JP4423834B2 - 転写活性化複合体及びその利用 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、転写活性化複合体及びその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ダウン症は、常染色体異常に起因する疾患である。ダウン症の患者では、体細胞中の染色体２１番が正常の２本ではなく、トリソミー（三本）になっており、これが原因で精神遅滞、成長の異常、心臓病、白血病、早期に発症するアルツハイマー症等を生じる。
今までに当該疾患原因遺伝子の単離同定及び機能解析等に関連する多くの研究がなされた結果、中枢神経系細胞の発生、分化において重要な働きをする転写調節因子として知られる Single-minded 2 （以下、Ｓｉｍ２と記す。）の遺伝子が、ヒト染色体２１番上のダウン症候群のクリティカル領域（q22.2）に存在しており、このクリティカル領域のみがトリソミーになってもダウン症の症状が発現することから、Ｓｉｍ２遺伝子の発現産物の細胞中での量が増えることがダウン症候群の病因となる要素であることが示唆されている。また、ＡＲＮＴ１又はＡＲＮＴ２等のＡＲＮＴファミリーに属する転写共役因子（以下、ＡＲＮＴファミリー属転写共役因子と記すこともある。）とＳｉｍ２とが結合してなる転写抑制化複合体が、ＣＭＥ配列（5'-ACGTG-3'：中枢神経系の正中線における転写に必要な塩基配列のコア配列であって、前記転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡの塩基配列：配列番号１６）に対して抑制的に働くこと、すなわち、前記転写抑制化複合体がＣＭＥ配列に結合して、その下流に位置する遺伝子の転写を抑制すること等が明らかにされており、当該転写抑制化複合体による転写抑制の亢進がダウン症候群の原因の一つであると現在考えられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記の知見に基づき、ＣＭＥ配列に結合して転写を促進する能力を有する転写調節因子／ＡＲＮＴファミリー属転写共役因子複合体を見出し、それをＳｉｍ２／ＡＲＮＴファミリー属転写共役因子複合体に対して競合的に働かせることにより、ダウン症の患者の治療に応用することが期待されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況の下、鋭意検討した結果、ある種のＡＲＮＴファミリー属転写共役因子とある種の転写調節因子との複合体が、ＣＭＥ配列に結合して転写を促進する能力を有することを見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかと、下記のいずれかのアミノ酸配列（以下、本アミノ酸配列と記すこともある。）を有する転写調節因子（以下、本転写調節因子と記すこともある。）との複合体であって、前記転写共役因子と転写調節因子Ｓｉｍ２との転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡに結合する能力を有し、前記ＤＮＡ領域の下流に位置する遺伝子の転写を促進する能力を有することを特徴とする転写活性化複合体（以下、本発明転写活性化複合体と記すこともある。）、
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列
２．前項１記載の転写活性化複合体を産生する能力を有し、前記複合体を構成する蛋白質をコードする１種以上のＤＮＡが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体と記すこともある。）；
３．下記の（１）および（２）のＤＮＡを含有する一種のベクター又は前記ＤＮＡを個別に有する複数種のベクター（以下、これらを一括して本ベクターと記すこともある。）が宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体、
＜ＤＮＡ＞
（１）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
（２）本アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
４．転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかと転写調節因子Ｓｉｍ２との転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡを含むプロモーターを機能可能な形で結合しているレポーター遺伝子のＤＮＡをさらに含有することを特徴とする前項２又は３記載の形質転換体；
５．物質が有する、前項１記載の転写活性化複合体が有する転写促進能力を調節する能力（以下、本調節能力と記すこともある。）の評価方法であって、
（１）前項４記載の形質転換体と被験物質とを接触させる第一工程、
（２）前記第一工程後に、前記形質転換体が有するレポーター遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、及び
（３）前記第二工程により測定された発現量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記物質の前記転写活性化複合体が有する転写促進能力を調節する能力を評価する第三工程；
を有することを特徴とする評価方法（以下、本発明評価方法と記すこともある。）；
６．前項５記載の評価方法により評価された調節能力に基づき、前記転写活性化複合体が有する転写促進能力を調節する能力を有する物質を選抜する工程、
を有することを特徴とする探索方法（以下、本発明探索方法と記すこともある。）；
７．前項６記載の探索方法により選抜された物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする治療剤（以下、本発明治療剤と記すこともある。）；
８．ダウン症改善剤であることを特徴とする前項７記載の治療剤；
９．下記の（１）および（２）のＤＮＡを含有する一種のベクター又は前記ＤＮＡを個別に有する複数種のベクターの、ダウン症改善剤としての使用；
＜ＤＮＡ＞
（１）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
（２）本アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
１０．下記の構成要素Ｉのうちのいずれか一方の構成要素（Ａ又はＢ）及び下記の構成要素ＩＩのうちのいずれか一方の構成要素（Ｘ又はＹ）を有する蛋白質と、下記の構成要素Ｉのうちの他方の構成要素（Ｂ又はＡ）及び下記の構成要素ＩＩのうちの他方の構成要素（Ｙ又はＸ）を有する蛋白質とが結合してなることを特徴とする転写活性化複合体（以下、本発明転写活性化複合体２と記すこともある。）、
＜構成要素Ｉ＞
（Ａ）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかに由来し、下記のいずれかのアミノ酸配列を有する転写調節因子が結合する領域、又は
（Ｂ）本アミノ酸配列を有する転写調節因子に由来し、転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかが結合する領域
＜構成要素ＩＩ＞
（Ｘ）宿主細胞内で機能可能な転写調節因子のＤＮＡ結合領域、又は
（Ｙ）宿主細胞内で機能可能な転写調節因子の転写活性化領域
１１．前記構成要素ＩＩの（Ｘ）が、下記のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡに結合するＤＮＡ結合領域であることを特徴とする前項１０記載の転写活性化複合体。
＜ＤＮＡ配列群＞
（１）Ｇａｌ４蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列、
（２）Ｌｅｘ蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列、
（３）Ｌａｃ Ｉ受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列、
（４）テトラサイクリン受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列
（５）ＺＦＨＤ−１蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列
（６）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかと転写調節因子Ｓｉｍ２との転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡの塩基配列；
１２．前記構成要素ＩＩの（Ｙ）が、下記のいずれかの蛋白質由来の転写活性化領域であることを特徴とする前項１０記載の転写活性化複合体、
＜蛋白質＞
（１）Ｇａｌ４蛋白質、
（２）Ｌｅｘ蛋白質、
（３）Ｌａｃ Ｉ受容体蛋白質、
（４）テトラサイクリン受容体蛋白質、
（５）ＺＦＨＤ−１蛋白質、
（６）Ｂ４２蛋白質
（７）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかの蛋白質、
（８）ＶＰ１６蛋白質
１３．前記両者の蛋白質がリガンドによる制御下において結合してなることを特徴とする前項１０記載の転写活性化複合体；
１４．前記構成要素Ｉの（Ｂ）が、前記リガンドが結合する領域を有することを特徴とする前項１３記載の転写活性化複合体；
１５．（１）下記の構成要素ｉのうちのいずれか一方の構成要素（ａ又はｂ）及び下記の構成要素ｉｉのうちのいずれか一方の構成要素（ｘ又はｙ）を含有するＤＮＡと、
（２）下記の構成要素ｉのうちの他方の構成要素（ｂ又はａ）及び下記の構成要素ｉｉのうちの他方の構成要素（ｙ又はｘ）を含有するＤＮＡと、
（３）下記の構成要素ｉｉｉを含有するＤＮＡと
が宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体２と記すこともある。）、
＜構成要素ｉ＞
（ａ）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかに由来し、本アミノ酸配列を有する転写調節因子が結合する領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、又は
（ｂ）下記のいずれかのアミノ酸配列を有する転写調節因子に由来し、転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかが結合する領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
＜構成要素ｉｉ＞
（ｘ）宿主細胞内で機能可能な転写調節因子のＤＮＡ結合領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、又は
（ｙ）宿主細胞内で機能可能な転写調節因子の転写活性化領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
＜構成要素ｉｉｉ＞
構成要素ｉｉの（ｘ）の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合領域が結合可能なＤＮＡ、および、構成要素ｉｉの（ｙ）の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有する転写活性化領域により活性化されうるプロモーターの下流に接続されたレポーター遺伝子のＤＮＡ；
１６．前記構成要素ｉｉの（ｘ）が、下記のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡに結合する蛋白質由来のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とする前項１５記載の形質転換体、
＜塩基配列群＞
（１）Ｇａｌ４蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列、
（２）Ｌｅｘ蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列、
（３）Ｌａｃ Ｉ受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列、
（４）テトラサイクリン受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列
（５）ＺＦＨＤ−１蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列
（６）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかと転写調節因子Ｓｉｍ２との転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡの塩基配列；
１７．前記構成要素ｉｉの（ｙ）が、下記のいずれかの蛋白質由来のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とする前項１５記載の形質転換体。
＜蛋白質＞
（１）Ｇａｌ４蛋白質、
（２）Ｌｅｘ蛋白質、
（３）Ｌａｃ Ｉ受容体蛋白質、
（４）テトラサイクリン受容体蛋白質、
（５）ＺＦＨＤ−１蛋白質、
（６）Ｂ４２蛋白質、
（７）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかの蛋白質、
（８）ＶＰ１６蛋白質；
１８．ツーハイブリッドアッセイのための、前項１０記載の転写活性化複合体の使用；
１９．ツーハイブリッドアッセイのための、前項１５記載の形質転換体の使用；
２０．物質が有する、前項１５記載の形質転換体が産生する転写活性化複合体の転写促進能力を調節する能力の評価方法であって、
（１）前項１５記載の形質転換体と被験物質とを接触させる第一工程、
（２）前記第一工程後に、前記形質転換体が有するレポーター遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、及び
（３）前記第二工程により測定された発現量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記物質の転写活性調節能力を評価する第三工程
を有することを特徴とする評価方法；
２１．前項２０記載の評価方法により評価された転写活性調節能力に基づき、前記転写活性化複合体が有する転写促進能力を調節する能力を有する物質を選抜する工程を有することを特徴とする探索方法；
２２．前項２１記載の探索方法により選抜された物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする治療剤；
２３．ダウン症改善剤であることを特徴とする前項２２記載の治療剤；
２４．（１）標識されたリガンドが結合している前項１記載の転写活性化複合体と被験物質とを接触させる工程、及び
（２）前記転写活性化複合体と前記被験物質との結合状態を、前記標識されたリガンドと当該被験物質との競合により生じる遊離型の標識されたリガンド又は結合型の標識されたリガンドの量又はその量に相関関係を有する指標値をモニターすることにより間接的に確認する工程
を有することを特徴とするレセプターバインディングアッセイ（以下、本発明バインディングアッセイと記すこともある。）；
等を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本アミノ酸配列を有する転写調節因子に関して、本アミノ酸配列において認められる、配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列との相違としては、アミノ酸の欠失、置換、修飾、付加等の変異をあげることができる。これらには、部位特異的変異導入法や突然変異処理等によって人為的に導入され得る変異に加えて、動物の系統、個体、器官、組織等の違いによるアミノ酸配列の相違などの天然に生ずる多型変異も含まれる。例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する転写調節因子（以下、ｈＮＸＦと記すこともある。）は、ヒト由来の本転写調節因子であり、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する転写調節因子（以下、ｍＮＸＦと記すこともある。）は、マウス由来の本転写調節因子であり、また、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する転写調節因子（以下、ｒＮＸＦと記すこともある。）は、ラット由来の本転写調節因子である。
【０００６】
本発明において「配列同一性」とは、２つの塩基配列又は２つのアミノ酸配列の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の全領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象の塩基配列又はアミノ酸配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を許容してもよい。このような配列同一性は、例えば、FASTA［Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA，4, 2444-2448(1988)］、BLAST［Altschulら、Journal of Molecular Biology, 215, 403-410(1990)］、CLUSTAL W［Thompson,Higgins＆Gibson, Nucleic Acid Research, 22, 4673-4680(1994a)］等のプログラムを用いて相同性解析を行いアラインメントを作成することによって算出することができる。上記のプログラムは、例えば、DNA Data Bank of Japan［国立遺伝学研究所 生命情報・ＤＤＢＪ研究センター (Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan ;CIB/DDBJ)内で運営される国際ＤＮＡデータバンク］のホームページ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）等において、一般的に利用可能である。また、配列同一性は、Vector NTI、GENETYX-WIN Ver.5（ソフトウェア開発株式会社製）等の市販の配列解析ソフトウェアを用いて求めることもできる。
本アミノ酸配列におけるアミノ酸同一性は、例えば、９０％以上であることが好ましい。
【０００７】
また、本アミノ酸配列に関して、「ストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡ」としては、例えば、高イオン濃度下[例えば、6XSSC（900mM塩化ナトリウム、90mMクエン酸ナトリウム）などが用いられる。]に、65℃の温度条件でハイブリダイズさせることによりDNA-DNAハイブリッドを形成し、低イオン濃度下[例えば、0.1 X SSC（15mM塩化ナトリウム、1.5mMクエン酸ナトリウム）などが用いられる。]に、65℃の温度条件で30分間洗浄した後でも該ハイブリッドが維持されうるＤＮＡをあげることができる。
【０００８】
本アミノ酸配列を有する転写調節因子の転写調節能は、例えば、下記のレポーター遺伝子を用いたアッセイ等に基づき評価することができる。
まず、本ＡＲＮＴ属転写共役因子と転写調節因子Ｓｉｍ２との転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡ（5'-ACGTG-3'、配列番号１６：以下、本応答性ＤＮＡと記すこともある。）を含む転写制御ＤＮＡの下流に連結されたレポーター遺伝子と被験転写調節因子のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子とが宿主細胞に導入されてなる形質転換体を作製し、次に前記形質転換体が有する前記レポーター遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定し、さらに測定された発現量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記被験転写調節因子が有する転写調節能を評価すればよい。
上記の転写調節能としては、本応答性ＤＮＡの下流に位置する遺伝子（上記のレポーター遺伝子を用いたアッセイの場合には、レポーター遺伝子を意味する。）の転写を促進する能力又は転写を抑制する能力等があげられる。
上記の評価方法におけるレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、成長ホルモン遺伝子などを利用することができ、宿主細胞における安定性が比較的高いレポーター蛋白質をコードする遺伝子が好ましい。
【０００９】
まず、本応答性ＤＮＡを含む転写制御ＤＮＡの下流に連結されたレポーター遺伝子と被験転写調節因子のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、被験転写調節因子の遺伝子と記すこともある。）とを、宿主細胞（例えば、HeLa細胞、CV-1細胞、Hepa1細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、COS1細胞、BF-2細胞、CHH-1細胞等）に導入することによって形質転換体を作製する。ここで、被験転写調節因子の遺伝子は、例えば、後述のように、宿主細胞で機能可能なプロモーターと機能可能な形で結合されて基本ベクターに組み込まれた形で宿主細胞へ導入するとよい。本応答性ＤＮＡを含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子も、基本ベクターに組み込まれた形で用いるとよい。また例えば、本応答性ＤＮＡを含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子が組み込まれたベクターと、宿主細胞で機能可能なプロモーターと機能可能な形で結合された被験転写調節因子の遺伝子を保有するベクターとを、マーカー遺伝子を有するベクターとともに宿主細胞に導入する。次いで当該細胞を通常数週間培養した後、導入されたマーカー遺伝子の発現量に基づき目的とする形質転換体を選抜することにより、本応答性ＤＮＡを含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子及び宿主細胞で機能可能なプロモーターと機能可能な形で結合された被験転写調節因子の遺伝子が、宿主細胞に導入されてなる形質転換体を取得することができる。
ここで「宿主細胞で機能可能なプロモーター」としては、例えば、宿主細胞が出芽酵母細胞である場合には、GAL1プロモーターのような誘導型プロモーターや、ADHプロモーターのような恒常的に発現するプロモーター等を使用することができる。宿主細胞が動物細胞である場合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター等をあげることができる。また、転写制御領域としては、例えば、宿主細胞で機能可能な最小プロモーターである、宿主細胞で発現可能な遺伝子由来の最小TATAボックス配列からなるＤＮＡをあげることができ、具体的には、TATAボックス及び転写開始点近傍の約５０塩基程度からなる塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。
【００１０】
上述のように作製された形質転換体を、例えば、数時間から数日間培養した後、当該形質転換体が有する前記レポーター遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する。具体的には、レポーター遺伝子が発現すると、当該レポーター遺伝子にコードされるレポーター蛋白質が前記形質転換体の細胞内等に蓄積されるかもしくは培地中に分泌される。このレポーター蛋白質の量又はその量と相関関係を有する指標値を測定することにより、当該形質転換体の細胞あたりのレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値を測定する。具体的には、例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いた場合には、前記形質転換体から調製された細胞粗抽出物にルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを加えると、当該細胞粗抽出物中のルシフェラーゼ量に比例した強度で発光する。従って、この発光強度をルミノメーター等の測定装置で測定することにより、ルシフェラーゼ量、ひいては、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を知ることができる。同様にして、本応答性ＤＮＡを含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子を含むが、被験転写調節因子の遺伝子を含まない形質転換体（即ち、対照形質転換体）におけるレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値を測定し、当該測定値と上記のレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値とを比較することにより、被験転写因子の遺伝子が有する転写調節能を評価することができる。
【００１１】
本アミノ酸配列を有する転写調節因子（即ち、本転写調節因子）をコードするＤＮＡ（以下、本転写調節因子ＤＮＡと記すこともある。）は、例えば、ヒト、マウス、ラットなどの動物の組織から、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラー クローニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory発行、1989年）等に記載の遺伝子工学的方法に準じて取得することができる。
具体的には、まず、ヒト、マウス、ラットなどの動物の組織由来の全RNAを調製する。例えば、脳の組織を塩酸グアニジンやグアニジンチオシアネート等の蛋白質変性剤を含む溶液中で粉砕し、さらに該粉砕物にフェノール、クロロホルム等を加えることにより蛋白質を変性させる。変性蛋白質を遠心分離等により除去した後、回収された上清画分から塩酸グアニジン／フェノール法、SDS−フェノール法、グアニジンチオシアネート／CsCl法等の方法により全RNAを抽出する。なお、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、例えばISOGEN（ニッポンジーン製）がある。得られた全RNAを鋳型としてオリゴdTプライマーをRNAのポリA配列にアニールさせ、逆転写酵素により一本鎖cDNAを合成する。次いで、合成された一本鎖cDNAを鋳型とし、かつ大腸菌RNaseHを用いてRNA鎖にニックとギャップを入れることにより得られるRNAをプライマーとして大腸菌のDNAポリメラーゼＩを用いて二本鎖のcDNAを合成する。更に、合成された二本鎖cDNAの両末端をT4 DNAポリメラーゼにより平滑化する。末端が平滑化された二本鎖cDNAは、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿等の通常の方法により精製、回収する。なお、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、例えばcDNA合成システムプラス（アマシャムファルマシアバイオテク社製）やTimeSaver cDNA合成キット（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等があげられる。次に、得られた二本鎖cDNAを例えば、プラスミドpUC118やファージλgt10などのベクターとリガーゼを用いて連結することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。尚、ｃＤＮＡライブラリーとしては、市販のｃＤＮＡライブラリー（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製やＣｌｏｎｔｅｃｈ社製等）を用いることも可能である。
また、ヒト、マウス、ラットなどの動物の組織片から、例えば、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラー クローニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory発行、1989年）や、村松正寶、”ラボマニュアル遺伝子工学”（丸善１９８８）等に記載される通常の方法に準じてゲノムＤＮＡを調製する。例えば試料が毛髪の場合には、毛髪２〜３本を滅菌水、次いでエタノールで洗浄した後、2〜3 mmの長さに切断し、これにBCL-Buffer［10mM Tris-HCl(pH7.5), 5 mM MgCl2, 0.32M Sucrose, 1 Triton X-100］200μｌを加え、さらにProteinaseKを最終濃度100μｌ/ml 、ＳＤＳを最終濃度0.5 （w/v）になるようにそれぞれ加え混合する。この混合物を70℃で1時間保温した後、フェノール／クロロホルム抽出を行うことによりゲノムＤＮＡを得ることができる。また、試料が末梢血の場合は、DNA-Extraction kit(Stratagene社製)等を用いて該試料を処理することによりゲノムＤＮＡを得ることができる。得られたゲノムＤＮＡをλgt10などのベクターとリガーゼを用いて連結することによりゲノムＤＮＡライブラリーが得られる。尚、ゲノムＤＮＡライブラリーとしては、市販のゲノムＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製等）を用いることも可能である。
【００１２】
上記のようなcDNAライブラリーやゲノムＤＮＡライブラリーから、例えば、配列番号４、５、６又は５９（もしくは６０）のいずれかで示される塩基配列の部分塩基配列又は該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲと記す。）や、配列番号４、５、６又は５９（もしくは６０）のいずれかで示される塩基配列又は該塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により、本転写調節因子ＤＮＡを取得することができる。
ＰＣＲに用いられるプライマーとしては、例えば、約10塩基から約50塩基程度の長さのオリゴヌクレオチドであって、配列番号４、５、６又は５９（もしくは６０）のいずれかで示される塩基配列の５’非翻訳領域から選択した塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び、配列番号４、５、６又は５９（もしくは６０）のいずれかで示される塩基配列の３’非翻訳領域から選択した塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。具体的には、フォワードプライマーとしては、例えば、配列番号７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドや配列番号８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをあげることができる。また、リバースプライマーとしては、例えば、配列番号９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドや配列番号１０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをあげることができる。PCRの条件としては、例えば、反応液50μl中に、LA-Taqポリメラーゼ用10倍濃緩衝液（宝酒造社製）5μl、2.5mM dNTP混合液（各2.5mMのdATP,dGTP,dCTP及びdTTPを含む。）５μl（dATP,dGTP,dCTP及びdTTP各々の終濃度が0.25mM）、20μMプライマー 各0.25〜1.25μl（終濃度が0.1〜0.5μM）、鋳型cDNA 0.1〜0.5μg、LA-Taqポリメラーゼ（宝酒造社製）1.25ユニットを含む組成の反応液にて、95℃で1分間次いで68℃で3分間の保温を1サイクルとしてこれを35サイクル行う等の条件が挙げられる。
【００１３】
ハイブリダイゼーション法に用いられるプローブとしては、例えば、配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号５９で示される塩基配列の塩基番号１４１９〜６１６４で表される塩基配列からなるＤＮＡ、又はこれらＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ等があげられる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、6×SSC（0.9M塩化ナトリウム、0.09Mクエン酸ナトリウム）、5×デンハルト溶液（0.1(w/v)フィコール400、0.1(w/v)ポリビニルピロリドン、0.1(w/v)BSA）、0.5(w/v)SDS及び100μg/ml変性サケ精子DNA存在下に、65℃で保温し、次いで１×SSC（0.15M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリウム）及び0.5(w/v)SDS存在下に、室温で15分間の保温を2回行い、さらに0.1×SSC（0.015M 塩化ナトリウム、0.0015Mクエン酸ナトリウム）及び0.5(w/v)SDS存在下に、68℃で30分間保温する条件等をあげることができる。また、例えば、5xSSC、50mM HEPES pH7.0、10xデンハルト溶液及び20μg/ml変性サケ精子DNA存在下に65℃にて保温し、次いで2xSSC中で室温にて３０分間の保温を行い、さらに0.1xSSC中で６５℃にて４０分間の保温を２回行う条件をあげることもできる。
尚、本転写調節因子ＤＮＡは、例えば配列番号４、５、６又は５９（もしくは６０）のいずれかで示される塩基配列に基づいて、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller,M.et al.,Nature,310,105,1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製することもできる。
【００１４】
このようにして得られた本転写調節因子ＤＮＡは、例えば、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラー クローニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング ハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、1989年等に記載の遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングすることができる。具体的には例えば、TAクローニングキット（Invitrogen社）やpBluescriptII（Stratagene社）などの市販のプラスミドベクターを用いてクローニングすることができる。
得られた本転写調節因子ＤＮＡの塩基配列は、Maxam Gilbert法 (例えば、Maxam,A.M & W.Gilbert,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,560,1977等に記載される)やSanger法（例えばSanger,F. & A.R.Coulson,J.Mol.Biol.,94,441,1975、Sanger,F,& Nicklen and A.R.Coulson.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463,1977等に記載される）等により確認することができる。
本転写調節因子ＤＮＡの具体例としては、配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜２４５６で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列、配列番号５９で示される塩基配列の塩基番号１４１９〜６１６４で表される塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。
【００１５】
本転写調節因子ＤＮＡを、当該遺伝子が導入される宿主細胞において利用可能なベクター（以下、基本ベクターと記す。）、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖でき、宿主細胞からの単離、精製が可能であり、検出可能なマーカーをもつベクターに、通常の遺伝子工学的手法に準じて組み込むことにより本転写調節因子ＤＮＡベクターを構築することができる。
本転写調節因子ＤＮＡベクターの構築に用いることができる基本ベクターとしては、具体的には大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えば、プラスミドpUC119(宝酒造社製)やファージミドpBluescriptII(Stratagene社製)等をあげることができる。出芽酵母を宿主細胞とする場合には、プラスミドpGBT9、pGAD424、pACT2(Clontech社製)等をあげることができる。また、哺乳類動物細胞を宿主細胞とする場合には、pRc/RSV、pRc/CMV(Invitrogen社製)等のプラスミド、ウシパピローマウイルスプラスミドpBPV(アマシャムファルマシアバイオテク社製)もしくはEBウイルスプラスミドpCEP4(Invitrogen社製)等のウイルス由来の自律複製起点を含むベクター、ワクシニアウイルス等のウイルス等をあげることができる。さらに、昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合には、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスをあげることができる。自律複製起点を含むベクター、例えば、上記の酵母用プラスミドpACT2や、ウシパピローマウイルスプラスミドpBPV、EBウイルスプラスミドpCEP4等を用いて本転写調節因子ＤＮＡベクターを構築すると、当該ベクターは宿主細胞に導入された際にエピソームとして細胞内に保持される。
バキュロウイルスやワクシニアウイルス等のウイルスに本転写調節因子ＤＮＡを組み込むには、使用しようとするウイルスのゲノムと相同な塩基配列を含有するトランスファーベクターを用いればよい。このようなトランスファーベクターとしては、例えば、Pharmingen社から市販されているpVL1392,pVL1393(Smith,G.E.,Summers M.D.et al.:Mol.Cell.Biol.,3,2156-2165(1983))、pSFB5(Funahashi,S.et al.:J.Virol.,65,5584-5588(1991))等のプラスミドをあげることができる。本転写調節因子ＤＮＡを前記のようなトランスファーベクターに挿入し、当該トランスファーベクターとウイルスのゲノムとを同時に宿主細胞に導入すると、トランスファーベクターとウイルスのゲノムとの間で相同組換えが起こり、本転写調節因子ＤＮＡがゲノム上に組み込まれたウイルスを得ることができる。ウイルスのゲノムとしては、Baculovirus,Adenovirus,Vacciniavirusなどのゲノムを用いることができる。
より具体的には、例えば、バキュロウイルスに本転写調節因子ＤＮＡを組み込む場合には、まずトランスファーベクターpVL1393,pVL1392等のマルチクローニング部位に本転写調節因子ＤＮＡを挿入した後、該トランスファーベクターのDNAとBaculovirus genome DNA(Baculogold;Pharmingen社製)とを昆虫細胞Sf21株（ATCCから入手可能）にリン酸カルシウム法等によって導入することにより、得られる細胞を培養する。次いで培養液から遠心分離等により、本転写調節因子ＤＮＡが挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイルス粒子を回収し、回収されたウィルス粒子をフェノール等で除蛋白処理することにより、本転写調節因子ＤＮＡを含有するウイルスのゲノムを得ることができる。さらに、得られたウイルスのゲノムを、昆虫細胞Sf21株等のウイルス粒子形成能力を有する宿主細胞にリン酸カルシウム法等によって導入することにより、得られる細胞を培養する。このようにして本転写調節因子ＤＮＡを含有するウイルス粒子を増やすことができる。
一方、マウス白血病レトロウイルス等の比較的小さなゲノムに本転写調節因子ＤＮＡを組み込むには、トランスファーベクターを利用せずに、本転写調節因子ＤＮＡを直接組み込むこともできる。例えば、ウイルスベクタ-DC(X)（Eli Gilboa et al.,BioTechniques,4,504-512(1986)）等は、当該ベクター上のクローニング部位に本転写調節因子ＤＮＡを組み込む。得られた本転写調節因子ＤＮＡの組み込れたウイルスベクターを、例えば、Ampli-GPE（J.Virol.,66,3755(1992)）等のパッケージング細胞に導入することにより、本転写調節因子ＤＮＡの挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイルス粒子を得ることができる。
【００１６】
本転写調節因子ＤＮＡの上流に、宿主細胞で機能可能なプロモーターを機能可能な形で結合させ、これを上述のような基本ベクターに組み込むことにより、本転写調節因子ＤＮＡを宿主細胞で発現させることの可能な本転写調節因子ＤＮＡベクターを構築することができる。ここで、「機能可能な形で結合させる」とは、本転写調節因子ＤＮＡが導入される宿主細胞において、プロモーターの制御下に本転写調節因子ＤＮＡが発現されるように、当該プロモーターと本転写調節因子ＤＮＡとを結合させることを意味する。宿主細胞で機能可能なプロモーターとしては、導入される宿主細胞内でプロモーター活性を示すＤＮＡをあげることができる。例えば、宿主細胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター（lacP）、トリプトファンオペロンのプロモーター(trpP)、アルギニンオペロンのプロモーター(argP)、ガラクトースオペロンのプロモーター(galP)、tacプロモーター、T7プロモーター、T3プロモーター、λファージのプロモーター(λ-pL、λ-pR)等をあげることができ、宿主細胞が動物細胞や分裂酵母である場合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、シミアンウイルス(SV40)の初期又は後期プロモーター、マウス乳頭腫ウイルス(MMTV)プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞が出芽酵母である場合には、ADH1プロモーター等あげることができる。また、宿主細胞において機能するプロモーターをあらかじめ保有する基本ベクターを使用する場合には、前記プロモーターと本転写調節因子ＤＮＡとが機能可能な形で結合するように、前記プロモーターの下流に本転写調節因子ＤＮＡを挿入すればよい。例えば、前述のプラスミドpRc/RSV、pRc/CMV等には、動物細胞で機能可能なプロモーターの下流にクローニング部位が設けられている。当該クローニング部位に本転写調節因子ＤＮＡを挿入することによって得られるベクターを動物細胞へ導入することにより、当該動物細胞において本転写調節因子ＤＮＡを発現させることができる。これらのプラスミドにはあらかじめSV40の自律複製起点（ori）が組み込まれているため、oriを欠失したSV40ゲノムで形質転換された培養細胞、例えば、COS細胞等に当該プラスミドを導入すると、細胞内でプラスミドのコピー数が非常に増大し、結果として当該プラスミドに組み込まれた本転写調節因子ＤＮＡを大量発現させることもできる。また前述の酵母用プラスミドpACT2はADH1プロモーターを有しており、当該プラスミド又はその誘導体のADH1プロモーターの下流に本転写調節因子ＤＮＡを挿入すれば、本転写調節因子ＤＮＡを、例えば、CG1945(Clontech社製)等の出芽酵母内で大量発現させることが可能な本転写調節因子ＤＮＡベクターが構築できる。
【００１７】
本発明転写活性化複合体を構成するもう一方の蛋白質、即ち、転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれか（以下、本ＡＲＮＴ属転写共役因子と記すこともある。）とは、ＡＲＮＴ１、ＡＲＮＴ２又はＡＲＮＴ３（ＢＭＡＬ１と呼ばれることもある。）のいずれかのＡＲＮＴファミリー属転写共役因子である。これら転写共役因子は、相互比較において高い配列同一性を有する転写共役因子である。このような転写共役因子は、転写調節因子Ｓｉｍ２と転写抑制化複合体を形成することにより、配列番号１６（5'-ACGTG-3'）で示されるＤＮＡに結合する能力を有し、前記ＤＮＡの下流に位置する遺伝子の転写を抑制する能力を有する。これらの転写共役因子のうち、ＡＲＮＴ１又はＡＲＮＴ２を好ましいものとしてあげることができる。
【００１８】
転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ（以下、本ＡＲＮＴ属転写共役因子ＤＮＡと記すこともある。）の調製方法としては、データベースに公開されているヒト由来のＡＲＮＴ１（accession no. NM_001668）、ヒト由来のＡＲＮＴ２（accession no. AB002305）、ヒト由来のＡＲＮＴ３（accession no. D89722）等をコードする塩基配列に基づき、その５’非翻訳領域の部分塩基配列を有するLong PCR用のプライマーと３’非翻訳領域の部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するLong PCR用のプライマーとを設計し、これらプライマーにより挟まれる遺伝子の領域、即ち、本ＡＲＮＴ属転写共役因子をコードする翻訳領域の全長を有するＤＮＡ、をヒト脳ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲで増幅することにより得る方法等をあげることができる。
本ＡＲＮＴ属転写共役因子ＤＮＡを有するベクターを作製するには、上記の本転写調節因子ＤＮＡベクターの作製方法において本転写調節因子ＤＮＡの代わりに本ＡＲＮＴ属転写共役因子ＤＮＡを用いること以外は基本的に同様な方法に準じて作製すればよい。
【００１９】
（１）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ（即ち、本ＡＲＮＴ属転写共役因子ＤＮＡ）、及び、（２）本アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ（即ち、本転写調節因子ＤＮＡ）、の両ＤＮＡを含有する一種のベクターの作製方法としては、例えば、同じプラスミドに２つの遺伝子を組み込み同時に発現させる目的の発現ベクター［ｐＢＩベクター（Clontech社製）等］に、転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと本アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡとの両者を組み込む方法をあげることができる。また、上記２種のＤＮＡを個別に含有する複数種のベクターの作製方法としては、例えば、ｐＲＣ／ＲＳＶベクター（Invitrogen社製）等の通常の発現ベクターに、転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと本アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡとを別々に組み込む方法があげられる。
上記の両ＤＮＡを含有する一種のベクター又は前記ＤＮＡを個別に有する複数種のベクターをダウン症改善剤として使用することもできる。
【００２０】
本発明転写活性化複合体は、本発明形質転換体を培養し、産生された（１）本発明転写活性化複合体、あるいは、（２）本ＡＲＮＴ属転写共役因子及び本転写活性化因子、を培養物から回収することにより取得することができる。また、本発明転写活性化複合体を発現する形質転換体の形態で本発明転写活性化複合体を利用することもできる。
本発明転写活性化複合体は、本発明転写活性化複合体を産生する能力を有する一つ又は複数からなるベクターを宿主細胞に導入することにより作製することができる。具体的には、（１）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、及び、（２）本アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、の両ＤＮＡを含有する一種のベクター又は前記ＤＮＡを個別に有する複数種のベクターを宿主細胞に導入して作製すればよい。
本ベクターを宿主細胞へ導入する方法としては、宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用することができる。例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合には、J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著；「 モレキュラー・クローニング 第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory発行、1989年）等に記載される塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法等の通常の方法を用いることができる。また、哺乳類動物細胞又は昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法又はリポフェクション法等の一般的な遺伝子導入法に準じて前記細胞に導入することができる。酵母を宿主細胞とする場合には、例えば、リチウム法を基にしたYeast transformation kit(Clontech社製)などを用いて導入することができる。
尚、ウイルスをベクターとして用いる場合には、上述のように一般的な遺伝子導入法によりウイルスのゲノムを宿主細胞に導入できるほか、前記両ＤＮＡの挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイルス粒子を、宿主細胞へ感染させることによっても、当該ウイルスのゲノムを宿主細胞に導入することができる。
【００２１】
本発明形質転換体を選抜するには、例えば、本ベクターと同時にマーカー遺伝子が導入された宿主細胞を、マーカー遺伝子の性質に応じた方法によって培養すればよい。例えば、マーカー遺伝子が、宿主細胞に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する遺伝子である場合には、当該選抜薬剤が添加された培地を用いて、本ベクターが導入された宿主細胞を培養すればよい。薬剤耐性を付与する遺伝子と選抜薬剤との組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイシンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子とブラストサイジンＳとの組み合わせ等をあげることができる。また、マーカー遺伝子が宿主細胞の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、当該栄養要求性に対応する栄養素を含まない最少培地を用いて、本ベクターが導入された細胞を培養すればよい。また前記両ＤＮＡを宿主細胞で発現させることが可能な本ベクターを導入した場合には、ＤＮＡ結合活性に基づく検出方法を用いることもできる。
前記両ＤＮＡが宿主細胞の染色体内に位置する本発明形質転換体を取得するには、例えば、まず本ベクターとマーカー遺伝子を有するベクターとを制限酵素等で消化することにより直鎖状にした後、これらを前述の方法で宿主細胞に導入する。次いで当該細胞を通常数週間培養した後、導入されたマーカー遺伝子の発現量に基づき目的とする形質転換体を選抜し取得すればよい。また、例えば、上記のような選抜薬剤を付与する遺伝子をマーカー遺伝子として有する本ベクターを前述の方法によって宿主細胞に導入する。次いで当該細胞を選抜薬剤が添加された培地で数週間以上継代培養した後、コロニー状に生き残った選抜薬剤耐性クローンを純化培養することにより、前記両ＤＮＡが宿主細胞の染色体に導入されてなる本発明形質転換体を選抜し取得することもできる。導入されたＤＮＡが宿主細胞の染色体に組み込まれたことを確認するには、当該細胞のゲノムＤＮＡを通常の遺伝子工学的方法に準じて調製し、調製されたゲノムＤＮＡから、導入された前記両ＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡをプライマーやプローブとしたＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション等の方法を利用して、前記両ＤＮＡの存在を検出すればよい。当該形質転換体は、凍結保存が可能であり必要に応じて起眠して使用することができるので、実験毎の形質転換体作製の手間を省くことができ、また、あらかじめ性質や取扱い条件の確認された形質転換体を用いて試験を実施することが可能となる。
【００２２】
上述のようにして得られた本発明形質転換体を培養し、産生された（１）本発明転写活性化複合体、あるいは、（２）本ＡＲＮＴ属転写共役因子及び本転写活性化因子、を培養物から回収することにより本発明転写活性化複合体を製造することができる。
例えば、本発明形質転換体が微生物である場合には、当該形質転換体は、一般微生物における通常の培養に使用される炭素源や窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養することができる。培養は、一般微生物における通常の方法に準じて行い、固体培養、液体培養（旋回式振とう培養、往復式振とう培養、ジャーファーメンター（JarFermenter）培養、タンク培養等）等が可能である。培養温度及び培地のｐＨは、微生物が生育する範囲から適宜選ぶことができ、例えば、約15℃〜約40℃の培養温度にて、ｐＨが約６〜約８の培地で培養するのが一般的である。培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通常約１日間〜約5日間である。温度シフト型やIPTG誘導型等の誘導型のプロモーターを有する発現ベクターを用いた場合には、誘導時間は1日間以内が好ましく、通常数時間である。
また、上記形質転換体が哺乳類、昆虫類等の動物細胞である場合には、当該形質転換体は一般の培養細胞における通常の培養に使用される培地を用いて培養することができる。選抜薬剤を利用して当該形質転換体を作製した場合には、当該選抜薬剤の存在下に培養することが好ましい。哺乳類動物細胞の場合には、例えば、終濃度が10％となるようFBSが添加されたDMEM培地（ニッスイ社製等）を用いて37℃、5％CO2存在下等の条件で数日毎に新しい培養液に交換しながら培養すればよい。細胞がコンフルエントになるまで増殖したら、例えば、0.25％(w/v)程度となるようトリプシンが添加されたPBS溶液を加えて個々の細胞に分散させ、数倍に希釈して新しいシャーレに播種し培養を続ける。昆虫類動物細胞の場合も同様に、例えば、10％(v/v)FBS及び2％(w/v)Yeastlateを含むGrace's medium等の昆虫細胞用培養液を用いて培養温度25℃から35℃で培養すればよい。この際、Sf21細胞等のシャーレからはがれやすい細胞の場合には、トリプシン液を用いずピペッテイングにより分散させ継代培養を行なうことができる。また、バキュロウイルス等のウイルスベクターを含む形質転換体の場合には、培養時間は細胞質効果が現れて細胞が死滅する前、例えば、ウイルス感染後72時間までとすることが好ましい。
【００２３】
培養物から、本発明形質転換体により産生された（１）本発明転写活性化複合体、あるいは、（２）本ＡＲＮＴ属転写共役因子及び本転写活性化因子、を回収するには、適宜、通常の単離、精製の方法を組み合わせて行えばよい。例えば、まず培養終了後、形質転換体の細胞を遠心分離等で集め、集められた細胞を通常のバッファー、例えば、20mM HEPES pH7,1mM EDTA,1mM DTT,0.5mM PMSFからなるバッファーに懸濁した後、ポリトロン、超音波処理、ダウンスホモジナイザー等で破砕する。得られた破砕液を数万xgで数十分間から1時間程度超遠心分離し、上清画分を回収することにより、（１）本発明転写活性化複合体、あるいは、（２）本ＡＲＮＴ属転写共役因子及び本転写活性化因子、を含む画分を得ることができる。さらに、前記上清画分をイオン交換、疎水、ゲルろ過、アフィニティ等の各種クロマトグラフィーに供することにより、より精製された（１）本発明転写活性化複合体、あるいは、（２）本ＡＲＮＴ属転写共役因子及び本転写活性化因子、を回収することもできる。この際、本応答性ＤＮＡを含む約15bpから約200bp程度の長さのオリゴヌクレオチドをプローブとしたDNA結合アッセイ等により、本発明転写活性化複合体等を含む画分を見分けることもできる。
このようにして製造された本発明転写活性化複合体は、例えば、被験物質の当該転写活性化複合体に対する結合能力・結合量を評価するためのレセプターバインディングアッセイ等に用いることができる。
【００２４】
本発明バインディングアッセイは、本発明転写活性化複合体に対する化学物質の結合能力の測定や結合量の定量のほか結合特異性、結合力の分析などが可能な試験方法である。例えば、前記のようにして本発明形質転換体２から回収された本発明転写活性化複合体に、標識されたリガンド（以下、標識リガンドと記す。）が予め結合しているところへ、被験物質を共存させると、被験物質と標識リガンドとの競合から、両者の本発明転写活性化複合体への親和性に応じて、標識リガンドが本発明転写活性化複合体から遊離し、本発明転写活性化複合体に結合した標識リガンドの量が減少し、よって本発明転写活性化複合体に結合した標識量が減少する。従って、遊離型の標識リガンドの標識量又は結合型の標識リガンドの標識量をモニターすることにより、本発明転写活性化複合体と前記被験物質との結合状態を間接的に確認することができ、例えば、本発明転写活性化複合体に対する被験物質の結合能力の測定等が可能となる。
標識リガンドの結合型／遊離型の分離は、ヒドロキシアパタイト法やグリセロール密度勾配超遠心法等で行うことができる。反応系は大きく3群に分けられる。第一の群は、本発明転写活性化複合体に標識リガンドが結合しているところへ溶媒のみが添加される系であり、被験物質の添加濃度がゼロである系に相当する。当該系における結合型の標識リガンドの標識量は、標識リガンドの本発明転写活性化複合体に対する総結合量を示す。第二の群は、本発明転写活性化複合体に標識リガンドが結合しているところへ、例えば、標識されていないリガンドが、本発明転写活性化複合体を十分飽和し標識リガンドが結合できなくなるだけの添加濃度（例えば10μＭ）となるよう添加された系であり、当該系における結合型の標識リガンドの標識量は、標識リガンドの本発明転写活性化複合体に対する非特異的結合量と判断される。従って、本発明転写活性化複合体への標識リガンドの特異的結合量は、総結合量から非特異的結合量を引いた値となる。第三の群は、本発明転写活性化複合体に標識リガンドが結合しているところへ、被験物質が、例えば、最終添加濃度10μＭ（この濃度は目的により任意に変更する。）となるよう添加された系である。被験物質が本発明転写活性化複合体への結合能力を有する場合には、この系から得られる結合型の標識リガンドの標識量は、上記のようにして求めた被験物質の添加濃度がゼロの時の本発明転写活性化複合体への標識リガンドの特異的結合量より小さくなる。このようにして本発明転写活性化複合体と前記被験物質との結合状態を間接的に確認する。本発明バインディングアッセイを行うことにより、本発明転写活性化複合体に対する被験物質の結合能力を調べることができ、被験物質が複数の物質を含む場合にはその中に本発明転写活性化複合体に親和性を示す物質が存在するかどうかを調べることもできる。さらに、本発明転写活性化複合体に対する被験物質の結合能力をより詳細に評価するには、例えば、前記の第三の群における被験物質の添加濃度を変えて同様に本発明バインディングアッセイを行えばよい。例えば、結合型の標識リガンドの標識量を測定し、得られた測定値に基づき、結合型のリガンド量と遊離型のリガンド量とを算出した後、得られた結果を、例えば、スキャッチャード解析することにより、被験物質と本発明転写活性化複合体との結合親和性、結合特異性、結合容量等を評価することができる。
【００２５】
本発明形質転換体は、本ベクターのほかに、本発明転写活性化複合体により活性化されうるプロモーターを機能可能な形で結合しているレポーター遺伝子のＤＮＡをも含有していてもよい。
このような形質転換体は、物質が有する、本発明転写活性化複合体が有する転写促進能力を調節する能力（即ち、本調節能力）の評価方法等に利用することができる。例えば、物質が有する本調節能力の評価方法であって、
（１）上記の形質転換体と被験物質とを接触させる第一工程、
（２）前記第一工程後に、前記形質転換体が有するレポーター遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、及び
（３）前記第二工程により測定された発現量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記物質の前記転写活性化複合体が有する転写促進能力を調節する能力を評価する第三工程；
を有することを特徴とする評価方法（即ち、本発明評価方法）をあげることができる。
さらに当該評価方法により評価された調節能力に基づき前記転写活性化複合体が有する転写促進能力を調節する能力を有する物質を選抜する工程を有することを特徴とする探索方法（即ち、本発明探索方法）、当該探索方法により選抜された物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする、例えば、ダウン症改善剤等の治療剤（即ち、本発明治療剤）等にも応用することができる。
【００２６】
本発明探索方法により選抜される物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする治療剤（即ち、本発明治療剤）は、その有効量を経口的または非経口的にヒト等の哺乳動物に対し投与することができる。例えば、経口的に投与する場合には、本発明治療剤は錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の通常の形態で使用することができる。また、非経口的に投与する場合には、本発明治療剤を溶液、乳剤、懸濁液等の通常の液剤の形態で使用することができる。前記形態の本発明治療剤を非経口的に投与する方法としては、例えば注射する方法、坐剤の形で直腸に投与する方法等を挙げることができる。
前記の適当な投与剤型は許容される通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤、希釈剤等に本発明探索方法により選抜される物質またはその薬学的に許容される塩を配合することにより製造することができる。また注射剤型で用いる場合には、許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明治療剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常は経口の場合には成人で１日あたり有効成分量として約１ｍｇ〜約２ｇ、好ましくは有効成分量として約５ｍｇ〜約１ｇを投与すればよく、注射の場合には成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
【００２７】
本発明では、本発明転写活性化複合体が有する転写促進能力を発揮するために必要となる領域を用いたツーハイブリッドアッセイのための転写活性化複合体や形質転換体等をも提供している。即ち、本発明は、（１）ツーハイブリッドアッセイのための、本発明転写活性化複合体２の使用に関する発明、（２）ツーハイブリッドアッセイのための、本発明形質転換体２の使用に関する発明を含んでいる。ここで、ツーハイブリッドアッセイのためのシステムを調製するには、市販のキット、例えば、Matchmaker Two-hybrid System（Clontech社製）、CheckMate Mammalian Two-Hybrid System（Promega）等を利用すればよい。
本発明転写活性化複合体２は、下記の構成要素Ｉのうちのいずれか一方の構成要素（Ａ又はＢ）及び下記の構成要素ＩＩのうちのいずれか一方の構成要素（Ｘ又はＹ）を有する蛋白質と、下記の構成要素Ｉのうちの他方の構成要素（Ｂ又はＡ）及び下記の構成要素ＩＩのうちの他方の構成要素（Ｙ又はＸ）を有する蛋白質とが結合してなる複合体である。ここで、例えば、当該両者の蛋白質がリガンドによる制御下において結合してなる複合体であってもよい。
＜構成要素Ｉ＞
（Ａ）本ＡＲＮＴ属転写共役因子に由来し、本アミノ酸配列を有する転写調節因子が結合する領域、又は
（Ｂ）本アミノ酸配列を有する転写調節因子に由来し、本ＡＲＮＴ属転写共役因子が結合する領域
＜構成要素ＩＩ＞
（Ｘ）宿主細胞内で機能可能な転写調節因子のＤＮＡ結合領域、又は
（Ｙ）宿主細胞内で機能可能な転写調節因子の転写活性化領域
当該発明において、構成要素Ｉの（Ａ）を有する転写共役因子は、本アミノ酸配列を有する転写調節因子とリガンドとの複合体を認識してこれに結合可能な転写共役因子であって、本ＡＲＮＴ属転写共役因子である。
一方、構成要素Ｉの（Ｂ）を有する転写調節因子は、本アミノ酸配列を有する転写調節因子である。尚、当該転写調節因子は、リガンドが結合する領域を有している。このような領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡとしては、当該転写調節因子の部分塩基配列であり、例えば、配列番号４で示される塩基配列のうち、塩基番号１３２〜２５０７で示される塩基配列を含む塩基配列等をあげることができる。
構成要素ＩＩの（Ｘ）を有する転写調節因子としては、例えば、Ｇａｌ４蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（5'-CGGAGGACTGTCCTCCG-3'、配列番号１１）、Ｌｅｘ蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（5'-TACTGTATGTACATACAGTA-3'、配列番号１２）、Ｌａｃ Ｉ受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（5'-GAATTGTGAGCGCGCACAATTC-3'、配列番号１３）、テトラサイクリン受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（5'-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3'、配列番号１４）、ＺＦＨＤ−１蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（5'-TAATGATGGGCG-3'、配列番号１５）、転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかと転写調節因子Ｓｉｍ２との転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡの塩基配列（5'-ACGTG-3'、配列番号１６）等のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡに結合する転写調節因子であって、かつ宿主細胞内で機能可能な転写調節因子をあげることができる。一方、構成要素ＩＩの（Ｙ）を有する転写調節因子としては、例えば、Ｇａｌ４蛋白質、Ｌｅｘ蛋白質、Ｌａｃ Ｉ受容体蛋白質、テトラサイクリン受容体蛋白質、ＺＦＨＤ−１蛋白質、Ｂ４２蛋白質、本ＡＲＮＴ属転写共役因子である蛋白質、ＶＰ１６蛋白質等の宿主細胞内で機能可能な転写調節因子をあげることができる。
【００２８】
このような各構成要素からなる転写活性化複合体は、例えば、本発明形質転換体２等により産生される。
本発明形質転換体２に関して、構成要件ｉの（ａ）は、構成要素Ｉの（Ａ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを意味し、当該ＤＮＡは構成要素Ｉの（Ａ）を有する転写共役因子の遺伝子から通常の遺伝子工学的手法により調製すればよい。一方、構成要件ｉの（ｂ）は、構成要素Ｉの（Ｂ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを意味し、当該ＤＮＡは構成要素Ｉの（Ｂ）を有する本転写調節因子の遺伝子から通常の遺伝子工学的手法により調製すればよい。
構成要件ｉｉの（ｘ）は、構成要素ＩＩの（Ｘ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを意味し、当該ＤＮＡは構成要素ＩＩの（Ｘ）を有する転写調節因子の遺伝子から通常の遺伝子工学的手法により調製すればよい。一方、構成要件ｉｉの（ｙ）は、構成要素ＩＩの（Ｙ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを意味し、当該ＤＮＡは構成要素ＩＩの（Ｙ）を有する転写調節因子の遺伝子から通常の遺伝子工学的手法により調製すればよい。
構成要素ｉｉｉは、構成要素ＩＩの（Ｘ）が結合可能なＤＮＡと、構成要素ＩＩの（Ｙ）により活性化されうるプロモーターの下流に接続されたレポーター遺伝子のＤＮＡとを意味する。構成要素ＩＩの（Ｘ）結合可能なＤＮＡとしては、例えば、Ｇａｌ４蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（5'-CGGAGGACTGTCCTCCG-3'、配列番号１１）、Ｌｅｘ蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（5'-TACTGTATGTACATACAGTA-3'、配列番号１２）、Ｌａｃ Ｉ受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（5'-GAATTGTGAGCGCGCACAATTC-3'、配列番号１３）、テトラサイクリン受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（5'-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3'、配列番号１４）、ＺＦＨＤ−１蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（5'-TAATGATGGGCG-3'、配列番号１５）、転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかと転写調節因子Ｓｉｍ２との転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡ領域（5'-ACGTG-3'、配列番号１６）等のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。また構成要素ＩＩの（Ｙ）により活性化されうるプロモーターとしては、具体的には、構成要素ＩＩの（Ｙ）がＧａｌ４蛋白質由来である場合には、例えば、酵母由来の最小ＴＡＴＡボックス配列があげられる。レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、成長ホルモン遺伝子等の通常のレポーターアッセイに用いられるレポーター遺伝子をあげることができ、宿主細胞における安定性が比較的高いレポーター蛋白質をコードする遺伝子であることが好ましい。
【００２９】
このような各構成要素を本発明転写活性化複合体２が発現されるように適切に組み合わせながらベクターに挿入し、通常の遺伝子工学的手法を用いて同一の宿主細胞に導入することにより、当該形質転換体を作製することができる。例えば、構成要素ｉのうちのいずれか一方の構成要素（ａ又はｂ）と、構成要素ｉｉのうちのいずれか一方の構成要素（ｘ又はｙ）とを、その塩基配列の読み枠を合わせて連結させることによりキメラ遺伝子（キメラ遺伝子１）を作製する。また、構成要素ｉのうちの他方の構成要素（ｂ又はａ）と、構成要素ｉｉのうちの他方の構成要素（ｙ又はｘ）とを、その塩基配列の読み枠を合わせて連結させることによりキメラ遺伝子（キメラ遺伝子２）を作製する。これらキメラ遺伝子１及び２をそれぞれ宿主細胞内で機能可能なプロモーター、例えば、宿主細胞が出芽酵母細胞である場合には、GAL1プロモーターのような誘導型プロモーターや、ADHプロモーターのような恒常的に発現するプロモーター等の下流に接続された状態で同一の宿主細胞内に導入するとよい。構成要素ｉｉｉは、通常、「構成要素ｉｉの（ｘ）の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合領域が結合可能なＤＮＡ」の下流に「構成要素ｉｉの（ｙ）の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有する転写活性化領域により活性化されうるプロモーターの下流に接続されたレポーター遺伝子のＤＮＡ」が接続された状態で、上記の２種のキメラ遺伝子と同一の宿主細胞内に導入される。尚、宿主細胞が、利用可能な内在性のレポーター遺伝子を有する場合には、それを利用してもよく、この場合にはレポーター遺伝子の導入を省略することができる。
本発明形質転換体２を作製するために使用される宿主細胞としては、例えば、出芽酵母細胞、HeLa細胞等の哺乳類動物細胞等があげられる。
【００３０】
本発明形質転換体２を用いて、物質が有する、当該形質転換体が産生する本発明転写活性化複合体２の転写促進能力を調節する能力の評価方法では、本発明形質転換体２と被験物質とを、例えば、数時間から数日間接触させた後、具体的には、被験物質が添加された培地中で数時間から数日間培養した後、当該形質転換体が有する上記レポーター遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する。当該形質転換体が産生する本発明転写活性化複合体２が被験物質の結合により活性化された場合には、レポーター遺伝子の転写が促進され、当該レポーター遺伝子にコードされるレポーター蛋白質が前記形質転換体の細胞内等に蓄積されるかもしくは培地中に分泌される。このレポーター蛋白質の量又はその量と相関関係を有する指標値を測定することにより、当該形質転換体の細胞あたりのレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値を測定する。
具体的には、例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いた場合には、被験物質を接触させた形質転換体から調製された細胞粗抽出物にルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを加えると、当該細胞粗抽出物中のルシフェラーゼ量に比例した強度で発光する。従って、この発光強度をルミノメーター等の測定装置で測定することにより、ルシフェラーゼ量、ひいては、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を知ることができる。同様にして、当該形質転換体と被験物質とを接触させない条件下におけるレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値を測定し、当該測定値と被験物質とを接触させた条件下におけるレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値とを比較することにより、被験物質が有する本発明転写活性化複合体２の転写促進能力を調節する能力を評価することができる。
このような評価方法により評価された上記能力に基づき当該能力を有する物質を選抜することが可能となり、さらに当該物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する治療剤を提供することも可能となる。
【００３１】
上記の方法により選抜される物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする治療剤（即ち、本発明治療剤）は、その有効量を経口的または非経口的にヒト等の哺乳動物に対し投与することができる。例えば、経口的に投与する場合には、本発明治療剤は錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の通常の形態で使用することができる。また、非経口的に投与する場合には、本発明治療剤を溶液、乳剤、懸濁液等の通常の液剤の形態で使用することができる。前記形態の本発明治療剤を非経口的に投与する方法としては、例えば注射する方法、坐剤の形で直腸に投与する方法等を挙げることができる。
前記の適当な投与剤型は許容される通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤、希釈剤等に本発明探索方法により選抜される物質またはその薬学的に許容される塩を配合することにより製造することができる。また注射剤型で用いる場合には、許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明治療剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常は経口の場合には成人で１日あたり有効成分量として約１ｍｇ〜約２ｇ、好ましくは有効成分量として約５ｍｇ〜約１ｇを投与すればよく、注射の場合には成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
尚、本発明治療剤の適用可能と考えられる疾患としては、ダウン症による精神遅延等の疾患をあげることができる。
【００３２】
レポーターアッセイに関連する本発明、ツーハイブリッドシステムに関連する本発明及び本発明バインディングアッセイは、物質の本調節能力評価や、例えば、ダウン症改善剤の有効成分としての物質の検出等に利用することができる。
【００３３】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【００３４】
実施例１ （本転写調節因子（mNXF）DNAの調製及びそれを含有するベクターであるpGEM-mNXFの調製）
配列番号７で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをそれぞれDNA合成機（アプライドバイオシステムズ社製モデル394）を用いて合成した。このように合成されたポリヌクレオチドをプライマーとして、マウスBrain cDNAライブラリー（＃10655−017ギブコBRL社製）10 ngを鋳型として、反応液５０μｌ当たり上記のポリヌクレオチド10pmolを添加し、LA-Taqポリメラーゼ（宝酒造社製）及び当該酵素を含むキットに添付されたバッファーを用いてPCRを行った。当該ＰＣＲは、PCRsystem9700（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、95℃1分間次いで68℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを35サイクル行った。
得られたPCR反応液の全量を、低融点アガロース電気泳動（アガロースL：ニッポンジーン）に供することにより、増幅ＤＮＡ（約2.5kb）を精製・回収した。精製・回収された増幅ＤＮＡの一部とダイターミネーターシークエンスキットFS（アプライドバイオシステムズ社製）とを用いてダイレクトシークエンス用のサンプルを調製し、これをオートシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製、モデル3700）を用いたダイレクト塩基配列解析に供した。
上記のようにして精製・回収された増幅DNA（約１μｇ）とpGEM T easyベクター（プロメガ社製）（10ng）とを混合し、この混合物にT4 DNAリガーゼを添加して反応させることにより、プラスミドmNXFを得た。得られたpGEM-mNXFの塩基配列をABIモデル3700型オートシークエンサーを用いてダイターミネーター法で決定した。決定された塩基配列を、前記のダイレクトシークエンスで得られた塩基配列と比較して、翻訳領域の塩基配列が完全に一致していることを確認した。
【００３５】
実施例２ （本発明転写活性化複合体の転写促進能力を確認するための試験等）（２−１）pGL3-TATA-Galx4の調製（TATA最小プロモーターを有するルシフェラーゼ遺伝子の上流に、転写調節因子GAL4のDNA結合領域が４コピー導入されたレポーター遺伝子プラスミドの構築）
転写調節因子GAL4のDNA結合領域と任意の転写調節因子とのキメラ蛋白質の転写調節能を測定するために用いたレポーター遺伝子プラスミドpGL3-TATA-Galx4は、TATA最小プロモーターを有するルシフェラーゼ遺伝子の上流に、AL4のDNA結合領域が結合可能なＤＮＡがタンデムに４コピー導入されたものである。GAL4のDNA結合領域と任意の転写調節因子とのキメラ蛋白質が当該レポーター遺伝子プラスミドに作用する場合において、シフェラーゼ遺伝子の発現量を測定することで前記キメラ蛋白質が有する転写活性能を評価することができる。当該レポーター遺伝子プラスミドpGL3-TATA-Galx4を以下のようにして作製した。
まず、GAL4のDNA結合領域が結合可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと当該塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号１７：5'-cgcgtcgagctcgggtcggaggactgtcctccgactgctcgagtcgagctcgggtcggaggactgtcctccgactgctcgaga-3'、配列番号１８：5'-cgcgtctcgagcagtcggaggacagtcctccgacccgagctcgactcgagcagtcggaggacagtcctccgacccgagctcga-3'）をアニールした後T4 Kinaseでその5'末端をリン酸化し、これをT4 Ligaseでタンデムに結合させた。得られた二本鎖オリゴヌクレオチドを、低融点アガロース電気泳動（NuseiveGTG；FMCbio社製）に供することにより、当該二本鎖オリゴヌクレオチドがタンデムに２つ結合してなるＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。これに、pGL3-TATAベクターをMluIで切断した後アルカリフォスファターゼ（BAP C75；宝酒造製）処理して得られたＤＮＡ（0.1μｇ）をT4 Ligase(宝酒造製)で結合させる（１６℃、１６時間反応）ことにより、pGL3-TATA-Galx4を得た。
【００３６】
（２−２）pRC/RSV-Gal4-DBDの調製（転写調節因子GAL4のDNA結合領域を発現するプラスミドの構築）
転写調節因子GAL4のDNA結合領域（以下、Gal4-DBDと記すこともある。GAL4から転写活性化領域を欠いた蛋白質。）を発現するプラスミドであるpRC/RSV-Gal4-DBDを以下のようにして作製した。
まず、Gal4-DBDをコードするDNAを有するプラスミドpM（市販キットK1602-1に含まれる；Clontech社より購入した）をNheIとXbaIとで切断した後、更にT4 ポリメラーゼで平滑末端化した。それを低融点アガロース電気泳動（アガロースL；ニッポンジーン社製）に供することにより、Gal4-DBDをコードするのＤＮＡ（約500bp）を回収した。回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。
次に、pRC/RSV（Invitorgen社製）をHindIIIで切断した後、更にT4ポリメラーゼで平滑末端化した。それをBAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）に、前記インサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pRC/RSV-Gal4-DBDを作製した。
【００３７】
（２−３）pRC/RSV-MA、ｐRC/RSV-MB、pRC/RSV-MCの調製（転写調節因子GAL4のDNA結合領域と任意の転写調節因子の転写活性化領域とを結合したキメラ蛋白質を発現させるために、Gal4-DBDをコードするDNAの下流に、制限酵素PmaCIの認識部位がそれぞれ異なるフレームで挿入されたプラスミドの構築）
pRC/RSV-MA、pRC/RSV-MB、pRC/RSV-MCは、RSVプロモーターの下流にGal4-DBDの翻訳領域を有しており、さらにその下流に位置するPmaCI切断により形成される平滑末端に、平滑末端化ＤＮＡを、Gal4-DBDをコードするDNAの翻訳フレームに対して当該平滑末端化ＤＮＡの翻訳フレームが一致するように結合させることができる。このようにしてGAL4のDNA結合領域と任意の転写調節因子の転写活性化領域とを結合したキメラ蛋白質を発現させることができる。
pRC/RSV-MA、ｐRC/RSV-MB、pRC/RSV-MCは以下のようにして調製した。
まず、２種のオリゴヌクレオチド（配列番号１９：5´-agcttcatcccacgtgagtcat-3´、配列番号２０：5´-ctagatgactcacgtgggatga-3´）をアニールした後にT4 kinaseでその5'末端をリン酸化した。得られたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。一方、上記（２−２）で調製されたpRC/RSV-Gal4-DBDをHindIIIとXbaIとで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡをベクターＤＮＡとした。それら両者をT4 Ligaseで結合させることにより、pRC/RSV-MAを作製した。同様に、他の２種のオリゴヌクレオチド（配列番号２１：5´-agcttcatccacacgtgagtcat-3´、配列番号２２：5´-ctagatgactcacgtgtggatga-3´）をアニールした後T4 kinaseで5'末端をリン酸化して得られたＤＮＡをインサートＤＮＡとして用いることにより、pRC/RSV-MBを作製した。更に同様に、他の２種のオリゴヌクレオチド（配列番号２３：5´-agcttcatccaacacgtgagtcat-3´、配列番号２４：5´-ctagatgactcacgtgttggatga-3´）をアニールした後T4 kinaseで5'末端をリン酸化して得られたＤＮＡをインサートＤＮＡとして用いることにより、pRC/RSV-MCを作製した。
【００３８】
（２−４）pBlue-hArnt1kozac、pBlue-hArnt2kozac、pBlue-hArnt3kozac、pGEM-hBMAL2kozac、pRC/RSV-hSim2kozac及びpBlue-hClockkozacの調製
(2-4-1) pBlue-hArnt1kozac
Arnt1の翻訳領域全長を有するプラスミドであるpBlue-hArnt1kozacを以下のようにして作製した。
まず、ヒトLiver ｍRNA（Clontech社より購入した）からpolyｄTプライマー（アマシャムファルマシア社から購入した）及び逆転写酵素（SuperScriptII；GIBCO社より購入した）を用いて一本鎖ｃDNAを作製した。作製されたcDNAを鋳型として、フォワードプライマー5´-ggccatggcggcgactactgccaaccccgaaatga-3´（配列番号２５）、リバースプライマー5´-tgagggaagggaagggagaggaacttttattctgt -3´（配列番号２６）及びPyrobest ポリメラーゼ（宝酒造製）を用いたPCRを行うことにより増幅ＤＮＡを得た。尚、PCRの条件は、95℃1分間次いで68℃3分間の保温を１サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡをTEで500分の1に希釈してこれを鋳型とし、フォワードプライマー5´-cccggcggccgcccagccaccatggcggcgactactgccaaccccgaaatgacatc -3´（配列番号２７）、リバースプライマー5´-cccgtctagaaccccttatcctcaccccaatagttctattctgaa -3´（配列番号２８）及びPyrobest ポリメラーゼ（宝酒造製）を用いたPCRを再度行うことにより増幅ＤＮＡを得た。尚、PCRの条件は、95℃1分間次いで68℃3分間の保温を１サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡは、Arnt1をコードするDNAの開始コドンの直前にコザック配列（5'-CCAGCCACC-3'）を有し、さらにその上流にNotI制限酵素部位を有している。当該増幅ＤＮＡに、それが有するStopコドン下流にXbaI制限酵素部位を導入した。得られたＤＮＡをNotI及びXbaIの両制限酵素で切断した後、これを低融点アガロース電気泳動に供することによりＤＮＡを精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。
次に、pBluescriptベクターをNotIとXbaIとで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pBlue-hArnt1kozacを作製した。
【００３９】
(2-4-2) pBlue-hArnt2kozac
Arnt2をコードするDNAの翻訳領域全長を有するプラスミドであるpBlue-hArnt2kozacを以下のようにして作製した。
まず、ヒトBrain ｍRNA（Clontech社より購入した）からpolyｄTプライマー（アマシャムファルマシア社から購入した）及び逆転写酵素（SuperScriptII；GIBCO社より購入した）を用いて一本鎖ｃDNAを作製した。作製されたcDNAを鋳型として、フォワードプライマー5´-catctctcacctggactgctgtgaccttcattcat-3´（配列番号２９）、リバースプライマー5´-cacatgggcatcgacatcacagtatgggtggcact-3´（配列番号３０）及びPyrobest ポリメラーゼ（宝酒造製）を用いたPCRを行うことにより増幅ＤＮＡを得た。尚、PCRの条件は、95℃1分間次いで68℃2分間の保温を１サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡをTEで500分の1に希釈しこれを鋳型として、フォワードプライマー5´-gggcgcggccgcccagccaccatggcttcagacatacctggatctgtgacgttgcc -3´（配列番号３１）、リバースプライマー5´-gggctctagactactcagaaaacggtggaaacatgcccaggtcgg -3´（配列番号３２）及びPyrobest ポリメラーゼ（宝酒造製）を用いたPCRを再度行うことにより増幅ＤＮＡを得た。尚、PCRの条件は、95℃1分間次いで68℃2分間の保温を１サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡは、Arnt2をコードするDNAの開始コドンの直前にコザック配列（5'-CCAGCCACC-3'）を有し、さらにその上流にNotI制限酵素部位を有している。当該増幅ＤＮＡに、それが有するStopコドン下流にXbaI制限酵素部位を導入した。得られたＤＮＡをNotI及びXbaIの両制限酵素で切断した後、これを低融点アガロース電気泳動に供することにより、ＤＮＡを精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。
次に、pBluescriptベクターをNotIとXbaIで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pBlue-hArnt2kozacを作製した。
【００４０】
(2-4-3) pBlue-hArnt3kozac
Arnt3をコードするDNAの翻訳領域全長を有するプラスミドであるpBlue-hArnt3kozacを以下のようにして作製した。
まず、ヒトBrain ｍRNA（Clontech社より購入した）からpolyｄTプライマー（アマシャムファルマシア社から購入した）及び逆転写酵素（SuperScriptII；GIBCO社より購入）を用いて一本鎖ｃDNAを作製した。作製されたcDNAを鋳型として、フォワードプライマー5´-atggacacagacaaagatgaccctcatggaaggtt -3´（配列番号３３）、リバースプライマー5´-tgtttacagcggccatggcaagtcactaaagtcaac -3´（配列番号３４）及びPyrobest ポリメラーゼ（宝酒造製）を用いたPCRを行うことにより増幅ＤＮＡを得た。尚、PCRの条件は、95℃1分間次いで68℃2分間の保温を１サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡをTEで500分の1に希釈しこれを鋳型として、フォワードプライマー5´-ggggcggccgccccagccacc atggacacagacaaagatgaccctcatggaaggtt -3´（配列番号３５）、リバースプライマー5´-gggtctaga tgtttacagcggccatggcaagtcactaaagtcaac -3´（配列番号３６）及びPyrobest ポリメラーゼ（宝酒造製）を用いたPCRを再度行うことにより増幅ＤＮＡを得た。尚、PCRの条件は、95℃1分間次いで68℃2分間の保温を１サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡは、Arnt3をコードするDNAの開始コドンの直前にコザック配列（5'-CCAGCCACC-3'）を有し、さらにその上流にNotI制限酵素部位を有している。当該増幅ＤＮＡに、それが有するStopコドン下流にXbaI制限酵素部位を導入した。得られたＤＮＡをNotI及びXbaIの両制限酵素で切断した後、これを低融点アガロース電気泳動に供することにより、ＤＮＡを精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。
次に、pBluescriptベクターをNotIとXbaIとで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pBlue-hArnt3kozacを作製した。
【００４１】
(2-4-4) pGEM-hBmal2kozac
Bmal2をコードするDNAの翻訳領域全長を有するプラスミドであるpGEM-hBmal2kozacを以下のようにして作製した。
まず、ヒトBrain ｍRNA（Clontech社より購入した）からpolyｄTプライマー（アマシャムファルマシア社から購入した）及び逆転写酵素（SuperScriptII；GIBCO社より購入した）を用いて一本鎖ｃDNAを作製した。作製されたcDNAを鋳型として、フォワードプライマー5´-agctatggggtcttccagctcacacatgacagag -3´（配列番号３７）、リバースプライマー5´-atcaaaggctagagggtccactggatgtcactgaa -3´（配列番号３８）及びPyrobest ポリメラーゼ（宝酒造製）を用いたPCRを行うことにより増幅ＤＮＡを得た。尚、PCRの条件は、95℃1分間次いで68℃2分間の保温を１サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡをTEで500分の1に希釈しこれを鋳型として、フォワードプライマー5´-gggcgcggccgcccagccaccatggggtcttccagctcacacatgacagagtttcc -3´（配列番号３９）、リバースプライマー5´-atcaaaggctagagggtccactggatgtcactgaa -3´（配列番号４０）及びLA-Taq ポリメラーゼ（宝酒造製）を用いたPCRを再度行うことにより増幅ＤＮＡを得た。尚、PCRの条件は、95℃1分間次いで68℃2分間の保温を１サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡは、Bmal2をコードするDNAの開始コドンの直前にコザック配列（5'-CCAGCCACC-3'）を有し、さらにその上流にNotI制限酵素部位を有している。得られた増幅ＤＮＡを低融点アガロース電気泳動に供することにより精製・回収した。精製・回収された増幅ＤＮＡをインサートＤＮＡとした。このインサートＤＮＡ（0.5μg）をpGEMeasyT（Promega社より購入）ベクター（0.1μg）にT4 Ligaseで結合させることにより、pGEM-hBmal2kozacを作製した。
【００４２】
(2-4-5) pRC/RSV-hSim2kozac
Sim2をコードするDNAの翻訳領域全長を有するプラスミドであるpRC/RSV-hSim2kozacを以下のようにして作製した。
まず、ヒトKidney ｍRNA（Clontech社より購入した）からpolyｄTプライマー（アマシャムファルマシア社から購入した）及び逆転写酵素（SuperScriptII；GIBCO社より購入）を用いて一本鎖ｃDNAを作製した。作製されたcDNAを鋳型として、フォワードプライマー5´-gtctaatatgcccggagccgaggcgcgatgaagga-3´（配列番号４１）、リバースプライマー5´-tcacctcccgttggtgatgatgaccgaggcgcccag-3´（配列番号４２）及びPyrobest ポリメラーゼ（宝酒造製）を用いたPCRを行うことにより増幅ＤＮＡを得た。尚、PCRの条件は、95℃1分間次いで68℃2分間の保温を１サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡをTEで500分の1に希釈しこれを鋳型として、フォワードプライマー5´-gggcgcggccgcccagccaccatgaaggagaagtccaagaatgcggccaagaccag -3´（配列番号４３）、リバースプライマー5´-gggctctagatcacctcccgttggtgatgatgaccgaggcgccca -3´（配列番号４４）及びPyrobest ポリメラーゼ（宝酒造製）を用いたPCRを再度行うことにより増幅ＤＮＡを得た。尚、PCRの条件は、95℃1分間次いで68℃2分間の保温を１サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡは、Sim2をコードするDNAの開始コドンの直前にコザック配列（5'-CCAGCCACC-3'）を有し、さらにその上流にNotI制限酵素部位を有している。当該増幅ＤＮＡに、それが有するStopコドン下流にXbaI制限酵素部位を導入した。得られたＤＮＡをNotI及びXbaIの両制限酵素で切断した後、これを低融点アガロース電気泳動に供することにより、ＤＮＡを精製・回収された。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。
次に、pRC/RSVベクターをNotIとXbaIとで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pRC/RSV-hSim2kozacを作製した。
【００４３】
(2-4-6) pBlue-hClockkozac
Clock翻訳領域全長を有するプラスミドであるpBlue-hClockkozacを以下のようにして作製した。
まず、ヒトBrain ｍRNA（Clontech社より購入した）からpolyｄTプライマー（アマシャムファルマシア社から購入した）及び逆転写酵素（SuperScriptII；GIBCO社より購入）を用いて一本鎖ｃDNAを作製した。作製されたcDNAを鋳型として、フォワードプライマー5´-gatccaaggagtacaaaaggagaagtacaaatgtc-3´（配列番号４５）、リバースプライマー5´-tactgcatctcatgaaactgctggaactttccct -3´（配列番号４６）及びPyrobestポリメラーゼ（宝酒造製）を用いたPCRを行うことにより増幅ＤＮＡを得た。尚、PCRの条件は、95℃1分間次いで68℃2分間の保温を１サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡの末端をT4kinaseでリン酸化した後、これを低融点アガロース電気泳動に供することにより、増幅ＤＮＡ（約2.5kbp）を精製・回収した。精製・回収された増幅ＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pBluescriptIIベクター（Stratagene社より購入した）をSmaIで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pBlue-hClockを得た。
次に、このプラスミド1μgを鋳型にしてフォワードプライマー5´-gggcgggatccccagccaccatgttgtttaccgtaagctg-3´（配列番号４７）、リバースプライマー5´-ctactgtggttgaaccttgg-3´（配列番号４８）及びPyrobest ポリメラーゼ（宝酒造製）を用いたPCRを再度行うことにより増幅ＤＮＡを得た。尚、PCRの条件は、95℃1分間次いで68℃３分間の保温を１サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡは、Clockの開始コドンの直前にコザック配列（5'-CCAGCCACC-3'）を有している。得られた増幅ＤＮＡをT4 kinaseでリン酸化した後、これを低融点アガロース電気泳動に供することにより精製・回収した。精製・回収された増幅ＤＮＡをインサートＤＮＡとした。次に、ｐBluescriptIIベクターをSmaIで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pBlue-hClock kozacを作製した。
【００４４】
（２−５）pRC/RSV-MC-ｍNXF(bHLH-PAS)、pRC/RSV-MC-Arnt1 (bHLH-PAS)、pRC/RSV-MC-Arnt2(bHLH-PAS)、pRC/RSV-MB-Arnt3(bHLH-PAS)、pRC/RSV-MA Bmal2(bHLH-PAS)の調製（ツーハイブリッドアッセイに必要なキメラ蛋白質発現用プラスミドの構築（その１））
(2-5-1) pRC/RSV-MC-ｍNXF(bHLH-PAS)
転写調節因子GAL4のDNA結合領域と本転写調節因子（mNXF）のbHLH-PAS領域部分とが結合してなるキメラ蛋白質（以下、Gal4-mNXFと記すこともある。）を発現するプラスミドであるpRC/RSV-MC-ｍNXF(bHLH-PAS)を以下のようにして作製した。
まず、実施例１で調製されたpGEM-mNXFをSacIとApaIとで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端としたのち、低融点アガロース電気泳動（AgaroseL;ニッポンジーン社製）に供することにより、ＤＮＡ（約1.8kbp：本転写調節因子（mNXF）のbHLH-PAS領域部分を含む）を精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pRC/RSV-MCをpmaCIで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡを（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pRC/RSV-MC-ｍNXF(bHLH-PAS)を作製した。
【００４５】
(2-5-2) pRC/RSV-MC-Arnt1 (bHLH-PAS)
転写調節因子GAL4のDNA結合領域と本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt1のbHLH-PAS領域部分とが結合してなるキメラ蛋白質（以下、Gal4-Arnt1と記すこともある。）を発現するプラスミドであるpRC/RSV-MC-Arnt1(bHLH-PAS)を以下のようにして作製した。
まず、前記（2-4-1）で調製されたpBlue-hArnt1kozacをNotIとNaeIとで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端としたのち、低融点アガロース電気泳動（AgaroseL;ニッポンジーン社製）に供することにより、ＤＮＡ（約1.8kbp：Arnt1のbHLH-PAS領域部分を含む）を精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pRC/RSV-MCをpmaCIで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pRC/RSV-MC-Arnt1 (bHLH-PAS)を作製した。
【００４６】
(2-5-3) pRC/RSV-MC-Arnt2(bHLH-PAS)
転写調節因子GAL4のDNA結合領域と本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2のbHLH-PAS領域部分とが結合してなるキメラ蛋白質（以下、Gal4-Arnt2と記すこともある。）を発現するプラスミドであるpRC/RSV-MC-Arnt2(bHLH-PAS)を以下のようにして作製した。
まず、前記（2-4-2）で調製されたpBlue-hArnt2kozacをNotIとBglIIとで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端としたのち、低融点アガロース電気泳動（AgaroseL;ニッポンジーン社製）に供することにより、ＤＮＡ（約1.5kbp：Arnt2のbHLH-PAS領域部分を含む）を精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pRC/RSV-MCをpmaCIで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pRC/RSV-MC-Arnt2(bHLH-PAS)を作製した。
【００４７】
(2-5-4) pRC/RSV-MB-Arnt3(bHLH-PAS)
転写調節因子GAL4のDNA結合領域と本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt3のbHLH-PAS領域部分とが結合してなるキメラ蛋白質（以下、Gal4-Arnt3と記すこともある。）を発現するプラスミドであるpRC/RSV-MC-Arnt3(bHLH-PAS)を以下のようにして作製した。
まず、前記（2-4-3）で調製されたpBlue-hArnt3kozacをNotIとSphIとで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端としたのち、低融点アガロース電気泳動（AgaroseL;ニッポンジーン社製）に供することにより、ＤＮＡ（約1.3kbp：Arnt3のbHLH-PAS領域部分を含む）を精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pRC/RSV-MBをpmaCIで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pRC/RSV-MB-Arnt3(bHLH-PAS)を作製した。
【００４８】
(2-5-5) pRC/RSV-MA Bmal2(bHLH-PAS)
転写調節因子GAL4のDNA結合領域と転写共役因子Bmal2のbHLH-PAS領域部分とが結合してなるキメラ蛋白質（以下、Gal4-Bmal2と記すこともある。）を発現するプラスミドであるpRC/RSV-MA-Bmal2(bHLH-PAS)を以下のようにして作製した。
まず、前記（2-4-4）で調製されたpGEM-hBmal2kozacをNotIとAccIとで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端としたのち、低融点アガロース電気泳動（AgaroseL;ニッポンジーン社製）に供することにより、ＤＮＡ（約1.25kbp：Bmal2のbHLH-PAS領域部分を含む）を精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pRC/RSV-MAをpmaCIで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pRC/RSV-MA Bmal2(bHLH-PAS)を作製した。
【００４９】
（２−６）pVP16-Arnt1 (bHLH-PAS)、pVP16-Arnt2 (bHLH-PAS)、pVP16-Arnt3(bHLH-PAS)、pVP16-BMAL2(bHLH-PAS)、pVP16-Sim2(bHLH-PAS)、pVP16-Clock (bHLH-PAS)、pVP16-NXF (bHLH-PAS)及びpVP16-CPの調製（ツーハイブリッドアッセイに必要なキメラ蛋白質発現用プラスミドの構築（その２）及び陰性対照プラスミドの構築）
(2-6-1) pVP16-Arnt1 (bHLH-PAS)
Vp16転写活性化領域と転写共役因子Arnt1のbHLH-PAS領域部分とが結合してなるキメラ蛋白質（以下、VP16-Arnt1と記すこともある。）を発現するプラスミドであるpVP16-Arnt1(bHLH-PAS)を以下のようにして作製した。
まず、前記（2-4-1）で調製されたpBlue-hArnt1kozacをNotIとNaeIとで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端化したのち、低融点アガロース電気泳動に供することにより、ＤＮＡ（約1.8kbp：Arnt1のbHLH-PAS領域部分を含む）を精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pVP16ベクター（Clontech社より購入した）をBamHIで切断した後BAP処理し、さらにT4ポリメラーゼで平滑末端化して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pVP16-Arnt1 (bHLH-PAS)を作製した。
【００５０】
(2-6-2) pVP16-Arnt2 (bHLH-PAS)
Vp16転写活性化領域と本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2のbHLH-PAS領域部分とが結合してなるキメラ蛋白質（以下、VP16-Arnt2と記すこともある。）を発現するプラスミドであるpVP16-Arnt2(bHLH-PASを以下のようにして作製した。
まず、前記（2-4-2）で調製されたpBlue-hArnt2kozacをNotIとBglIIとで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端化したのち、低融点アガロース電気泳動に供することにより、ＤＮＡ（約1.5kbp：Arnt2のbHLH-PAS領域部分を含む）を精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pVP16ベクター（Clontech社より購入した）をBamHIで切断した後BAP処理し、さらにT4ポリメラーゼで平滑末端化して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pVP16-Arnt2 (bHLH-PAS)を作製した。
【００５１】
(2-6-3) pVP16-Arnt3(bHLH-PAS)
Vp16転写活性化領域と本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt3のbHLH-PAS領域部分を含む全長とが結合してなるキメラ蛋白質（以下、VP16-Arnt3と記すこともある。）を発現するプラスミドであるpVP16-Arnt3を以下のようにして作製した。
まず、前記（2-4-3）で調製されたpBlue-hArnt3kozacをNotIとXbaIとで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端化したのち、低融点アガロース電気泳動に供することにより、ＤＮＡ（約1.8kbp：Arnt3の全長を含む）を精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pVP16ベクター（Clontech社より購入した）をEcoRIで切断した後BAP処理し、さらにT4ポリメラーゼで平滑末端化して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pVP16-Arnt3を作製した。
【００５２】
(2-6-4) pVP16-BMAL2(bHLH-PAS)
Vp16転写活性化領域と転写共役因子Bmal2のbHLH-PAS領域部分を含む全長とが結合してなるキメラ蛋白質（以下、VP16-Bmal2と記すこともある。）を発現するプラスミドであるpVP16-Bmal2を以下のようにして作製した。
まず、前記（2-4-4）で調製されたpGEM-hBmal2kozacをNotIで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端化したのち、低融点アガロース電気泳動に供することにより、ＤＮＡ（約1.7kbp：Bmal2の全長を含む）を精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pVP16ベクター（Clontech社より購入した）をHindIIIで切断した後BAP処理し、さらにT4ポリメラーゼで平滑末端化して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pVP16-Bmal2を作製した。
【００５３】
(2-6-5) pVP16-Sim2(bHLH-PAS)
Vp16転写活性化領域とSim2のbHLH-PAS領域部分とが結合してなるキメラ蛋白質（以下、VP16-Sim2と記すこともある。）を発現するプラスミドであるpVP16-Sim2(bHLH-PAS)を以下のようにして作製した。
まず、前記（2-4-5）で調製されたpRC/RSV-hSim2kozacをNotIとBamHIとで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端化したのち、低融点アガロース電気泳動に供することにより、ＤＮＡ（約1.5kbp：Sim2のbHLH-PAS領域部分を含む）を精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pVP16ベクター（Clontech社より購入した）をBamHIで切断した後BAP処理し、さらにT4ポリメラーゼで平滑末端化して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pVP16-Sim2(bHLH-PAS)を作製した。
【００５４】
(2-6-6) pVP16-Clock (bHLH-PAS)
Vp16転写活性化領域とClockのbHLH-PAS領域部分とが結合してなるキメラ蛋白質（以下、VP16-Clockと記すこともある。）を発現するプラスミドであるpVP16-Clock(bHLH-PAS)を以下のようにして作製した。
まず、前記（2-4-6）で調製されたpBlue-hClock kozacをHicIIとNcoIとで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端化したのち、低融点アガロース電気泳動に供することにより、ＤＮＡ（約1.6kbp：ClockのbHLH-PAS領域部分を含む）を精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pVP16ベクター（Clontech社より購入した）をBamHIで切断した後BAP処理をし、さらにT4ポリメラーゼで平滑末端化して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pVP16-Clock (bHLH-PAS)を作製した。
【００５５】
(2-6-7) pVP16-NXF (bHLH-PAS)
Vp16転写活性化領域と本転写活性因子（ｍNXF）のbHLH-PAS領域部分とが結合してなるキメラ蛋白質（以下、VP16-NXFと記すこともある。）を発現するプラスミドであるpVP16-NXF(bHLH-PAS)を以下のようにして作製した。
まず、実施例１で調製されたpGEM-mNXFをSacIとApaIとで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端化したのち、低融点アガロース電気泳動に供することにより、ＤＮＡ（約1.8kbp：本転写活性因子（ｍNXF）のbHLH-PAS領域部分を含む）を精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pVP16ベクター（Clontech社より購入した）をBamHIで切断した後BAP処理し、さらにT4ポリメラーゼで平滑末端化して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pVP16-NXF (bHLH-PAS)を作製した。
【００５６】
(2-6-8) pVP16-CP
ウィルスコート蛋白質とVP16とのキメラ蛋白質を発現するプラスミドであるpVP16-CPをクロンテック社より購入した。この蛋白質はbHLH-PAS領域を持たず、bHLH-PASファミリーに属する転写調節因子に対して何ら結合性を示さない。そこで当該プラスミドを下記（２−６）での試験における陰性対照プラスミドとして用いた。
【００５７】
（２−７）本ＡＲＮＴ属転写共役因子と本転写調節因子との複合体形成を確認するためのツーハイブリッドアッセイ
約５ｘ１０6のHeLa細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（日水製薬社製）を用いて３７℃にて５％ＣＯ2存在下に、直径約１０ｃｍのシャーレ（ファルコン社製）を用いて培養した。翌日、培養された細胞をトリプシン処理により分散し、FBSを含まないDMEM培地で２回洗浄した後、再度５ｘ１０6に細胞密度がなるようにFBSを含まないDMEM培地に分散させた。この細胞分散液0.4ｍｌに対して、前記（２−１）で調製されたレポーター遺伝子プラスミド（pGL3-TATA-Galx4）（例えば３μg）、前記（２−５）で調製されたキメラ蛋白質を発現するプラスミド（例えば３μg）及び前記（２−６）で調製されたキメラ蛋白質を発現するプラスミド等（例えば３μg）の３者を混合した後、この混合物をエレクトロポレーション用キュベットに移し、Geneパルサー（BIORAD社製）を用いたエレクトロポレーション法により220V、950μFの条件でトランスフェクションを行った。トランスフェクション後、培地を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に置換してさらに６穴プレート内で約24時間培養した。次いで、ウェルから培地を除き、器壁に接着している細胞をPBS(-)で２回洗浄した後、５倍に希釈したＰＧＣ５０（東洋インキ社製）をウェルあたり２００μｌずつ加えてさらに室温に３０分間放置した。この細胞液２０μｌずつオペークプレート（コーニングコースター社製）上に分注し、当該プレートを酵素基質自動インジェクター付きルミノメーターＬＢ９６Ｐ（ベルトールド社製）にセットし、５０μｌの基質液ＰＧＬ１００（東洋インキ社製）を自動分注した後、各ウェル内のルシフェラーゼ活性をそれぞれ測定した。
その結果を、図１〜４に示す。Gal4-NXFを用いた系（図１参照）において、VP16-Arnt1、VP16-Arnt2、VP16-Arnt3が本転写調節因子（NXF）のbHLH-PAS領域部分と結合性（相互作用）を示すことが確認された。一方、Bmal2、Sim2、Clockは本転写調節因子（NXF）のbHLH-PAS領域部分と結合性（相互作用）を示さなかった。
また、本転写調節因子（NXF）同士はそのホモダイマーを形成しないことも確認された。
さらに、Gal4-Arnt1を用いた系（図２参照）、Gal4-Arnt2を用いた系（図３参照）及びGal4-Arnt3を用いた系（図４参照）において、本転写調節因子（NXF）がArnt1、Arnt2及びArnt3のいずれかのbHLH-PAS領域部分と結合性（相互作用）を示すことが再確認された。
また、Gal4-Bmal2を用いた系（図５参照）において、本転写調節因子（NXF）はBmal2と結合性（相互作用）を示さないことが再確認された。
【００５８】
（２−８）本発明転写活性化複合体が有するＤＮＡ結合性を確認するためのゲルシフトアッセイ
(2-8-1) pVL1392-hArnt2kozacの調製（本ＡＲＮＴ属転写共役因子全長を発現する組換えウィルス作製用トランスファーベクターの構築）
Arnt2全長を発現する組換えウィルス（Baculo Virus）作製用トランスファーベクターであるpVL1392-hArnt2kozacを以下のようにして作製した。
まず、前記（2-4-2）で調製されたpBlue-hArnt2kozacをNotIとXbaIとで同時に切断した後、これを低融点アガロース電気泳動（AgaroseL；ニッポンジーン社製）に供することにより、ＤＮＡ（約2.2kbp：Arnt2の翻訳領域全長を含む）を回収した。回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。
次に、pVL1392ベクター（ファーミンゲン社より購入した）をNotIとXbaIとで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）にインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合することにより、Arnt2全長を発現する組換えウイルス作製用トランスファーベクターであるpVL1392-hArnt2kozacを作製した。
【００５９】
(2-8-2) pVL1392-NXFの調製（本転写調節因子全長を発現する組換えウィルス作製用トランスファーベクターの構築）
次に、本転写調節因子（rNXF）全長を発現する組換えウイルス（Baculo Virus）作製用トランスファーベクターであるpVL1392-rNXFを以下のようにして作製した。
実施例１に記載されたpGEM-mNXFの調製において鋳型としてマウスBrain cDNAライブラリーの代わりにラットBrain cDNAライブラリーを用いることにより同様にしてpGEM-rNXFを調製した。
pGEM-rNXFをScaIとSacIとの両者及びNotIで切断した後、これをT4ポリメラーゼを用いて平滑末端化した。平滑末端化されたＤＮＡを低融点アガロース電気泳動（AgaroseL；ニッポンジーン社製）に供することにより、ＤＮＡ（約2.5kbp：本転写調節因子（NXF）の翻訳領域全長を含む）を回収した。回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。
次に、pVL1393ベクター（ファーミンゲン社より購入した）をSmaIで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）にインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合することにより、本転写調節因子（rNXF）を発現する組換えウイルス作製用トランスファーベクターであるpVL1392-rNXFを作製した。
【００６０】
(2-8-3) 本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2又は本転写調節因子（rNXF）遺伝子が組み込まれた組換えウイルス粒子の調製
まず、昆虫細胞Sf21（Invitorgen社より購入した）を、１０％FCS（ウシ胎児血清）、０．３３％イースト加水分解物、０．３３％ラクトアルブミン加水分解物を加えたGrace培地（GIBCO社より購入した）を用いて通常の空気中２７℃で培養した。培養された細胞に、組換えウィルス作製用トランスファーベクター及びBaculoVirusゲノムDNAを以下のようにして導入した。
まず、6穴プレートのウェルに106個の細胞を播種した後、２時間放置した。細胞が接着したことを確認した後、各ウェルの培養液を0.8mlの無血清Grace培地に置換した。このようにして調製された細胞に、200μlの無血清培地に0.25μgのLinearized Baculo virusゲノムDNA（Baculo Gold DNA；ファーミンゲン社より購入した）と2μgの組換えウィルス作製用トランスファーベクターとを混合した後にCell Fectin試薬（GIBCO社より購入した）を6μl加えさらに室温に１５分間放置することにより調製された混合物を、添加した。5時間後、各ウェルの培養液を通常の血清入りのGrace培地に置換してそのまま72時間培養を継続した。このようにして、組換えウィルス作製用トランスファーベクターとBaculo VirusゲノムDNAとが相同組換えをおこした結果として、Baculo Virus由来のポリヘドリン蛋白質遺伝子が有するプロモーターの下流に本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2をコードするＤＮＡ又は本転写調節因子（rNXF）をコードするＤＮＡが組み込まれた組換えウイルス粒子を得た。尚、対照として市販（ファーミンゲン社より購入した）のWild Baculo Virus（非組換え型ウィルス）を用いた。
【００６１】
(2-8-4) 本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2又は本転写調節因子（NXF）を含む全細胞抽出液の調製
本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2又は本転写調節因子（NXF）を含む全細胞抽出液を以下のようにして作製した。
まず、T50フラスコ中の106個の昆虫細胞Sf21に上記（2-8-3）で調製された組換えウィルス粒子を感染させた。感染72時間後、細胞を1000gで2分間遠心分離することにより、細胞ペレットを回収した。回収された細胞ペレットを細胞体積の4倍量の２０ｍM HEPS（pH7.9）、300mM NaCl、20％ Glycerolの組成からなるバッファー中でピペットを用いてピペッテイングすることによりホモジナイズし、これを３０分間氷上に放置した。放置後、10,000gで1時間遠心分離することにより上清を回収した。この上清を、本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2又は本転写調節因子（NXF）を含む全細胞抽出液として以下の試験に用いた。
【００６２】
(2-8-5) ゲルシフトアッセイ
ゲルシフトアッセイを以下のようにして行った。
まず、CME二本鎖オリゴヌクレオチドは、２種のオリゴヌクレオチド（配列番号４９：5´-ctagaaatttgtacgtgccacaga-3´、配列番号５０：5´-tctgtggcacgtacaaatttctag-3´）をアニールして作製された。一方、E-box二本鎖オリゴヌクレオチド（CMEのコア配列に１塩基置換を有する塩基配列を有するＤＮＡであって、Sim2とArnt2とが結合しなくなったＤＮＡ）は、２種以下のオリゴヌクレオチド（配列番号５１：5´-caagtccacgtgcaggga-3´、配列番号５２：5´-tccctgcacgtggacttg-3´）をアニールして作製された。
作製されたCME二本鎖オリゴヌクレオチド2μgに10UのT4 kinase及び3.7MBqの[γ-32P]-ATP（AA0018;アマシャムファルマシア社製）を用いて37℃、１時間反応させることにより、その5'末端を放射能ラベルした。これをスピンカラム（ProbeQuant G50 micro columns；アマシャムファルマシア社製）で1000xgで2分間遠心分離し素通り画分を回収することにより、過剰な放射性基質が除かれた放射能ラベルCME二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。このようにして得られた放射能ラベルCME二本鎖オリゴヌクレオチド約104DPM／試験区を以下のゲルシフトアッセイにおけるhotプローブDNAとして用いた。ゲルシフトアッセイにおけるhotプローブDNAとの結合反応は、20mM HEPES （pH7.9）、１００ｍM NaCl、１ｍM DTT、5％Glycerol、0.1μg/μl Poly[dI-dC]及び前記（2-8-4）で調製された全細胞抽出液１μgからなる組成の反応液を、25℃、30分間インキュベートすることにより行われた。尚、ColdプローブDNAをCompetitorとして結合反応系内に添加する場合には、hotプローブDNAの量の100倍の量を結合反応系内に共存させた。上記の結合反応により生じた結合反応生成物を、0.5xTBE bufferを用いて、５％（アクリルアミド：ビス＝39：1）ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。電気泳動後、３MMChr濾紙にゲルを転写し、乾燥した後当該濾紙を用いてIPプレート（富士フィルム社製）を約３時間感光させた。放射能感光されたIPプレートをイメージングアナライザー（富士フィルム社製）を用いてその放射能感光部分を読み取ることにより、ゲルイメージを得た。
結果を図６に示す。本転写調節因子（NXF）とArnt属転写共役因子Arnt2とが共存するときのみにhotプローブDNA（即ち、放射能ラベルCME二本鎖オリゴヌクレオチド）との結合を示すバンドが観察された。一方、そのバンドは、大過剰のCold プローブDNAである放射能非ラベルCME二本鎖オリゴヌクレオチドを結合反応系内に共存させると消失したが、大過剰のColdプローブDNAである 放射能非ラベルE-box二本鎖オリゴヌクレオチドを結合反応系内に共存させても消失しないことから、E-box配列に結合することなく、CME配列に特異的な結合を示すバンドであることが判明した。
以上より、本発明転写活性複合体はCME配列（即ち、Arnt属転写共役因子と転写調節因子Ｓｉｍ２との転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡ）に特異的に結合することが確認された。
【００６３】
（２−９）本発明転写活性化複合体が有する転写促進能力を確認するためのCME配列応答性レポーターを用いたルシフェラーゼアッセイ
(2-9-1) pRC/RSV-hArnt2kozacの調製
Arnt2全長の哺乳動物細胞内発現プラスミドを以下のようにして作製した。
まず、pBlue-hArnt2kozacをNotIとXbaIとで同時に切断し、これを低融点アガロース電気泳動（AgaroseL；ニッポンジーン社製）に供することにより、Arnt2をコードするＤＮＡの翻訳領域全長を含むＤＮＡ（約2.2kbp）を回収した。回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。
次に、ｐRC/RSV（Invitrogen社より購入した）をNotIとXbaIとで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合することにより、Arnt2全長を哺乳動物細胞内で発現させるためのプラスミド（即ち、Arnt2全長の哺乳動物細胞内発現プラスミド）であるｐRC/RSV-hArnt2kozacを調製した。
【００６４】
(2-9-2) pRC/RSV-mNXFsense（及びpRC/RSV-mNXFantisense）の調製
次に、本転写調節因子（mNXF）全長の哺乳動物細胞内発現プラスミドを以下のようにして作製した。
まず、pGEM-mNXFは、mNXFをコードする翻訳領域の開始コドンの上流に市販のpGEMベクターのSp6プロモーターが位置するように構築されていた。そこでこのpGEM-mNXF 1μgを鋳型にして、２種のオリゴヌクレオチド（フォワードプライマー5´-gggcgctgcagcccagccaccatgtaccgatccaccaaggg-3´（配列番号５３）、リバースプライマー5´-aatctcggcgttgatctggt-3´（配列番号５４）をプライマーとしてKODplusポリメラーゼ（TOYOBO社製）を用いてPCR反応を行うことにより、本転写調節因子（mNXF）の開始コドンの直前にコザック配列（5'-CCAGCCACC-3'）とさらにその上流にPstI制限酵素部位とが導入された本転写調節因子（mNXF）ＤＮＡの部分断片を得た。尚、PCR反応条件は、95℃１分間次いで55℃３０秒間さらに72℃１分間の保温を1サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡを、PstIとBssHIIとで切断した後、これを低融点アガロース電気泳動（NusieveGTGアガロース；FMCbio社製）に供することにより精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。次に、pGEM-mNXFをPstIとBssHIIとで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡを低融点アガロース電気泳動（AgaroseL；ニッポンジーン社製）に供することにより、ＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡ（0.1μｇ）をベクターとした。このベクターに上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、本転写調節因子（mNXF）の開始コドン直前にコザック配列（5'-CCAGCCACC-3'）が導入されているpGEM-mNXFコザックを作製した。
次に、このｐGEM-mNXFコザックをPstI、NotI及びScaIの３者で同時に切断した後、これを低融点アガロース電気泳動に供することにより、mNXFコザックPstI-NotI切断断片であるＤＮＡ（約2.5kbp）を回収した。そして回収されたＤＮＡをT4ポリメラーゼを用いて平滑末端化して得られたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。RSVプロモーターを保有するpRC/RSV（Invitorgen社製）をHindIIIで切断した後T4ポリメラーゼで平滑末端化して得られたＤＮＡをBAP処理し、これをベクターとした。このベクター（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、（ａ）RSVプロモーターの制御下にmNXFコザックのセンス鎖が発現するようにしたpRC/RSV-mNXFsense、及び（ｂ）RSVプロモーターの制御下にmNXFコザック断片のアンチセンス鎖が発現するようにしたpRC/RSV-mNXFantisenseを作製した。尚、以下の試験では、このうちpRC/RSV-mNXFsenseのみを本転写調節因子（mNXF）の哺乳動物細胞内発現プラスミドとして利用した。
【００６５】
(2-9-3) pRC/RSV-hSim2kozacの調製
Sim2の哺乳動物細胞内発現プラスミドとしては、前記(2-4-5)で作製されたpRC/RSV-hSim2kozacを用いた。
【００６６】
(2-9-4) pRC/RSV-hClock kozacの調製
Clockを発現するプラスミドを以下のようにして作製した。
まず、pBlue-hClock kozacをEcoRV及びSpeIの両制限酵素で切断した。これをT4ポリメラーゼにより平滑末端化した後、これを低融点アガロース電気泳動に供することにより、ＤＮＡ（約2.5kbp：Clockの翻訳配列を含む）を回収した。回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pRC/RSVベクターをHindIIIで切断した後T4ポリメラーゼで平滑末端化して得られたＤＮＡ（0.1μg）にインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pRC/RSV-hClock kozacを作製した。
【００６７】
(2-9-5) pGL3-TATA-CMEx4の調製
TATA最小プロモーターを有するルシフェラーゼ遺伝子の上流に、CME配列（即ち、Sim１又はSim2が結合し得るＤＮＡ領域）を４コピー有するレポーター遺伝子プラスミドを以下のようにして作製した。
まず、２種のオリゴヌクレオチド（配列番号５５：5´-ctagcctagaaatttgtacgtgccacagactagaaatttgtacgtgccacagag-3´、配列番号５６：5´-ctagctctgtggcacgtacaaatttctagtctgtggcacgtacaaatttctagg-3´）をアニールさせることにより、二本鎖オリゴヌクレオチドを作製した。作製された二本鎖オリゴヌクレオチドは、CME配列（即ち、Sim1又はSim2が結合し得るＤＮＡ領域）を２コピー有し、かつ、末端がNheI制限酵素切断断片と結合できる突出末端となっている。このオリゴヌクレオチドの末端をT4 kinaseでリン酸化した後、これをT4 Ligaseを用いてタンデムに結合させることにより、結合反応生成物を得た。得られた結合反応生成物を低融点アガロース電気泳動（NusieveGTGアガロース；FMCbio社製）に供することにより、二本鎖オリゴヌクレオチドが２つタンデムに結合してなるＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pGL3-TATAベクターをNheIで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）にインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合することにより、TATA最小プロモーターを有するルシフェラーゼ遺伝子の上流に、CME配列（即ち、Sim1又はSim2が結合し得るＤＮＡ領域）を４コピー有するレポーター遺伝子プラスミドであるpGL3-TATA-CMEx4を作製した。
【００６８】
(2-9-6) pGL3-TATA-（Ebox）x3の調製
TATA最小プロモーターを有するルシフェラーゼ遺伝子の上流に、E-boxを有するレポーター遺伝子プラスミドを以下のようにして作製した。
まず、２種のオリゴヌクレオチド（配列番号５７：5´-ctttagccacgtgacagtgtaagcacacgtgggccctcaagtccacgtgcagggac-3´、配列番号５８：5´-tcgagtccctgcacgtggacttgagggcccacgtgtgcttacactgtcacgtggctaaaggtac-3´）をアニールさせることにより、二本鎖オリゴヌクレオチドを作製した。作製された二本鎖オリゴヌクレオチドは、Clockの応答性配列（即ち、E-box：Science（1998）280、1564-1567,N.Gekakis et.al.）を３コピー有し、かつ、末端がKpnIとXhoIとの切断末端に結合できるような突出末端になっている。このオリゴヌクレオチドの末端をT4 Kinaseでリン酸化して得られたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。そしてpGL3-TATAベクターをKpnIとXhoIとで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）にインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、TATA最小プロモーターを有するルシフェラーゼ遺伝子の上流に、Clockの応答性配列（即ち、E-box）を３コピー有するレポーター遺伝子プラスミドであるpGL3-TATA-（Ebox）x3を作製した。
【００６９】
(2-9-7) 本発明転写活性化複合体の転写促進能力を確認するためのレポーターアッセイ
約５ｘ１０6のHeLa細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（日水製薬社製）を用いて３７℃にて５％ＣＯ2存在下に、直径約１０ｃｍのシャーレ（ファルコン社製）を用いて培養した。翌日、培養された細胞をトリプシン処理により分散し、FBSを含まないDMEM培地で２回洗浄した後、再度５ｘ１０6に細胞密度がなるようにFBSを含まないDMEM培地に分散した。この細胞分散液0.4ｍｌに、前記（2-9-5,6）で調製されたレポーター遺伝子プラスミド（例えば３μg）、前記（2-9-1,2）で調製された蛋白質を発現するプラスミド（例えば３μg）及び前記（2-9-3,4）で調製された蛋白質を発現するプラスミド等（例えば３μg）の３者を組み合わせて混合した（表１に組み合わせの詳細を記載する。）後、この混合物をエレクトロポレーション用キュベットに移し、Geneパルサー（BIORAD社製）を用いたエレクトロポレーション法により220V、950μFの条件でトランスフェクションを行った。トランスフェクション後、培地を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に置換してさらに６穴プレート内で約24時間培養した。
【００７０】
【表１】
【００７１】
次いで、ウェルから培地を除き、器壁に接着している細胞をPBS(-)で２回洗浄した後、５倍に希釈したＰＧＣ５０（東洋インキ社製）をウェルあたり２００μｌずつ加えてさらに室温に３０分間放置した。この細胞液２０μｌずつをオペークプレート（コーニングコースター社製）上に分注し、当該プレートを酵素基質自動インジェクター付きルミノメーターＬＢ９６Ｐ（ベルトールド社製）にセットし、５０μｌの基質液ＰＧＬ１００（東洋インキ社製）を自動分注した後、各ウェル内のルシフェラーゼ活性をそれぞれ測定した。
Clockの応答性配列であるE-box配列により制御されるレポーター遺伝子の発現に対して、（ａ）本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2単独発現の場合、（ｂ）本転写調節因子（NXF）単独発現の場合及び（ｃ）本発明転写活性化複合体発現（即ち、本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2と本転写調節因子（NXF）との同時発現）の場合には何ら影響を与えないことが確認された（図７）。
一方、CME配列により制御されるレポーター遺伝子の発現に対して、（ａ’）本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2単独発現の場合及び（ｂ’）本転写調節因子（NXF）単独発現の場合には顕著な影響を与えないのに対して、（ｃ’）本発明転写活性化複合体発現（即ち、本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2と本転写調節因子（NXF）との同時発現）の場合には強い転写促進能力が示された。
このことから、本発明転写活性化複合体が結合し得るＤＮＡ領域はCME配列と同一であり、そして本発明転写活性化複合体は当該CME配列を含むプロモーターに対して転写促進作用を示すことが確認された。
また、本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2存在下で、本転写調節因子（NXF）は用量依存的にレポーター遺伝子の転写を活性化した（図８中のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ参照）。また本発明転写活性化複合体により転写活性が上昇しているところへSim2を添加していく系（図８中のＥ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）では、Sim2の用量依存的にレポーター遺伝子の転写が抑制された。陰性対照として用いたClockを上記のSim2の代わりに添加していく系（図８中のＩ、Ｊ、Ｋ、Ｌ参照）では、レポーター遺伝子の転写は抑制されなかった。
さらに、本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2存在下で、Sim２の添加によって転写が抑制されている状態に対して本転写調節因子（mNXF）を添加していく系（図９中のｂ、ｃ、ｄ、ｅ）では、mNXFの用量依存的に、Sim2による転写の抑制が解除され転写活性化が生じた。このように本転写調節因子（mNXF）は、CME配列を含むプロモーターに機能可能な形で結合しているレポーター遺伝子のSim2による転写抑制を解除することが確認された。
【００７２】
【発明の効果】
本発明により、Ｓｉｍ２／ＡＲＮＴファミリー属転写共役因子複合体と競合的にＣＭＥ配列に結合して、当該配列の下流に位置する遺伝子の転写を促進する能力を有する転写調節因子／ＡＲＮＴファミリー属転写共役因子複合体等が提供可能となった。
【００７３】
[配列表フリーテキスト]
配列番号７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１
Gal4蛋白質応答要素のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１２
Lex蛋白質応答要素のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１３
Lac I受容体蛋白質応答要素のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１４
テトラサイクリン受容体蛋白質応答要素のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１５
ZFHD-1蛋白質応答要素のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１６
ＣＭＥ配列
配列番号１７
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１８
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１９
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２０
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２１
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２２
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２３
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２４
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４９
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号５０
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号５１
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号５２
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号５３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５５
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号５６
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号５７
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号５８
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
【００７４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本ＡＲＮＴ属転写共役因子と本転写調節因子との複合体形成を確認するためのツーハイブリッドアッセイ（Gal4-NXF＋VP16-Xを用いた系）の結果を示す図である。横軸は、各試験系に用いた転写共役因子及び他を示す。左端から３番目までが本ＡＲＮＴ属転写共役因子である。左端から４番目から６番目までは非本ＡＲＮＴ属転写共役因子であり、これは比較のための試験系に相当する。右端から２番目は本転写調節因子（NXF）であり、これはホモダイマー形成の有無を調べるための試験系に相当する。また最右端はＣＰであり、これはネガティブコントロールのための試験系に相当する。縦軸は、ルシフェラーゼ活性値を示しており、これはレポーター遺伝子の転写に対する活性を表す指標値である。
【図２】本ＡＲＮＴ属転写共役因子であるＡＲＮＴ１と本転写調節因子との複合体形成を確認するためのツーハイブリッドアッセイ（Gal4-Arnt1＋VP16-Xを用いた系）の結果を示す図である。横軸は、各試験系に用いた転写調節因子を示す。最左端はSim2であり、これはポジティブコントロールのための試験系に相当する。左端から２番目はClockであり、これは比較のための試験系に相当する。右端から２番目は本転写調節因子（NXF）である。最右端はＣＰであり、これはネガティブコントロールのための試験系に相当する。縦軸は、ルシフェラーゼ活性値を示しており、これはレポーター遺伝子の転写に対する活性を表す指標値である。
【図３】本ＡＲＮＴ属転写共役因子であるＡＲＮＴ２と本転写調節因子との複合体形成を確認するためのツーハイブリッドアッセイ（Gal4-Arnt2＋VP16-Xを用いた系）の結果を示す図である。横軸は、各試験系に用いた転写調節因子を示す。左端は本転写調節因子（NXF）である。右端はＣＰであり、これはネガティブコントロールのための試験系に相当する。縦軸は、ルシフェラーゼ活性値を示しており、これはレポーター遺伝子の転写に対する活性を表す指標値である。
【図４】本ＡＲＮＴ属転写共役因子であるＡＲＮＴ３と本転写調節因子との複合体形成を確認するためのツーハイブリッドアッセイ（Gal4-Arnt3＋VP16-Xを用いた系）の結果を示す図である。横軸は、各試験系に用いた転写調節因子を示す。左端は本転写調節因子（NXF）である。右端はＣＰであり、これはネガティブコントロールのための試験系に相当する。縦軸は、ルシフェラーゼ活性値を示しており、これはレポーター遺伝子の転写に対する活性を表す指標値である。
【図５】非本ＡＲＮＴ属転写共役因子であるＢｍａｌ２と本転写調節因子との複合体形成を確認するためのツーハイブリッドアッセイ（Gal4-Bmal2＋VP16-Xを用いた系）の結果を示す図である。横軸は、各試験系に用いた転写調節因子を示す。左端はClockであり、これはポジティブコントロールのための試験系に相当する。真中は本転写調節因子（NXF）である。右端はＣＰであり、これはネガティブコントロールのための試験系に相当する。縦軸は、ルシフェラーゼ活性値を示しており、これはレポーター遺伝子の転写に対する活性を表す指標値である。
【図６】本発明転写活性化複合体が有するＤＮＡ結合性を確認するためのゲルシフトアッセイの結果を示す写真である。レーン１（最左端）はプローブのみを試料とした場合、レーン２はWild Baculo Virus（非組換え型ウィルス）感染細胞から調製された全細胞抽出液を試料とした場合、レーン３は本Arnt属転写共役因子であるArnt2を含む全細胞抽出液を試料とした場合、レーン４は本転写調節因子（NXF）を含む全細胞抽出液を試料とした場合、レーン５は本Arnt属転写共役因子であるArnt2及び本転写調節因子（NXF）（即ち、本発明転写活性化複合体に相当する）を含む全細胞抽出液を試料とした場合、レーン６は大過剰のCold プローブDNAである放射能非ラベルCME二本鎖オリゴヌクレオチドを結合反応系内に共存させた時の、本発明転写活性化複合体（即ち、Arnt2及びNXF）を含む全細胞抽出液を試料とした場合、レーン７は大過剰のCold プローブDNAである放射能非ラベルE-box二本鎖オリゴヌクレオチドを結合反応系内に共存させた時の、本発明転写活性化複合体（即ち、Arnt2及びNXF）を含む全細胞抽出液を試料とした場合を示している。レーン５及び７では、特異的な結合を示すバンド（hotプローブＤＮＡとの結合を示すバンド）が観察される。
【図７】本発明転写活性化複合体の転写促進能力を確認するためのレポーターアッセイの結果を示す図である。横軸は、各試験系に用いた応答性配列と、転写調節因子及び／又は転写共役因子転写調節因子との組み合わせを示す。最左端から４番目までがClockの応答性配列であるE-box配列を用いた系であり、これは比較のための試験系に相当する。一方、最左端から５番目以降はＣＭＥ配列を用いた系であり、本発明のための試験系に相当する。縦軸は、ルシフェラーゼ活性値を示しており、これはレポーター遺伝子の転写に対する活性を表す指標値である。最右端では、CME配列により制御されるレポーター遺伝子の発現に対する、本発明転写活性化複合体（即ち、本ＡＲＮＴ属転写共役因子であるArnt2と本転写調節因子（NXF）との同時発現）の強い転写促進能力が確認される。
【図８】本発明転写活性化複合体の転写促進能力を確認するためのレポーターアッセイ（CME配列を含むプロモーターに機能可能な形で結合しているレポーター遺伝子を用いる系）の結果を示す図である。横軸は、各試験系に用いた本ＡＲＮＴ属転写共役因子であるＡＲＮＴ２と、各種の転写調節因子（Clock、NXF又はSim2）との組み合わせを示す。最左端から４番目まで（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）が本ＡＲＮＴ属転写共役因子であるArnt2存在下での本転写調節因子（NXF）によるレポーター遺伝子の転写活性に関する用量依存性の試験系に相当する。最左端から５番目から８番目まで（Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）が本ＡＲＮＴ属転写共役因子であるArnt2存在下での本転写調節因子（NXF）によるレポーター遺伝子の転写活性に対するSim2の影響性の試験系に相当する。最左端から９番目から１２番目まで（Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ）が本ＡＲＮＴ属転写共役因子であるArnt2存在下での本転写調節因子（NXF）によるレポーター遺伝子の転写活性に対するClockの影響性の試験系であって、ネガティブコントロールに相当する。
【図９】本発明転写活性化複合体の転写促進能力を確認するためのレポーターアッセイ（CME配列を含むプロモーターに機能可能な形で結合しているレポーター遺伝子を用いる系）の結果を示す図である。横軸は、各試験系に用いた本ＡＲＮＴ属転写共役因子であるＡＲＮＴ２と、各種の転写調節因子（NXF及び／又はSim2）との組み合わせを示す。最左端から２番目以降（ｂ、ｃ、ｄ、ｅ）は本ＡＲＮＴ属転写共役因子であるＡＲＮＴ２の共存時における、Sim2存在下での本転写調節因子（NXF）によるレポーター遺伝子の転写活性に対する本転写調節因子（NXF）の影響性の試験系に相当する。最左端（ａ）は本ＡＲＮＴ属転写共役因子であるＡＲＮＴ２の共存時における、転写調節因子Ｓｉｍ２非存在下での本転写調節因子（NXF）によるレポーター遺伝子の転写活性に関する試験系であって、コントロールに相当する。
【発明の属する技術分野】
本発明は、転写活性化複合体及びその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ダウン症は、常染色体異常に起因する疾患である。ダウン症の患者では、体細胞中の染色体２１番が正常の２本ではなく、トリソミー（三本）になっており、これが原因で精神遅滞、成長の異常、心臓病、白血病、早期に発症するアルツハイマー症等を生じる。
今までに当該疾患原因遺伝子の単離同定及び機能解析等に関連する多くの研究がなされた結果、中枢神経系細胞の発生、分化において重要な働きをする転写調節因子として知られる Single-minded 2 （以下、Ｓｉｍ２と記す。）の遺伝子が、ヒト染色体２１番上のダウン症候群のクリティカル領域（q22.2）に存在しており、このクリティカル領域のみがトリソミーになってもダウン症の症状が発現することから、Ｓｉｍ２遺伝子の発現産物の細胞中での量が増えることがダウン症候群の病因となる要素であることが示唆されている。また、ＡＲＮＴ１又はＡＲＮＴ２等のＡＲＮＴファミリーに属する転写共役因子（以下、ＡＲＮＴファミリー属転写共役因子と記すこともある。）とＳｉｍ２とが結合してなる転写抑制化複合体が、ＣＭＥ配列（5'-ACGTG-3'：中枢神経系の正中線における転写に必要な塩基配列のコア配列であって、前記転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡの塩基配列：配列番号１６）に対して抑制的に働くこと、すなわち、前記転写抑制化複合体がＣＭＥ配列に結合して、その下流に位置する遺伝子の転写を抑制すること等が明らかにされており、当該転写抑制化複合体による転写抑制の亢進がダウン症候群の原因の一つであると現在考えられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記の知見に基づき、ＣＭＥ配列に結合して転写を促進する能力を有する転写調節因子／ＡＲＮＴファミリー属転写共役因子複合体を見出し、それをＳｉｍ２／ＡＲＮＴファミリー属転写共役因子複合体に対して競合的に働かせることにより、ダウン症の患者の治療に応用することが期待されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況の下、鋭意検討した結果、ある種のＡＲＮＴファミリー属転写共役因子とある種の転写調節因子との複合体が、ＣＭＥ配列に結合して転写を促進する能力を有することを見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかと、下記のいずれかのアミノ酸配列（以下、本アミノ酸配列と記すこともある。）を有する転写調節因子（以下、本転写調節因子と記すこともある。）との複合体であって、前記転写共役因子と転写調節因子Ｓｉｍ２との転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡに結合する能力を有し、前記ＤＮＡ領域の下流に位置する遺伝子の転写を促進する能力を有することを特徴とする転写活性化複合体（以下、本発明転写活性化複合体と記すこともある。）、
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列
２．前項１記載の転写活性化複合体を産生する能力を有し、前記複合体を構成する蛋白質をコードする１種以上のＤＮＡが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体と記すこともある。）；
３．下記の（１）および（２）のＤＮＡを含有する一種のベクター又は前記ＤＮＡを個別に有する複数種のベクター（以下、これらを一括して本ベクターと記すこともある。）が宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体、
＜ＤＮＡ＞
（１）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
（２）本アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
４．転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかと転写調節因子Ｓｉｍ２との転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡを含むプロモーターを機能可能な形で結合しているレポーター遺伝子のＤＮＡをさらに含有することを特徴とする前項２又は３記載の形質転換体；
５．物質が有する、前項１記載の転写活性化複合体が有する転写促進能力を調節する能力（以下、本調節能力と記すこともある。）の評価方法であって、
（１）前項４記載の形質転換体と被験物質とを接触させる第一工程、
（２）前記第一工程後に、前記形質転換体が有するレポーター遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、及び
（３）前記第二工程により測定された発現量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記物質の前記転写活性化複合体が有する転写促進能力を調節する能力を評価する第三工程；
を有することを特徴とする評価方法（以下、本発明評価方法と記すこともある。）；
６．前項５記載の評価方法により評価された調節能力に基づき、前記転写活性化複合体が有する転写促進能力を調節する能力を有する物質を選抜する工程、
を有することを特徴とする探索方法（以下、本発明探索方法と記すこともある。）；
７．前項６記載の探索方法により選抜された物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする治療剤（以下、本発明治療剤と記すこともある。）；
８．ダウン症改善剤であることを特徴とする前項７記載の治療剤；
９．下記の（１）および（２）のＤＮＡを含有する一種のベクター又は前記ＤＮＡを個別に有する複数種のベクターの、ダウン症改善剤としての使用；
＜ＤＮＡ＞
（１）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
（２）本アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
１０．下記の構成要素Ｉのうちのいずれか一方の構成要素（Ａ又はＢ）及び下記の構成要素ＩＩのうちのいずれか一方の構成要素（Ｘ又はＹ）を有する蛋白質と、下記の構成要素Ｉのうちの他方の構成要素（Ｂ又はＡ）及び下記の構成要素ＩＩのうちの他方の構成要素（Ｙ又はＸ）を有する蛋白質とが結合してなることを特徴とする転写活性化複合体（以下、本発明転写活性化複合体２と記すこともある。）、
＜構成要素Ｉ＞
（Ａ）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかに由来し、下記のいずれかのアミノ酸配列を有する転写調節因子が結合する領域、又は
（Ｂ）本アミノ酸配列を有する転写調節因子に由来し、転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかが結合する領域
＜構成要素ＩＩ＞
（Ｘ）宿主細胞内で機能可能な転写調節因子のＤＮＡ結合領域、又は
（Ｙ）宿主細胞内で機能可能な転写調節因子の転写活性化領域
１１．前記構成要素ＩＩの（Ｘ）が、下記のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡに結合するＤＮＡ結合領域であることを特徴とする前項１０記載の転写活性化複合体。
＜ＤＮＡ配列群＞
（１）Ｇａｌ４蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列、
（２）Ｌｅｘ蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列、
（３）Ｌａｃ Ｉ受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列、
（４）テトラサイクリン受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列
（５）ＺＦＨＤ−１蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列
（６）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかと転写調節因子Ｓｉｍ２との転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡの塩基配列；
１２．前記構成要素ＩＩの（Ｙ）が、下記のいずれかの蛋白質由来の転写活性化領域であることを特徴とする前項１０記載の転写活性化複合体、
＜蛋白質＞
（１）Ｇａｌ４蛋白質、
（２）Ｌｅｘ蛋白質、
（３）Ｌａｃ Ｉ受容体蛋白質、
（４）テトラサイクリン受容体蛋白質、
（５）ＺＦＨＤ−１蛋白質、
（６）Ｂ４２蛋白質
（７）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかの蛋白質、
（８）ＶＰ１６蛋白質
１３．前記両者の蛋白質がリガンドによる制御下において結合してなることを特徴とする前項１０記載の転写活性化複合体；
１４．前記構成要素Ｉの（Ｂ）が、前記リガンドが結合する領域を有することを特徴とする前項１３記載の転写活性化複合体；
１５．（１）下記の構成要素ｉのうちのいずれか一方の構成要素（ａ又はｂ）及び下記の構成要素ｉｉのうちのいずれか一方の構成要素（ｘ又はｙ）を含有するＤＮＡと、
（２）下記の構成要素ｉのうちの他方の構成要素（ｂ又はａ）及び下記の構成要素ｉｉのうちの他方の構成要素（ｙ又はｘ）を含有するＤＮＡと、
（３）下記の構成要素ｉｉｉを含有するＤＮＡと
が宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体２と記すこともある。）、
＜構成要素ｉ＞
（ａ）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかに由来し、本アミノ酸配列を有する転写調節因子が結合する領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、又は
（ｂ）下記のいずれかのアミノ酸配列を有する転写調節因子に由来し、転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかが結合する領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
＜構成要素ｉｉ＞
（ｘ）宿主細胞内で機能可能な転写調節因子のＤＮＡ結合領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、又は
（ｙ）宿主細胞内で機能可能な転写調節因子の転写活性化領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
＜構成要素ｉｉｉ＞
構成要素ｉｉの（ｘ）の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合領域が結合可能なＤＮＡ、および、構成要素ｉｉの（ｙ）の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有する転写活性化領域により活性化されうるプロモーターの下流に接続されたレポーター遺伝子のＤＮＡ；
１６．前記構成要素ｉｉの（ｘ）が、下記のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡに結合する蛋白質由来のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とする前項１５記載の形質転換体、
＜塩基配列群＞
（１）Ｇａｌ４蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列、
（２）Ｌｅｘ蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列、
（３）Ｌａｃ Ｉ受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列、
（４）テトラサイクリン受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列
（５）ＺＦＨＤ−１蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列
（６）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかと転写調節因子Ｓｉｍ２との転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡの塩基配列；
１７．前記構成要素ｉｉの（ｙ）が、下記のいずれかの蛋白質由来のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とする前項１５記載の形質転換体。
＜蛋白質＞
（１）Ｇａｌ４蛋白質、
（２）Ｌｅｘ蛋白質、
（３）Ｌａｃ Ｉ受容体蛋白質、
（４）テトラサイクリン受容体蛋白質、
（５）ＺＦＨＤ−１蛋白質、
（６）Ｂ４２蛋白質、
（７）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかの蛋白質、
（８）ＶＰ１６蛋白質；
１８．ツーハイブリッドアッセイのための、前項１０記載の転写活性化複合体の使用；
１９．ツーハイブリッドアッセイのための、前項１５記載の形質転換体の使用；
２０．物質が有する、前項１５記載の形質転換体が産生する転写活性化複合体の転写促進能力を調節する能力の評価方法であって、
（１）前項１５記載の形質転換体と被験物質とを接触させる第一工程、
（２）前記第一工程後に、前記形質転換体が有するレポーター遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、及び
（３）前記第二工程により測定された発現量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記物質の転写活性調節能力を評価する第三工程
を有することを特徴とする評価方法；
２１．前項２０記載の評価方法により評価された転写活性調節能力に基づき、前記転写活性化複合体が有する転写促進能力を調節する能力を有する物質を選抜する工程を有することを特徴とする探索方法；
２２．前項２１記載の探索方法により選抜された物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする治療剤；
２３．ダウン症改善剤であることを特徴とする前項２２記載の治療剤；
２４．（１）標識されたリガンドが結合している前項１記載の転写活性化複合体と被験物質とを接触させる工程、及び
（２）前記転写活性化複合体と前記被験物質との結合状態を、前記標識されたリガンドと当該被験物質との競合により生じる遊離型の標識されたリガンド又は結合型の標識されたリガンドの量又はその量に相関関係を有する指標値をモニターすることにより間接的に確認する工程
を有することを特徴とするレセプターバインディングアッセイ（以下、本発明バインディングアッセイと記すこともある。）；
等を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本アミノ酸配列を有する転写調節因子に関して、本アミノ酸配列において認められる、配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列との相違としては、アミノ酸の欠失、置換、修飾、付加等の変異をあげることができる。これらには、部位特異的変異導入法や突然変異処理等によって人為的に導入され得る変異に加えて、動物の系統、個体、器官、組織等の違いによるアミノ酸配列の相違などの天然に生ずる多型変異も含まれる。例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する転写調節因子（以下、ｈＮＸＦと記すこともある。）は、ヒト由来の本転写調節因子であり、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する転写調節因子（以下、ｍＮＸＦと記すこともある。）は、マウス由来の本転写調節因子であり、また、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する転写調節因子（以下、ｒＮＸＦと記すこともある。）は、ラット由来の本転写調節因子である。
【０００６】
本発明において「配列同一性」とは、２つの塩基配列又は２つのアミノ酸配列の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の全領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象の塩基配列又はアミノ酸配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を許容してもよい。このような配列同一性は、例えば、FASTA［Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA，4, 2444-2448(1988)］、BLAST［Altschulら、Journal of Molecular Biology, 215, 403-410(1990)］、CLUSTAL W［Thompson,Higgins＆Gibson, Nucleic Acid Research, 22, 4673-4680(1994a)］等のプログラムを用いて相同性解析を行いアラインメントを作成することによって算出することができる。上記のプログラムは、例えば、DNA Data Bank of Japan［国立遺伝学研究所 生命情報・ＤＤＢＪ研究センター (Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan ;CIB/DDBJ)内で運営される国際ＤＮＡデータバンク］のホームページ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）等において、一般的に利用可能である。また、配列同一性は、Vector NTI、GENETYX-WIN Ver.5（ソフトウェア開発株式会社製）等の市販の配列解析ソフトウェアを用いて求めることもできる。
本アミノ酸配列におけるアミノ酸同一性は、例えば、９０％以上であることが好ましい。
【０００７】
また、本アミノ酸配列に関して、「ストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡ」としては、例えば、高イオン濃度下[例えば、6XSSC（900mM塩化ナトリウム、90mMクエン酸ナトリウム）などが用いられる。]に、65℃の温度条件でハイブリダイズさせることによりDNA-DNAハイブリッドを形成し、低イオン濃度下[例えば、0.1 X SSC（15mM塩化ナトリウム、1.5mMクエン酸ナトリウム）などが用いられる。]に、65℃の温度条件で30分間洗浄した後でも該ハイブリッドが維持されうるＤＮＡをあげることができる。
【０００８】
本アミノ酸配列を有する転写調節因子の転写調節能は、例えば、下記のレポーター遺伝子を用いたアッセイ等に基づき評価することができる。
まず、本ＡＲＮＴ属転写共役因子と転写調節因子Ｓｉｍ２との転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡ（5'-ACGTG-3'、配列番号１６：以下、本応答性ＤＮＡと記すこともある。）を含む転写制御ＤＮＡの下流に連結されたレポーター遺伝子と被験転写調節因子のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子とが宿主細胞に導入されてなる形質転換体を作製し、次に前記形質転換体が有する前記レポーター遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定し、さらに測定された発現量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記被験転写調節因子が有する転写調節能を評価すればよい。
上記の転写調節能としては、本応答性ＤＮＡの下流に位置する遺伝子（上記のレポーター遺伝子を用いたアッセイの場合には、レポーター遺伝子を意味する。）の転写を促進する能力又は転写を抑制する能力等があげられる。
上記の評価方法におけるレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、成長ホルモン遺伝子などを利用することができ、宿主細胞における安定性が比較的高いレポーター蛋白質をコードする遺伝子が好ましい。
【０００９】
まず、本応答性ＤＮＡを含む転写制御ＤＮＡの下流に連結されたレポーター遺伝子と被験転写調節因子のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、被験転写調節因子の遺伝子と記すこともある。）とを、宿主細胞（例えば、HeLa細胞、CV-1細胞、Hepa1細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、COS1細胞、BF-2細胞、CHH-1細胞等）に導入することによって形質転換体を作製する。ここで、被験転写調節因子の遺伝子は、例えば、後述のように、宿主細胞で機能可能なプロモーターと機能可能な形で結合されて基本ベクターに組み込まれた形で宿主細胞へ導入するとよい。本応答性ＤＮＡを含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子も、基本ベクターに組み込まれた形で用いるとよい。また例えば、本応答性ＤＮＡを含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子が組み込まれたベクターと、宿主細胞で機能可能なプロモーターと機能可能な形で結合された被験転写調節因子の遺伝子を保有するベクターとを、マーカー遺伝子を有するベクターとともに宿主細胞に導入する。次いで当該細胞を通常数週間培養した後、導入されたマーカー遺伝子の発現量に基づき目的とする形質転換体を選抜することにより、本応答性ＤＮＡを含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子及び宿主細胞で機能可能なプロモーターと機能可能な形で結合された被験転写調節因子の遺伝子が、宿主細胞に導入されてなる形質転換体を取得することができる。
ここで「宿主細胞で機能可能なプロモーター」としては、例えば、宿主細胞が出芽酵母細胞である場合には、GAL1プロモーターのような誘導型プロモーターや、ADHプロモーターのような恒常的に発現するプロモーター等を使用することができる。宿主細胞が動物細胞である場合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター等をあげることができる。また、転写制御領域としては、例えば、宿主細胞で機能可能な最小プロモーターである、宿主細胞で発現可能な遺伝子由来の最小TATAボックス配列からなるＤＮＡをあげることができ、具体的には、TATAボックス及び転写開始点近傍の約５０塩基程度からなる塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。
【００１０】
上述のように作製された形質転換体を、例えば、数時間から数日間培養した後、当該形質転換体が有する前記レポーター遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する。具体的には、レポーター遺伝子が発現すると、当該レポーター遺伝子にコードされるレポーター蛋白質が前記形質転換体の細胞内等に蓄積されるかもしくは培地中に分泌される。このレポーター蛋白質の量又はその量と相関関係を有する指標値を測定することにより、当該形質転換体の細胞あたりのレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値を測定する。具体的には、例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いた場合には、前記形質転換体から調製された細胞粗抽出物にルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを加えると、当該細胞粗抽出物中のルシフェラーゼ量に比例した強度で発光する。従って、この発光強度をルミノメーター等の測定装置で測定することにより、ルシフェラーゼ量、ひいては、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を知ることができる。同様にして、本応答性ＤＮＡを含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子を含むが、被験転写調節因子の遺伝子を含まない形質転換体（即ち、対照形質転換体）におけるレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値を測定し、当該測定値と上記のレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値とを比較することにより、被験転写因子の遺伝子が有する転写調節能を評価することができる。
【００１１】
本アミノ酸配列を有する転写調節因子（即ち、本転写調節因子）をコードするＤＮＡ（以下、本転写調節因子ＤＮＡと記すこともある。）は、例えば、ヒト、マウス、ラットなどの動物の組織から、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラー クローニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory発行、1989年）等に記載の遺伝子工学的方法に準じて取得することができる。
具体的には、まず、ヒト、マウス、ラットなどの動物の組織由来の全RNAを調製する。例えば、脳の組織を塩酸グアニジンやグアニジンチオシアネート等の蛋白質変性剤を含む溶液中で粉砕し、さらに該粉砕物にフェノール、クロロホルム等を加えることにより蛋白質を変性させる。変性蛋白質を遠心分離等により除去した後、回収された上清画分から塩酸グアニジン／フェノール法、SDS−フェノール法、グアニジンチオシアネート／CsCl法等の方法により全RNAを抽出する。なお、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、例えばISOGEN（ニッポンジーン製）がある。得られた全RNAを鋳型としてオリゴdTプライマーをRNAのポリA配列にアニールさせ、逆転写酵素により一本鎖cDNAを合成する。次いで、合成された一本鎖cDNAを鋳型とし、かつ大腸菌RNaseHを用いてRNA鎖にニックとギャップを入れることにより得られるRNAをプライマーとして大腸菌のDNAポリメラーゼＩを用いて二本鎖のcDNAを合成する。更に、合成された二本鎖cDNAの両末端をT4 DNAポリメラーゼにより平滑化する。末端が平滑化された二本鎖cDNAは、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿等の通常の方法により精製、回収する。なお、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、例えばcDNA合成システムプラス（アマシャムファルマシアバイオテク社製）やTimeSaver cDNA合成キット（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等があげられる。次に、得られた二本鎖cDNAを例えば、プラスミドpUC118やファージλgt10などのベクターとリガーゼを用いて連結することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。尚、ｃＤＮＡライブラリーとしては、市販のｃＤＮＡライブラリー（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製やＣｌｏｎｔｅｃｈ社製等）を用いることも可能である。
また、ヒト、マウス、ラットなどの動物の組織片から、例えば、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラー クローニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory発行、1989年）や、村松正寶、”ラボマニュアル遺伝子工学”（丸善１９８８）等に記載される通常の方法に準じてゲノムＤＮＡを調製する。例えば試料が毛髪の場合には、毛髪２〜３本を滅菌水、次いでエタノールで洗浄した後、2〜3 mmの長さに切断し、これにBCL-Buffer［10mM Tris-HCl(pH7.5), 5 mM MgCl2, 0.32M Sucrose, 1 Triton X-100］200μｌを加え、さらにProteinaseKを最終濃度100μｌ/ml 、ＳＤＳを最終濃度0.5 （w/v）になるようにそれぞれ加え混合する。この混合物を70℃で1時間保温した後、フェノール／クロロホルム抽出を行うことによりゲノムＤＮＡを得ることができる。また、試料が末梢血の場合は、DNA-Extraction kit(Stratagene社製)等を用いて該試料を処理することによりゲノムＤＮＡを得ることができる。得られたゲノムＤＮＡをλgt10などのベクターとリガーゼを用いて連結することによりゲノムＤＮＡライブラリーが得られる。尚、ゲノムＤＮＡライブラリーとしては、市販のゲノムＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製等）を用いることも可能である。
【００１２】
上記のようなcDNAライブラリーやゲノムＤＮＡライブラリーから、例えば、配列番号４、５、６又は５９（もしくは６０）のいずれかで示される塩基配列の部分塩基配列又は該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲと記す。）や、配列番号４、５、６又は５９（もしくは６０）のいずれかで示される塩基配列又は該塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により、本転写調節因子ＤＮＡを取得することができる。
ＰＣＲに用いられるプライマーとしては、例えば、約10塩基から約50塩基程度の長さのオリゴヌクレオチドであって、配列番号４、５、６又は５９（もしくは６０）のいずれかで示される塩基配列の５’非翻訳領域から選択した塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び、配列番号４、５、６又は５９（もしくは６０）のいずれかで示される塩基配列の３’非翻訳領域から選択した塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。具体的には、フォワードプライマーとしては、例えば、配列番号７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドや配列番号８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをあげることができる。また、リバースプライマーとしては、例えば、配列番号９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドや配列番号１０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをあげることができる。PCRの条件としては、例えば、反応液50μl中に、LA-Taqポリメラーゼ用10倍濃緩衝液（宝酒造社製）5μl、2.5mM dNTP混合液（各2.5mMのdATP,dGTP,dCTP及びdTTPを含む。）５μl（dATP,dGTP,dCTP及びdTTP各々の終濃度が0.25mM）、20μMプライマー 各0.25〜1.25μl（終濃度が0.1〜0.5μM）、鋳型cDNA 0.1〜0.5μg、LA-Taqポリメラーゼ（宝酒造社製）1.25ユニットを含む組成の反応液にて、95℃で1分間次いで68℃で3分間の保温を1サイクルとしてこれを35サイクル行う等の条件が挙げられる。
【００１３】
ハイブリダイゼーション法に用いられるプローブとしては、例えば、配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号５９で示される塩基配列の塩基番号１４１９〜６１６４で表される塩基配列からなるＤＮＡ、又はこれらＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ等があげられる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、6×SSC（0.9M塩化ナトリウム、0.09Mクエン酸ナトリウム）、5×デンハルト溶液（0.1(w/v)フィコール400、0.1(w/v)ポリビニルピロリドン、0.1(w/v)BSA）、0.5(w/v)SDS及び100μg/ml変性サケ精子DNA存在下に、65℃で保温し、次いで１×SSC（0.15M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリウム）及び0.5(w/v)SDS存在下に、室温で15分間の保温を2回行い、さらに0.1×SSC（0.015M 塩化ナトリウム、0.0015Mクエン酸ナトリウム）及び0.5(w/v)SDS存在下に、68℃で30分間保温する条件等をあげることができる。また、例えば、5xSSC、50mM HEPES pH7.0、10xデンハルト溶液及び20μg/ml変性サケ精子DNA存在下に65℃にて保温し、次いで2xSSC中で室温にて３０分間の保温を行い、さらに0.1xSSC中で６５℃にて４０分間の保温を２回行う条件をあげることもできる。
尚、本転写調節因子ＤＮＡは、例えば配列番号４、５、６又は５９（もしくは６０）のいずれかで示される塩基配列に基づいて、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller,M.et al.,Nature,310,105,1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製することもできる。
【００１４】
このようにして得られた本転写調節因子ＤＮＡは、例えば、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラー クローニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング ハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、1989年等に記載の遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングすることができる。具体的には例えば、TAクローニングキット（Invitrogen社）やpBluescriptII（Stratagene社）などの市販のプラスミドベクターを用いてクローニングすることができる。
得られた本転写調節因子ＤＮＡの塩基配列は、Maxam Gilbert法 (例えば、Maxam,A.M & W.Gilbert,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,560,1977等に記載される)やSanger法（例えばSanger,F. & A.R.Coulson,J.Mol.Biol.,94,441,1975、Sanger,F,& Nicklen and A.R.Coulson.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463,1977等に記載される）等により確認することができる。
本転写調節因子ＤＮＡの具体例としては、配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜２４５６で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列、配列番号５９で示される塩基配列の塩基番号１４１９〜６１６４で表される塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。
【００１５】
本転写調節因子ＤＮＡを、当該遺伝子が導入される宿主細胞において利用可能なベクター（以下、基本ベクターと記す。）、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖でき、宿主細胞からの単離、精製が可能であり、検出可能なマーカーをもつベクターに、通常の遺伝子工学的手法に準じて組み込むことにより本転写調節因子ＤＮＡベクターを構築することができる。
本転写調節因子ＤＮＡベクターの構築に用いることができる基本ベクターとしては、具体的には大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えば、プラスミドpUC119(宝酒造社製)やファージミドpBluescriptII(Stratagene社製)等をあげることができる。出芽酵母を宿主細胞とする場合には、プラスミドpGBT9、pGAD424、pACT2(Clontech社製)等をあげることができる。また、哺乳類動物細胞を宿主細胞とする場合には、pRc/RSV、pRc/CMV(Invitrogen社製)等のプラスミド、ウシパピローマウイルスプラスミドpBPV(アマシャムファルマシアバイオテク社製)もしくはEBウイルスプラスミドpCEP4(Invitrogen社製)等のウイルス由来の自律複製起点を含むベクター、ワクシニアウイルス等のウイルス等をあげることができる。さらに、昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合には、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスをあげることができる。自律複製起点を含むベクター、例えば、上記の酵母用プラスミドpACT2や、ウシパピローマウイルスプラスミドpBPV、EBウイルスプラスミドpCEP4等を用いて本転写調節因子ＤＮＡベクターを構築すると、当該ベクターは宿主細胞に導入された際にエピソームとして細胞内に保持される。
バキュロウイルスやワクシニアウイルス等のウイルスに本転写調節因子ＤＮＡを組み込むには、使用しようとするウイルスのゲノムと相同な塩基配列を含有するトランスファーベクターを用いればよい。このようなトランスファーベクターとしては、例えば、Pharmingen社から市販されているpVL1392,pVL1393(Smith,G.E.,Summers M.D.et al.:Mol.Cell.Biol.,3,2156-2165(1983))、pSFB5(Funahashi,S.et al.:J.Virol.,65,5584-5588(1991))等のプラスミドをあげることができる。本転写調節因子ＤＮＡを前記のようなトランスファーベクターに挿入し、当該トランスファーベクターとウイルスのゲノムとを同時に宿主細胞に導入すると、トランスファーベクターとウイルスのゲノムとの間で相同組換えが起こり、本転写調節因子ＤＮＡがゲノム上に組み込まれたウイルスを得ることができる。ウイルスのゲノムとしては、Baculovirus,Adenovirus,Vacciniavirusなどのゲノムを用いることができる。
より具体的には、例えば、バキュロウイルスに本転写調節因子ＤＮＡを組み込む場合には、まずトランスファーベクターpVL1393,pVL1392等のマルチクローニング部位に本転写調節因子ＤＮＡを挿入した後、該トランスファーベクターのDNAとBaculovirus genome DNA(Baculogold;Pharmingen社製)とを昆虫細胞Sf21株（ATCCから入手可能）にリン酸カルシウム法等によって導入することにより、得られる細胞を培養する。次いで培養液から遠心分離等により、本転写調節因子ＤＮＡが挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイルス粒子を回収し、回収されたウィルス粒子をフェノール等で除蛋白処理することにより、本転写調節因子ＤＮＡを含有するウイルスのゲノムを得ることができる。さらに、得られたウイルスのゲノムを、昆虫細胞Sf21株等のウイルス粒子形成能力を有する宿主細胞にリン酸カルシウム法等によって導入することにより、得られる細胞を培養する。このようにして本転写調節因子ＤＮＡを含有するウイルス粒子を増やすことができる。
一方、マウス白血病レトロウイルス等の比較的小さなゲノムに本転写調節因子ＤＮＡを組み込むには、トランスファーベクターを利用せずに、本転写調節因子ＤＮＡを直接組み込むこともできる。例えば、ウイルスベクタ-DC(X)（Eli Gilboa et al.,BioTechniques,4,504-512(1986)）等は、当該ベクター上のクローニング部位に本転写調節因子ＤＮＡを組み込む。得られた本転写調節因子ＤＮＡの組み込れたウイルスベクターを、例えば、Ampli-GPE（J.Virol.,66,3755(1992)）等のパッケージング細胞に導入することにより、本転写調節因子ＤＮＡの挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイルス粒子を得ることができる。
【００１６】
本転写調節因子ＤＮＡの上流に、宿主細胞で機能可能なプロモーターを機能可能な形で結合させ、これを上述のような基本ベクターに組み込むことにより、本転写調節因子ＤＮＡを宿主細胞で発現させることの可能な本転写調節因子ＤＮＡベクターを構築することができる。ここで、「機能可能な形で結合させる」とは、本転写調節因子ＤＮＡが導入される宿主細胞において、プロモーターの制御下に本転写調節因子ＤＮＡが発現されるように、当該プロモーターと本転写調節因子ＤＮＡとを結合させることを意味する。宿主細胞で機能可能なプロモーターとしては、導入される宿主細胞内でプロモーター活性を示すＤＮＡをあげることができる。例えば、宿主細胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター（lacP）、トリプトファンオペロンのプロモーター(trpP)、アルギニンオペロンのプロモーター(argP)、ガラクトースオペロンのプロモーター(galP)、tacプロモーター、T7プロモーター、T3プロモーター、λファージのプロモーター(λ-pL、λ-pR)等をあげることができ、宿主細胞が動物細胞や分裂酵母である場合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、シミアンウイルス(SV40)の初期又は後期プロモーター、マウス乳頭腫ウイルス(MMTV)プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞が出芽酵母である場合には、ADH1プロモーター等あげることができる。また、宿主細胞において機能するプロモーターをあらかじめ保有する基本ベクターを使用する場合には、前記プロモーターと本転写調節因子ＤＮＡとが機能可能な形で結合するように、前記プロモーターの下流に本転写調節因子ＤＮＡを挿入すればよい。例えば、前述のプラスミドpRc/RSV、pRc/CMV等には、動物細胞で機能可能なプロモーターの下流にクローニング部位が設けられている。当該クローニング部位に本転写調節因子ＤＮＡを挿入することによって得られるベクターを動物細胞へ導入することにより、当該動物細胞において本転写調節因子ＤＮＡを発現させることができる。これらのプラスミドにはあらかじめSV40の自律複製起点（ori）が組み込まれているため、oriを欠失したSV40ゲノムで形質転換された培養細胞、例えば、COS細胞等に当該プラスミドを導入すると、細胞内でプラスミドのコピー数が非常に増大し、結果として当該プラスミドに組み込まれた本転写調節因子ＤＮＡを大量発現させることもできる。また前述の酵母用プラスミドpACT2はADH1プロモーターを有しており、当該プラスミド又はその誘導体のADH1プロモーターの下流に本転写調節因子ＤＮＡを挿入すれば、本転写調節因子ＤＮＡを、例えば、CG1945(Clontech社製)等の出芽酵母内で大量発現させることが可能な本転写調節因子ＤＮＡベクターが構築できる。
【００１７】
本発明転写活性化複合体を構成するもう一方の蛋白質、即ち、転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれか（以下、本ＡＲＮＴ属転写共役因子と記すこともある。）とは、ＡＲＮＴ１、ＡＲＮＴ２又はＡＲＮＴ３（ＢＭＡＬ１と呼ばれることもある。）のいずれかのＡＲＮＴファミリー属転写共役因子である。これら転写共役因子は、相互比較において高い配列同一性を有する転写共役因子である。このような転写共役因子は、転写調節因子Ｓｉｍ２と転写抑制化複合体を形成することにより、配列番号１６（5'-ACGTG-3'）で示されるＤＮＡに結合する能力を有し、前記ＤＮＡの下流に位置する遺伝子の転写を抑制する能力を有する。これらの転写共役因子のうち、ＡＲＮＴ１又はＡＲＮＴ２を好ましいものとしてあげることができる。
【００１８】
転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ（以下、本ＡＲＮＴ属転写共役因子ＤＮＡと記すこともある。）の調製方法としては、データベースに公開されているヒト由来のＡＲＮＴ１（accession no. NM_001668）、ヒト由来のＡＲＮＴ２（accession no. AB002305）、ヒト由来のＡＲＮＴ３（accession no. D89722）等をコードする塩基配列に基づき、その５’非翻訳領域の部分塩基配列を有するLong PCR用のプライマーと３’非翻訳領域の部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するLong PCR用のプライマーとを設計し、これらプライマーにより挟まれる遺伝子の領域、即ち、本ＡＲＮＴ属転写共役因子をコードする翻訳領域の全長を有するＤＮＡ、をヒト脳ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲで増幅することにより得る方法等をあげることができる。
本ＡＲＮＴ属転写共役因子ＤＮＡを有するベクターを作製するには、上記の本転写調節因子ＤＮＡベクターの作製方法において本転写調節因子ＤＮＡの代わりに本ＡＲＮＴ属転写共役因子ＤＮＡを用いること以外は基本的に同様な方法に準じて作製すればよい。
【００１９】
（１）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ（即ち、本ＡＲＮＴ属転写共役因子ＤＮＡ）、及び、（２）本アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ（即ち、本転写調節因子ＤＮＡ）、の両ＤＮＡを含有する一種のベクターの作製方法としては、例えば、同じプラスミドに２つの遺伝子を組み込み同時に発現させる目的の発現ベクター［ｐＢＩベクター（Clontech社製）等］に、転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと本アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡとの両者を組み込む方法をあげることができる。また、上記２種のＤＮＡを個別に含有する複数種のベクターの作製方法としては、例えば、ｐＲＣ／ＲＳＶベクター（Invitrogen社製）等の通常の発現ベクターに、転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと本アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡとを別々に組み込む方法があげられる。
上記の両ＤＮＡを含有する一種のベクター又は前記ＤＮＡを個別に有する複数種のベクターをダウン症改善剤として使用することもできる。
【００２０】
本発明転写活性化複合体は、本発明形質転換体を培養し、産生された（１）本発明転写活性化複合体、あるいは、（２）本ＡＲＮＴ属転写共役因子及び本転写活性化因子、を培養物から回収することにより取得することができる。また、本発明転写活性化複合体を発現する形質転換体の形態で本発明転写活性化複合体を利用することもできる。
本発明転写活性化複合体は、本発明転写活性化複合体を産生する能力を有する一つ又は複数からなるベクターを宿主細胞に導入することにより作製することができる。具体的には、（１）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、及び、（２）本アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、の両ＤＮＡを含有する一種のベクター又は前記ＤＮＡを個別に有する複数種のベクターを宿主細胞に導入して作製すればよい。
本ベクターを宿主細胞へ導入する方法としては、宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用することができる。例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合には、J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著；「 モレキュラー・クローニング 第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory発行、1989年）等に記載される塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法等の通常の方法を用いることができる。また、哺乳類動物細胞又は昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法又はリポフェクション法等の一般的な遺伝子導入法に準じて前記細胞に導入することができる。酵母を宿主細胞とする場合には、例えば、リチウム法を基にしたYeast transformation kit(Clontech社製)などを用いて導入することができる。
尚、ウイルスをベクターとして用いる場合には、上述のように一般的な遺伝子導入法によりウイルスのゲノムを宿主細胞に導入できるほか、前記両ＤＮＡの挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイルス粒子を、宿主細胞へ感染させることによっても、当該ウイルスのゲノムを宿主細胞に導入することができる。
【００２１】
本発明形質転換体を選抜するには、例えば、本ベクターと同時にマーカー遺伝子が導入された宿主細胞を、マーカー遺伝子の性質に応じた方法によって培養すればよい。例えば、マーカー遺伝子が、宿主細胞に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する遺伝子である場合には、当該選抜薬剤が添加された培地を用いて、本ベクターが導入された宿主細胞を培養すればよい。薬剤耐性を付与する遺伝子と選抜薬剤との組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイシンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子とブラストサイジンＳとの組み合わせ等をあげることができる。また、マーカー遺伝子が宿主細胞の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、当該栄養要求性に対応する栄養素を含まない最少培地を用いて、本ベクターが導入された細胞を培養すればよい。また前記両ＤＮＡを宿主細胞で発現させることが可能な本ベクターを導入した場合には、ＤＮＡ結合活性に基づく検出方法を用いることもできる。
前記両ＤＮＡが宿主細胞の染色体内に位置する本発明形質転換体を取得するには、例えば、まず本ベクターとマーカー遺伝子を有するベクターとを制限酵素等で消化することにより直鎖状にした後、これらを前述の方法で宿主細胞に導入する。次いで当該細胞を通常数週間培養した後、導入されたマーカー遺伝子の発現量に基づき目的とする形質転換体を選抜し取得すればよい。また、例えば、上記のような選抜薬剤を付与する遺伝子をマーカー遺伝子として有する本ベクターを前述の方法によって宿主細胞に導入する。次いで当該細胞を選抜薬剤が添加された培地で数週間以上継代培養した後、コロニー状に生き残った選抜薬剤耐性クローンを純化培養することにより、前記両ＤＮＡが宿主細胞の染色体に導入されてなる本発明形質転換体を選抜し取得することもできる。導入されたＤＮＡが宿主細胞の染色体に組み込まれたことを確認するには、当該細胞のゲノムＤＮＡを通常の遺伝子工学的方法に準じて調製し、調製されたゲノムＤＮＡから、導入された前記両ＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡをプライマーやプローブとしたＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション等の方法を利用して、前記両ＤＮＡの存在を検出すればよい。当該形質転換体は、凍結保存が可能であり必要に応じて起眠して使用することができるので、実験毎の形質転換体作製の手間を省くことができ、また、あらかじめ性質や取扱い条件の確認された形質転換体を用いて試験を実施することが可能となる。
【００２２】
上述のようにして得られた本発明形質転換体を培養し、産生された（１）本発明転写活性化複合体、あるいは、（２）本ＡＲＮＴ属転写共役因子及び本転写活性化因子、を培養物から回収することにより本発明転写活性化複合体を製造することができる。
例えば、本発明形質転換体が微生物である場合には、当該形質転換体は、一般微生物における通常の培養に使用される炭素源や窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養することができる。培養は、一般微生物における通常の方法に準じて行い、固体培養、液体培養（旋回式振とう培養、往復式振とう培養、ジャーファーメンター（JarFermenter）培養、タンク培養等）等が可能である。培養温度及び培地のｐＨは、微生物が生育する範囲から適宜選ぶことができ、例えば、約15℃〜約40℃の培養温度にて、ｐＨが約６〜約８の培地で培養するのが一般的である。培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通常約１日間〜約5日間である。温度シフト型やIPTG誘導型等の誘導型のプロモーターを有する発現ベクターを用いた場合には、誘導時間は1日間以内が好ましく、通常数時間である。
また、上記形質転換体が哺乳類、昆虫類等の動物細胞である場合には、当該形質転換体は一般の培養細胞における通常の培養に使用される培地を用いて培養することができる。選抜薬剤を利用して当該形質転換体を作製した場合には、当該選抜薬剤の存在下に培養することが好ましい。哺乳類動物細胞の場合には、例えば、終濃度が10％となるようFBSが添加されたDMEM培地（ニッスイ社製等）を用いて37℃、5％CO2存在下等の条件で数日毎に新しい培養液に交換しながら培養すればよい。細胞がコンフルエントになるまで増殖したら、例えば、0.25％(w/v)程度となるようトリプシンが添加されたPBS溶液を加えて個々の細胞に分散させ、数倍に希釈して新しいシャーレに播種し培養を続ける。昆虫類動物細胞の場合も同様に、例えば、10％(v/v)FBS及び2％(w/v)Yeastlateを含むGrace's medium等の昆虫細胞用培養液を用いて培養温度25℃から35℃で培養すればよい。この際、Sf21細胞等のシャーレからはがれやすい細胞の場合には、トリプシン液を用いずピペッテイングにより分散させ継代培養を行なうことができる。また、バキュロウイルス等のウイルスベクターを含む形質転換体の場合には、培養時間は細胞質効果が現れて細胞が死滅する前、例えば、ウイルス感染後72時間までとすることが好ましい。
【００２３】
培養物から、本発明形質転換体により産生された（１）本発明転写活性化複合体、あるいは、（２）本ＡＲＮＴ属転写共役因子及び本転写活性化因子、を回収するには、適宜、通常の単離、精製の方法を組み合わせて行えばよい。例えば、まず培養終了後、形質転換体の細胞を遠心分離等で集め、集められた細胞を通常のバッファー、例えば、20mM HEPES pH7,1mM EDTA,1mM DTT,0.5mM PMSFからなるバッファーに懸濁した後、ポリトロン、超音波処理、ダウンスホモジナイザー等で破砕する。得られた破砕液を数万xgで数十分間から1時間程度超遠心分離し、上清画分を回収することにより、（１）本発明転写活性化複合体、あるいは、（２）本ＡＲＮＴ属転写共役因子及び本転写活性化因子、を含む画分を得ることができる。さらに、前記上清画分をイオン交換、疎水、ゲルろ過、アフィニティ等の各種クロマトグラフィーに供することにより、より精製された（１）本発明転写活性化複合体、あるいは、（２）本ＡＲＮＴ属転写共役因子及び本転写活性化因子、を回収することもできる。この際、本応答性ＤＮＡを含む約15bpから約200bp程度の長さのオリゴヌクレオチドをプローブとしたDNA結合アッセイ等により、本発明転写活性化複合体等を含む画分を見分けることもできる。
このようにして製造された本発明転写活性化複合体は、例えば、被験物質の当該転写活性化複合体に対する結合能力・結合量を評価するためのレセプターバインディングアッセイ等に用いることができる。
【００２４】
本発明バインディングアッセイは、本発明転写活性化複合体に対する化学物質の結合能力の測定や結合量の定量のほか結合特異性、結合力の分析などが可能な試験方法である。例えば、前記のようにして本発明形質転換体２から回収された本発明転写活性化複合体に、標識されたリガンド（以下、標識リガンドと記す。）が予め結合しているところへ、被験物質を共存させると、被験物質と標識リガンドとの競合から、両者の本発明転写活性化複合体への親和性に応じて、標識リガンドが本発明転写活性化複合体から遊離し、本発明転写活性化複合体に結合した標識リガンドの量が減少し、よって本発明転写活性化複合体に結合した標識量が減少する。従って、遊離型の標識リガンドの標識量又は結合型の標識リガンドの標識量をモニターすることにより、本発明転写活性化複合体と前記被験物質との結合状態を間接的に確認することができ、例えば、本発明転写活性化複合体に対する被験物質の結合能力の測定等が可能となる。
標識リガンドの結合型／遊離型の分離は、ヒドロキシアパタイト法やグリセロール密度勾配超遠心法等で行うことができる。反応系は大きく3群に分けられる。第一の群は、本発明転写活性化複合体に標識リガンドが結合しているところへ溶媒のみが添加される系であり、被験物質の添加濃度がゼロである系に相当する。当該系における結合型の標識リガンドの標識量は、標識リガンドの本発明転写活性化複合体に対する総結合量を示す。第二の群は、本発明転写活性化複合体に標識リガンドが結合しているところへ、例えば、標識されていないリガンドが、本発明転写活性化複合体を十分飽和し標識リガンドが結合できなくなるだけの添加濃度（例えば10μＭ）となるよう添加された系であり、当該系における結合型の標識リガンドの標識量は、標識リガンドの本発明転写活性化複合体に対する非特異的結合量と判断される。従って、本発明転写活性化複合体への標識リガンドの特異的結合量は、総結合量から非特異的結合量を引いた値となる。第三の群は、本発明転写活性化複合体に標識リガンドが結合しているところへ、被験物質が、例えば、最終添加濃度10μＭ（この濃度は目的により任意に変更する。）となるよう添加された系である。被験物質が本発明転写活性化複合体への結合能力を有する場合には、この系から得られる結合型の標識リガンドの標識量は、上記のようにして求めた被験物質の添加濃度がゼロの時の本発明転写活性化複合体への標識リガンドの特異的結合量より小さくなる。このようにして本発明転写活性化複合体と前記被験物質との結合状態を間接的に確認する。本発明バインディングアッセイを行うことにより、本発明転写活性化複合体に対する被験物質の結合能力を調べることができ、被験物質が複数の物質を含む場合にはその中に本発明転写活性化複合体に親和性を示す物質が存在するかどうかを調べることもできる。さらに、本発明転写活性化複合体に対する被験物質の結合能力をより詳細に評価するには、例えば、前記の第三の群における被験物質の添加濃度を変えて同様に本発明バインディングアッセイを行えばよい。例えば、結合型の標識リガンドの標識量を測定し、得られた測定値に基づき、結合型のリガンド量と遊離型のリガンド量とを算出した後、得られた結果を、例えば、スキャッチャード解析することにより、被験物質と本発明転写活性化複合体との結合親和性、結合特異性、結合容量等を評価することができる。
【００２５】
本発明形質転換体は、本ベクターのほかに、本発明転写活性化複合体により活性化されうるプロモーターを機能可能な形で結合しているレポーター遺伝子のＤＮＡをも含有していてもよい。
このような形質転換体は、物質が有する、本発明転写活性化複合体が有する転写促進能力を調節する能力（即ち、本調節能力）の評価方法等に利用することができる。例えば、物質が有する本調節能力の評価方法であって、
（１）上記の形質転換体と被験物質とを接触させる第一工程、
（２）前記第一工程後に、前記形質転換体が有するレポーター遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、及び
（３）前記第二工程により測定された発現量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記物質の前記転写活性化複合体が有する転写促進能力を調節する能力を評価する第三工程；
を有することを特徴とする評価方法（即ち、本発明評価方法）をあげることができる。
さらに当該評価方法により評価された調節能力に基づき前記転写活性化複合体が有する転写促進能力を調節する能力を有する物質を選抜する工程を有することを特徴とする探索方法（即ち、本発明探索方法）、当該探索方法により選抜された物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする、例えば、ダウン症改善剤等の治療剤（即ち、本発明治療剤）等にも応用することができる。
【００２６】
本発明探索方法により選抜される物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする治療剤（即ち、本発明治療剤）は、その有効量を経口的または非経口的にヒト等の哺乳動物に対し投与することができる。例えば、経口的に投与する場合には、本発明治療剤は錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の通常の形態で使用することができる。また、非経口的に投与する場合には、本発明治療剤を溶液、乳剤、懸濁液等の通常の液剤の形態で使用することができる。前記形態の本発明治療剤を非経口的に投与する方法としては、例えば注射する方法、坐剤の形で直腸に投与する方法等を挙げることができる。
前記の適当な投与剤型は許容される通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤、希釈剤等に本発明探索方法により選抜される物質またはその薬学的に許容される塩を配合することにより製造することができる。また注射剤型で用いる場合には、許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明治療剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常は経口の場合には成人で１日あたり有効成分量として約１ｍｇ〜約２ｇ、好ましくは有効成分量として約５ｍｇ〜約１ｇを投与すればよく、注射の場合には成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
【００２７】
本発明では、本発明転写活性化複合体が有する転写促進能力を発揮するために必要となる領域を用いたツーハイブリッドアッセイのための転写活性化複合体や形質転換体等をも提供している。即ち、本発明は、（１）ツーハイブリッドアッセイのための、本発明転写活性化複合体２の使用に関する発明、（２）ツーハイブリッドアッセイのための、本発明形質転換体２の使用に関する発明を含んでいる。ここで、ツーハイブリッドアッセイのためのシステムを調製するには、市販のキット、例えば、Matchmaker Two-hybrid System（Clontech社製）、CheckMate Mammalian Two-Hybrid System（Promega）等を利用すればよい。
本発明転写活性化複合体２は、下記の構成要素Ｉのうちのいずれか一方の構成要素（Ａ又はＢ）及び下記の構成要素ＩＩのうちのいずれか一方の構成要素（Ｘ又はＹ）を有する蛋白質と、下記の構成要素Ｉのうちの他方の構成要素（Ｂ又はＡ）及び下記の構成要素ＩＩのうちの他方の構成要素（Ｙ又はＸ）を有する蛋白質とが結合してなる複合体である。ここで、例えば、当該両者の蛋白質がリガンドによる制御下において結合してなる複合体であってもよい。
＜構成要素Ｉ＞
（Ａ）本ＡＲＮＴ属転写共役因子に由来し、本アミノ酸配列を有する転写調節因子が結合する領域、又は
（Ｂ）本アミノ酸配列を有する転写調節因子に由来し、本ＡＲＮＴ属転写共役因子が結合する領域
＜構成要素ＩＩ＞
（Ｘ）宿主細胞内で機能可能な転写調節因子のＤＮＡ結合領域、又は
（Ｙ）宿主細胞内で機能可能な転写調節因子の転写活性化領域
当該発明において、構成要素Ｉの（Ａ）を有する転写共役因子は、本アミノ酸配列を有する転写調節因子とリガンドとの複合体を認識してこれに結合可能な転写共役因子であって、本ＡＲＮＴ属転写共役因子である。
一方、構成要素Ｉの（Ｂ）を有する転写調節因子は、本アミノ酸配列を有する転写調節因子である。尚、当該転写調節因子は、リガンドが結合する領域を有している。このような領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡとしては、当該転写調節因子の部分塩基配列であり、例えば、配列番号４で示される塩基配列のうち、塩基番号１３２〜２５０７で示される塩基配列を含む塩基配列等をあげることができる。
構成要素ＩＩの（Ｘ）を有する転写調節因子としては、例えば、Ｇａｌ４蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（5'-CGGAGGACTGTCCTCCG-3'、配列番号１１）、Ｌｅｘ蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（5'-TACTGTATGTACATACAGTA-3'、配列番号１２）、Ｌａｃ Ｉ受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（5'-GAATTGTGAGCGCGCACAATTC-3'、配列番号１３）、テトラサイクリン受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（5'-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3'、配列番号１４）、ＺＦＨＤ−１蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（5'-TAATGATGGGCG-3'、配列番号１５）、転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかと転写調節因子Ｓｉｍ２との転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡの塩基配列（5'-ACGTG-3'、配列番号１６）等のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡに結合する転写調節因子であって、かつ宿主細胞内で機能可能な転写調節因子をあげることができる。一方、構成要素ＩＩの（Ｙ）を有する転写調節因子としては、例えば、Ｇａｌ４蛋白質、Ｌｅｘ蛋白質、Ｌａｃ Ｉ受容体蛋白質、テトラサイクリン受容体蛋白質、ＺＦＨＤ−１蛋白質、Ｂ４２蛋白質、本ＡＲＮＴ属転写共役因子である蛋白質、ＶＰ１６蛋白質等の宿主細胞内で機能可能な転写調節因子をあげることができる。
【００２８】
このような各構成要素からなる転写活性化複合体は、例えば、本発明形質転換体２等により産生される。
本発明形質転換体２に関して、構成要件ｉの（ａ）は、構成要素Ｉの（Ａ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを意味し、当該ＤＮＡは構成要素Ｉの（Ａ）を有する転写共役因子の遺伝子から通常の遺伝子工学的手法により調製すればよい。一方、構成要件ｉの（ｂ）は、構成要素Ｉの（Ｂ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを意味し、当該ＤＮＡは構成要素Ｉの（Ｂ）を有する本転写調節因子の遺伝子から通常の遺伝子工学的手法により調製すればよい。
構成要件ｉｉの（ｘ）は、構成要素ＩＩの（Ｘ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを意味し、当該ＤＮＡは構成要素ＩＩの（Ｘ）を有する転写調節因子の遺伝子から通常の遺伝子工学的手法により調製すればよい。一方、構成要件ｉｉの（ｙ）は、構成要素ＩＩの（Ｙ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを意味し、当該ＤＮＡは構成要素ＩＩの（Ｙ）を有する転写調節因子の遺伝子から通常の遺伝子工学的手法により調製すればよい。
構成要素ｉｉｉは、構成要素ＩＩの（Ｘ）が結合可能なＤＮＡと、構成要素ＩＩの（Ｙ）により活性化されうるプロモーターの下流に接続されたレポーター遺伝子のＤＮＡとを意味する。構成要素ＩＩの（Ｘ）結合可能なＤＮＡとしては、例えば、Ｇａｌ４蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（5'-CGGAGGACTGTCCTCCG-3'、配列番号１１）、Ｌｅｘ蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（5'-TACTGTATGTACATACAGTA-3'、配列番号１２）、Ｌａｃ Ｉ受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（5'-GAATTGTGAGCGCGCACAATTC-3'、配列番号１３）、テトラサイクリン受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（5'-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3'、配列番号１４）、ＺＦＨＤ−１蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列（5'-TAATGATGGGCG-3'、配列番号１５）、転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかと転写調節因子Ｓｉｍ２との転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡ領域（5'-ACGTG-3'、配列番号１６）等のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。また構成要素ＩＩの（Ｙ）により活性化されうるプロモーターとしては、具体的には、構成要素ＩＩの（Ｙ）がＧａｌ４蛋白質由来である場合には、例えば、酵母由来の最小ＴＡＴＡボックス配列があげられる。レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、成長ホルモン遺伝子等の通常のレポーターアッセイに用いられるレポーター遺伝子をあげることができ、宿主細胞における安定性が比較的高いレポーター蛋白質をコードする遺伝子であることが好ましい。
【００２９】
このような各構成要素を本発明転写活性化複合体２が発現されるように適切に組み合わせながらベクターに挿入し、通常の遺伝子工学的手法を用いて同一の宿主細胞に導入することにより、当該形質転換体を作製することができる。例えば、構成要素ｉのうちのいずれか一方の構成要素（ａ又はｂ）と、構成要素ｉｉのうちのいずれか一方の構成要素（ｘ又はｙ）とを、その塩基配列の読み枠を合わせて連結させることによりキメラ遺伝子（キメラ遺伝子１）を作製する。また、構成要素ｉのうちの他方の構成要素（ｂ又はａ）と、構成要素ｉｉのうちの他方の構成要素（ｙ又はｘ）とを、その塩基配列の読み枠を合わせて連結させることによりキメラ遺伝子（キメラ遺伝子２）を作製する。これらキメラ遺伝子１及び２をそれぞれ宿主細胞内で機能可能なプロモーター、例えば、宿主細胞が出芽酵母細胞である場合には、GAL1プロモーターのような誘導型プロモーターや、ADHプロモーターのような恒常的に発現するプロモーター等の下流に接続された状態で同一の宿主細胞内に導入するとよい。構成要素ｉｉｉは、通常、「構成要素ｉｉの（ｘ）の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合領域が結合可能なＤＮＡ」の下流に「構成要素ｉｉの（ｙ）の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有する転写活性化領域により活性化されうるプロモーターの下流に接続されたレポーター遺伝子のＤＮＡ」が接続された状態で、上記の２種のキメラ遺伝子と同一の宿主細胞内に導入される。尚、宿主細胞が、利用可能な内在性のレポーター遺伝子を有する場合には、それを利用してもよく、この場合にはレポーター遺伝子の導入を省略することができる。
本発明形質転換体２を作製するために使用される宿主細胞としては、例えば、出芽酵母細胞、HeLa細胞等の哺乳類動物細胞等があげられる。
【００３０】
本発明形質転換体２を用いて、物質が有する、当該形質転換体が産生する本発明転写活性化複合体２の転写促進能力を調節する能力の評価方法では、本発明形質転換体２と被験物質とを、例えば、数時間から数日間接触させた後、具体的には、被験物質が添加された培地中で数時間から数日間培養した後、当該形質転換体が有する上記レポーター遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する。当該形質転換体が産生する本発明転写活性化複合体２が被験物質の結合により活性化された場合には、レポーター遺伝子の転写が促進され、当該レポーター遺伝子にコードされるレポーター蛋白質が前記形質転換体の細胞内等に蓄積されるかもしくは培地中に分泌される。このレポーター蛋白質の量又はその量と相関関係を有する指標値を測定することにより、当該形質転換体の細胞あたりのレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値を測定する。
具体的には、例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いた場合には、被験物質を接触させた形質転換体から調製された細胞粗抽出物にルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを加えると、当該細胞粗抽出物中のルシフェラーゼ量に比例した強度で発光する。従って、この発光強度をルミノメーター等の測定装置で測定することにより、ルシフェラーゼ量、ひいては、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を知ることができる。同様にして、当該形質転換体と被験物質とを接触させない条件下におけるレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値を測定し、当該測定値と被験物質とを接触させた条件下におけるレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値とを比較することにより、被験物質が有する本発明転写活性化複合体２の転写促進能力を調節する能力を評価することができる。
このような評価方法により評価された上記能力に基づき当該能力を有する物質を選抜することが可能となり、さらに当該物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する治療剤を提供することも可能となる。
【００３１】
上記の方法により選抜される物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする治療剤（即ち、本発明治療剤）は、その有効量を経口的または非経口的にヒト等の哺乳動物に対し投与することができる。例えば、経口的に投与する場合には、本発明治療剤は錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の通常の形態で使用することができる。また、非経口的に投与する場合には、本発明治療剤を溶液、乳剤、懸濁液等の通常の液剤の形態で使用することができる。前記形態の本発明治療剤を非経口的に投与する方法としては、例えば注射する方法、坐剤の形で直腸に投与する方法等を挙げることができる。
前記の適当な投与剤型は許容される通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤、希釈剤等に本発明探索方法により選抜される物質またはその薬学的に許容される塩を配合することにより製造することができる。また注射剤型で用いる場合には、許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明治療剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常は経口の場合には成人で１日あたり有効成分量として約１ｍｇ〜約２ｇ、好ましくは有効成分量として約５ｍｇ〜約１ｇを投与すればよく、注射の場合には成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
尚、本発明治療剤の適用可能と考えられる疾患としては、ダウン症による精神遅延等の疾患をあげることができる。
【００３２】
レポーターアッセイに関連する本発明、ツーハイブリッドシステムに関連する本発明及び本発明バインディングアッセイは、物質の本調節能力評価や、例えば、ダウン症改善剤の有効成分としての物質の検出等に利用することができる。
【００３３】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【００３４】
実施例１ （本転写調節因子（mNXF）DNAの調製及びそれを含有するベクターであるpGEM-mNXFの調製）
配列番号７で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号９で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをそれぞれDNA合成機（アプライドバイオシステムズ社製モデル394）を用いて合成した。このように合成されたポリヌクレオチドをプライマーとして、マウスBrain cDNAライブラリー（＃10655−017ギブコBRL社製）10 ngを鋳型として、反応液５０μｌ当たり上記のポリヌクレオチド10pmolを添加し、LA-Taqポリメラーゼ（宝酒造社製）及び当該酵素を含むキットに添付されたバッファーを用いてPCRを行った。当該ＰＣＲは、PCRsystem9700（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、95℃1分間次いで68℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを35サイクル行った。
得られたPCR反応液の全量を、低融点アガロース電気泳動（アガロースL：ニッポンジーン）に供することにより、増幅ＤＮＡ（約2.5kb）を精製・回収した。精製・回収された増幅ＤＮＡの一部とダイターミネーターシークエンスキットFS（アプライドバイオシステムズ社製）とを用いてダイレクトシークエンス用のサンプルを調製し、これをオートシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製、モデル3700）を用いたダイレクト塩基配列解析に供した。
上記のようにして精製・回収された増幅DNA（約１μｇ）とpGEM T easyベクター（プロメガ社製）（10ng）とを混合し、この混合物にT4 DNAリガーゼを添加して反応させることにより、プラスミドmNXFを得た。得られたpGEM-mNXFの塩基配列をABIモデル3700型オートシークエンサーを用いてダイターミネーター法で決定した。決定された塩基配列を、前記のダイレクトシークエンスで得られた塩基配列と比較して、翻訳領域の塩基配列が完全に一致していることを確認した。
【００３５】
実施例２ （本発明転写活性化複合体の転写促進能力を確認するための試験等）（２−１）pGL3-TATA-Galx4の調製（TATA最小プロモーターを有するルシフェラーゼ遺伝子の上流に、転写調節因子GAL4のDNA結合領域が４コピー導入されたレポーター遺伝子プラスミドの構築）
転写調節因子GAL4のDNA結合領域と任意の転写調節因子とのキメラ蛋白質の転写調節能を測定するために用いたレポーター遺伝子プラスミドpGL3-TATA-Galx4は、TATA最小プロモーターを有するルシフェラーゼ遺伝子の上流に、AL4のDNA結合領域が結合可能なＤＮＡがタンデムに４コピー導入されたものである。GAL4のDNA結合領域と任意の転写調節因子とのキメラ蛋白質が当該レポーター遺伝子プラスミドに作用する場合において、シフェラーゼ遺伝子の発現量を測定することで前記キメラ蛋白質が有する転写活性能を評価することができる。当該レポーター遺伝子プラスミドpGL3-TATA-Galx4を以下のようにして作製した。
まず、GAL4のDNA結合領域が結合可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと当該塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号１７：5'-cgcgtcgagctcgggtcggaggactgtcctccgactgctcgagtcgagctcgggtcggaggactgtcctccgactgctcgaga-3'、配列番号１８：5'-cgcgtctcgagcagtcggaggacagtcctccgacccgagctcgactcgagcagtcggaggacagtcctccgacccgagctcga-3'）をアニールした後T4 Kinaseでその5'末端をリン酸化し、これをT4 Ligaseでタンデムに結合させた。得られた二本鎖オリゴヌクレオチドを、低融点アガロース電気泳動（NuseiveGTG；FMCbio社製）に供することにより、当該二本鎖オリゴヌクレオチドがタンデムに２つ結合してなるＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。これに、pGL3-TATAベクターをMluIで切断した後アルカリフォスファターゼ（BAP C75；宝酒造製）処理して得られたＤＮＡ（0.1μｇ）をT4 Ligase(宝酒造製)で結合させる（１６℃、１６時間反応）ことにより、pGL3-TATA-Galx4を得た。
【００３６】
（２−２）pRC/RSV-Gal4-DBDの調製（転写調節因子GAL4のDNA結合領域を発現するプラスミドの構築）
転写調節因子GAL4のDNA結合領域（以下、Gal4-DBDと記すこともある。GAL4から転写活性化領域を欠いた蛋白質。）を発現するプラスミドであるpRC/RSV-Gal4-DBDを以下のようにして作製した。
まず、Gal4-DBDをコードするDNAを有するプラスミドpM（市販キットK1602-1に含まれる；Clontech社より購入した）をNheIとXbaIとで切断した後、更にT4 ポリメラーゼで平滑末端化した。それを低融点アガロース電気泳動（アガロースL；ニッポンジーン社製）に供することにより、Gal4-DBDをコードするのＤＮＡ（約500bp）を回収した。回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。
次に、pRC/RSV（Invitorgen社製）をHindIIIで切断した後、更にT4ポリメラーゼで平滑末端化した。それをBAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）に、前記インサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pRC/RSV-Gal4-DBDを作製した。
【００３７】
（２−３）pRC/RSV-MA、ｐRC/RSV-MB、pRC/RSV-MCの調製（転写調節因子GAL4のDNA結合領域と任意の転写調節因子の転写活性化領域とを結合したキメラ蛋白質を発現させるために、Gal4-DBDをコードするDNAの下流に、制限酵素PmaCIの認識部位がそれぞれ異なるフレームで挿入されたプラスミドの構築）
pRC/RSV-MA、pRC/RSV-MB、pRC/RSV-MCは、RSVプロモーターの下流にGal4-DBDの翻訳領域を有しており、さらにその下流に位置するPmaCI切断により形成される平滑末端に、平滑末端化ＤＮＡを、Gal4-DBDをコードするDNAの翻訳フレームに対して当該平滑末端化ＤＮＡの翻訳フレームが一致するように結合させることができる。このようにしてGAL4のDNA結合領域と任意の転写調節因子の転写活性化領域とを結合したキメラ蛋白質を発現させることができる。
pRC/RSV-MA、ｐRC/RSV-MB、pRC/RSV-MCは以下のようにして調製した。
まず、２種のオリゴヌクレオチド（配列番号１９：5´-agcttcatcccacgtgagtcat-3´、配列番号２０：5´-ctagatgactcacgtgggatga-3´）をアニールした後にT4 kinaseでその5'末端をリン酸化した。得られたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。一方、上記（２−２）で調製されたpRC/RSV-Gal4-DBDをHindIIIとXbaIとで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡをベクターＤＮＡとした。それら両者をT4 Ligaseで結合させることにより、pRC/RSV-MAを作製した。同様に、他の２種のオリゴヌクレオチド（配列番号２１：5´-agcttcatccacacgtgagtcat-3´、配列番号２２：5´-ctagatgactcacgtgtggatga-3´）をアニールした後T4 kinaseで5'末端をリン酸化して得られたＤＮＡをインサートＤＮＡとして用いることにより、pRC/RSV-MBを作製した。更に同様に、他の２種のオリゴヌクレオチド（配列番号２３：5´-agcttcatccaacacgtgagtcat-3´、配列番号２４：5´-ctagatgactcacgtgttggatga-3´）をアニールした後T4 kinaseで5'末端をリン酸化して得られたＤＮＡをインサートＤＮＡとして用いることにより、pRC/RSV-MCを作製した。
【００３８】
（２−４）pBlue-hArnt1kozac、pBlue-hArnt2kozac、pBlue-hArnt3kozac、pGEM-hBMAL2kozac、pRC/RSV-hSim2kozac及びpBlue-hClockkozacの調製
(2-4-1) pBlue-hArnt1kozac
Arnt1の翻訳領域全長を有するプラスミドであるpBlue-hArnt1kozacを以下のようにして作製した。
まず、ヒトLiver ｍRNA（Clontech社より購入した）からpolyｄTプライマー（アマシャムファルマシア社から購入した）及び逆転写酵素（SuperScriptII；GIBCO社より購入した）を用いて一本鎖ｃDNAを作製した。作製されたcDNAを鋳型として、フォワードプライマー5´-ggccatggcggcgactactgccaaccccgaaatga-3´（配列番号２５）、リバースプライマー5´-tgagggaagggaagggagaggaacttttattctgt -3´（配列番号２６）及びPyrobest ポリメラーゼ（宝酒造製）を用いたPCRを行うことにより増幅ＤＮＡを得た。尚、PCRの条件は、95℃1分間次いで68℃3分間の保温を１サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡをTEで500分の1に希釈してこれを鋳型とし、フォワードプライマー5´-cccggcggccgcccagccaccatggcggcgactactgccaaccccgaaatgacatc -3´（配列番号２７）、リバースプライマー5´-cccgtctagaaccccttatcctcaccccaatagttctattctgaa -3´（配列番号２８）及びPyrobest ポリメラーゼ（宝酒造製）を用いたPCRを再度行うことにより増幅ＤＮＡを得た。尚、PCRの条件は、95℃1分間次いで68℃3分間の保温を１サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡは、Arnt1をコードするDNAの開始コドンの直前にコザック配列（5'-CCAGCCACC-3'）を有し、さらにその上流にNotI制限酵素部位を有している。当該増幅ＤＮＡに、それが有するStopコドン下流にXbaI制限酵素部位を導入した。得られたＤＮＡをNotI及びXbaIの両制限酵素で切断した後、これを低融点アガロース電気泳動に供することによりＤＮＡを精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。
次に、pBluescriptベクターをNotIとXbaIとで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pBlue-hArnt1kozacを作製した。
【００３９】
(2-4-2) pBlue-hArnt2kozac
Arnt2をコードするDNAの翻訳領域全長を有するプラスミドであるpBlue-hArnt2kozacを以下のようにして作製した。
まず、ヒトBrain ｍRNA（Clontech社より購入した）からpolyｄTプライマー（アマシャムファルマシア社から購入した）及び逆転写酵素（SuperScriptII；GIBCO社より購入した）を用いて一本鎖ｃDNAを作製した。作製されたcDNAを鋳型として、フォワードプライマー5´-catctctcacctggactgctgtgaccttcattcat-3´（配列番号２９）、リバースプライマー5´-cacatgggcatcgacatcacagtatgggtggcact-3´（配列番号３０）及びPyrobest ポリメラーゼ（宝酒造製）を用いたPCRを行うことにより増幅ＤＮＡを得た。尚、PCRの条件は、95℃1分間次いで68℃2分間の保温を１サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡをTEで500分の1に希釈しこれを鋳型として、フォワードプライマー5´-gggcgcggccgcccagccaccatggcttcagacatacctggatctgtgacgttgcc -3´（配列番号３１）、リバースプライマー5´-gggctctagactactcagaaaacggtggaaacatgcccaggtcgg -3´（配列番号３２）及びPyrobest ポリメラーゼ（宝酒造製）を用いたPCRを再度行うことにより増幅ＤＮＡを得た。尚、PCRの条件は、95℃1分間次いで68℃2分間の保温を１サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡは、Arnt2をコードするDNAの開始コドンの直前にコザック配列（5'-CCAGCCACC-3'）を有し、さらにその上流にNotI制限酵素部位を有している。当該増幅ＤＮＡに、それが有するStopコドン下流にXbaI制限酵素部位を導入した。得られたＤＮＡをNotI及びXbaIの両制限酵素で切断した後、これを低融点アガロース電気泳動に供することにより、ＤＮＡを精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。
次に、pBluescriptベクターをNotIとXbaIで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pBlue-hArnt2kozacを作製した。
【００４０】
(2-4-3) pBlue-hArnt3kozac
Arnt3をコードするDNAの翻訳領域全長を有するプラスミドであるpBlue-hArnt3kozacを以下のようにして作製した。
まず、ヒトBrain ｍRNA（Clontech社より購入した）からpolyｄTプライマー（アマシャムファルマシア社から購入した）及び逆転写酵素（SuperScriptII；GIBCO社より購入）を用いて一本鎖ｃDNAを作製した。作製されたcDNAを鋳型として、フォワードプライマー5´-atggacacagacaaagatgaccctcatggaaggtt -3´（配列番号３３）、リバースプライマー5´-tgtttacagcggccatggcaagtcactaaagtcaac -3´（配列番号３４）及びPyrobest ポリメラーゼ（宝酒造製）を用いたPCRを行うことにより増幅ＤＮＡを得た。尚、PCRの条件は、95℃1分間次いで68℃2分間の保温を１サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡをTEで500分の1に希釈しこれを鋳型として、フォワードプライマー5´-ggggcggccgccccagccacc atggacacagacaaagatgaccctcatggaaggtt -3´（配列番号３５）、リバースプライマー5´-gggtctaga tgtttacagcggccatggcaagtcactaaagtcaac -3´（配列番号３６）及びPyrobest ポリメラーゼ（宝酒造製）を用いたPCRを再度行うことにより増幅ＤＮＡを得た。尚、PCRの条件は、95℃1分間次いで68℃2分間の保温を１サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡは、Arnt3をコードするDNAの開始コドンの直前にコザック配列（5'-CCAGCCACC-3'）を有し、さらにその上流にNotI制限酵素部位を有している。当該増幅ＤＮＡに、それが有するStopコドン下流にXbaI制限酵素部位を導入した。得られたＤＮＡをNotI及びXbaIの両制限酵素で切断した後、これを低融点アガロース電気泳動に供することにより、ＤＮＡを精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。
次に、pBluescriptベクターをNotIとXbaIとで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pBlue-hArnt3kozacを作製した。
【００４１】
(2-4-4) pGEM-hBmal2kozac
Bmal2をコードするDNAの翻訳領域全長を有するプラスミドであるpGEM-hBmal2kozacを以下のようにして作製した。
まず、ヒトBrain ｍRNA（Clontech社より購入した）からpolyｄTプライマー（アマシャムファルマシア社から購入した）及び逆転写酵素（SuperScriptII；GIBCO社より購入した）を用いて一本鎖ｃDNAを作製した。作製されたcDNAを鋳型として、フォワードプライマー5´-agctatggggtcttccagctcacacatgacagag -3´（配列番号３７）、リバースプライマー5´-atcaaaggctagagggtccactggatgtcactgaa -3´（配列番号３８）及びPyrobest ポリメラーゼ（宝酒造製）を用いたPCRを行うことにより増幅ＤＮＡを得た。尚、PCRの条件は、95℃1分間次いで68℃2分間の保温を１サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡをTEで500分の1に希釈しこれを鋳型として、フォワードプライマー5´-gggcgcggccgcccagccaccatggggtcttccagctcacacatgacagagtttcc -3´（配列番号３９）、リバースプライマー5´-atcaaaggctagagggtccactggatgtcactgaa -3´（配列番号４０）及びLA-Taq ポリメラーゼ（宝酒造製）を用いたPCRを再度行うことにより増幅ＤＮＡを得た。尚、PCRの条件は、95℃1分間次いで68℃2分間の保温を１サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡは、Bmal2をコードするDNAの開始コドンの直前にコザック配列（5'-CCAGCCACC-3'）を有し、さらにその上流にNotI制限酵素部位を有している。得られた増幅ＤＮＡを低融点アガロース電気泳動に供することにより精製・回収した。精製・回収された増幅ＤＮＡをインサートＤＮＡとした。このインサートＤＮＡ（0.5μg）をpGEMeasyT（Promega社より購入）ベクター（0.1μg）にT4 Ligaseで結合させることにより、pGEM-hBmal2kozacを作製した。
【００４２】
(2-4-5) pRC/RSV-hSim2kozac
Sim2をコードするDNAの翻訳領域全長を有するプラスミドであるpRC/RSV-hSim2kozacを以下のようにして作製した。
まず、ヒトKidney ｍRNA（Clontech社より購入した）からpolyｄTプライマー（アマシャムファルマシア社から購入した）及び逆転写酵素（SuperScriptII；GIBCO社より購入）を用いて一本鎖ｃDNAを作製した。作製されたcDNAを鋳型として、フォワードプライマー5´-gtctaatatgcccggagccgaggcgcgatgaagga-3´（配列番号４１）、リバースプライマー5´-tcacctcccgttggtgatgatgaccgaggcgcccag-3´（配列番号４２）及びPyrobest ポリメラーゼ（宝酒造製）を用いたPCRを行うことにより増幅ＤＮＡを得た。尚、PCRの条件は、95℃1分間次いで68℃2分間の保温を１サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡをTEで500分の1に希釈しこれを鋳型として、フォワードプライマー5´-gggcgcggccgcccagccaccatgaaggagaagtccaagaatgcggccaagaccag -3´（配列番号４３）、リバースプライマー5´-gggctctagatcacctcccgttggtgatgatgaccgaggcgccca -3´（配列番号４４）及びPyrobest ポリメラーゼ（宝酒造製）を用いたPCRを再度行うことにより増幅ＤＮＡを得た。尚、PCRの条件は、95℃1分間次いで68℃2分間の保温を１サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡは、Sim2をコードするDNAの開始コドンの直前にコザック配列（5'-CCAGCCACC-3'）を有し、さらにその上流にNotI制限酵素部位を有している。当該増幅ＤＮＡに、それが有するStopコドン下流にXbaI制限酵素部位を導入した。得られたＤＮＡをNotI及びXbaIの両制限酵素で切断した後、これを低融点アガロース電気泳動に供することにより、ＤＮＡを精製・回収された。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。
次に、pRC/RSVベクターをNotIとXbaIとで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pRC/RSV-hSim2kozacを作製した。
【００４３】
(2-4-6) pBlue-hClockkozac
Clock翻訳領域全長を有するプラスミドであるpBlue-hClockkozacを以下のようにして作製した。
まず、ヒトBrain ｍRNA（Clontech社より購入した）からpolyｄTプライマー（アマシャムファルマシア社から購入した）及び逆転写酵素（SuperScriptII；GIBCO社より購入）を用いて一本鎖ｃDNAを作製した。作製されたcDNAを鋳型として、フォワードプライマー5´-gatccaaggagtacaaaaggagaagtacaaatgtc-3´（配列番号４５）、リバースプライマー5´-tactgcatctcatgaaactgctggaactttccct -3´（配列番号４６）及びPyrobestポリメラーゼ（宝酒造製）を用いたPCRを行うことにより増幅ＤＮＡを得た。尚、PCRの条件は、95℃1分間次いで68℃2分間の保温を１サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡの末端をT4kinaseでリン酸化した後、これを低融点アガロース電気泳動に供することにより、増幅ＤＮＡ（約2.5kbp）を精製・回収した。精製・回収された増幅ＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pBluescriptIIベクター（Stratagene社より購入した）をSmaIで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pBlue-hClockを得た。
次に、このプラスミド1μgを鋳型にしてフォワードプライマー5´-gggcgggatccccagccaccatgttgtttaccgtaagctg-3´（配列番号４７）、リバースプライマー5´-ctactgtggttgaaccttgg-3´（配列番号４８）及びPyrobest ポリメラーゼ（宝酒造製）を用いたPCRを再度行うことにより増幅ＤＮＡを得た。尚、PCRの条件は、95℃1分間次いで68℃３分間の保温を１サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡは、Clockの開始コドンの直前にコザック配列（5'-CCAGCCACC-3'）を有している。得られた増幅ＤＮＡをT4 kinaseでリン酸化した後、これを低融点アガロース電気泳動に供することにより精製・回収した。精製・回収された増幅ＤＮＡをインサートＤＮＡとした。次に、ｐBluescriptIIベクターをSmaIで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pBlue-hClock kozacを作製した。
【００４４】
（２−５）pRC/RSV-MC-ｍNXF(bHLH-PAS)、pRC/RSV-MC-Arnt1 (bHLH-PAS)、pRC/RSV-MC-Arnt2(bHLH-PAS)、pRC/RSV-MB-Arnt3(bHLH-PAS)、pRC/RSV-MA Bmal2(bHLH-PAS)の調製（ツーハイブリッドアッセイに必要なキメラ蛋白質発現用プラスミドの構築（その１））
(2-5-1) pRC/RSV-MC-ｍNXF(bHLH-PAS)
転写調節因子GAL4のDNA結合領域と本転写調節因子（mNXF）のbHLH-PAS領域部分とが結合してなるキメラ蛋白質（以下、Gal4-mNXFと記すこともある。）を発現するプラスミドであるpRC/RSV-MC-ｍNXF(bHLH-PAS)を以下のようにして作製した。
まず、実施例１で調製されたpGEM-mNXFをSacIとApaIとで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端としたのち、低融点アガロース電気泳動（AgaroseL;ニッポンジーン社製）に供することにより、ＤＮＡ（約1.8kbp：本転写調節因子（mNXF）のbHLH-PAS領域部分を含む）を精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pRC/RSV-MCをpmaCIで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡを（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pRC/RSV-MC-ｍNXF(bHLH-PAS)を作製した。
【００４５】
(2-5-2) pRC/RSV-MC-Arnt1 (bHLH-PAS)
転写調節因子GAL4のDNA結合領域と本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt1のbHLH-PAS領域部分とが結合してなるキメラ蛋白質（以下、Gal4-Arnt1と記すこともある。）を発現するプラスミドであるpRC/RSV-MC-Arnt1(bHLH-PAS)を以下のようにして作製した。
まず、前記（2-4-1）で調製されたpBlue-hArnt1kozacをNotIとNaeIとで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端としたのち、低融点アガロース電気泳動（AgaroseL;ニッポンジーン社製）に供することにより、ＤＮＡ（約1.8kbp：Arnt1のbHLH-PAS領域部分を含む）を精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pRC/RSV-MCをpmaCIで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pRC/RSV-MC-Arnt1 (bHLH-PAS)を作製した。
【００４６】
(2-5-3) pRC/RSV-MC-Arnt2(bHLH-PAS)
転写調節因子GAL4のDNA結合領域と本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2のbHLH-PAS領域部分とが結合してなるキメラ蛋白質（以下、Gal4-Arnt2と記すこともある。）を発現するプラスミドであるpRC/RSV-MC-Arnt2(bHLH-PAS)を以下のようにして作製した。
まず、前記（2-4-2）で調製されたpBlue-hArnt2kozacをNotIとBglIIとで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端としたのち、低融点アガロース電気泳動（AgaroseL;ニッポンジーン社製）に供することにより、ＤＮＡ（約1.5kbp：Arnt2のbHLH-PAS領域部分を含む）を精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pRC/RSV-MCをpmaCIで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pRC/RSV-MC-Arnt2(bHLH-PAS)を作製した。
【００４７】
(2-5-4) pRC/RSV-MB-Arnt3(bHLH-PAS)
転写調節因子GAL4のDNA結合領域と本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt3のbHLH-PAS領域部分とが結合してなるキメラ蛋白質（以下、Gal4-Arnt3と記すこともある。）を発現するプラスミドであるpRC/RSV-MC-Arnt3(bHLH-PAS)を以下のようにして作製した。
まず、前記（2-4-3）で調製されたpBlue-hArnt3kozacをNotIとSphIとで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端としたのち、低融点アガロース電気泳動（AgaroseL;ニッポンジーン社製）に供することにより、ＤＮＡ（約1.3kbp：Arnt3のbHLH-PAS領域部分を含む）を精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pRC/RSV-MBをpmaCIで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pRC/RSV-MB-Arnt3(bHLH-PAS)を作製した。
【００４８】
(2-5-5) pRC/RSV-MA Bmal2(bHLH-PAS)
転写調節因子GAL4のDNA結合領域と転写共役因子Bmal2のbHLH-PAS領域部分とが結合してなるキメラ蛋白質（以下、Gal4-Bmal2と記すこともある。）を発現するプラスミドであるpRC/RSV-MA-Bmal2(bHLH-PAS)を以下のようにして作製した。
まず、前記（2-4-4）で調製されたpGEM-hBmal2kozacをNotIとAccIとで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端としたのち、低融点アガロース電気泳動（AgaroseL;ニッポンジーン社製）に供することにより、ＤＮＡ（約1.25kbp：Bmal2のbHLH-PAS領域部分を含む）を精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pRC/RSV-MAをpmaCIで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pRC/RSV-MA Bmal2(bHLH-PAS)を作製した。
【００４９】
（２−６）pVP16-Arnt1 (bHLH-PAS)、pVP16-Arnt2 (bHLH-PAS)、pVP16-Arnt3(bHLH-PAS)、pVP16-BMAL2(bHLH-PAS)、pVP16-Sim2(bHLH-PAS)、pVP16-Clock (bHLH-PAS)、pVP16-NXF (bHLH-PAS)及びpVP16-CPの調製（ツーハイブリッドアッセイに必要なキメラ蛋白質発現用プラスミドの構築（その２）及び陰性対照プラスミドの構築）
(2-6-1) pVP16-Arnt1 (bHLH-PAS)
Vp16転写活性化領域と転写共役因子Arnt1のbHLH-PAS領域部分とが結合してなるキメラ蛋白質（以下、VP16-Arnt1と記すこともある。）を発現するプラスミドであるpVP16-Arnt1(bHLH-PAS)を以下のようにして作製した。
まず、前記（2-4-1）で調製されたpBlue-hArnt1kozacをNotIとNaeIとで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端化したのち、低融点アガロース電気泳動に供することにより、ＤＮＡ（約1.8kbp：Arnt1のbHLH-PAS領域部分を含む）を精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pVP16ベクター（Clontech社より購入した）をBamHIで切断した後BAP処理し、さらにT4ポリメラーゼで平滑末端化して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pVP16-Arnt1 (bHLH-PAS)を作製した。
【００５０】
(2-6-2) pVP16-Arnt2 (bHLH-PAS)
Vp16転写活性化領域と本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2のbHLH-PAS領域部分とが結合してなるキメラ蛋白質（以下、VP16-Arnt2と記すこともある。）を発現するプラスミドであるpVP16-Arnt2(bHLH-PASを以下のようにして作製した。
まず、前記（2-4-2）で調製されたpBlue-hArnt2kozacをNotIとBglIIとで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端化したのち、低融点アガロース電気泳動に供することにより、ＤＮＡ（約1.5kbp：Arnt2のbHLH-PAS領域部分を含む）を精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pVP16ベクター（Clontech社より購入した）をBamHIで切断した後BAP処理し、さらにT4ポリメラーゼで平滑末端化して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pVP16-Arnt2 (bHLH-PAS)を作製した。
【００５１】
(2-6-3) pVP16-Arnt3(bHLH-PAS)
Vp16転写活性化領域と本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt3のbHLH-PAS領域部分を含む全長とが結合してなるキメラ蛋白質（以下、VP16-Arnt3と記すこともある。）を発現するプラスミドであるpVP16-Arnt3を以下のようにして作製した。
まず、前記（2-4-3）で調製されたpBlue-hArnt3kozacをNotIとXbaIとで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端化したのち、低融点アガロース電気泳動に供することにより、ＤＮＡ（約1.8kbp：Arnt3の全長を含む）を精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pVP16ベクター（Clontech社より購入した）をEcoRIで切断した後BAP処理し、さらにT4ポリメラーゼで平滑末端化して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pVP16-Arnt3を作製した。
【００５２】
(2-6-4) pVP16-BMAL2(bHLH-PAS)
Vp16転写活性化領域と転写共役因子Bmal2のbHLH-PAS領域部分を含む全長とが結合してなるキメラ蛋白質（以下、VP16-Bmal2と記すこともある。）を発現するプラスミドであるpVP16-Bmal2を以下のようにして作製した。
まず、前記（2-4-4）で調製されたpGEM-hBmal2kozacをNotIで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端化したのち、低融点アガロース電気泳動に供することにより、ＤＮＡ（約1.7kbp：Bmal2の全長を含む）を精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pVP16ベクター（Clontech社より購入した）をHindIIIで切断した後BAP処理し、さらにT4ポリメラーゼで平滑末端化して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pVP16-Bmal2を作製した。
【００５３】
(2-6-5) pVP16-Sim2(bHLH-PAS)
Vp16転写活性化領域とSim2のbHLH-PAS領域部分とが結合してなるキメラ蛋白質（以下、VP16-Sim2と記すこともある。）を発現するプラスミドであるpVP16-Sim2(bHLH-PAS)を以下のようにして作製した。
まず、前記（2-4-5）で調製されたpRC/RSV-hSim2kozacをNotIとBamHIとで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端化したのち、低融点アガロース電気泳動に供することにより、ＤＮＡ（約1.5kbp：Sim2のbHLH-PAS領域部分を含む）を精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pVP16ベクター（Clontech社より購入した）をBamHIで切断した後BAP処理し、さらにT4ポリメラーゼで平滑末端化して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pVP16-Sim2(bHLH-PAS)を作製した。
【００５４】
(2-6-6) pVP16-Clock (bHLH-PAS)
Vp16転写活性化領域とClockのbHLH-PAS領域部分とが結合してなるキメラ蛋白質（以下、VP16-Clockと記すこともある。）を発現するプラスミドであるpVP16-Clock(bHLH-PAS)を以下のようにして作製した。
まず、前記（2-4-6）で調製されたpBlue-hClock kozacをHicIIとNcoIとで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端化したのち、低融点アガロース電気泳動に供することにより、ＤＮＡ（約1.6kbp：ClockのbHLH-PAS領域部分を含む）を精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pVP16ベクター（Clontech社より購入した）をBamHIで切断した後BAP処理をし、さらにT4ポリメラーゼで平滑末端化して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pVP16-Clock (bHLH-PAS)を作製した。
【００５５】
(2-6-7) pVP16-NXF (bHLH-PAS)
Vp16転写活性化領域と本転写活性因子（ｍNXF）のbHLH-PAS領域部分とが結合してなるキメラ蛋白質（以下、VP16-NXFと記すこともある。）を発現するプラスミドであるpVP16-NXF(bHLH-PAS)を以下のようにして作製した。
まず、実施例１で調製されたpGEM-mNXFをSacIとApaIとで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端化したのち、低融点アガロース電気泳動に供することにより、ＤＮＡ（約1.8kbp：本転写活性因子（ｍNXF）のbHLH-PAS領域部分を含む）を精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pVP16ベクター（Clontech社より購入した）をBamHIで切断した後BAP処理し、さらにT4ポリメラーゼで平滑末端化して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pVP16-NXF (bHLH-PAS)を作製した。
【００５６】
(2-6-8) pVP16-CP
ウィルスコート蛋白質とVP16とのキメラ蛋白質を発現するプラスミドであるpVP16-CPをクロンテック社より購入した。この蛋白質はbHLH-PAS領域を持たず、bHLH-PASファミリーに属する転写調節因子に対して何ら結合性を示さない。そこで当該プラスミドを下記（２−６）での試験における陰性対照プラスミドとして用いた。
【００５７】
（２−７）本ＡＲＮＴ属転写共役因子と本転写調節因子との複合体形成を確認するためのツーハイブリッドアッセイ
約５ｘ１０6のHeLa細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（日水製薬社製）を用いて３７℃にて５％ＣＯ2存在下に、直径約１０ｃｍのシャーレ（ファルコン社製）を用いて培養した。翌日、培養された細胞をトリプシン処理により分散し、FBSを含まないDMEM培地で２回洗浄した後、再度５ｘ１０6に細胞密度がなるようにFBSを含まないDMEM培地に分散させた。この細胞分散液0.4ｍｌに対して、前記（２−１）で調製されたレポーター遺伝子プラスミド（pGL3-TATA-Galx4）（例えば３μg）、前記（２−５）で調製されたキメラ蛋白質を発現するプラスミド（例えば３μg）及び前記（２−６）で調製されたキメラ蛋白質を発現するプラスミド等（例えば３μg）の３者を混合した後、この混合物をエレクトロポレーション用キュベットに移し、Geneパルサー（BIORAD社製）を用いたエレクトロポレーション法により220V、950μFの条件でトランスフェクションを行った。トランスフェクション後、培地を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に置換してさらに６穴プレート内で約24時間培養した。次いで、ウェルから培地を除き、器壁に接着している細胞をPBS(-)で２回洗浄した後、５倍に希釈したＰＧＣ５０（東洋インキ社製）をウェルあたり２００μｌずつ加えてさらに室温に３０分間放置した。この細胞液２０μｌずつオペークプレート（コーニングコースター社製）上に分注し、当該プレートを酵素基質自動インジェクター付きルミノメーターＬＢ９６Ｐ（ベルトールド社製）にセットし、５０μｌの基質液ＰＧＬ１００（東洋インキ社製）を自動分注した後、各ウェル内のルシフェラーゼ活性をそれぞれ測定した。
その結果を、図１〜４に示す。Gal4-NXFを用いた系（図１参照）において、VP16-Arnt1、VP16-Arnt2、VP16-Arnt3が本転写調節因子（NXF）のbHLH-PAS領域部分と結合性（相互作用）を示すことが確認された。一方、Bmal2、Sim2、Clockは本転写調節因子（NXF）のbHLH-PAS領域部分と結合性（相互作用）を示さなかった。
また、本転写調節因子（NXF）同士はそのホモダイマーを形成しないことも確認された。
さらに、Gal4-Arnt1を用いた系（図２参照）、Gal4-Arnt2を用いた系（図３参照）及びGal4-Arnt3を用いた系（図４参照）において、本転写調節因子（NXF）がArnt1、Arnt2及びArnt3のいずれかのbHLH-PAS領域部分と結合性（相互作用）を示すことが再確認された。
また、Gal4-Bmal2を用いた系（図５参照）において、本転写調節因子（NXF）はBmal2と結合性（相互作用）を示さないことが再確認された。
【００５８】
（２−８）本発明転写活性化複合体が有するＤＮＡ結合性を確認するためのゲルシフトアッセイ
(2-8-1) pVL1392-hArnt2kozacの調製（本ＡＲＮＴ属転写共役因子全長を発現する組換えウィルス作製用トランスファーベクターの構築）
Arnt2全長を発現する組換えウィルス（Baculo Virus）作製用トランスファーベクターであるpVL1392-hArnt2kozacを以下のようにして作製した。
まず、前記（2-4-2）で調製されたpBlue-hArnt2kozacをNotIとXbaIとで同時に切断した後、これを低融点アガロース電気泳動（AgaroseL；ニッポンジーン社製）に供することにより、ＤＮＡ（約2.2kbp：Arnt2の翻訳領域全長を含む）を回収した。回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。
次に、pVL1392ベクター（ファーミンゲン社より購入した）をNotIとXbaIとで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）にインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合することにより、Arnt2全長を発現する組換えウイルス作製用トランスファーベクターであるpVL1392-hArnt2kozacを作製した。
【００５９】
(2-8-2) pVL1392-NXFの調製（本転写調節因子全長を発現する組換えウィルス作製用トランスファーベクターの構築）
次に、本転写調節因子（rNXF）全長を発現する組換えウイルス（Baculo Virus）作製用トランスファーベクターであるpVL1392-rNXFを以下のようにして作製した。
実施例１に記載されたpGEM-mNXFの調製において鋳型としてマウスBrain cDNAライブラリーの代わりにラットBrain cDNAライブラリーを用いることにより同様にしてpGEM-rNXFを調製した。
pGEM-rNXFをScaIとSacIとの両者及びNotIで切断した後、これをT4ポリメラーゼを用いて平滑末端化した。平滑末端化されたＤＮＡを低融点アガロース電気泳動（AgaroseL；ニッポンジーン社製）に供することにより、ＤＮＡ（約2.5kbp：本転写調節因子（NXF）の翻訳領域全長を含む）を回収した。回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。
次に、pVL1393ベクター（ファーミンゲン社より購入した）をSmaIで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）にインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合することにより、本転写調節因子（rNXF）を発現する組換えウイルス作製用トランスファーベクターであるpVL1392-rNXFを作製した。
【００６０】
(2-8-3) 本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2又は本転写調節因子（rNXF）遺伝子が組み込まれた組換えウイルス粒子の調製
まず、昆虫細胞Sf21（Invitorgen社より購入した）を、１０％FCS（ウシ胎児血清）、０．３３％イースト加水分解物、０．３３％ラクトアルブミン加水分解物を加えたGrace培地（GIBCO社より購入した）を用いて通常の空気中２７℃で培養した。培養された細胞に、組換えウィルス作製用トランスファーベクター及びBaculoVirusゲノムDNAを以下のようにして導入した。
まず、6穴プレートのウェルに106個の細胞を播種した後、２時間放置した。細胞が接着したことを確認した後、各ウェルの培養液を0.8mlの無血清Grace培地に置換した。このようにして調製された細胞に、200μlの無血清培地に0.25μgのLinearized Baculo virusゲノムDNA（Baculo Gold DNA；ファーミンゲン社より購入した）と2μgの組換えウィルス作製用トランスファーベクターとを混合した後にCell Fectin試薬（GIBCO社より購入した）を6μl加えさらに室温に１５分間放置することにより調製された混合物を、添加した。5時間後、各ウェルの培養液を通常の血清入りのGrace培地に置換してそのまま72時間培養を継続した。このようにして、組換えウィルス作製用トランスファーベクターとBaculo VirusゲノムDNAとが相同組換えをおこした結果として、Baculo Virus由来のポリヘドリン蛋白質遺伝子が有するプロモーターの下流に本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2をコードするＤＮＡ又は本転写調節因子（rNXF）をコードするＤＮＡが組み込まれた組換えウイルス粒子を得た。尚、対照として市販（ファーミンゲン社より購入した）のWild Baculo Virus（非組換え型ウィルス）を用いた。
【００６１】
(2-8-4) 本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2又は本転写調節因子（NXF）を含む全細胞抽出液の調製
本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2又は本転写調節因子（NXF）を含む全細胞抽出液を以下のようにして作製した。
まず、T50フラスコ中の106個の昆虫細胞Sf21に上記（2-8-3）で調製された組換えウィルス粒子を感染させた。感染72時間後、細胞を1000gで2分間遠心分離することにより、細胞ペレットを回収した。回収された細胞ペレットを細胞体積の4倍量の２０ｍM HEPS（pH7.9）、300mM NaCl、20％ Glycerolの組成からなるバッファー中でピペットを用いてピペッテイングすることによりホモジナイズし、これを３０分間氷上に放置した。放置後、10,000gで1時間遠心分離することにより上清を回収した。この上清を、本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2又は本転写調節因子（NXF）を含む全細胞抽出液として以下の試験に用いた。
【００６２】
(2-8-5) ゲルシフトアッセイ
ゲルシフトアッセイを以下のようにして行った。
まず、CME二本鎖オリゴヌクレオチドは、２種のオリゴヌクレオチド（配列番号４９：5´-ctagaaatttgtacgtgccacaga-3´、配列番号５０：5´-tctgtggcacgtacaaatttctag-3´）をアニールして作製された。一方、E-box二本鎖オリゴヌクレオチド（CMEのコア配列に１塩基置換を有する塩基配列を有するＤＮＡであって、Sim2とArnt2とが結合しなくなったＤＮＡ）は、２種以下のオリゴヌクレオチド（配列番号５１：5´-caagtccacgtgcaggga-3´、配列番号５２：5´-tccctgcacgtggacttg-3´）をアニールして作製された。
作製されたCME二本鎖オリゴヌクレオチド2μgに10UのT4 kinase及び3.7MBqの[γ-32P]-ATP（AA0018;アマシャムファルマシア社製）を用いて37℃、１時間反応させることにより、その5'末端を放射能ラベルした。これをスピンカラム（ProbeQuant G50 micro columns；アマシャムファルマシア社製）で1000xgで2分間遠心分離し素通り画分を回収することにより、過剰な放射性基質が除かれた放射能ラベルCME二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。このようにして得られた放射能ラベルCME二本鎖オリゴヌクレオチド約104DPM／試験区を以下のゲルシフトアッセイにおけるhotプローブDNAとして用いた。ゲルシフトアッセイにおけるhotプローブDNAとの結合反応は、20mM HEPES （pH7.9）、１００ｍM NaCl、１ｍM DTT、5％Glycerol、0.1μg/μl Poly[dI-dC]及び前記（2-8-4）で調製された全細胞抽出液１μgからなる組成の反応液を、25℃、30分間インキュベートすることにより行われた。尚、ColdプローブDNAをCompetitorとして結合反応系内に添加する場合には、hotプローブDNAの量の100倍の量を結合反応系内に共存させた。上記の結合反応により生じた結合反応生成物を、0.5xTBE bufferを用いて、５％（アクリルアミド：ビス＝39：1）ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。電気泳動後、３MMChr濾紙にゲルを転写し、乾燥した後当該濾紙を用いてIPプレート（富士フィルム社製）を約３時間感光させた。放射能感光されたIPプレートをイメージングアナライザー（富士フィルム社製）を用いてその放射能感光部分を読み取ることにより、ゲルイメージを得た。
結果を図６に示す。本転写調節因子（NXF）とArnt属転写共役因子Arnt2とが共存するときのみにhotプローブDNA（即ち、放射能ラベルCME二本鎖オリゴヌクレオチド）との結合を示すバンドが観察された。一方、そのバンドは、大過剰のCold プローブDNAである放射能非ラベルCME二本鎖オリゴヌクレオチドを結合反応系内に共存させると消失したが、大過剰のColdプローブDNAである 放射能非ラベルE-box二本鎖オリゴヌクレオチドを結合反応系内に共存させても消失しないことから、E-box配列に結合することなく、CME配列に特異的な結合を示すバンドであることが判明した。
以上より、本発明転写活性複合体はCME配列（即ち、Arnt属転写共役因子と転写調節因子Ｓｉｍ２との転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡ）に特異的に結合することが確認された。
【００６３】
（２−９）本発明転写活性化複合体が有する転写促進能力を確認するためのCME配列応答性レポーターを用いたルシフェラーゼアッセイ
(2-9-1) pRC/RSV-hArnt2kozacの調製
Arnt2全長の哺乳動物細胞内発現プラスミドを以下のようにして作製した。
まず、pBlue-hArnt2kozacをNotIとXbaIとで同時に切断し、これを低融点アガロース電気泳動（AgaroseL；ニッポンジーン社製）に供することにより、Arnt2をコードするＤＮＡの翻訳領域全長を含むＤＮＡ（約2.2kbp）を回収した。回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。
次に、ｐRC/RSV（Invitrogen社より購入した）をNotIとXbaIとで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合することにより、Arnt2全長を哺乳動物細胞内で発現させるためのプラスミド（即ち、Arnt2全長の哺乳動物細胞内発現プラスミド）であるｐRC/RSV-hArnt2kozacを調製した。
【００６４】
(2-9-2) pRC/RSV-mNXFsense（及びpRC/RSV-mNXFantisense）の調製
次に、本転写調節因子（mNXF）全長の哺乳動物細胞内発現プラスミドを以下のようにして作製した。
まず、pGEM-mNXFは、mNXFをコードする翻訳領域の開始コドンの上流に市販のpGEMベクターのSp6プロモーターが位置するように構築されていた。そこでこのpGEM-mNXF 1μgを鋳型にして、２種のオリゴヌクレオチド（フォワードプライマー5´-gggcgctgcagcccagccaccatgtaccgatccaccaaggg-3´（配列番号５３）、リバースプライマー5´-aatctcggcgttgatctggt-3´（配列番号５４）をプライマーとしてKODplusポリメラーゼ（TOYOBO社製）を用いてPCR反応を行うことにより、本転写調節因子（mNXF）の開始コドンの直前にコザック配列（5'-CCAGCCACC-3'）とさらにその上流にPstI制限酵素部位とが導入された本転写調節因子（mNXF）ＤＮＡの部分断片を得た。尚、PCR反応条件は、95℃１分間次いで55℃３０秒間さらに72℃１分間の保温を1サイクルとしてこれを35サイクルであった。このようにして得られた増幅ＤＮＡを、PstIとBssHIIとで切断した後、これを低融点アガロース電気泳動（NusieveGTGアガロース；FMCbio社製）に供することにより精製・回収した。精製・回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。次に、pGEM-mNXFをPstIとBssHIIとで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡを低融点アガロース電気泳動（AgaroseL；ニッポンジーン社製）に供することにより、ＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡ（0.1μｇ）をベクターとした。このベクターに上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、本転写調節因子（mNXF）の開始コドン直前にコザック配列（5'-CCAGCCACC-3'）が導入されているpGEM-mNXFコザックを作製した。
次に、このｐGEM-mNXFコザックをPstI、NotI及びScaIの３者で同時に切断した後、これを低融点アガロース電気泳動に供することにより、mNXFコザックPstI-NotI切断断片であるＤＮＡ（約2.5kbp）を回収した。そして回収されたＤＮＡをT4ポリメラーゼを用いて平滑末端化して得られたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。RSVプロモーターを保有するpRC/RSV（Invitorgen社製）をHindIIIで切断した後T4ポリメラーゼで平滑末端化して得られたＤＮＡをBAP処理し、これをベクターとした。このベクター（0.1μg）に上記のインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、（ａ）RSVプロモーターの制御下にmNXFコザックのセンス鎖が発現するようにしたpRC/RSV-mNXFsense、及び（ｂ）RSVプロモーターの制御下にmNXFコザック断片のアンチセンス鎖が発現するようにしたpRC/RSV-mNXFantisenseを作製した。尚、以下の試験では、このうちpRC/RSV-mNXFsenseのみを本転写調節因子（mNXF）の哺乳動物細胞内発現プラスミドとして利用した。
【００６５】
(2-9-3) pRC/RSV-hSim2kozacの調製
Sim2の哺乳動物細胞内発現プラスミドとしては、前記(2-4-5)で作製されたpRC/RSV-hSim2kozacを用いた。
【００６６】
(2-9-4) pRC/RSV-hClock kozacの調製
Clockを発現するプラスミドを以下のようにして作製した。
まず、pBlue-hClock kozacをEcoRV及びSpeIの両制限酵素で切断した。これをT4ポリメラーゼにより平滑末端化した後、これを低融点アガロース電気泳動に供することにより、ＤＮＡ（約2.5kbp：Clockの翻訳配列を含む）を回収した。回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pRC/RSVベクターをHindIIIで切断した後T4ポリメラーゼで平滑末端化して得られたＤＮＡ（0.1μg）にインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、pRC/RSV-hClock kozacを作製した。
【００６７】
(2-9-5) pGL3-TATA-CMEx4の調製
TATA最小プロモーターを有するルシフェラーゼ遺伝子の上流に、CME配列（即ち、Sim１又はSim2が結合し得るＤＮＡ領域）を４コピー有するレポーター遺伝子プラスミドを以下のようにして作製した。
まず、２種のオリゴヌクレオチド（配列番号５５：5´-ctagcctagaaatttgtacgtgccacagactagaaatttgtacgtgccacagag-3´、配列番号５６：5´-ctagctctgtggcacgtacaaatttctagtctgtggcacgtacaaatttctagg-3´）をアニールさせることにより、二本鎖オリゴヌクレオチドを作製した。作製された二本鎖オリゴヌクレオチドは、CME配列（即ち、Sim1又はSim2が結合し得るＤＮＡ領域）を２コピー有し、かつ、末端がNheI制限酵素切断断片と結合できる突出末端となっている。このオリゴヌクレオチドの末端をT4 kinaseでリン酸化した後、これをT4 Ligaseを用いてタンデムに結合させることにより、結合反応生成物を得た。得られた結合反応生成物を低融点アガロース電気泳動（NusieveGTGアガロース；FMCbio社製）に供することにより、二本鎖オリゴヌクレオチドが２つタンデムに結合してなるＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。pGL3-TATAベクターをNheIで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）にインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合することにより、TATA最小プロモーターを有するルシフェラーゼ遺伝子の上流に、CME配列（即ち、Sim1又はSim2が結合し得るＤＮＡ領域）を４コピー有するレポーター遺伝子プラスミドであるpGL3-TATA-CMEx4を作製した。
【００６８】
(2-9-6) pGL3-TATA-（Ebox）x3の調製
TATA最小プロモーターを有するルシフェラーゼ遺伝子の上流に、E-boxを有するレポーター遺伝子プラスミドを以下のようにして作製した。
まず、２種のオリゴヌクレオチド（配列番号５７：5´-ctttagccacgtgacagtgtaagcacacgtgggccctcaagtccacgtgcagggac-3´、配列番号５８：5´-tcgagtccctgcacgtggacttgagggcccacgtgtgcttacactgtcacgtggctaaaggtac-3´）をアニールさせることにより、二本鎖オリゴヌクレオチドを作製した。作製された二本鎖オリゴヌクレオチドは、Clockの応答性配列（即ち、E-box：Science（1998）280、1564-1567,N.Gekakis et.al.）を３コピー有し、かつ、末端がKpnIとXhoIとの切断末端に結合できるような突出末端になっている。このオリゴヌクレオチドの末端をT4 Kinaseでリン酸化して得られたＤＮＡをインサートＤＮＡとした。そしてpGL3-TATAベクターをKpnIとXhoIとで切断した後BAP処理して得られたＤＮＡ（0.1μg）にインサートＤＮＡ（0.5μg）をT4 Ligaseで結合させることにより、TATA最小プロモーターを有するルシフェラーゼ遺伝子の上流に、Clockの応答性配列（即ち、E-box）を３コピー有するレポーター遺伝子プラスミドであるpGL3-TATA-（Ebox）x3を作製した。
【００６９】
(2-9-7) 本発明転写活性化複合体の転写促進能力を確認するためのレポーターアッセイ
約５ｘ１０6のHeLa細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（日水製薬社製）を用いて３７℃にて５％ＣＯ2存在下に、直径約１０ｃｍのシャーレ（ファルコン社製）を用いて培養した。翌日、培養された細胞をトリプシン処理により分散し、FBSを含まないDMEM培地で２回洗浄した後、再度５ｘ１０6に細胞密度がなるようにFBSを含まないDMEM培地に分散した。この細胞分散液0.4ｍｌに、前記（2-9-5,6）で調製されたレポーター遺伝子プラスミド（例えば３μg）、前記（2-9-1,2）で調製された蛋白質を発現するプラスミド（例えば３μg）及び前記（2-9-3,4）で調製された蛋白質を発現するプラスミド等（例えば３μg）の３者を組み合わせて混合した（表１に組み合わせの詳細を記載する。）後、この混合物をエレクトロポレーション用キュベットに移し、Geneパルサー（BIORAD社製）を用いたエレクトロポレーション法により220V、950μFの条件でトランスフェクションを行った。トランスフェクション後、培地を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に置換してさらに６穴プレート内で約24時間培養した。
【００７０】
【表１】
次いで、ウェルから培地を除き、器壁に接着している細胞をPBS(-)で２回洗浄した後、５倍に希釈したＰＧＣ５０（東洋インキ社製）をウェルあたり２００μｌずつ加えてさらに室温に３０分間放置した。この細胞液２０μｌずつをオペークプレート（コーニングコースター社製）上に分注し、当該プレートを酵素基質自動インジェクター付きルミノメーターＬＢ９６Ｐ（ベルトールド社製）にセットし、５０μｌの基質液ＰＧＬ１００（東洋インキ社製）を自動分注した後、各ウェル内のルシフェラーゼ活性をそれぞれ測定した。
Clockの応答性配列であるE-box配列により制御されるレポーター遺伝子の発現に対して、（ａ）本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2単独発現の場合、（ｂ）本転写調節因子（NXF）単独発現の場合及び（ｃ）本発明転写活性化複合体発現（即ち、本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2と本転写調節因子（NXF）との同時発現）の場合には何ら影響を与えないことが確認された（図７）。
一方、CME配列により制御されるレポーター遺伝子の発現に対して、（ａ’）本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2単独発現の場合及び（ｂ’）本転写調節因子（NXF）単独発現の場合には顕著な影響を与えないのに対して、（ｃ’）本発明転写活性化複合体発現（即ち、本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2と本転写調節因子（NXF）との同時発現）の場合には強い転写促進能力が示された。
このことから、本発明転写活性化複合体が結合し得るＤＮＡ領域はCME配列と同一であり、そして本発明転写活性化複合体は当該CME配列を含むプロモーターに対して転写促進作用を示すことが確認された。
また、本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2存在下で、本転写調節因子（NXF）は用量依存的にレポーター遺伝子の転写を活性化した（図８中のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ参照）。また本発明転写活性化複合体により転写活性が上昇しているところへSim2を添加していく系（図８中のＥ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）では、Sim2の用量依存的にレポーター遺伝子の転写が抑制された。陰性対照として用いたClockを上記のSim2の代わりに添加していく系（図８中のＩ、Ｊ、Ｋ、Ｌ参照）では、レポーター遺伝子の転写は抑制されなかった。
さらに、本ＡＲＮＴ属転写共役因子Arnt2存在下で、Sim２の添加によって転写が抑制されている状態に対して本転写調節因子（mNXF）を添加していく系（図９中のｂ、ｃ、ｄ、ｅ）では、mNXFの用量依存的に、Sim2による転写の抑制が解除され転写活性化が生じた。このように本転写調節因子（mNXF）は、CME配列を含むプロモーターに機能可能な形で結合しているレポーター遺伝子のSim2による転写抑制を解除することが確認された。
【００７２】
【発明の効果】
本発明により、Ｓｉｍ２／ＡＲＮＴファミリー属転写共役因子複合体と競合的にＣＭＥ配列に結合して、当該配列の下流に位置する遺伝子の転写を促進する能力を有する転写調節因子／ＡＲＮＴファミリー属転写共役因子複合体等が提供可能となった。
【００７３】
[配列表フリーテキスト]
配列番号７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１
Gal4蛋白質応答要素のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１２
Lex蛋白質応答要素のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１３
Lac I受容体蛋白質応答要素のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１４
テトラサイクリン受容体蛋白質応答要素のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１５
ZFHD-1蛋白質応答要素のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１６
ＣＭＥ配列
配列番号１７
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１８
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１９
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２０
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２１
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２２
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２３
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２４
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４９
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号５０
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号５１
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号５２
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号５３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５５
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号５６
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号５７
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号５８
プラスミド構築のために設計されたオリゴヌクレオチド
【００７４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本ＡＲＮＴ属転写共役因子と本転写調節因子との複合体形成を確認するためのツーハイブリッドアッセイ（Gal4-NXF＋VP16-Xを用いた系）の結果を示す図である。横軸は、各試験系に用いた転写共役因子及び他を示す。左端から３番目までが本ＡＲＮＴ属転写共役因子である。左端から４番目から６番目までは非本ＡＲＮＴ属転写共役因子であり、これは比較のための試験系に相当する。右端から２番目は本転写調節因子（NXF）であり、これはホモダイマー形成の有無を調べるための試験系に相当する。また最右端はＣＰであり、これはネガティブコントロールのための試験系に相当する。縦軸は、ルシフェラーゼ活性値を示しており、これはレポーター遺伝子の転写に対する活性を表す指標値である。
【図２】本ＡＲＮＴ属転写共役因子であるＡＲＮＴ１と本転写調節因子との複合体形成を確認するためのツーハイブリッドアッセイ（Gal4-Arnt1＋VP16-Xを用いた系）の結果を示す図である。横軸は、各試験系に用いた転写調節因子を示す。最左端はSim2であり、これはポジティブコントロールのための試験系に相当する。左端から２番目はClockであり、これは比較のための試験系に相当する。右端から２番目は本転写調節因子（NXF）である。最右端はＣＰであり、これはネガティブコントロールのための試験系に相当する。縦軸は、ルシフェラーゼ活性値を示しており、これはレポーター遺伝子の転写に対する活性を表す指標値である。
【図３】本ＡＲＮＴ属転写共役因子であるＡＲＮＴ２と本転写調節因子との複合体形成を確認するためのツーハイブリッドアッセイ（Gal4-Arnt2＋VP16-Xを用いた系）の結果を示す図である。横軸は、各試験系に用いた転写調節因子を示す。左端は本転写調節因子（NXF）である。右端はＣＰであり、これはネガティブコントロールのための試験系に相当する。縦軸は、ルシフェラーゼ活性値を示しており、これはレポーター遺伝子の転写に対する活性を表す指標値である。
【図４】本ＡＲＮＴ属転写共役因子であるＡＲＮＴ３と本転写調節因子との複合体形成を確認するためのツーハイブリッドアッセイ（Gal4-Arnt3＋VP16-Xを用いた系）の結果を示す図である。横軸は、各試験系に用いた転写調節因子を示す。左端は本転写調節因子（NXF）である。右端はＣＰであり、これはネガティブコントロールのための試験系に相当する。縦軸は、ルシフェラーゼ活性値を示しており、これはレポーター遺伝子の転写に対する活性を表す指標値である。
【図５】非本ＡＲＮＴ属転写共役因子であるＢｍａｌ２と本転写調節因子との複合体形成を確認するためのツーハイブリッドアッセイ（Gal4-Bmal2＋VP16-Xを用いた系）の結果を示す図である。横軸は、各試験系に用いた転写調節因子を示す。左端はClockであり、これはポジティブコントロールのための試験系に相当する。真中は本転写調節因子（NXF）である。右端はＣＰであり、これはネガティブコントロールのための試験系に相当する。縦軸は、ルシフェラーゼ活性値を示しており、これはレポーター遺伝子の転写に対する活性を表す指標値である。
【図６】本発明転写活性化複合体が有するＤＮＡ結合性を確認するためのゲルシフトアッセイの結果を示す写真である。レーン１（最左端）はプローブのみを試料とした場合、レーン２はWild Baculo Virus（非組換え型ウィルス）感染細胞から調製された全細胞抽出液を試料とした場合、レーン３は本Arnt属転写共役因子であるArnt2を含む全細胞抽出液を試料とした場合、レーン４は本転写調節因子（NXF）を含む全細胞抽出液を試料とした場合、レーン５は本Arnt属転写共役因子であるArnt2及び本転写調節因子（NXF）（即ち、本発明転写活性化複合体に相当する）を含む全細胞抽出液を試料とした場合、レーン６は大過剰のCold プローブDNAである放射能非ラベルCME二本鎖オリゴヌクレオチドを結合反応系内に共存させた時の、本発明転写活性化複合体（即ち、Arnt2及びNXF）を含む全細胞抽出液を試料とした場合、レーン７は大過剰のCold プローブDNAである放射能非ラベルE-box二本鎖オリゴヌクレオチドを結合反応系内に共存させた時の、本発明転写活性化複合体（即ち、Arnt2及びNXF）を含む全細胞抽出液を試料とした場合を示している。レーン５及び７では、特異的な結合を示すバンド（hotプローブＤＮＡとの結合を示すバンド）が観察される。
【図７】本発明転写活性化複合体の転写促進能力を確認するためのレポーターアッセイの結果を示す図である。横軸は、各試験系に用いた応答性配列と、転写調節因子及び／又は転写共役因子転写調節因子との組み合わせを示す。最左端から４番目までがClockの応答性配列であるE-box配列を用いた系であり、これは比較のための試験系に相当する。一方、最左端から５番目以降はＣＭＥ配列を用いた系であり、本発明のための試験系に相当する。縦軸は、ルシフェラーゼ活性値を示しており、これはレポーター遺伝子の転写に対する活性を表す指標値である。最右端では、CME配列により制御されるレポーター遺伝子の発現に対する、本発明転写活性化複合体（即ち、本ＡＲＮＴ属転写共役因子であるArnt2と本転写調節因子（NXF）との同時発現）の強い転写促進能力が確認される。
【図８】本発明転写活性化複合体の転写促進能力を確認するためのレポーターアッセイ（CME配列を含むプロモーターに機能可能な形で結合しているレポーター遺伝子を用いる系）の結果を示す図である。横軸は、各試験系に用いた本ＡＲＮＴ属転写共役因子であるＡＲＮＴ２と、各種の転写調節因子（Clock、NXF又はSim2）との組み合わせを示す。最左端から４番目まで（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）が本ＡＲＮＴ属転写共役因子であるArnt2存在下での本転写調節因子（NXF）によるレポーター遺伝子の転写活性に関する用量依存性の試験系に相当する。最左端から５番目から８番目まで（Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）が本ＡＲＮＴ属転写共役因子であるArnt2存在下での本転写調節因子（NXF）によるレポーター遺伝子の転写活性に対するSim2の影響性の試験系に相当する。最左端から９番目から１２番目まで（Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ）が本ＡＲＮＴ属転写共役因子であるArnt2存在下での本転写調節因子（NXF）によるレポーター遺伝子の転写活性に対するClockの影響性の試験系であって、ネガティブコントロールに相当する。
【図９】本発明転写活性化複合体の転写促進能力を確認するためのレポーターアッセイ（CME配列を含むプロモーターに機能可能な形で結合しているレポーター遺伝子を用いる系）の結果を示す図である。横軸は、各試験系に用いた本ＡＲＮＴ属転写共役因子であるＡＲＮＴ２と、各種の転写調節因子（NXF及び／又はSim2）との組み合わせを示す。最左端から２番目以降（ｂ、ｃ、ｄ、ｅ）は本ＡＲＮＴ属転写共役因子であるＡＲＮＴ２の共存時における、Sim2存在下での本転写調節因子（NXF）によるレポーター遺伝子の転写活性に対する本転写調節因子（NXF）の影響性の試験系に相当する。最左端（ａ）は本ＡＲＮＴ属転写共役因子であるＡＲＮＴ２の共存時における、転写調節因子Ｓｉｍ２非存在下での本転写調節因子（NXF）によるレポーター遺伝子の転写活性に関する試験系であって、コントロールに相当する。
Claims (19)
- 転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかと、下記のいずれかのアミノ酸配列を有する転写調節因子との複合体であって、前記転写共役因子と転写調節因子Ｓｉｍ２との転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡに結合する能力を有し、前記ＤＮＡ領域の下流に位置する遺伝子の転写を促進する能力を有することを特徴とする転写活性化複合体。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列 - 請求項１記載の転写活性化複合体を産生する能力を有し、前記複合体を構成する蛋白質をコードする１種以上のＤＮＡが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体。
- 下記の（１）および（２）のＤＮＡを含有する一種のベクター又は前記ＤＮＡを個別に有する複数種のベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする請求項２記載の形質転換体。
＜ＤＮＡ＞
（１）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
（２）下記のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列 - 転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかと転写調節因子Ｓｉｍ２との転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡを含むプロモーターを機能可能な形で結合しているレポーター遺伝子のＤＮＡをさらに含有することを特徴とする請求項２又は３記載の形質転換体。
- 物質が有する、請求項１記載の転写活性化複合体が有する転写促進能力を調節する能力の評価方法であって、
（１）請求項４記載の形質転換体と被験物質とを接触させる第一工程、
（２）前記第一工程後に、前記形質転換体が有するレポーター遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、及び
（３）前記第二工程により測定された発現量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記物質の前記転写活性化複合体が有する転写促進能力を調節する能力を評価する第三工程、
を有することを特徴とする評価方法。 - 請求項５記載の評価方法により評価された調節能力に基づき、前記転写活性化複合体が有する転写促進能力を調節する能力を有する物質を選抜する工程、
を有することを特徴とする探索方法。 - 下記の構成要素Ｉのうちのいずれか一方の構成要素及び下記の構成要素ＩＩのうちのいずれか一方の構成要素を有する蛋白質と、下記の構成要素Ｉのうちの他方の構成要素及び下記の構成要素ＩＩのうちの他方の構成要素を有する蛋白質とが結合してなることを特徴とする転写活性化複合体であって、転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかと転写調節因子Ｓｉｍ２との転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡに結合する能力を有し、前記ＤＮＡ領域の下流に位置する遺伝子の転写を促進する能力を有する転写活性化複合体。
＜構成要素Ｉ＞
（Ａ）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかに由来し、下記のいずれかのアミノ酸配列を有する転写調節因子が結合する領域、又は
（Ｂ）下記のいずれかのアミノ酸配列を有する転写調節因子に由来し、転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかが結合する領域
＜構成要素ＩＩ＞
（Ｘ）宿主細胞内で機能可能な転写調節因子のＤＮＡ結合領域、又は
（Ｙ）宿主細胞内で機能可能な転写調節因子の転写活性化領域
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列 - 前記構成要素ＩＩの（Ｘ）が、下記のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡに結合するＤＮＡ結合領域であることを特徴とする請求項７記載の転写活性化複合体。
＜ＤＮＡ配列群＞
（１）Ｇａｌ４蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列、
（２）Ｌｅｘ蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列、
（３）Ｌａｃ Ｉ受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列、
（４）テトラサイクリン受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列
（５）ＺＦＨＤ−１蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列
（６）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかと転写調節因子Ｓｉｍ２との転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡの塩基配列 - 前記構成要素ＩＩの（Ｙ）が、下記のいずれかの蛋白質由来の転写活性化領域であることを特徴とする請求項７記載の転写活性化複合体。
＜蛋白質＞
（１）Ｇａｌ４蛋白質、
（２）Ｌｅｘ蛋白質、
（３）Ｌａｃ Ｉ受容体蛋白質、
（４）テトラサイクリン受容体蛋白質、
（５）ＺＦＨＤ−１蛋白質、
（６）Ｂ４２蛋白質
（７）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかの蛋白質、
（８）ＶＰ１６蛋白質 - 前記両者の蛋白質がリガンドによる制御下において結合してなることを特徴とする請求項７記載の転写活性化複合体。
- 前記構成要素Ｉの（Ｂ）が、前記リガンドが結合する領域を有することを特徴とする請求項１０記載の転写活性化複合体。
- 請求項７記載の転写活性化複合体を産生する能力を有し、
（１）下記の構成要素ｉのうちのいずれか一方の構成要素及び下記の構成要素ｉｉのうちのいずれか一方の構成要素を含有するＤＮＡと、
（２）下記の構成要素ｉのうちの他方の構成要素及び下記の構成要素ｉｉのうちの他方の構成要素を含有するＤＮＡと、
（３）下記の構成要素ｉｉｉを含有するＤＮＡと
が宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体。
＜構成要素ｉ＞
（ａ）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかに由来し、下記のいずれかのアミノ酸配列を有する転写調節因子が結合する領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、又は
（ｂ）下記のいずれかのアミノ酸配列を有する転写調節因子に由来し、転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかが結合する領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
＜構成要素ｉｉ＞
（ｘ）宿主細胞内で機能可能な転写調節因子のＤＮＡ結合領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、又は
（ｙ）宿主細胞内で機能可能な転写調節因子の転写活性化領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
＜構成要素ｉｉｉ＞
構成要素ｉｉの（ｘ）の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合領域が結合可能なＤＮＡ、および、構成要素ｉｉの（ｙ）の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有する転写活性化領域により活性化されうるプロモーターの下流に接続されたレポーター遺伝子のＤＮＡ
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列の塩基番号１０２〜２５０７で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号５で示される塩基配列の塩基番号５１〜２４５６で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号６で示される塩基配列の塩基番号３５〜２４４０で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ転写調節能を有する蛋白質のアミノ酸配列 - 前記構成要素ｉｉの（ｘ）が、下記のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡに結合する蛋白質由来のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とする請求項１２記載の形質転換体。
＜塩基配列群＞
（１）Ｇａｌ４蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列、
（２）Ｌｅｘ蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列、
（３）Ｌａｃ Ｉ受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列、
（４）テトラサイクリン受容体蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列
（５）ＺＦＨＤ−１蛋白質が結合するＤＮＡの塩基配列
（６）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかと転写調節因子Ｓｉｍ２との転写抑制化複合体が結合し得るＤＮＡの塩基配列 - 前記構成要素ｉｉの（ｙ）が、下記のいずれかの蛋白質由来のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とする請求項１２記載の形質転換体。
＜蛋白質＞
（１）Ｇａｌ４蛋白質、
（２）Ｌｅｘ蛋白質、
（３）Ｌａｃ Ｉ受容体蛋白質、
（４）テトラサイクリン受容体蛋白質、
（５）ＺＦＨＤ−１蛋白質、
（６）Ｂ４２蛋白質、
（７）転写共役因子ＡＲＮＴ１〜３のいずれかの蛋白質、
（８）ＶＰ１６蛋白質 - ツーハイブリッドアッセイのための、請求項７記載の転写活性化複合体の使用。
- ツーハイブリッドアッセイのための、請求項１２記載の形質転換体の使用。
- 物質が有する、請求項１２記載の形質転換体が産生する転写活性化複合体の転写促進能力を調節する能力の評価方法であって、
（１）請求項１２記載の形質転換体と被験物質とを接触させる第一工程、
（２）前記第一工程後に、前記形質転換体が有するレポーター遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する第二工程、及び
（３）前記第二工程により測定された発現量又はその量と相関関係を有する指標値に基づき前記物質の転写活性調節能力を評価する第三工程
を有することを特徴とする評価方法。 - 請求項１７記載の評価方法により評価された転写活性調節能力に基づき、前記転写活性化複合体が有する転写促進能力を調節する能力を有する物質を選抜する工程を有することを特徴とする探索方法。
- （１）標識されたリガンドが結合している請求項１記載の転写活性化複合体と被験物質とを接触させる工程、及び
（２）前記転写活性化複合体と前記被験物質との結合状態を、前記標識されたリガンドと当該被験物質との競合により生じる遊離型の標識されたリガンド又は結合型の標識されたリガンドの量又はその量に相関関係を有する指標値をモニターすることにより間接的に確認する工程
を有することを特徴とするレセプターバインディングアッセイ。
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