JP4452520B2 - 分子内クエンチャー−フルオロフォア結合体によるアナライトの蛍光測定 - Google Patents

Description

本発明は、アナライトの蛍光測定を行うための方法および試薬キットに関する。

例えば診断用途におけるアナライトの測定には多くの方法がある。一つの手法は、酸化還元反応および酸化還元指示薬によってアナライトを測定するというものである。その場合、酸化系または還元系が酸化還元指示薬に直接またはメディエータを介して作用する。アナライトが存在すると、酸化還元指示薬の還元または酸化が生じて、それによって定性的もしくは定量的測定が可能となる。

酸化還元指示薬の種類に応じて、指示薬は比色、蛍光または電気化学的検出方法によって測定することができる。比色検出試薬の例には、ヘテロポリ酸類（特許文献１）、テトラゾリウム化合物（特許文献２）、ニトロソ芳香族化合物（特許文献３）、RIND化合物（特許文献４）、フェナジン類（特許文献５）およびインダントロン類（特許文献６）がある。電気化学的検出試薬の例には、ニトロソ芳香族化合物、フェナジン類、ヘキサシアノ鉄酸カリウムおよびベンゾキノン（例えば、特許文献７および特許文献８参照）がある。蛍光検出試薬の例には、レサズリン（特許文献９）、遷移金属錯体（非特許文献１; および非特許文献２）ならびにスコポレチン、エスクレチン、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、ジクロロフルオレセイン、Ｎ−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジンおよび専らＨ_２Ｏ_２の検出に用いられるMNBDHがある（非特許文献３も参照）。
欧州特許第0431456号明細書 欧州特許第0574769号明細書 欧州特許出願公開第0620283号明細書 欧州特許出願公開第0190740号明細書 国際公開第93/06487号パンフレット 欧州特許第0831327号明細書 欧州特許出願公開第0441222号明細書 欧州特許出願公開第0505494号明細書 米国特許第5,912,139号明細書 Ryabovら, JBIC 4, 1999年, p.175-182 Woltmanら, Anal. Chem., 1999年, 71, p.1504-1512 R. Haughland著, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 第6版, 1996年

しかしながら、先行技術から公知の蛍光検出試薬には、いくつか欠点がある。例えば、大部分の公知の蛍光指示薬では、グルコースオキシダーゼによって発生するＨ_２Ｏ_２を検出することでグルコースなどの代謝物を測定する必要がある。この反応は通常、酵素であるペルオキシダーゼによって触媒的に助ける必要があり、尿素やビリルビンなどの電子供与体による干渉を非常に受けやすい。その試薬はまた、長期間における安定性に欠ける。

対照的に、グルコースの酸素依存的検出を可能とする酸化還元指示薬、すなわち酸素ではなく酸化酵素から電子を直接受容する酸化還元指示薬が有利である。しかしながら、これに適した電子受容体として知られているのは、レサズリンならびにＯｓおよびＲｕ錯体のみである。しかしながらレサズリンの場合、酸化還元反応によって形成されるレゾルフィンの発光バンドが、未反応のレサズリンの吸収バンドと強く重なるため、アナライト測定の感度が大幅に低下する。遷移金属錯体は、酸化還元電位が高いため（例：Ｒｕ錯体）、アスコルビン酸などの化合物による強い干渉を示す。その錯体の蛍光効率は、サンプルの酸素含有量によっても変動する。

さらに公知の蛍光指示薬を用いると、使用される励起光源が主として光のUVおよび緑色領域に限定される。よって、例えば、特に強い青色および赤色のLEDを用いることができる化合物で知られているものは数が十分ではない。

従って本発明の課題は、少なくとも部分的に先行技術の欠点を解消することができる、アナライトの蛍光測定用の検出試薬としての新たな酸化還元−活性化合物を提供することである。

上記課題は、酸化還元反応によって蛍光を変えることができる酸化還元指示薬としてのフルオロフォアおよびクエンチャーの分子内結合体を提供することで、本発明によって達成された。特に、還元可能または酸化可能クエンチャーを含む結合体を用いることで、フルオロフォア基の選択に応じてあらゆる所望の励起光源を使用することが可能な汎用酸化還元指示薬を提供することができる。本発明のこの基本原理を、グルコース蛍光測定用の酸化還元指示薬としてキノン−フルオレセイン結合体を用いて例示した。その結合体のキノン基は、フルオロフォア基であるフルオレセインの蛍光を抑制するクエンチャー基である。キノンが酵素的に還元されてジヒドロキノンとなって、酸化還元反応の程度に応じて酸化還元指示薬の蛍光が増加すると、この消光効果はなくなる。状況に応じて、他のクエンチャー基およびフルオロフォア基を含む結合体を用いることが可能である。分子相互作用の結果、特定のフルオロフォア基の蛍光強度または蛍光寿命を部分的に低下させるかまたは完全に消すクエンチャー基としては、あらゆる分子が検討の対象となる。その分子相互作用の基礎となるプロセスの例には、動的消光、静的消光、錯体形成、電子移動、エネルギー移動、電荷移動、光子誘起電子移動（photon-induced electron transfer, PET）および光子誘起電荷移動（photon-induced charge transfer, PCT）がある。よって、クエンチャー基は、酸化または還元状態での吸収バンドがフルオロフォア（供与体）の発光バンドと重なり、双極子−双極子相互作用（いわゆる、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）によるフルオロフォア基（供与体）の蛍光強度または蛍光寿命を部分的もしくは完全に低下させる受容体基であることもできる（J.R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 1999も参照）。

従って本発明の第１の態様は、酸化還元反応および蛍光測定によってアナライトを検出する方法であって、前記アナライトを含むサンプルを、蛍光酸化還元指示薬として下記一般式（Ｉ）：
Ｑ−Ｆ （Ｉ）
［式中、Ｑはクエンチャー基であり、Ｆはフルオロフォア基である。］
で表される化合物を含む検出試薬と接触させることを特徴とする方法である。そのような化合物は基本的には、先行技術においてすでに報告されている（例えば、Zhangら, Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry 103 (1997), 63-67; Songら, Dyes and Pigments 42 (1999), 149-158参照）。

本発明の別の態様は、酸化還元反応および蛍光測定によってアナライトを検出するための試薬であって、蛍光酸化還元指示薬として前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を含む試薬である。

本発明は、酸化還元反応によって測定することができるアナライトを検出する上で好適である。その検出は、定性的、半定量的または定量的であることができる。本発明の１実施形態では、アナライトは還元可能または酸化可能な物質、例えば血液、血清、血漿、尿などの体液中に存在する代謝物であることができる。この場合、酸化還元指示薬に加えて、アナライトを還元または酸化するための１種以上の酵素ならびに適宜にニコチンヌクレオシド誘導体（例：NAD⁺、NADP⁺）またはフラビンヌクレオシド誘導体（例：FAD）などの補酵素も含む検出試薬を使用することが適切である。そのようなアナライトの好ましい例には、グルコース、ラクテート(lactate)、アルコール、ガラクトース、コレステロール、果糖、フェニルアラニン、アラニン、ロイシン、グリセリン、ピルベート(pyruvate)およびクレアチニンがある。例えばグルコースは、グルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼ／ジアフォラーゼを用いる公知の方法によって検出することができる。

さらにアナライトとしては酸化還元反応を触媒する酵素も可能であり、例えばグルコースオキシダーゼ（GOD）、グルコース色素オキシドレダクターゼ（Gluc-DOR）、デヒドロゲナーゼまたはグルタミン酸−オキサロ酢酸トランスフェラーゼ（GOT）のような反応をオキシドレダクターゼ反応と組み合わせることができる酵素などのオキシドレダクターゼがある。

酸化還元指示薬および必要に応じてアナライトの還元または酸化のための酵素以外に、検出試薬はさらに補酵素、補助物質、酵素カスケード、緩衝剤および場合によりメディエータなどの一般的な成分を含むことができる。酸化還元指示薬（Ｉ）による電子の受容または放出を助ける物質は、メディエータとして好適である。しかしながら、一般に、電子を直接受容または放出することができる酸化還元指示薬（Ｉ）が好ましい。

本発明による方法は、乾式または湿式試験などの従来の試験方式で行う。乾式試験では、例えばテストストリップ形態の吸収材を、検出試薬を乾燥形態で、例えば凍結乾燥物として付与することができる支持体として用いる。液体試験は、例えばキュベット、マイクロタイタープレートなどの好適な反応容器内で液相中で行い、その場合、検出試薬は反応容器自体に入れてもよく、または乾燥形態もしくは液体形態で別個の容器に入れて提供することができる。

蛍光測定の場合、サンプルに所定波長の励起光を照射し、異なる波長を有するサンプルが出す蛍光発光を公知の方法によって測定する。フルオロフォアを自由に選択することで、本発明によってアナライトの測定に至適な試験様式を提供することができる。

本発明による酸化還元指示薬（Ｉ）の蛍光活性は、その化合物が酸化状態で存在するか還元状態で存在するかに応じて異なる。クエンチャー基Ｑは好ましくは、酸化還元反応によって還元または酸化することができ、クエンチャー活性（すなわち隣接するフルオロフォア基の蛍光を少なくとも部分的に消光する能力）が酸化還元状態の関数として変化する基である。対照的に、フルオロフォア基Ｆは好ましくは、酸化還元反応によって還元や酸化することができない基である。

クエンチャー基は好ましくは、フルオロフォア基と共有結合により結合している。その結合は、直接であるかリンカーを介したものであることができる。好適なリンカーは、例えばＯ、ＮもしくはＳなどのヘテロ原子を有していても良いアルキレン基またはペプチドなどの公知の直鎖もしくは分岐のリンカー基である。リンカーの鎖長は、好ましくは１〜20原子である。

消光状態と非消光状態での酸化還元指示薬の蛍光強度における差は好ましくは、５%〜100％である。しかしながら、残留蛍光を較正に用いることができることから、蛍光を消光状態で完全に抑制する必要はない。

クエンチャー基Ｑは、還元可能基であることができ、その場合のクエンチャー活性は還元によって上昇しても低下してもよい。クエンチャー活性は好ましくは、還元によって低下する。還元可能クエンチャー基の好ましい例は、キノン類、ニトロソアニリン類などの芳香族ニトロソ化合物類ならびに他のニトロソベンゼン誘導体、Ｎ−オキサイド類、特にはＮ−オキサイド基の窒素原子が芳香環系の構成要素であるＮ−オキサイド類、ベンゾフラン類、ニトロソナフタルイミド類、いわゆるスピンラベル、テトラゾリウム化合物、フェナジン類、ピリジン類、アントラキノン類、キノキサリン類、ピリミドキノン類、フェニルヒドロキシルアミン類、インダントロン類、フェナントレンキノン類ならびに有機金属錯体がある。

別の形態として、クエンチャー基Ｑは酸化可能基であることができ、その場合クエンチャー活性は酸化によって上昇しても低下してもよい。クエンチャー活性は好ましくは、酸化によって上昇する。酸化可能クエンチャー基の例には、ヒドロキノン類、フェニレンジアミン類、ジヒドロフェナジン類、ジヒドロナフトキノン類、ジヒドロアントラキノン類および有機金属錯体がある。

前述のように、フルオロフォア基Ｆは好ましくは、酸化還元反応によって還元も酸化もされ得ない基である。それによりＦは、非常に広範囲の公知のフルオロフォア基から選択することができる。フルオロフォア基の好ましい例には、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体、ローダミン類、テトラメチルローダミン類、クマリン類、レゾルフィン類、ピレン類、アントラセン類、フェニレン類、フタロシアニン類、シアニン類、キサンテン類、アミドピリリウム色素、オキサジン類、カドラン（quadrain）色素、カルボピロニン類、NBD誘導体、BODIPY（商標名）フルオロフォア類（モレキュラー・プローブ社（Molecular ProbesInc.）から）、ALEXA（商標名）フルオロフォア類（モレキュラー・プローブ社から）、ランタニドキレート類、メタロポリフィリン類、NIRフルオロフォア類、ロードール（rhodol）色素、ナフタルイミド類およびポルフィリン類がある。青色光または赤色光によって励起することができるフルオロフォアが特に好ましい。

本発明の別の態様は、酸化還元反応および蛍光測定によってアナライトを検出するための試薬であって、酸化還元指示薬として下記一般式（Ｉ）：
Ｑ−Ｆ （Ｉ）
［式中、Ｑはクエンチャー基であり、Ｆはフルオロフォア基である］で表される化合物を含み；前記クエンチャー基Ｑおよび／または前記フルオロフォア基Ｆが還元または酸化され得るものであり；前記蛍光が前記還元または酸化に応じて変化し得る試薬である。

酸化還元指示薬以外に、本発明による前記試薬は酵素、補酵素、補助物質、緩衝剤およびメディエータから選択される他の成分を含むこともできる。

添付の図面および実施例によって、本発明についての理解を深めることができる。

キノン−フルオレセイン誘導体の合成（図１）
キノン誘導体である２−メチルキノン−３，３−ジメチルプロピオン酸を文献に従って合成する（Borchardtら, J. Amer. Chem. Soc. (1972) 94 (26), 9175-9182）。

その反応では、トリホスゲン（メルク（Merck）カタログ番号814283）93ｍｇをテトラヒドロフラン６ｍＬに溶かし、不活性条件下に氷冷しながらジメチルホルムアミド70μＬを加える。５−アミノフルオレセイン（フルカ（Fluka）カタログ番号07980）312ｍｇ、キノン誘導体200ｍｇおよびトリエチルアミン375μＬを加える。

適切な反応後、生成物混合物を氷水に投入し、酢酸エチルで数回抽出する。合わせたエステル相を水で抽出し、その後塩化カルシウムで脱水する。

それを分取HPLCによってさらに精製する。

収量70ｍｇ；質量スペクトラムは理論値に一致するものである。

酸化還元指示薬としてキノン−フルオレセイン誘導体を用いるグルコース測定
反応図式

３ｍＬ蛍光キュベットに下記の化合物を加えた（記載の濃度は、キュベット中での最終濃度を指す）。
グルコースデヒドロゲナーゼ（GlucDH）：1.3Ｕ／ｍＬ；
ジアフォラーゼ：1.3Ｕ／ｍＬ；
NAD⁺：36.9μｍｏｌ／Ｌ；
キノン−フルオレセイン（図１；実施例１から）：35.4μｍｏｌ／Ｌ。

グルコース水溶液（１％ＮａＣｌ含有0.1Ｍリン酸緩衝液、pH7.4）を加えることで、反応を開始する。反応の速度論を、励起波長470ｎｍおよび発光波長525ｎｍで各種グルコース濃度について記録した。実験結果を図２に示してある。番号１、２、３、４および５を付した曲線は、グルコース濃度０ｍｇ／ｄＬ、４ｍｇ／ｄＬ、６ｍｇ／ｄＬ、７ｍｇ／ｄＬおよび８ｍｇ／ｄＬに相当し、秒単位の時間に対して相対強度をプロットしている。

図２から、サンプル中に存在するグルコース濃度に比例した蛍光増加が認められることがわかる。

本発明による酸化還元指示薬の１例としてのキノン−フルオレセイン結合体を示す図である。 各種グルコース濃度でのグルコース検出系におけるキノン−フルオレセイン還元の速度論を示す図である。

Claims (7)

1. 酸化還元反応および蛍光測定によって、還元可能または酸化可能なアナライトを検出する方法であって、前記アナライトを含むサンプルを、前記アナライトを還元または酸化するための酵素と蛍光酸化還元指示薬として下記一般式（Ｉ）で表される化合物とを含む検出試薬に接触させることを特徴とする方法
   Ｑ−Ｆ （Ｉ）
   ［式中、
   Ｑは、還元状態または酸化状態での吸収バンドがＦの発光バンドと重なる受容体基であって、キノン類、芳香族ニトロソ化合物、ニトロソアニリン類、ニトロソベンゼン誘導体、Ｎ−オキサイド類、Ｎ−オキサイド基の窒素原子が芳香環系の構成要素であるＮ−オキサイド類、ベンゾフラン類、ニトロソナフタルイミド類、スピンラベル、テトラゾリウム化合物、フェナジン類、ピリジン類、アントラキノン類、キノキサリン類、ピリミドキノン類、フェニルヒドロキシルアミン類、インダントロン類、フェナントレンキノン類および有機金属錯体から選択される還元可能なクエンチャー基、またはヒドロキノン類、フェニレンジアミン類、ジヒドロフェナジン類、ジヒドロナフトキノン類、ジヒドロアントラキノン類および有機金属錯体から選択される酸化可能なクエンチャー基であり、
   Ｆはフルオレセイン、フルオレセイン誘導体、ローダミン類、テトラメチルローダミン類、クマリン類、レゾルフィン類、ピレン類、アントラセン類、フェニレン類、フタロシアニン類、シアニン類、キサンテン類、アミドピリリウム色素、オキサジン類、カドラン色素、カルボピロニン類、NBD誘導体、BODIPY(商標)フルオロフォア類、ALEXA(商標)フルオロフォア類、ランタニドキレート類、メタロポリフィリン類、NIRフルオロフォア類、ロードール色素、ナフタルイミド類およびポルフィリン類から選択されるフルオロフォア基である］。
2. Ｑがキノン類であり、Ｆがフルオレセイン誘導体である、請求項１に記載の方法。
3. 前記検出試薬が補酵素をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記酸化還元指示薬（Ｉ）において、ＱがリンカーによってＦに結合している請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 酸化還元反応および蛍光測定によって、還元可能または酸化可能なアナライトを検出するための試薬であって、前記アナライトを還元または酸化するための酵素と酸化還元指示薬として下記一般式（Ｉ）：
   Ｑ−Ｆ （Ｉ）
   ［式中、
   Ｑは、還元状態または酸化状態での吸収バンドがＦの発光バンドと重なる受容体基であって、キノン類、芳香族ニトロソ化合物、ニトロソアニリン類、ニトロソベンゼン誘導体、Ｎ−オキサイド類、Ｎ−オキサイド基の窒素原子が芳香環系の構成要素であるＮ−オキサイド類、ベンゾフラン類、ニトロソナフタルイミド類、スピンラベル、テトラゾリウム化合物、フェナジン類、ピリジン類、アントラキノン類、キノキサリン類、ピリミドキノン類、フェニルヒドロキシルアミン類、インダントロン類、フェナントレンキノン類および有機金属錯体から選択される還元可能なクエンチャー基、またはヒドロキノン類、フェニレンジアミン類、ジヒドロフェナジン類、ジヒドロナフトキノン類、ジヒドロアントラキノン類および有機金属錯体から選択される酸化可能なクエンチャー基であり、
   Ｆはフルオレセイン、フルオレセイン誘導体、ローダミン類、テトラメチルローダミン類、クマリン類、レゾルフィン類、ピレン類、アントラセン類、フェニレン類、フタロシアニン類、シアニン類、キサンテン類、アミドピリリウム色素、オキサジン類、カドラン色素、カルボピロニン類、NBD誘導体、BODIPY(商標)フルオロフォア類、ALEXA(商標)フルオロフォア類、ランタニドキレート類、メタロポリフィリン類、NIRフルオロフォア類、ロードール色素、ナフタルイミド類およびポルフィリン類から選択されるフルオロフォア基である］
   で表される化合物とを含む前記試薬。
6. Ｑがキノン類であり、Ｆがフルオレセイン誘導体である、請求項５に記載の試薬。
7. 補酵素をさらに含む、請求項５または６に記載の試薬。

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