JP4436134B2 - ドレクスレラノール誘導体、その製法及び使用 - Google Patents

ドレクスレラノール誘導体、その製法及び使用 Download PDF

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Description

本発明は、ドレクスレラノールと名付けられた新規な化合物に関するものである。ドレクスレラノールは、微生物ドレクスレラ アウストラリエンシス（Drechslera australiensis）、ＳＴ ００３３６０、ＤＳＭ １４０９３又は真菌ＳＴ ００４１１２、ＤＳＭ １４５２４の発酵により生成されるものであるが、この菌の分類学的詳細は未だ決定されていない。本発明は更にこれら化合物の製法について、及びそれらの医薬品の製造のための使用、殊に、変性神経障害、例えば、アルツハイマー病、或いはうつ病、睡眠障害又は季節関連性情動障害等のような精神的障害に対する治療および／又は予防用医薬品の製造のための使用に関するものである。
アルツハイマー病は、主に初老の人達に起こる神経精神病的障害である。本病気は記憶障害、減少した知覚力、方向障害、言語障害、系統立った思考の障害等を含む症状の複合体として現れる。アルツハイマー患者では、特徴的な神経組織学的な変化、例えばアミロイド斑の沈着物、神経細胞中の神経細線維（神経細線維束）の変質等が脳中に見られる。これらの変化は明らかに特異的なものであるが、正常な老化過程において少ないながら起きているので非特異的である。
現在、原因治療はなく、対症療法のみが可能である。これまで、本病気の進行を遅らせるだけの薬剤はあるが、これらの薬剤は本病気を治癒するものではない。目下のところ、大脳アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、例えば商品名として、タクリン（Tacrin(R)）、ドネペジル（Donepezil(R)）、リバスチグミン（Rivastigmin(R)）、ガランタミン（Galantamin(R)）等から成る一群のグループが最も重要な治療法として供されているが、それはアルツハイマー病においてかなりの程度にまで障害を受けた記憶関連構造にとって、コリン作動性シグナル伝達が重要な役割を演じているからである。しかしながら、これらの薬剤は、本病気の緩和な中期の段階においてのみ使用することができるに過ぎないものである。これらの薬剤は、大脳の情報伝達シナップスにおけるアセチルコリン濃度を増大させる。もし、ニューロンが極めて大きく障害を受けている場合、即ち本病気の後期の段階においては、これらの薬剤はもはや効果を発揮することができない。使用が検討されている他の剤としては、エストロゲン、非ステロイド系鎮痛薬、抗酸化剤及び神経成長因子（ＮＧＦ）がある。
現在のところ、ドイツ連邦共和国において、アルツハイマー病に苦しんでいる人はお凡そ１００万人と推定されている。そしてドイツ人の寿命予測年数が増大することを考えれば、この数値は向こう数年の内には更に増大するものと思われる。それ故に、本病気の治療に用い得る薬剤が緊急に必要とされている。
ｃ−Ｊｕｎ−Ｎ末端キナーゼ（c-Jun N-terminal kinase、略称ＪＮＫｓ）から成る群は酸化的ストレスによって活性化される。これまでＪＮＫ−３（ＪＮＫ−１及びＪＮＫ−２とは対照的）のみがヒトの大脳のニューロンにおいて発現されていることが知られている。このようにＪＮＫｓは細胞死に影響することが指唆されている。この細胞死（即ちアポトーシス）がアルツハイマー病患者の大脳におけるニューロンの死の原因となる機構であると思われる（Kumagae等，Mol. Brain Res. (1999), 67(1), 10-7）。ｃ−Ｊｕｎ−Ｎ末端キナーゼの活性化がこの機構の一ステップである。この部位の阻害がアポローシスを阻止することとなり、その結果アルツハイマー病の障害に対し反作用として働き、そしてその進行を抑制するものと思われる。
本発明の他の側面としては、精神障害の治療及び／又は予防が挙げられる。日周期リズムは、種々の器官に存在する内在性時計機構によって生じるものである。日周期時計はこの生物リズムの維持にとって重要なものである。それは全くの暗黒の状態においても自己維持性をもちまた絶え間なく続いている不変のものである。しかしながら、例えば光や温度のような変化による外部のシグナルに同調することができる。この内在性時計は、日常の変動活動、摂食、睡眠／覚醒サイクルのような生理的変化、例えばホルモン分泌や体温の変化等の日常の変動を調節している（Keesler等、Neuroreport(2000)，11(5), 951-955）。
ペリオド（ＰＥＲ）は日周期時計の主要なタンパク質であり、その濃度及びリン酸化状態により、１日の変動に相応している。ヒトＰＥＲ１（ｈＰＥＲ１）の酵素ヒトカゼインキナーゼ１エプシロン（ｈＣＫ１ε）によるリン酸化は、ｈＰＥＲ１のタンパク質安定を減少させる原因となる。リン酸化されたｈＰＥＲ１は約１２時間の半減期を有するのに対し、リン酸化されていないｈＰＥＲ１は細胞中２４時間経過しても安定である。この主要タンパク質ｈＰＥＲ１に対する影響は、例えばうつ病のような内在性時計の障害に関連した病気（Souetre等、Annales medico-physiologiques, 1985, 143(9), 845-870）、睡眠障害又は季節関連性情動障害等にとっては特に臨床的に重要である。うつ病の治療には、これまで、ＭＡＯ阻害薬（モノアミンオキシダーゼ阻害薬）、軸索原形質へのノルアドレナリン及び／又はセロトニンの再取り込みの阻害薬（例えば、三環系抗うつ薬）が使用可能であるが、その詳細な機構は今のところ明らかではない。ｈＣＫ１εの阻害剤を用いることにより、例えば睡眠障害、季節関連性情動障害及び殊にうつ病のような心理的障害の治療にとって新しい有効な要因となり得るものと思われる。
本発明は、式(Ｉ)
Figure 0004436134
 ［式中、
ＲはＨ、又は式−(ＣＨ(ＯＲ2))5−ＣＨ2−ＯＲ2の基であり、
Ｒ1及びＲ2は、それぞれ互いに独立して、
１.０ Ｈ又は
２.０ Ｃ1−Ｃ6−アルキル、Ｃ2−Ｃ6−アルケニル、Ｃ2−Ｃ6−アルキニル又はＣ5−Ｃ10−アリール基であり、ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルは直鎖又は分枝鎖であり、またこれらの基は場合により
２.１ −ＯＨ、
２.２ ＝Ｏ、
２.３ 直鎖又は分枝鎖の−Ｏ−Ｃ1−Ｃ6−アルキル、
２.４ 直鎖又は分枝鎖の−Ｏ−Ｃ2−Ｃ6−アルケニル、
２.５ −アリール、
２.６ 直鎖又は分枝鎖の−ＮＨ−Ｃ1−Ｃ6−アルキル、
２.７ 直鎖又は分枝鎖の−ＮＨ−Ｃ2−Ｃ6−アルケニル、
２.８ −ＮＨ2又は
２.９ ハロゲン
（ここで、２.３から２.７の置換基は−ＣＮ、−アミン又は−オキシム官能基で更に置換されることができる）で一置換又は二置換されている］の化合物、又は式(Ｉ)で表される化合物の立体異性体又は式(Ｉ)で表される化合物の生理学的に許容され得る塩、或いは、式(Ｉ)で表される化合物の立体異性体の生理学的に許容され得る塩に関する。
Ｃ1−Ｃ6−アルキルは、直鎖又は分枝鎖のアルキルで、１〜６個の炭素原子を有し、好ましくは１〜４個の炭素原子を有する、例えばメチル、エチル、ｉ−プロピル、ｔ−ブチル及びヘキシルが挙げられる。
Ｃ2−Ｃ6−アルケニルは、直鎖又は分枝鎖のアルケニルで２〜６個の炭素原子を有し、それらはモノ−、ジ−、又はトリ不飽和であり、例えばアリル、クロチル、１−プロペニル、ペンタ−１,３−ジエニル及びペンテニルが挙げられる。
Ｃ2−Ｃ6−アルキニルは、直鎖又は分枝鎖のアルキニルで２〜６個の炭素原子を有し、それらはモノ−又はジ−不飽和であり、例えば、プロピニル、ブチニル及びペンチニルが挙げられる。
Ｃ5−Ｃ10−アリールは５〜１０個の炭素原子を有するアリール基であり、例えば、フェニル、ベンジル、又は１−若しくは２−ナフチルで、それらは更に、例えば塩素、臭素、フッ素のようなハロゲン、１〜４個の炭素原子を有するアルキル、好ましくはメチル、ヒドロキシ、１〜４個の炭素原子を有するアルコキシで、特に好ましくはメトキシ又はトリフルオロメチルで置換されていてもよい。
本発明は、好ましくは式(Ｉ)において、
Ｒは、Ｈ又は式−(ＣＨ(ＯＲ2))5−ＣＨ2−ＯＲ2の基であり、
Ｒ1及びＲ2はそれぞれ互いに独立して、Ｈ又はＣ1−Ｃ6−アルキル、或いはこれら好ましい化合物の立体異性体及び／又は生理学的に許容され得る塩に関するものである。
本発明は、特に好ましくは、式(Ｉ)において
Ｒは式−(ＣＨ(ＯＲ2))5−ＣＨ2−ＯＲ2の基であり、
Ｒ1及びＲ2は、Ｈである化合物、又はその好ましい化合物の立体異性体及び／又は生理学的に許容し得る塩に関する。そのような化合物としては、式(II)で表される化合物がある。
Figure 0004436134
本発明の特に好ましいものとしては、式(Ｉ)においてＲ及びＲ1はＨである化合物又はその化合物の立体異性体及び／又は生理学的に許容し得る塩に関するものである。そのような化合物としては、式(III)で表されるものがある。
Figure 0004436134
式(Ｉ)及び(II)で表される化合物の不斉中心は、別段に記載がない限り、Ｒ又はＳ立体配置である。
本発明は、光学活性的に純粋な化合物並びにエンチオマー混合物及びジアステレオマー混合物のような立体異性体の混合物（混合比のいかんに関わらず）双方に関するものである。
本発明は、更に式(Ｉ)、(II)、又は(III)で表される化合物の自明な化学的均等物にも関するものである。
本発明に係る自明な化学的均等物とは、本発明に係る化合物と同様な活性を有し、化学的差異が微細であるか又は緩和な条件下で本発明に係る化合物に変換され得るような化合物を意味する。ここで言う均等物には、例えば、エーテル、エステル、還元化合物及び本発明に係る化合物の複合体を含むものである。
例えば、式(Ｉ)、(II)又は(III)で表される化合物の１つ又は２つ以上の水酸基は、例えば、Ｃ1−Ｃ6−アルコールで酸添加によりエーテル化され得るし、或いは例えば酸塩化物や他の酸誘導体のような活性化された酸によりエステル化され得る。更に、例えば式(Ｉ)、(II)又は(III)で表される化合物の１つ又は２つ以上の二重結合を還元剤を用いることにより、例えばＨ2／Ｐｄを用いることにより還元することが可能である。
本発明に係る化合物のフェノール基は、更に、モノ−又は多価陽イオンとキレートを形成することができる。キレート形成性のフェノール基を有している化合物は更に抗酸化剤の効果をも有している（N. Sugihara等，Journal of Health Science 2001, 47(2), 99-106）。抗酸化剤（酸化阻害剤）は、酸素の影響による原因から保護されるべき物質中での望ましくない変化を阻止し又は抑制する有機化合物である。抗酸化剤は、例えばプラスティックを老化から保護し、脂肪を酸敗から保護し、油を樹脂化から保護し、芳香剤を香りの変質から保護するため、食糧品、医薬品等において必要とされるものである。抗酸化剤の作用は、通常酸化中に生じる有離ラジカル基のラジカル捕捉剤として作用することである。それ故、式(Ｉ)、(II)及び(III)の化合物は、キレート剤及び抗酸化剤としても使用することができるものである。
上述した誘導体の製法は、例えば、Jerry March著，Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, 第４版，1992年発行のような教科書に記載されている。反応を選択的に遂行するためには、反応前に既知の方法により適当な保護基を導入することが有利である。保護基は、反応後に除去してから反応生成物を精製することができる。
式(Ｉ)、(II)及び(III)で表される化合物、並びにそれらの自明な化学均等物は、当業
者にとって既知の方法により、対応する医薬品として許容され得る塩に変換することができる。
本発明に係る化合物の薬理学的に許容され得る塩とは「Remingtons Phrmaceutical Sciences」第17版，1418頁、1985年発行に記載されているような無機塩又は有機塩の双方を意味しているものと理解される。可能性の有る塩としては、特にアルカリ金属、アンモニウム及びアルカリ土類金属の塩、生理学的に許容し得るアミンの塩、及び例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、マレイン酸、フマル酸のような無機又は有機酸との塩を挙げることができる。
本発明は更に表２（後記参照）記載の如く、1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲ測定値により特徴付けられる実験式Ｃ26Ｈ24Ｏ9で表される化合物、又はそれらの立体異性体及び／又は生理学的に許容し得る塩に関するものである。
本発明は、更に、表３（後記参照）記載の如く1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲ測定値により特徴付けられる実験式Ｃ20Ｈ12Ｏ3で表される化合物、又はそれらの立体異性体、及び／又は生理学的に許容し得る塩に関するものである。
本発明は更に、ＳＴ ００３３６０（ＤＳＭ １４０９３）又はＳＴ ００３３６０（ＤＳＭ １４０９３）の変株及び／又は突然変異株を培養液中に式(II)で表される化合物が蓄積するまで培地中で発酵し、続いて式(II)で表される化合物を単離し、そして適当な場合は薬理学的に許容し得る塩に変換することによって得られる式(II)の化合物に関するものである。
本発明は更に、ＳＴ ００４１１２（ＤＳＭ １４５２４）又はＳＴ ００４１１２（ＤＳＭ １４５２４）の変株及び／又は突然変異株を培養液中に式(III)で表される化合物が蓄積するまで培地中で発酵し、続いて式(III)で表される化合物を単離し、そして適当な場合は薬理学的に許容し得る塩に変換することによって得られる式(III)の化合物に関するものである。
本発明は更に加えて、ＳＴ ００３３６０（ＤＳＭ １４０９３）又はＳＴ ００３３６０（ＤＳＭ １４０９３）の変株及び／又は突然変異株を培養液中に式(II)で表される化合物が蓄積するまで培地中で発酵し、続いて式(II)で表される化合物を単離するか、又はＳＴ ００４１１２（ＤＳＭ １４５２４）又はＳＴ ００４１１２（ＤＳＭ １４５２４）の変株及び／又は突然変異株を培養液中に式(III)で表される化合物が蓄積するまで培地中で発酵し、続いて式(III)で表される化合物を単離し、更に引き続き式(Ｉ)の化合物に変換し、そして必要に応じて薬理学に許容し得る塩に変換することによって得られる式(Ｉ)の化合物に関するものである。微生物ドッレッチスレラ アウストラリエンシス（Drechslera australiensis）ＳＴ ００３３６０の単離株は、ブダペスト条約の規定に基づき、２００１年２月２８日に、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures）GmbH(DSM), Mascheroder Weg 1B, 38124 Brunswick, Germanyに寄託しており、寄託番号はＤＳＭ １４０９３である。
微生物ドレクスレラ アウストラリエンシス（Drechslera australiensis）ＳＴ ００３３６０、ＤＳＭ １４０９３は暗黒な褐色の菌糸体を有しているが、その他の特徴的形態等については未知である。
ブダペスト条約の規定に基づき、分類学的には未同定の真菌ＳＴ ００４１１２の単離株も同様に、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)，Ma
scheroder Weg 1B, 38124 Brunswick, Germanyに寄託しており、寄託番号はＤＳＭ １４５２４である。
微生物ＳＴ ００４１１２、ＤＳＭ １４５２４は、モルト寒天培地上で灰色から黒色である。この菌株は、フランス領ギアナで採取した土壌標品から単離されたものである。
本発明は、更に、微生物ＳＴ ００３３６０（ＤＳＭ １４０９３）又はＳＴ ００３３６６（ＤＳＭ １４０９３）の変株及び／又は突然変異株を液体培地中で培養した後に、式(II)で表される化合物を単離し、精製することによる式(II)で表される化合物の製法、及び適当な場合はそれらを自明な化学的均等物及び／又は薬理学的に許容し得る塩への変換方法に関するものである。
本発明は、更に微生物ＳＴ ００４１１２（ＤＳＭ １４５２４）又はＳＴ ００４１１２（ＤＳＭ １４５２４）の変株及び／又は突然変異株を液体培地中で培養した後に、式(III)で表される化合物を単離し、精製することによる式(III)で表される化合物の製法、及び適当な場合はそれらを自明な化学的均等物及び／又は薬理学的に許容され得る塩への変換方法に関するものである。
本発明は、更に
(ａ)微生物ＳＴ ００３３６０（ＤＳＭ １４０９３）又はＳＴ ００３３６０（ＤＳＭ １４０９３）の変株及び／又は突然変異株を液体培地中で培養した後に、式(II)で表される化合物を単離し、精製し、又は微生物ＳＴ ００４１１２（ＤＳＭ １４５２４）若しくはＳＴ ００４１１２（ＤＳＭ １４５２４）の変株及び／又は突然変異株を液体培地中で培養した後に式(III)で表される化合物を単離し、精製し、そして
(ｂ)式(II)で表される化合物又は式(III)で表される化合物を式(Ｉ)で表される化合物へ変換し、そして
(ｃ)式(Ｉ)で表される化合物を、適当な場合は、薬理学的に許容し得る塩へ変換することより成る式(Ｉ)で表される化合物の製法に関するものである。
菌株ドレクスレラ アウストラリエンシス（Drechslera australiensis）、ＤＳＭ １４０９３又はＳＴ ００４１１２、ＤＳＭ １４５２４の代りとしてそれらの突然変異株及び／又は変株もまた使用することができる。ここで言う突然変異株とは、ある微生物の有するゲノム中の１つ又は２つ以上の遺伝子が修飾を受けてはいるが、本発明に係る化合物を生成する能力に関係する遺伝子又は遺伝子群を機能的にも遺伝性的にも維持している菌株のことをいう。
このような突然変異株は、既知の方法で作成することができ、例えば、紫外線又はＸ線のような照射による物理的方法、又は化学的突然変異誘発剤によるものがあり、例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、２−ヒドロキシ−４−メトキシ−ベンゾフェノン（ＭＯＢ）、又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、又はPrentice Hall，1984年発行の「Biology of Microorganisms」中のBrock等の記載（238-247頁)が挙げられる。
変株とは、微生物の表現型の一つである。微生物は環境に順応する能力があるために、特徴的な生理的適応性を示すからである。表現型順応においては、微生物の細胞が関与しているが、修飾された性質は遺伝的には変異を受けていないため他の条件下においては可逆的である（H. Stolp著，Microbial ecology：organisms, habitats, activities. Cambridge University Press, Cambridge, GB, 180頁, 1988）。
本発明に係る抗生物質を生成する突然変異株及び変株のスクリーニングは、培養液中に
蓄積した活性物質の生物活性値を例えばＪＮＫ−３−又はｈＣＫ１ε−阻害活性値を測定することにより、或いは発酵液中のＪＮＫ−３−又はｈＣＫ１ε−阻害として知られている化合物を例えばＨＰＬＣ又はＬＣ−ＭＳ測定法で測定することによる検出法で行うことができる。
本発明に係る化合物の生成及びそのための発酵過程は、当業者に既知の方法、例えば生物活性物質を生物検定法により、或いは薄層クロマト（ＴＬＣ）又は高速液体クロマト（ＨＰＬＣ）のようなクロマトグラフィーの方法でテストすることができる。
少なくとも１つの炭素源と１つの窒素源及び通常の無機塩を含んだ栄養培地中、好気的条件下で、菌株ドレクスレラ アウストラリエンシス（Drechslera australiensis）ＳＴ ００３３６０、ＤＳＭ １４０９３は、本発明に係る式(II)で表される化合物を生成し、そしてＳＴ ００４１１２、ＤＳＭ １４５４２は本発明に係る式(III)で表される化合物を生成する。
下記に記載した発酵条件は菌株ドレクスレラ アウストラリエンシス（Drechslera australiensis）ＳＴ ００３３６０、ＤＳＭ １４０９３及びＳＴ ００４１１２、ＤＳＭ １４５２４に使用したものである。
好気的発酵に適切な炭素源として好まれるものは、消化可能な炭水化物及びグルコース、ラクトース、スクロース又はＤ−マンニトールのような糖アルコール、並びに例えば麦芽エキスのような天然物を含んだ炭水化物が挙げられる。適切な窒素を含んだ栄養培地としては、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質並びにそれらの消化産物、例えばペプトンやトリプトン等、更には肉エキス、酵母エキス、例えばトウモロコシ、小麦、インゲン豆、大豆等の紛砕種子、又は綿の木の紛砕物、アルコール製造成から得られる蒸留残査、ミートミール等が挙げられるが、しかしながら、アンモニア塩や硝酸塩も挙げることができる。栄養培地に含ませ得る有機塩としては、例えばアルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩化物、炭酸塩、硫酸塩又はリン酸塩、鉄、亜鉛、コバルト及びマンガン等が挙げられる。
栄養培地に含ませ得る微量元素としては、例えばモリブデン、銅、ニッケル又はセレンが挙げられる。
本発明に係る式(II)で表される化合物の生成は、特に、栄養培地中に約０.１〜５％、好ましくは０.５〜２％のポテトデキストロース及び０.２〜５％、好ましくは０.５〜１％の酵母エキスを含んでいるときに行われた。詳細なパーセント表示は全栄養培地に対する重量パーセントで表示している。
本発明に係る式(III)で表される化合物の生成は栄養培地中に、約０.１〜５％、好ましくは０.５〜２％の麦芽エキス及び約０.２〜５％、好ましくは０.５〜１％の酵母エキスを含んでいるときに行われた。詳細なパーセント表示は、全栄養培地に対する重量パーセントで表示している。
微生物の培養は、好気的に、例えば振とうフラスコ中又はファーメンター中で振とう又は撹拌しつつ培養液中で培養し、場合により培養液中に空気又は酸素を通気して行うが、固形培地上で行うこともできる。培養は、約１８〜３５℃、好ましくは２０〜３０℃、特に好ましくは２２〜２８℃の温度範囲で行うことができる。培養に適するｐＨは４〜８、好ましくは５〜６である。このような培養条件下、微生物は通常２４〜３００時間、好ましくは３６〜１６８時間、培養した。
培養は数段階に分けて行うことが有利であり、例えば１つ又は２つ以上の前培養を液体
栄養培地中で準備し、その後、生産培養である本培養に例えば、１：１０から１：１００の容積比で行った。前培養は、例えば、菌糸体を栄養培地に摂取した後、約３６〜１２０時間、好ましくは４８〜７２時間培養して増殖させた。菌糸体は、例えば麦芽−酵母寒天、又はポテトデキストロース寒天の固体又は液体培地中で約３〜４０日間、好ましくは４〜１０日間培養して増殖させた。本発明について更に実施例において具体的に説明する。パーセントは重量パーセントである。混合比は液体培地の場合は他に説明がない限り容積比である。
本発明の化合物は、菌糸体及び培養液の双方に存在する。それ故、培養液を濾過して培養濾過液と菌糸体とに分離してから乾燥させた方が便宜である。乾燥させた濾過液及び菌糸体はそれぞれ別々に有機溶媒、例えばメタノール又はプロパン−２−オールで抽出するのが便宜である。
培養を固形培地で行った場合は、本発明に係る化合物は菌糸体及び固形培地中の双方に存在する。培養物全体を凍結乾燥させた後、乾燥物を有機溶媒、例えばメタノール又はプロパン−２−オールで抽出するのが便宜である。
抽出は、広範囲のｐＨで行うことができるが、中性又は弱アルカリ中で、好ましくはｐＨ７〜ｐＨ１０の範囲で行うのが便宜である。抽出物は、例えば真空下で濃縮乾燥させることができる。
本発明に係る化合物を単離する方法の１つとしては、既知の方法である極性の相違に基づく分離方法で行うことができる。
更なる精製法としてはクロマトグラフィーがあり、吸着樹脂としては、例えばＤｉａｉｏｎ(R)ＨＰ−２０（三菱化成株式会社製）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ(R)ＸＡＤ７（Rohm and
Haas社製、USA）、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ(R)ＣＧ（TOSO Haas社製，Philadelphia, USA）、又はその他のものが挙げられる。更に適切なものとしては、数種の逆相支持体のものがあり、例えばＲＰ8及びＲＰ18のように高速液体クロマト（ＨＰＬＣ）との関係で一般に知られるようになってきたものもある。
更に本発明に係る化合物の精製に使用され得るものとしては、通常のクロマトグラフィー支持体として用いられる、例えばシリカゲル又は酸化アルミニウム、その他の既知のものが挙げられる。
代替的な単離法としては、分子篩（モレキュラーシーブ）があり、例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ(R)ＴＳＫ ＨＷ−４０（ドイツMerck社製）及びその他の既知のものがある。更に本発明に係る化合物の濃縮物からの回収法として用いられ得る方法としては、結晶化法が挙げられる。この方法に適するものとしては、例えば有機溶媒とそれらの混合物で無水又は水を添加したもの等がある。本発明に係る抗生物質の単離及び精製のための更なる方法としては、陰イオン交換樹脂、好ましくはｐＨ範囲が４〜１０のものが挙げられる。特に好ましくは、有機溶媒を添加した画分に緩衝液を使用することである。
驚くべきことは、本発明に係る式(Ｉ)で表される化合物が、ＪＮＫ−３及びＣＫ−１の阻害物質であるということである。表１は、実施例として本発明に係る化合物の活性値を要約したものである。
Figure 0004436134
本発明は、それ故に、式(Ｉ)、(II)又は(III)で表される化合物の１つ又は２つ以上の医薬品としての使用に関するものであり、特に式(Ｉ)、(II)又は(III)で表される化合物の１つ又は２つ以上を、変性神経障害、例えばアルツハイマー病、又は精神的障害、例えばうつ病、睡眠障害、又は季節関連精神障害等の治療及び／又は予防のための医薬品の製造に関するものでもある。
本発明は、更に追加的に、本発明に係る１つ又は２つ以上の化合物を含む医薬品に関するものである。
式(Ｉ)、(II)及び／又は(III)で表される化合物を含む当該医薬品は、１つ又は２つ以上の生理学的に適切な賦形剤を用いて適切な投薬の剤形に仕立てることによって製剤することができる。
本発明に係る医薬品は、腸溶性（経口的）として、腸管外（筋肉内又は静脈内）、直腸に又は局部に投薬することができる。それらは、溶液、散剤（錠剤、カプセル、マイクロカプセル）、軟膏剤（クリーム、ゲル）として、又は座剤として投薬することもできる。この種の生理学的に適切な賦形剤又は製剤としては医薬品として通常の液体又は固体の充填剤、並びに増量剤、溶媒、乳化剤、滑沢剤、香味剤、着色剤及び／又は緩衝剤が挙げられる。好適な投薬量としては、体重当たり０.１〜１０００、好ましくは０.２〜１００mg／kgを投与することができる。好適な投薬単位としては、本発明に係る化合物の１日当たりの有効量として、少なくとも３０〜３０００mg、好ましくは５０〜１０００mgである。
以下の実施例は、本発明の詳細について説明するものではあるが、本発明はいかなる仕方においても、これらに制限することを意図するものではない。
実施例１：ドレクスレラ アウストラリエンシス（Drechslera australiensis）ＳＴ ００３３６０、ＤＳＭ １４０９３のグリセロール培養の調製
滅菌した３００mlのエーレンマイヤーフラスコに栄養溶液（麦芽エキス２.０％、酵母エキス０.２％、グルコース１.０％、(ＮＨ4)2ＨＰＯ4０.０５％、ｐＨ６.０）１００mlを加え、菌株ドレクスレラ アウストラリエンシス（Drechslera australiensis）ＳＴ ００３３６０、ＤＳＭ １４０９３を接種し、回転数１４０rpmの回転シェーカー上で、２５℃で７日間培養した後、この培養液１.５mlを５０％グリセロール液２.５mlで希釈し、−１３５℃で貯蔵した。
実施例２：ドレクスレラ アウストラリエンシス（Drechslera austrariensis）ＳＴ ００３３６０、ＤＳＭ １４０９３のエーレンマイヤーフラスコ中での主培養の調製
ポテトデキストロース２.４ｇ／Ｌ及び酵母エキス０.２ｇ／Ｌから成る栄養溶液１００mlを含んで滅菌した３００mlのエーレンマイヤーフラスコに、斜面培地管（上記同様の栄養溶液に寒天２％を添加したもの）中で増殖させた菌糸を接種するか、又はグリセロール培養（実施例１参照）１mlを接種した後、回転数１８０rpmの回転シェーカー上で、２５℃で培養した。本発明に係る式(II)で表されるドレクスレラノールの最大生成は約１４４時間後に達成された。１０Ｌファーメンター培養のため、上記栄養溶液中４８〜９６時間培養した培養液（接種量は約１０％）を用いた。
実施例３：１０Ｌファーメンターにおける式(II)で表される化合物の製法
１０Ｌファーメンターは、以下の条件下で行った。
栄養培地：
ポテトデキストロース ２.４ｇ／Ｌ
酵母エキス ０.２ｇ／Ｌ
滅菌前のｐＨ ５.１
培養時間：１１５時間
培養温度：２５℃
撹拌数 ：２００rpm
通気量 ：１５Ｌ／min
培養中の泡形成は、エタノール性多価アルコール溶液の連続添加により抑制することができた。最大生成は９６〜１４４時間の間に達成した。
実施例４：式(II)で表される化合物の単離
名目１０Ｌのガラス製ファーメンターによる１回培養の発酵液を真空凍結乾燥した後、１回当たりメタノール３Ｌで３回抽出を行った。メタノール抽出画分を真空下で約５００mlに濃縮し、水で希釈してメタノール含量を１０％とした。希釈抽出物（５Ｌ）を、約０.５ＬのＭＣｌ−Ｇｅｌ(R)ＣＨＰ−２０Ｐ材質（三菱化学社製の吸着樹脂）を充填したガラスカラム（ＢＰＧ１００、４Ｌ内部容量、Pharmacia Biotech社製）に供した。カラムは水１００％からアセトニトリル１００％の傾斜を用い６０分間かけて溶出した。カラム流速は、５０ml／minで溶出液を５０mlずつの画分で採集した。全ての画分をＪＮＫ−３検定法でテストし、活性画分（画分２６〜４４）を採集後混合した。真空下で濃縮した後真空凍結乾燥し、褐色粉末１.２１ｇを得た。
この粉末をＬＵＮＡ(R)１０μＣ１８(２)（サイズ：２１.２mm×６０mm）を結合したＬＵＮＡ(R)１０μＣ１８(２)カラム（サイズ：５０mm×２５０mm；ドイツPhenomenex社製）に供し、０.１％酢酸アンモニウム／水中にアソトニトリル０％〜５０％の傾斜を用い、５０分間かけて、クロマト展開した。流出速度は１２５ml／minで、分画サイズは２５０mlである。生物検定の結果、画分１７が最大活性値を示した。その画分を真空凍結乾燥し（２２０mg）、質量分析計を分析した。その画分は、単一物質であることが判明した（純度９５％以上）。
実施例５：式(II)で表される化合物の特性
実施例４で単離した化合物の物理化学的及びスペクトル分析特性は以下のように要約される。
実験式：Ｃ26Ｈ24Ｏ9
分子量：４８０
最大ＵＶ吸収：226, 236, 260, 312, 340nm
1Ｈ−及び13Ｃ−ＮＭＲ：表２参照
Figure 0004436134
実施例６：ＳＴ ００４１１２、ＤＳＭ １４５２４のグリセロール培養の調製
栄養溶液（麦芽エキス２.０％、酵母エキス０.２％、グルコース１.０％、(ＮＨ4)2ＨＰＯ4０.０５％、ｐＨ６.０）１００mlを含む滅菌した３００mlのエーレンマイヤーフラスコに菌株ＤＳＭ １４５２４を接種し、１４０rpm回転の回転シェーカー上で、２５℃で７日間培養した。この培養液１.５mlを５０％グリセロール溶液２.５mlで希釈して−１３
５℃で保存した。
実施例７：ＳＴ ００４１１２、ＤＳＭ １４５２４の固形培地（プレート）上での主培養の調製
滅菌した２５cm×２５cmのプレート５０枚に、麦芽エキス２０ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ及び寒天２％を含み、ｐＨ７.０の栄養溶液２００mlを各々に注ぎ込んだ。これらのプレートに２５℃で培養しておいた前培養液２mlを各々接種した。式(III)で表される化合物の最大生成は、培養３６０時間後に達成した。
実施例８：ＳＴ ００４１１２、ＤＳＭ １４５２４のエーレンマイヤールフラスコ中での主培養の調製
ポテトデキストロース２.４ｇ／Ｌ及び酵母エキスト０.２ｇ／Ｌから成る栄養溶液１００mlを含む滅菌した３００mlのエーレンマイヤーフラスコに、上記の栄養溶液に寒天２％を添加した斜面培養管中で増殖させた培養菌株を接種し、又はグリセロール培養液（実施例６参照）１mlを接種し、回転数１８０rpmの回転シェーカー上で、２５℃で培養した。式(III)で表される化合物の最大生成は培養１４４時間後に達成した。１０Ｌファーメンター培養は、上記同様の栄養溶液中で４８〜９６時間培養した培養液を接種した（接種量は約１０％）。
実施例９：式(III)で表される化合物の単離
５０枚の培養プレート（各プレート ２０cm×２０cm）を採集し、真空凍結乾燥後、１回当たりメタノール１０Ｌで２回抽出した。メタノール抽出液を真空下で５００mlに濃縮した後、水を添加してメタノール含量を１０％までに希釈した。希釈した抽出液（５Ｌ）は、０.５ＬのＭＣｌ−Ｇｅｌ(R)ＣＨＰ−２０Ｐ材質（三菱化学社製の吸着樹脂）を充填したガラスカラム（ＢＰＧ１００、４Ｌ内部容量、Pharmacia Biotech社製）に供した。カラムは水１００％からアセトニトリル１００％までの傾斜で、３０分間かけて溶出した。カラムの溶出速度は５０ml／minで、溶出画分を５０ml毎の画分として採集した。すべての画分をＪＮＫ−３検定法によりテストし、活性画分（画分３０〜４４）を採集混合した。真空下で濃縮した後、真空凍結乾燥して、ゴムのような褐色残留物を得た。
この残留物を水／アソトニトリル（１：１）に溶解させ、遠心分離後、ＬＵＮＡ(R)１０μＣ１８(２)カラム（サイズ ２１mm×２５０mm；ドイツPhenomenex社製）に供し、０.１％酢酸アンモニウム／水中、アセトニトリル０〜１００％の傾斜を用いて、６０分間かけてクロマト展開した。流出速度は、３３ml／minで、画分３３ml毎に採集した。生物検定の結果、画分２８〜３２が最大活性を示した。これらの画分を真空凍結乾燥してから精製した。精製はＬＵＮＡ(R)５μＣ１８(２)カラム（サイズ １０mm×２５０mm；ドイツPhenomenex社製）に供し０.１％酢酸アンモニウム／水中、アセトニトリル３０〜６０％の傾斜を用いて、４５分間かけてクロマト展開して行った。流出速度は６.５ml／minで、画分６.５ml毎に採集した。生物検定の結果、画分１８〜２４が最大活性を示した。凍結乾燥後（収率：１０mg）、分析用ＨＰＬＣ及びＭＳ分析計で分析した結果、均一な化合物であることが分った（純度９５％以上）。
実施例１０：式(III)で表される化合物の特性
実施例９に基づいて単離された化合物の物理化学的及びスペクトル特性は以下のように要約することができる。
実験式：Ｃ20Ｈ12Ｏ3
分子量：３００
最大ＵＶ吸収：226，236，260，312，340nm
1Ｈ−及び13Ｃ−ＮＭＲ：表３参照
Figure 0004436134
 (ａ)これらの炭素原子については、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいてシグナルが観察されなかった（又は極めてシグナル幅の広いものであった）。化学シフト値は、ＨＭＢＣスペクトルにおける相対値として測定されたものである。
実施例１１：ＪＮＫ−３検定法における式(II)及び(III)で表される化合物の活性の実例
該検定は３８４穴プレートを用いたＣｙＢｉｏピペッター方式により行った。検定液は、３％ＤＭＳＯに溶解した標品１０μl（抽出物又は純品、例えば、式(II)で表される化合物、又は式(III)で表される化合物）、１０μlの酵素／基質混合物（ＪＮＫ−３／ＧＳＴ−ＡＴＦ２）及びＡＴＰ １０μlを含み、最終容量は３０μlである。３７℃で２０分間インキュベートした後、５０μlのＨＴＲＦ抗体混合物（ＸＬ６６５−抗ＧＳＴ／（Ｅｕ）クリプテート 抗−Ｐ−ＡＴＦ２）を添加した。室温に１２０分間静置した後、標品をＶｉｃｔｏｒ(R)（ＷＡＬＬＡＣ）中で３４０nm照射で得られるエネルギー転移及び６６５と６１５nmにおけるユウロピウム（Ｅｕ）のシグナル放射を測定した。
ＪＮＫ３、ＧＳＴ−ＡＴＦ２、ＡＴＰの希釈に用いる緩衝液Ｉ：
ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.５ ２５mM
ＭｇＣｌ2 １００μM
ＴＲＩＴＯＮ×１００ ０.０３％
ＤＴＴ １０mM
グリセロール ５％
ＨＴＲＦ試薬の希釈に用いる緩衝液II：
ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.０ １００mM
ＫＦ １００mM
ＥＤＴＡ １３３mM
ＢＳＡ １ｇ／Ｌ
試薬 購入先 最終濃度
JNK3キナーゼ Biotech, Vitry ８ng／穴
GST−ATF2 Biotech, Vitry ８８ng／穴
ATP Sigma, A7699 １５μM
抗−GST−XL665 CisBio １２５ng／穴
抗−P−ATF2−(Eu)クリプテート NEB/CisBio ６ng／穴
各プレートは、１６穴の陽性対照（最大エネルギー転移、標品の代りに緩衝液Ｉ）、８穴の無処理対照（最低エネルギー転移、ＡＴＰの代りに緩衝液II）及び８穴はＥＤＴＡ２００μMを含んでいる。
測定結果は以下のように算定した。
最初に、シグナル比＝（６６５nmのシグナル強度）／（６１５nmのシグナル強度）として算定した。次に、以下の公式を用いて、無処理対照による補正を行った。
デルタＦ(％)＝（シグナル比(標品)−シグナル比(最低エネルギー転移)）／（シグナル比(最低エネルギー転移)×１００）
標品の活性は、以下のようにして算定した。
阻止能力(％)＝１００×［１−デルタＦ（標品）／デルタＦ（最大エネルギー転移）］
実施例１２：ｈＣＫ１ε検定における式(II)で表される化合物の活性の実例
該検定は、３８４穴プレートを用いたＪｏｂｉ−Ｗｅｌｌ(CyBio社)及びＢｉｏｍｅｋ２０００ピペッター方式により行った。３８４穴プレートは、コーティング緩衝液中１００μg／mlの濃度のカゼイン溶液で各穴当たり５０μlでコーティングし（各穴当りのカゼイン量は５μg相当、カゼインはSigma社製）、一夜４℃で保存した。洗浄溶液１（ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.４ ５０mM及びＮａＣｌ １５０mM）を１回につき９０μlを用いて、４回洗浄した。最終容量を５０μlとして、反応を行わせた。例えば、式(II)で表される化合物又は式(III)で表される化合物を１０μlに希釈したもの、２０μlのｈＣＫ１ε酵素溶液（穴当たりカゼイン２９ng相当）及び２０μlのＡＴＰ溶液（最終濃度：穴当たり、０.４μCiの33Ｐ−γ−ＡＴＰ放射性同位体標識及び０.４μMの無標識ＡＴＰ）をコーティングしたプレート上にピペットで移した。プレートはその後３７℃で１時間インキュベートした。プレートはその後、洗浄溶液２（リン酸 ３％）を１回当たり７５μlで４回洗浄し、MicroBeta Trilux測定機（WALLAC）中で３０秒間測定した。
ｈＣＫ１ε酵素溶液：キナーゼ緩衝液１ml当たり組替えｈＣＫ１ε １.４５μgを含む溶液
キナーゼ緩衝液：
ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４ ５０Ｍ
ＭｇＣｌ2 １０mM
ＤＴＴ ０.２５mM
ＥＧＴＡ ０.６mM
コーテイン緩衝液：
Ｎａ2ＣＯ3 ２７.５mM
ＮａＨＣＯ3（ｐＨ９.６） ２２.５mM
ＮａＣｌ ０.９％
ＡＴＰ溶液：
33Ｐ−γ−ＡＴＰ ２０μCi／ml
無標識ＡＴＰ １μM
プレート当り、１６穴は全酵素活性の測定に用い（阻害物質を全く添加せずに）、そして他の１６穴は非選択的反応を測定するために、酵素を全く加えずに用いた。
標品の阻止能力は以下の式を用いて、算定することができる。
［１−（ＣＰＭ(標品)−ＣＰＭ(非選択的)）／（ＣＰＭ（酵素濃度）−（ＣＰＭ（非選択的）））×１００(％)
ＣＰＭ＝１分間当たりの放射能測定数
ＪＮＫ−３及びｈＣＫ１εを検定結果は表１に要約した通りである（前記参照）。

Claims (14)

  1. 式(II)
    Figure 0004436134
     の化合物、又は式(II)の化合物の立体異性体、又は式(II)の化合物の生理学的に許容し得る塩、又は式(II)の化合物の立体異性体の生理学的に許容し得る塩。
  2. 式(III)
    Figure 0004436134
     の化合物、又は式(III)の化合物の立体異性体、又は式(III)の化合物の生理学的に許容し得る塩、又は式(III)の化合物の立体異性体の生理学的に許容し得る塩。
  3. ＳＴ ００３３６０（ＤＳＭ １４０９３）を培養液中に式(II)の化合物が蓄積するまで培地中に培養し、続いて式(II)の化合物を単離し、そして適当な場合は、式(II)の化合物の薬理学的に許容し得る塩に変換することによって得られる、請求項１の式(II)の化合物、又は式(II)の化合物の薬理学的に許容し得る塩。
  4. ＳＴ ００４１１２（ＤＳＭ １４５２４）を培養液中に式(III)の化合物が蓄積するま
    で培地中に培養し、続いて式(III)の化合物を単離し、そして適当な場合は、式(III)の化合物の薬理学的に許容し得る塩に変換することによって得られる、請求項２の式(III)の化合物、又は式(III)の化合物の薬理学的に許容し得る塩。
  5. （ａ）微生物ＳＴ ００３３６０（ＤＳＭ １４０９３）を培養し、
    （ｂ）式(II)の化合物を単離及び精製し、そして
    （ｃ）式(II)の化合物を、適当な場合は、薬理学的に許容し得る塩に変換する
    ことを特徴とする、請求項１に記載した式(II)の化合物又は式(II)の化合物の薬理学的に許容し得る塩の製法。
  6. （ａ）微生物ＳＴ ００４１１２（ＤＳＭ １４５２４）を培養し、
    （ｂ）式(III)の化合物を単離及び精製し、そして
    （ｃ）式(III)の化合物を、適当な場合は、薬理学的許容し得る塩に変換する
    ことを特徴とする、請求項２に記載した式(III)の化合物又は式(III)の化合物の薬理学的に許容し得る塩の製法。
  7. 請求項１〜４のいずれか１項に記載した化合物の医薬品の製造のための使用。
  8. 請求項１〜４のいずれか１項に記載した化合物の変性神経障害の治療又は予防用医薬品の製造のための使用。
  9. 請求項１〜４のいずれか１項に記載した化合物のアルツハイマー病の治療又は予防用医薬品の製造のための使用。
  10. 請求項１〜４のいずれか１項に記載した化合物の心理的障害の治療又は予防用医薬品の製造のための使用。
  11. 請求項１〜４のいずれか１項に記載した化合物のうつ病、睡眠障害又は季節関連性情動障害の治療又は予防用医薬品の製造のための使用。
  12. 請求項１〜４のいずれか１項に記載した少なくとも１つの化合物および１つまたは２つ以上の生理学的に適切な賦形剤を含む医薬品。
  13. ＤＳＭＺに受託番号ＤＳＭ １４０９３として寄託された微生物株ドレクスレラ アウストラリエンシス（Drechslera australiensis）ＳＴ ００３３６０。
  14. ＤＳＭＺに受託番号ＤＳＭ １４５２４として寄託された真菌株ＳＴ ００４１１２。
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