólidas, líquidas o gaseosas); el mismo método es adecuado para la manipulación de gotas (partículas líquidas) aprovechando efectos conocidos como electrohumectación en dieléctrico, con el objetivo de actuar sobre el control de la posición de cada partícula presente en la muestra, con el fin de desplazar estas partículas de manera determinista o estadística, para detectar su presencia con los sensores ópticos o impedenziométricos integrados, y/o para caracterizar su tipo, con el fin de contarlas o manipularlas de manera eficiente.

En la solicitud de patente internacional WO 2007/110739 A2 se describen métodos y aparatos para el procesamiento (por ejemplo, lavado, incubación, etc.) de partículas en las que las partículas suspendidas en un primer fluido se introducen en condiciones de flujo laminar en al menos una primera microcámara o primera región de la misma, en las que se introduce un segundo fluido en condiciones de flujo laminar en al menos una segunda región de la microcámara o de una segunda microcámara, de manera que no se mezcle con el primer fluido, y en el que al menos un campo de fuerza (F) que actúa sobre las partículas se activa en las microcámaras, para provocar un cambio de las partículas solas en una dirección predeterminada y transferir las mismas en suspensión en el segundo fluido; se utiliza preferentemente un aparato que incluye al menos tres microcámaras dispuestas en secuencia entre sí en una dirección y cada una conectada con la microcámara inmediatamente antes de la misma y después de la misma con dos orificios desplazadas entre sí en una dirección perpendicular a la dirección de secuencia de las microcámaras.

Recientemente, en el artículo A single cell electroporation chip, Lab on a Chip, 2005, 5 (1), 38 - 43, Michelle Khine, Adrian Lau, Cristian Ionescu-Zanetti, Jeonggi Seo y Luke P. Lee , se ha descrito cómo incrementar la permeabilidad de las membranas celulares mediante electroporación realizada en células individuales; de esta manera, se pueden introducir en la célula sustancias polares que de otro modo no podrían permear la membrana plasmática (tal como tintes, medicamentos, ADN, proteínas, péptidos y aminoácidos).

El artículo Flow-through micro-electroporation chip for high efficiency single-cell genetic manipulation, Sensors and Actuators A: Physical. Volumen 104, Número 3, 15 de mayo de 2003, Páginas 205-212, Yong Huang, Boris Rubinsky describe en particular la manipulación genética de células individuales, que es de gran interés en campos tal como biología y biotecnologías, obtenidas mediante un chip de electroporación que hace uso de canales de microfluidos para manipular células individuales con precisión; como se sabe, la electroporación es una técnica que utiliza campos eléctricos intensos para inducir reordenamientos estructurales en la membrana celular; los poros se forman así a través de la membrana cuando el potencial transmembrana excede el voltaje de perforación dieléctrica de la membrana (0,2-1,5V) permitiendo que sustancias externas penetren la membrana y alcancen el citoplasma que contiene.

La electroporación de células individuales es una técnica interesante también porque permite el estudio de las variaciones que se producen en una célula de población celular por célula, y también el estudio de la química intracelular, por ejemplo, el suministro de fenotipos específicos a células individuales al activar o bloquear la expresión de proteínas específicas e individuales. Utilizando tecnología basada en el uso de matrices implementadas en chips, es posible producir aparatos para pruebas de HTS (cribado de alto rendimiento), vinculados tanto a la expresión de ADN y proteínas como a compuestos químicos (por ejemplo, medicamentos) que se dirigen a dianas celulares específicas (por ejemplo, receptores).

La electroporación de células individuales también es una técnica ventajosa en comparación con los protocolos de electroporación a granel que se utilizan normalmente, que requieren voltajes muy altos (>103 V) y no permiten un control eficaz de la permeabilidad de las células individuales, de modo que, por ejemplo, es difícil volver a cerrar los poros abiertos previamente.

Los intentos realizados hasta ahora para lograr la electroporación de células individuales varían desde el uso de microelectrodos de fibra de carbono (Lundqvist et al., 1998) hasta otras técnicas tal como capilares rellenos de electrolitos, micropipetas y chips micromanufacturados.

Los dispositivos micromanufacturados son ideales tanto para aislar células individuales como para enfocar el campo eléctrico.

Por último, el artículo " Controlling cell destruction using dielectrophoretic forces", A. Menachery y R. Pethig, IEE Proc.-Nanobiotechnol. 152, No. 4, agosto de 2005 , informa sobre un estudio de la lisis de células para diferentes tipos de células en electrodos almenados o polinomiales, y propone la lisis diferencial de células de diferentes tipos presentes en una mezcla (eligiendo frecuencias y amplitudes tal como para lisar un tipo, pero salvar otro).

Sin embargo, como los electrodos son mucho más grandes que las células, no se propone usar este enfoque, y probablemente no es posible usarlo, para destruir células individuales selectivamente, independientemente de su tipo. De hecho, dado que la posición con respecto a electrodos relativamente grandes (y, en consecuencia, la intensidad del campo al que se someten) varía considerablemente, este método no puede funcionar de manera homogénea en las diversas células.

El documento US 2003/146100 A1 divulga un método para aislar e inmovilizar al menos un constituyente subcelular de una biopartícula celular de interés en un sistema que comprende electrodos individualmente direccionables en un sustrato, el método que comprende, entre otros, los pasos:

a) introducir en el sistema una solución de muestra que contiene la biopartícula celular de interés, donde la solución de muestra es de una conductividad adecuada para el aislamiento dilectroforético de la biopartícula celular de interés; b) hacer pasar una corriente alterna a través de electrodos seleccionados, donde los electrodos se seleccionan para producir áreas de alta intensidad de campo de corriente alterna y baja intensidad de campo de corriente alterna en posiciones predeterminadas, donde la corriente alterna se suministra a un voltaje y frecuencia adecuados para el aislamiento dielectroforético de la biopartícula celular de interés;

c) mantener la corriente alterna en (b) durante un período de tiempo suficiente para permitir que la biopartícula celular de interés se agregue en las posiciones predeterminadas;

d) lisar electrónicamente la biopartícula celular agregada de interés para liberar uno o más constituyentes subcelulares de interés de la biopartícula celular.

La lisis se induce preferentemente usando campos en un intervalo de frecuencias entre la frecuencia de cruce (más allá de la cual las células pasan de dilectroforesis negativa (nDEP) a positiva (pDEP)), e inferior a la frecuencia más allá de la cual el potencial de la membrana se atenúa debido a la superación de la constante de relajación de membrana.

Breve descripción de la invención

El objetivo de la presente invención es suministrar métodos para operar en muestras de fluido que contienen partículas, típicamente células, para llevar a cabo la purificación y/o aislamiento de células individuales y/o la transformación de una o más células, lo cual es sin las limitaciones y/o los inconvenientes descritos para la técnica anterior.

En particular, un objetivo de la presente invención es actuar sobre el control de la posición de cada partícula presente en la muestra, con el fin de desplazar dichas partículas de una manera determinista, para operar selectivamente en cada célula y/o realizar de una manera más eficaz operaciones tal como lisis, etc.

Aquí y más adelante, los términos "partículas" o "partícula" se utilizan para indicar entidades micrométricas o nanométricas, naturales o artificiales, tal como células, componentes subcelulares, virus, liposomas, niosomas. A veces se utilizará el término célula, pero donde no se especifique lo contrario, se debe entender como un ejemplo no limitante del uso de partículas en el sentido descrito más completamente anteriormente.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a los métodos como se especifica en las reivindicaciones 1 y 11. Las realizaciones preferidas se definen por las reivindicaciones dependientes.

En particular, se utilizan campos de fuerza variables en el tiempo no uniformes. Los campos de fuerza pueden tener dilectroforesis positiva o negativa, electroforesis o movimientos electrohidrodinámicos, caracterizados por un conjunto de puntos estables de equilibrio para las partículas.

De esta manera, la presente invención supera las limitaciones de la técnica anterior.

La implementación de los métodos de acuerdo con la invención permite la purificación precisa de una muestra de células incluso a partir de agentes contaminantes presentes en un porcentaje bajo. También permite que las células se transformen de manera eficaz y selectiva con la introducción de material genético. Por último, permite que unas pocas células interesantes se aíslen rápidamente de una muestra heterogénea.

Otras características y ventajas de la invención quedarán claras a partir de la siguiente descripción de algunas de sus realizaciones no limitantes, con referencia a las figuras en las figuras anexas.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 ilustra esquemáticamente los pasos de un primer método de acuerdo con la invención llevado a cabo en un aparato de manipulación ilustrado en la sección en elevación;

La figura 2 ilustra los pasos del método en la figura 1 llevados a cabo con el mismo aparato que en la figura 1, pero ilustrado en el diseño visto desde arriba;

La figura 3 ilustra en la misma vista que la figura 2 una posible variación del método en las figuras 1 y 2;

La figura 4 ilustra el accionamiento del método en la figura 1 con una secuencia fotográfica;

La figura 5 ilustra en la misma vista que la figura 2 una variación adicional del método en la figura 1;

La figura 6 ilustra en la misma vista que la figura 2 un método adicional de manipulación de partículas no cubiertas por la presente invención; y

Las figuras 7 a 9 ilustran diferentes realizaciones de un aparato no cubierto por la invención reivindicada para un accionamiento particularmente ventajoso de los métodos de la invención.

Descripción detallada

El objetivo de la presente invención es llevar a cabo métodos para la manipulación y/o separación y/o análisis de partículas.

Los métodos de la invención se basan (figura 1) en el uso de un campo de fuerza no uniforme (F) con el cual atraer partículas individuales o grupos de partículas (CÉLULA) hacia posiciones de equilibrio estable (JAULA). Este campo puede ser, por ejemplo, un campo de dilectroforesis (DEP), negativo (NDEP) o positivo (PDEDP), o un campo de movimientos electrohidrodinámicos (EHD).

El procesamiento realizado en las células se basa en la aplicación de campos eléctricos localizados capaces de provocar la ruptura permanente de la membrana celular.

El método también puede hacer uso de sensores integrados, preferentemente del tipo óptico y/o impedenziométrico, por ejemplo, en todos aquellos pasos en los que es necesario verificar el tipo de partículas cercanas a ciertos electrodos. Alternativamente, información similar puede estar disponible por medio de sensores ópticos no integrados, acoplados a un microscopio, que permite el examen del contenido de la microcámara en la que se llevan a cabo los métodos de la invención.

Generación de fuerzas

Existen varios métodos para generar fuerzas para desplazar partículas, de acuerdo con la técnica anterior, mediante arreglos de electrodos (EL), formados en un sustrato. Típicamente, de acuerdo con patentes anteriores del mismo solicitante (figura 1), se utiliza una cubierta (TAPA), que a su vez puede ser un electrodo, que delimita una microcámara, en la que se encuentran las partículas (CÉLULA), típicamente suspendidas en un fluido compuesto por un líquido. En el caso de dilectroforesis (DEP), los voltajes aplicados son voltajes periódicos en fase (Vphip) indicados con el signo más (+) y voltajes contrafase (Vphin) indicados con el signo menos (-). El término "voltajes contrafásicos" significa voltajes desplazados por 180°. El campo genera una fuerza que actúa en las partículas de una región del espacio (JAULA), atrayéndolas hacia un punto de equilibrio (PEQ). En el caso de DEP negativo (NDEP), es posible producir jaulas de fuerza cerradas, de acuerdo con la técnica anterior, si la cubierta (TAPA) es un electrodo conductor; en este caso, el punto de equilibrio (MPEQ) corresponde a cada electrodo conectado a Vphin (-) si los electrodos adyacentes se conectan a la fase opuesta Vphip (+) y si la cubierta (TAPA) se conecta a la fase Vphin (-). Este punto de equilibrio (MPEQ) está normalmente a una distancia en el líquido con respecto a los electrodos, por lo que las partículas (CÉLULA) están en levitación, en un estado estacionario.

En el caso de DEP positivo (PDEP), el punto de equilibrio (ZPEQ) se encuentra normalmente en la superficie en la que se realizan los electrodos, y las partículas (CÉLULA) están en contacto con él, en un estado estacionario. Para el PDEP no es necesario tener más electrodos en la cubierta, porque los puntos de equilibrio del PDEP corresponden a los máximos del campo eléctrico. Para los movimientos electro-hidrodinámicos (EHD), las configuraciones de electrodos generan flujos que empujan las partículas hacia los puntos mínimos del flujo.

Por simplicidad, a continuación se considera puramente como un ejemplo, y por lo tanto sin limitación para los fines de la presente invención, el uso de jaulas cerradas con dilectroforesis negativa como la fuerza de activación para los pasos de movimiento de partículas en la descripción de los métodos y aparatos (para los cuales es necesario usar una cubierta que actúa como un electrodo) de la invención. Para los expertos del sector con capacidades ordinarias es evidente que es posible generalizar los métodos y aparatos descritos más adelante para el uso de diferentes fuerzas de activación, y diferentes tipos de partículas.

Método para la lisis selectiva de partículas

Las partículas que se van a lisar se colocan cerca del espacio entre dos electrodos mediante una de las fuerzas de accionamiento mencionadas anteriormente, energizando los electrodos con voltajes sinusoidales de una primera amplitud (MA) y frecuencia (MF). El espacio es preferentemente menor que 10 |jm, y típicamente alrededor de 1-3 |jm, de modo que un estímulo de bajo voltaje, compatible con el voltaje de suministro de un circuito integrado (por ejemplo, 2,5, 3,3 o 5 V), es suficiente para determinar un potencial transmembrana suficiente para causar la ruptura irreversible de la partícula.

Este estímulo se compone preferentemente de un tren de impulsos sinusoidales de una segunda amplitud (ZA) y una segunda frecuencia (ZF) .

Se aplican impulsos eléctricos entre los dos electrodos seleccionados para provocar la lisis de la célula.

La figura 1 muestra en sección la evolución a lo largo del tiempo de los campos de fuerza y de los "patrones" (es decir, el complejo de configuraciones de estado (+) o (-) de los electrodos) de los voltajes aplicados a los electrodos, de acuerdo con una realización preferencial de la invención. En la figura 1(a), las células (CÉLULA) están en nDEP, suspendidas en el líquido en un primer punto de equilibrio (MPEQ). En la figura 1 (b) cambia el patrón de voltajes aplicados a los electrodos (EL), por lo que la frecuencia y opcionalmente la amplitud de los voltajes aplicados, así como la fuerza a la que se someten las células, cambian a pDEP (FZAP). Sin embargo, gracias al cambio del patrón de voltajes, solo la célula que se va a lisar (CELLZ) se somete a una fuerza significativa, por lo que se atrae hacia un nuevo punto de equilibrio estable (ZPEQ). Cerca de ese punto, el campo eléctrico es máximo y la frecuencia es tal que se provoca un potencial transmembrana suficiente para lisar la célula.

La figura 2 muestra en diseño las configuraciones de electrodos para los mismos pasos (a)-(d) que la figura 1, donde el patrón de electrodos en fase y contrafase con el voltaje aplicado a la tapa se indica por el color (en fase gris, en contrafase blanco).

Esta secuencia de patrones es particularmente favorable ya que, durante la lisis, las otras células en áreas vecinas se someten a un campo eléctrico casi nulo, ya que tanto la cubierta como los electrodos están en fase. Si la amplitud del voltaje aplicado a la cubierta es igual a la amplitud del voltaje aplicado a los electrodos, el campo en esas células es nulo.

Alternativamente, se pueden adoptar las series de patrones que se muestran en las figuras 3(a)-3(d). En este caso, como se muestra por el número de electrodos en fase y contrafase representados por los colores blanco y gris, la ventaja radica en la necesidad de reprogramar un número menor de electrodos cada vez, que puede ser ventajoso si es lento el proceso de escritura de las células de memoria para el patrón de electrodos que se van a accionar. De lo contrario, generalmente es preferible adoptar la solución anterior en la figura 2.

Con sensores integrados en el arreglo de electrodos que delimitan la superficie inferior de la microcámara, por ejemplo, de tipo óptico, es fácil verificar cuándo se ha producido la lisis, utilizando los métodos descritos en la solicitud de patente internacional núm. WO 2007/049103 A1 del mismo Solicitante, para ver si la jaula correspondiente a la célula lisada todavía está llena o vacía, o mejor para verificar la presencia de residuos resultantes de la lisis.

Sustancialmente, con los métodos descritos es posible seleccionar o procesar partículas sensibles a la aplicación de un estímulo externo usando un método que comprende en general el paso de producir, al aplicar el estímulo externo, la ruptura o lisis de al menos una partícula seleccionada; y donde también se contemplan los pasos de:

a) acercar las partículas (CÉLULA) a los electrodos (EL) de un arreglo de electrodos seleccionables que tienen dimensiones comparables o menores que aquellas de las partículas, a las cuales se puede aplicar un primer patrón (PMAN) de tensiones para organizar opcionalmente, si es necesario, las partículas (CÉLULA) por medio de un primer campo de fuerza (FMAN), al activar selectivamente los electrodos (EL);

b) aplicar a los electrodos un segundo patrón (PZAP) de voltajes, con el fin de crear un segundo campo de fuerza (FZAP), ubicado sustancialmente cerca de al menos una partícula seleccionada que se va a lisar (CÉLULA) y tal como para producir la aplicación a la por lo menos una partícula seleccionada de un estímulo adecuado para producir su ruptura o lisis.

Las partículas se suspenden en un fluido elegido, en caso de que se desee utilizar el paso de nDEP a pDEP como se describió anteriormente para obtener lisis, para presentar una conductividad eléctrica relativamente baja.

El primer patrón (PMAN) de voltajes para generar el primer campo de fuerza (FMAN) presenta una primera amplitud (MA) y una primera frecuencia (MF); y el segundo patrón (PZAP) de voltajes para generar el segundo campo de fuerza (FZAP) presenta una segunda amplitud (ZA) y una segunda frecuencia (ZF), al menos una de las cuales es diferente de la primera amplitud (MA) y primera frecuencia (MF). En este caso, el estímulo aplicado para obtener la lisis consiste en una fuerza que se puede aplicar a la por lo menos una partícula seleccionada por el segundo campo de fuerza (FZAP) y tanto el primer como el segundo patrón de voltajes se generan en CA (corriente alterna). En particular, la por lo menos una partícula seleccionada es una entidad biológica con una membrana lisable, en los ejemplos descritos una célula, y el estímulo aplicado consiste en llevar el potencial transmembrana de la por lo menos una partícula seleccionada a un valor tal como para producir la ruptura de la membrana.

De acuerdo con una posible variación del método de la invención, que se puede considerar ilustrada en la figura 2(b), el estímulo aplicado a la partícula seleccionada para lisarla consiste en viceversa de calentamiento ubicado en el fluido en el que se suspende la partícula seleccionada que se va a lisar.

De acuerdo con esta posible variación, particularmente ventajosa si las partículas se suspenden en un fluido (líquido) que presenta una alta conductividad eléctrica (por ejemplo, solución fisiológica), el segundo patrón (PZAP) de voltajes es tal que produce el calentamiento selectivo por efecto Joule de los electrodos seleccionados en el arreglo de electrodos con los que se genera el segundo campo de fuerza (FZAP), en la figura 2(b) el electrodo mostrado en blanco, en el que se concentra prácticamente toda la corriente suministrada al dispositivo ilustrado.

En este caso es evidente que al menos el segundo patrón de voltajes se puede generar en CA o CC (corriente continua).

De todos modos, los métodos descritos de acuerdo con la invención pueden incluir un paso de verificación de la lisis de la por lo menos una partícula seleccionada, preferentemente llevada a cabo por medio de los sensores ya mencionados integrados con el arreglo de electrodos, en un solo chip.

Por último, de acuerdo con una posible variación adicional de los métodos descritos, si uno está interesado en recuperar selectivamente los desechos producidos por la lisis, después del paso b) descrito anteriormente, se pueden llevar a cabo los siguientes pasos:

c) aplicar nuevamente el primer patrón (PMAN) de voltajes a los electrodos; y

d) en tanto que el paso c) se encuentra en progreso, producir un desplazamiento lento y controlado del fluido para recuperar un producto seleccionado de lisis de la por lo menos una partícula seleccionada.

De hecho, como se conoce bien por los expertos en el campo, en el caso de accionar el movimiento de las partículas por dilectroforesis, las fuerzas que actúan sobre las partículas debido al campo aplicado son en proporción al cubo del radio de las partículas, en tanto que las fuerzas de fricción viscosa hidrodinámica son proporcionales solo al radio de las partículas; por lo tanto, las partículas más pequeñas (los desechos de lisis en este caso específico) se pueden llevar a lo largo de un lavado moderado del fluido en el que se suspenden las partículas, en tanto que las partículas más grandes (las células no lisadas) se mantienen en una posición estacionaria (contra la acción de lavado viscosa) por las jaulas nDEP colocadas en modo estacionario y en las que las células se atrapan.

La eficacia de los métodos descritos, en particular del método de acuerdo con las figuras 1 y 2 , se muestra en la figura 4 . Dos células Raji suspendidas en una solución acuosa con manitol 280 mM (milimolar) y KCl 6,25 mM se organizan, ver figura 4(a) , por el campo eléctrico (MF) aplicado (MA) en el que los electrodos en el arreglo tienen sinusoides con una amplitud pico-pico de 3,3 V, la cubierta conductora (TAPA) una amplitud de 6,6V, todos con frecuencia de 50 kHz. Las células se llevan a los electrodos en fase con la tapa rodeada por electrodos de la fase opuesta (desplazamiento de 180°).

Después de eso, el patrón de los voltajes aplicados a los electrodos varía, poniendo en contrafase también el electrodo en la célula de abajo a la derecha, que se debe preservar. Aunque no hay jaula, la célula permanece en la misma posición, debido a la inercia. Al instante, el campo eléctrico aplicado cambia para producir dilectroforesis positiva (FZAP), llevando la frecuencia del campo eléctrico (ZF) a 400 kHz, y la partícula todavía presente en la jaula (CELLZ) entra en un nuevo punto de equilibrio estable debido a la fuerza de dilectroforesis positiva, ahora generada por el campo, que está en el espacio entre los electrodos, ver figura 4(b) . Esa región corresponde a los máximos del campo eléctrico, que a esa frecuencia son suficientes para provocar la lisis de la membrana, ver figura 4(c) .

Parece claro para los expertos en el sector con capacidades ordinarias que el campo eléctrico puede variar, de diferentes maneras, en particular también (o solo) en amplitud, o el patrón inicial de electrodos para manipulación y lisis se puede elegir de manera diferente, por ejemplo, como en la figura 5.

En este caso, se parte de un patrón nDEP, figura 5(a) , que posiciona las partículas en un punto de equilibrio (MPEQ) que se extiende verticalmente hasta el punto de equilibrio para el pDEP (ZPEQ), para el siguiente patrón de electrodos. De esta manera, la célula seleccionada no se mueve de su línea vertical, y el proceso de lisis se puede acelerar porque la célula tarda menos tiempo en alcanzar el área de máximo campo eléctrico en la que toma lugar la lisis.

Método para fusión de partículas asistida por manipulación dilectroforética

En este caso, que no está cubierto por la invención reivindicada, dos partículas se ponen en contacto en el mismo punto de equilibrio estable (MPEQ) por la fuerza (F) generada por los electrodos (EL). El estímulo que se aplica junto al par de células en contacto se elige con una amplitud y frecuencia tal como para provocar una fusión de las dos membranas celulares en una sola entidad (figura 6).

Con sensores integrados en el chip que sostiene el arreglo de electrodos, por ejemplo, de tipo óptico, entonces es posible verificar que la fusión ha tenido lugar sin la necesidad de un microscopio externo.

Las aplicaciones de fusión incluyen, por ejemplo, la generación de híbridos, de ambas células y bacterias eucariotas, o de plantas.

Por ejemplo, se podría considerar la posibilidad de usar un método similar para reprogramar células diferenciadas hacia células madre, por ejemplo, combinar una célula diferenciada con una célula madre enucleada.

Método de aislamiento de células por supervivencia

Una multiplicidad de células se enjuaga en suspensión en la microcámara con el arreglo de electrodos. Utilizando sensores integrados (por ejemplo, ópticos y/o impedenziométricos) y/o sensores externos (por ejemplo, un sensor óptico acoplado a un microscopio, con o sin fluorescencia), se identifica el tipo o célula que se encuentra en cada punto de equilibrio (PEQ). Los estímulos para la lisis entonces se aplican selectivamente a todas las células que no son de interés, preservando la vitalidad de las células vecinas de interés.

La muestra luego se enjuaga, recuperando las células vivas de interés y el lisado de células no de interés.

De acuerdo con la descripción, por lo tanto, se lleva a cabo un método para aislar partículas de interés de una población de partículas que incluye las partículas de interés, caracterizado porque comprende los siguientes pasos:

a) introducir la población de partículas, suspendidas en un fluido, en una microcámara, donde la microcámara se proporciona con un arreglo de electrodos seleccionables;

b) aplicar a la población de partículas el método de lisis selectiva descrito anteriormente para producir la lisis selectiva de todas las partículas de la población excepto las de interés;

c) recuperar las partículas de interés.

Paso b), particularmente en el caso donde la posición de las partículas de interés con respecto al arreglo de electrodos no se conoce a priori y las partículas de interés poseen características tal como ser sensibles solo a una intensidad determinada y/o tipo de estímulo (tampoco se conoce a priori), se aplica simultáneamente y/o repetidamente a todas las partículas de la población de partículas al aplicar a estos electrodos una pluralidad de patrones de voltaje adecuados para aplicar a las partículas estímulos de una intensidad y/o tipo tal como para producir, de esta manera, la lisis selectiva de todas las partículas en la población de partículas excepto las de interés.

El tipo diferente puede incluir, por ejemplo, la aplicación de voltajes CA con frecuencias determinadas, que se sabe que son ineficaces en la lisis de las partículas de interés, pero que son eficaces para la lisis de las partículas restantes. La intensidad diferente puede ser, por ejemplo, una intensidad creciente.

Con respecto al aislamiento basado en mover las células de interés a una segunda microcámara para su recuperación, el método descrito anteriormente presenta las siguientes ventajas:

1. Velocidad de ejecución

Las células se mueven lentamente bajo las fuerzas descritas (DEP, ETF, EHD) de accionamiento, y la clasificación basada en mover las células en una microcámara para recuperación es por lo tanto relativamente lenta. A la inversa, el tiempo para completar la operación de clasificación basada en la supervivencia requiere que solo una célula haya alcanzado el punto de equilibrio estable más cercano (PEQ), y el tiempo de lisis de la célula (aproximadamente un segundo), y no es necesario moverla a través de toda la microcámara de selección.

2. No es necesario un sistema de enfriamiento

Las células que se van a eliminar se pueden lisar en serie, trabajando por subregiones de la microcámara. De esta manera no es necesario tener sistemas de refrigeración, incluso para trabajar en chips muy grandes con soluciones amortiguadoras relativamente conductoras, porque la cantidad de calor desarrollado es proporcional a la zona energizada, que se puede hacer tan pequeña como se desee.

3. El chip puede tener dimensiones muy grandes

Ya que no es necesario energizar todo el chip al mismo tiempo, el problema de la caída resistiva en las pistas que portan los estímulos a los diversos electrodos se reduce en consecuencia. Sobre todo con soluciones amortiguadoras relativamente conductoras, y con un espaciamiento inferior entre electrodos, la caída resistiva en las pistas dentro del chip y/o la caída en la capa conductora de la tapa (cuando se utilizan jaulas NDEP para el accionamiento) no es insignificante si se energiza todo el arreglo de electrodos. Energizando solo una parte de la capa, se limita la carga resistiva que se va a gestionar y se disminuye la caída de voltaje en las pistas.

4. Operación también con células que no se pueden manipular con los campos de fuerza

Si la matriz de electrodos es suficientemente densa (con dimensiones comparables o más pequeñas que las células), para poder realizar lisis selectiva en células incluso sin haberlas seleccionado previamente, el método de la invención aún se puede completar, en particular si las células que se van a preservar, que presentan características diferentes de las células no interesantes, son sensibles a estímulos llevados a cabo a diferentes frecuencias de voltajes aplicados a los electrodos.

5. Encapsulado microfluídico simplificado

No es necesario tener una microcámara doble, sino un solo compartimento es suficiente, y la recuperación no necesita ser selectiva, por lo que la contaminación no está vinculada a la característica del flujo de recuperación.

Cualquier sensor integrado en el chip se usará para

1. determinar las partículas de interés.

2. Verificar la lisis de las células no deseadas.

Método de ultra-purificación de células

Con las técnicas de enriquecimiento a menudo es fácil eliminar las células presentes en proporciones mayores que las células de interés en varios grados de magnitud (por ejemplo, con centrifugaciones en gradientes de densidad o enriquecimiento con bolas magnéticas, etc.). Sin embargo, a veces es difícil eliminar las pocas células contaminantes que quedan (por ejemplo, presentes en una proporción de 0,1-10%) para obtener una muestra 100% pura. Esto es necesario, por ejemplo, si se quiere cultivar las células de interés, pero estas proliferan menos rápidamente que las no de interés, que, incluso si estuvieran presentes en un porcentaje bajo, prevalecerían corriente abajo de la proliferación. Como en el método de selección descrito anteriormente, las células se introducen en la microcámara, las células se alinean opcionalmente en puntos de equilibrio estable cerca de los electrodos (PEQ), y las células contaminantes se eliminan al lisarlas con los electrodos, evidentemente después de haberlas identificado con sensores integrados o externos adecuados, o con base en diferencias intrínsecas tal como la frecuencia del voltaje aplicado a los electrodos que producen lisis.

En este caso también, los sensores integrados, si existen, se pueden utilizar opcionalmente para

1. determinar las partículas de interés.

2. Verificar la lisis de las células no deseadas.

Luego se recuperan las células 100% puras, enjuagando la muestra.

Con base en este aspecto de la invención, por lo tanto, se acciona un método para la ultrapurificación de partículas de interés de partículas contaminantes, ambas contenidas en una población de partículas, caracterizado porque se aplica el método de aislamiento descrito anteriormente, donde el paso b) se aplica solo a las partículas contaminantes.

Método de análisis de células

El estudio a nivel biomolecular de ADN y/o de proteínas en células individuales es cada vez más de interés. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se propone un método para seleccionar y desplazar células seleccionadas posiblemente de una multiplicidad de células de una primera multiplicidad de puntos, y llevarlas a una segunda multiplicidad de puntos de análisis de dimensiones micrométricas, cada punto de análisis que comprende como máximo una sola célula. La célula se lisa y su contenido se analiza en el chip, por ejemplo de acuerdo con técnicas conocidas tal como PCR y/o electroforesis capilar en chip.

Con base en la invención, por lo tanto, se proporciona un método para el análisis de partículas, caracterizado porque comprende los pasos de:

a) introducir las partículas, suspendidas en un fluido, en una microcámara;

b) desplazar las partículas, de forma selectiva, cada una a un punto de análisis predeterminado separado de la microcámara, pero conectado hidráulicamente a esta;

c) aplicar a las partículas presentes en los puntos de análisis predeterminados un método de lisis selectiva como se describió anteriormente;

d) aplicar un protocolo de análisis definido en el sitio a los desechos respectivos de la lisis de las partículas;

donde el protocolo de análisis definido se elige del grupo que incluye: PCR, electroforesis capilar en chip; combinaciones de las anteriores.

Aparatos de análisis celular

Para llevar a cabo los métodos descritos, en particular el método de análisis anterior, se utiliza preferentemente un aparato como se ilustra en las figuras 7, 8 y 9. Los aparatos mostrados en las figuras 7, 8 y 9 no están cubiertos por la invención reivindicada.

El aparato (figura 7) contiene un arreglo de electrodos como en la técnica anterior, pero se caracteriza por una microcámara principal (CHM) y por una multiplicidad de microcámaras secundarias (CHJ). La microcámara principal se puede rellenar con una muestra que comprende al menos una célula a través de las respectivas entradas (IM1) y salidas (OM1). Cada microcámara secundaria (CHJ) es de mayores dimensiones, preferentemente sustancialmente comparable a las de una célula, como se muestra en la figura 7 . Preferentemente, cada microcámara secundaria se conecta a la microcámara principal a través de un canal (LCHG) con una configuración (longitud y/o forma) suficiente para evitar (evitar o al menos limitar) la dispersión de la muestra por difusión y contaminación hacia otras microcámaras, en el tiempo necesario para el análisis. De acuerdo con una posible variación (figura 8), hay una multiplicidad de microcámaras secundarias para lisis (CHLJ) conectadas a un canal para electroforesis capilar en chip, por ejemplo, con una unión cruzada (TJ). De manera alternativa, se puede producir una serie de canales para electroforesis capilar con una unión T doble, de acuerdo con la técnica anterior. Opcionalmente, al final del canal para electroforesis capilar se encuentra un sensor integrado (SENS_J), de tipo impedenziométrico y/u óptico, capaz de producir un electroferograma con base en el tiempo de migración de los compuestos analizados desde la unión (cruzada o doble T) al propio sensor. Una variación adicional se ilustra en la figura 9, donde cada microcámara de la multiplicidad se conecta a un capilar para electroforesis (CAPJ) a través de una salida de fluido (OJ) de cada microcámara secundaria.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Método para la selección o procesamiento de primeras partículas sensibles a la aplicación de un estímulo externo, que comprende el paso de producir, al aplicar el estímulo externo, la ruptura/lisis de al menos una primera partícula seleccionada, el método que comprende los pasos de:

a) proporcionar un arreglo de electrodos (EL), cada electrodo que tiene dimensiones comparables o menores que aquellas de las primeras partículas (CÉLULA) y cada electrodo es un electrodo seleccionable;

b) energizar selectivamente el arreglo de electrodos para aplicar a todos los electrodos un primer patrón de voltajes para generar un primer campo de fuerza (FMAN) que tiene primeros puntos de equilibrio estable (MPEQ) cada uno colocado en una primera posición, donde las primeras partículas se atraen hacia los primeros puntos de equilibrio estable y se ubican en la primera posición;

c) aplicar a todos los electrodos (EL) del arreglo un segundo patrón de voltajes, diferente del primer patrón de voltajes, para generar un segundo campo de fuerza (FZAP) que tiene por lo menos un segundo punto de equilibrio estable (ZPEQ) colocado en una segunda posición en un espacio entre por lo menos dos electrodos (EL) adyacentes entre sí y a la por lo menos una primera partícula seleccionada que se va a lisar; donde la por lo menos una primera partícula seleccionada (CÉLULA) que se va a lisar se atrae al por lo menos un segundo punto de equilibrio estable (ZPEQ) y se desplaza a la segunda posición; y donde:

i) el segundo campo de fuerza (FZAP) aplica, solo en la segunda posición en la que se genera al menos un segundo punto de equilibrio estable (ZPEQ), un estímulo para lisar la por lo menos una primera partícula (CÉLULA) seleccionada que se va a lisar y el segundo campo de fuerza (FZAP) que se diseña de modo que al menos una primera partícula que no se selecciona que se va a lisar permanezca en la primera posición;

ii) el primer patrón de voltajes y el segundo patrón de voltajes se aplican en una secuencia de tiempo a los mismos electrodos (EL).

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el estímulo consiste en un calentamiento localizado de un fluido en el que se sumerge al menos una primera partícula seleccionada que se va a lisar.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque el segundo patrón de voltajes es tal que produce el calentamiento selectivo por efecto Joule de aquellos electrodos seleccionados en el arreglo de electrodos (EL) con los cuales se genera el segundo punto de equilibrio estable (ZPEQ).

4. Método de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, caracterizado porque el segundo patrón de voltajes se genera ya sea en CA o CC.

5. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer patrón de voltajes para generar el primer campo de fuerza (FMAN) presenta una primera amplitud y frecuencia; y porque el segundo patrón de voltajes para generar el segundo campo de fuerza (FZAP) presenta una segunda amplitud y frecuencia, al menos una de las cuales es diferente de la primera amplitud y frecuencia.

6. Método de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque el estímulo consiste en una fuerza aplicable a la por lo menos una primera partícula (CÉLULA) seleccionada por el segundo campo de fuerza (FZAP); el segundo patrón de voltajes se genera en Ca .

7. Método de acuerdo con la reivindicación 6, donde la por lo menos una primera partícula (CÉLULA) seleccionada es una entidad biológica con una membrana lisable, por ejemplo una célula, en la que el estímulo consiste en llevar el potencial transmembrana de la por lo menos una partícula seleccionada a un valor tal como para producir la ruptura de la membrana.

8. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende un paso de verificación de la lisis de la por lo menos una partícula seleccionada, preferentemente llevado a cabo por medio de sensores integrados con el arreglo de electrodos (EL), en un solo chip.

9. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las partículas se suspenden en un fluido, caracterizado porque también comprende, después del paso c), el paso de

d) aplicar de nuevo el primer patrón de voltajes a los electrodos (EL); y

e) en tanto que el paso d) se encuentra en progreso, producir un desplazamiento controlado del fluido para recuperar un producto seleccionado de lisis de la por lo menos una primera partícula seleccionada (CÉLULA).

10. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las primeras partículas (CÉLULA) se suspenden en un fluido, caracterizado porque el fluido se elige de tal manera que presenta una conductividad eléctrica menor que la de una solución fisiológica.

11. Método para aislar partículas de interés de una población de partículas que incluye las partículas de interés, el método que comprende los siguientes pasos:

a) introducir la población de partículas suspendidas en un fluido en una microcámara equipada con un arreglo de electrodos (EL), cada electrodo que tiene dimensiones idénticas o menores que aquellas de partículas de la población de partículas que incluyen las partículas interesantes y cada electrodo (EL) que es seleccionable;

b) energizar selectivamente los electrodos (EL) del arreglo de electrodos para aplicar a todos los electrodos un primer patrón de voltajes para generar un primer campo de fuerza (FMAN) que tiene primeros puntos de equilibrio estable (MPEQ) cada uno colocado una primera posición, donde las partículas de interés y no de interés de la población de partículas se atraen hacia los primeros puntos de equilibrio estable y se ubican en la primera posición;

c) aplicar a todos los electrodos del arreglo de electrodos un segundo patrón de voltajes, diferente del primer patrón de voltajes, para generar un segundo campo de fuerza (FZAP) que tiene segundos puntos de equilibrio estables (ZPEQ) cada uno colocado en una segunda posición dispuesta en un espacio entre los electrodos (EL) del arreglo de electrodos adyacentes entre sí y a las partículas no de interés, donde las partículas no de interés de la población de partículas se atraen hacia los segundos puntos de equilibrio estable y se desplazan a la segunda posición y las partículas de interés permanecen en la primera posición; donde

i) el segundo campo de fuerza (FZAP) aplica únicamente en los segundos puntos de equilibrio estable un estímulo adecuado para lisar selectivamente las partículas no de interés;

ii) el primer y segundo patrón de voltajes se aplican en una secuencia de tiempo a los mismos electrodos (EL) ; d) recuperar las partículas de interés.

12. Método de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque el paso c) se aplica simultáneamente y/o repetidamente a todas las partículas de la población de partículas al aplicar a los electrodos (EL) una pluralidad de patrones de voltaje adecuados para aplicar a las partículas estímulos de una intensidad y/o tipo tal como para producir la lisis selectiva de todas las partículas en la población de partículas excepto las partículas de interés.

13. Método para la ultra-purificación de partículas de interés de partículas contaminadas, ambas contenidas en una población de partículas, caracterizado porque se aplica el método de aislamiento de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, donde el paso c) se aplica solo a las partículas contaminantes.

14. Método para el análisis de partículas, caracterizado porque comprende los pasos de:

a) introducir las partículas, suspendidas en un fluido, en una microcámara;

b) desplazar las partículas, de forma selectiva, cada una a un punto de análisis predeterminado separado de la microcámara, pero conectado hidráulicamente a esta;

c) aplicar a las partículas presentes en los puntos de análisis predeterminados un método de acuerdo con una de las reivindicaciones de 1 a 8;

d) aplicar un protocolo de análisis definido en el sitio a los desechos respectivos de la lisis de las partículas.

15. Método de acuerdo con la reivindicación 14, donde el protocolo de análisis definido se elige del grupo que incluye: PCR, electroforesis capilar en chip; combinaciones de las anteriores.