JP4409631B2 - 高力価ウイルスの生産方法および哺乳動物細胞への効率のよいレトロウイルス媒介形質導入 - Google Patents
高力価ウイルスの生産方法および哺乳動物細胞への効率のよいレトロウイルス媒介形質導入 Download PDFInfo
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Description
本発明は、新規なレトロウイルス構築物および哺乳動物細胞内での組換えレトロウイルスの一時的生産におけるその使用、ならびに哺乳動物細胞に効率よく形質導入を行うための該構築物の使用方法に関するものである。
発明の背景
レトロウイルスベクターはヒトの遺伝子治療において遺伝子を運搬するための重要な手段となっている(Miller, Nature 357:455-460(1992))。レトロウイルスベクターは初代培養において広範囲のげっ歯類、霊長類およびヒトの体細胞に単一コピーの非再配列遺伝子を送達できるため、この目的によく合致している。トリ(E)およびマウス(ψ)レトロウイルスのパッケージングシグナルをコードするレトロウイルス転写物内に存在する配列の同定とその後の欠失は、感染性ウイルス粒子の生産に必要なタンパク質をトランスで供給するためのパッケージング細胞系の開発を可能としたが、パッケージング細胞系がそれ自身のウイルスゲノムmRNAをパッケージすることをできなくしている(Watanabe and Temin, Molec. Cell. Biol. 3(12):2241-2249(1983); Mannら,Cell 33:153-159(1983); およびEmbretson and Temin, J. Virol. 61(9):2675-2683(1987))。レトロウイルスパッケージング系を構築する際に考慮すべき最も重要な点は、複製能のある組換えレトロウイルスを含まない高力価ベクター上清を生産することであり、複製能のあるレトロウイルスはげっ歯類(Cloydら,J. Exp. Med. 151, 542-552(1980))および霊長類(Donahueら,J. Exp. Med. 176, 1125-1135(1992))においてT細胞リンパ腫を形成することがわかっている。初期のマウスレトロウイルスパッケージング系は複製能のあるレトロウイルス(RCR:replication competent retrovirus)を形成する傾向が高く(Cone and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349-6353(1984)、また、ψ−ゲノムを同時パッケージする傾向も高かったが(Mannら,前掲,1983; Buttimore and Miller, Mol. Cell. Biol. 6(8):2895-2902(1986))、RCR形成能が著しく低下した第二世代のパッケージング系を構築するための2つの戦略が開発された。PA317によって具体化された1つの戦略は、第2鎖合成のための開始部位(3’LTR)とψ部位が欠失された単一ゲノムパッケージング構築物を使用するものである(Miller and Buttimore, Molec. Cell. Biol. 6(8):2895-2902(1986))。これらの改良は、パッケージングゲノムとウイルスベクター間の相同性を可能なかぎり排除して組換え体形成能を低下させるものであり、多くのベクター系とともにヘルパーフリーの高力価ウイルスの生産をもたらした(Miller and Rosman, BioTechniques 7(9):980-990(1989))。2番目のアプローチは、パッケージング機能を2つのゲノム、すなわちgagおよびpol遺伝子産物を発現するゲノムとenv遺伝子産物を発現するゲノム、に分割するものであった(Bosselmanら,Molec. Cell. Biol. 7(5):1797-1806(1987); Markowitzら,J. Virol. 62(4): 1120-1124(1988); Danos and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA)85: 6460-6464(1988))。このアプローチは、ψ−ゲノムを同時パッケージしてその後トランスファーする能力を排除するだけでなく、組換えを受けてRCRを生産するに違いないパッケージング細胞内の3つのレトロウイルスゲノムの存在ゆえに組換え頻度を非常に減少させた。組換え体が生じる場合には、望まれない遺伝子産物内の変異(Danos and Mulligan, 前掲)または欠失(Bosselmanら,前掲; Markowitzら,前掲)が組換え体を非機能的にする。その上、両方のパッケージング機能構築物上の3’LTRの欠失は機能的な組換え体を形成する能力をさらに減ずる。2つのゲノムパッケージング系を形成する初期の試みは低力価の生産体クローンを生起させたが(Bosselmanら,前掲)、今では高力価の生産体クローンをもたらす生産体系が利用可能となっている(Danos and Mulligan, 前掲; Markowitzら,前掲)。
現在入手できるパッケージング系は、遺伝子治療で使用するためにヒト細胞に形質を導入するのに十分な力価の生産体クローンをもたらし、ヒトの臨床試験の開始へと導いた(Miller, 前掲)。しかし、こうしたパッケージング系は2つの面で不十分なものである。第一に、特定の用途に適するレトロウイルスベクターを設計するのに、数種のベクター構成を構築して試験することが必要となる。例えば、Belmontら,Molec. and Cell. Biol. 8(12):5116-5125(1988)は、最高力価の生産体を生産しかつ最適な発現を与えることができるベクターを同定するために、16種類のレトロウイルスベクターから安定した生産体系を構築した。試験したベクター構成の一部には次のものが含まれていた。すなわち、(1)LTR駆動発現対内部プロモーター、(2)ウイルスまたは細胞の遺伝子から誘導される内部プロモーターの選択、および(3)構築物に選択マーカーが組み込まれたか否か、である。安定な生産体系を形成する必要がなく、迅速な高力価ウイルスの生産を可能とするパッケージング系は、いくつかの構築物から誘導される高力価生産体クローンの同定に要する約2か月を節約できるという点で非常に有利であろう。
第二に、NIH 3T3細胞と比べて、高力価アンホトロピック(両栄養性)レトロウイルス生産体による哺乳動物体細胞の初代培養物の感染効率は相当に変動する。マウス筋芽細胞(Dhawanら,Science 254:1509-1512(1991))またはラット毛細管内皮細胞(Yaoら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8101-8105(1991))の形質導入効率はNIH 3T3細胞のそれとほぼ等しいことがわかったが、イヌ肝細胞の形質導入効率(Armentanoら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145(1990))はNIH 3T3細胞で見いだされた効率の25%にすぎなかった。初代ヒト腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)、末梢血リンパ球から単離されたヒトCD4+およびCD8+ T細胞、そして霊長類の長期再構成造血幹細胞はNIH 3T3細胞と比べて形質導入効率が低い極端な例である。精製したヒトCD4+およびCD8+ T細胞は、ある場合に、安定な生産体クローンからの上清を用いて6〜9%のレベルで感染することが報告されており(Moreckiら,Cancer Immunol. Immunother. 32:342-352(1991))、そして霊長類またはヒトの長期再構成造血幹細胞は、NIH 3T3細胞での106個/mlの力価の生産体により1%以下が感染したにすぎなかった(van Beusechemら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644(1992); およびDonahueら,前掲)。もしもレトロウイルスベクターがneoR遺伝子を含むならば、形質導入細胞について高度に富化された集団はG418の存在下での選択により得ることができる。ところが、選択マーカーの発現は、造血幹細胞におけるin vivo長期遺伝子発現に対して有害な作用を及ぼすことが明らかとなった(Apperlyら,Blood 78:310-317(1991))。
初代培養のもとで哺乳動物細胞の著しく増大した形質導入を生じさせるアプローチは非常に望まれているものの、この要望は現在まだ満たされていない。
発明の概要
従って、本発明は、一時的トランスフェクションによるヒト細胞内での高力価組換えレトロウイルスの迅速な生産に必要とされるパッケージ可能なレトロウイルスベクター転写物とレトロウイルス遺伝子産物の両方の合成を支配する(それにより、安定な生産体系を形成することの必要性を排除する)新規なプラスミドベースの発現ベクターを提供する。さらに、本発明は、レトロウイルス構築物を用いて形質導入を行うことが難しいと以前に報じられた哺乳動物細胞の効率のよい形質導入法を提供する。本発明はまた、ウイルス生産にトランスで必要とされるレトロウイルス遺伝子産物の合成を支配する本発明のプラスミドベースの発現ベクターが産生細胞のゲノムに安定に組み込まれた細胞系の構築について記述する。こうした安定にトランスフェクションされた系は組換えレトロウイルスを高力価で連続的に生産する安定な細胞系を作るために使用される。
レトロウイルス構築物は、複製能のないレトロウイルスベクターをパッケージするために、そして複製能のあるヘルパーウイルスの生産なしに複製能のないレトロウイルスベクターを高力価でパッケージすることができるウイルス粒子タンパク質を生産するために必要とされる、ウイルス粒子タンパク質の全てをトランスでコードする複製能のないレトロウイルスゲノム由来の少なくとも1つのレトロウイルスヘルパーDNA配列を含んでなるパッケージングプラスミドである。該レトロウイルスDNA配列は該ウイルスの5’LTRの天然のエンハンサーおよび/またはプロモーターをコードする領域を欠いており、さらにヘルパーゲノムのパッケージングに関与するプサイ機能配列と3’LTRをどちらも欠失しているが、ウイルスの生産が望まれる細胞型において効率のよい転写を支配する外来のエンハンサーおよび/またはプロモーターならびにSV40ポリアデニル化部位をコードしている。このレトロウイルスはモロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)またはテナガザル(gibbon ape)白血病ウイルス(GALV)のような白血病ウイルスである。外来エンハンサーおよびプロモーターはヒトサイトメガロウイルス(HCMV)の即時型(IE:immediate early)エンハンサーおよびプロモーター、モロニーマウス肉腫ウイルス(MMSV)のエンハンサーおよびプロモーター(U3領域)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)のU3領域、脾臓フォーカス形成ウイルス(SFFV)のU3領域、または天然のモロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)プロモーターに結合されたHCMV IEエンハンサーであり得る。レトロウイルスパッケージングプラスミドはプラスミドベースの発現ベクターによりコードされる2つのレトロウイルスヘルパーDNA配列を含むことができ、例えば、第1のヘルパー配列はエコトロピック(環境栄養性)MMLVのgagおよびpolタンパク質をコードするcDNAを含み、第2のヘルパー配列はenvタンパク質をコードするcDNAを含む。宿主域を決定するenv遺伝子は、ゼノトロピック(異種栄養性)、アンホトロピック、エコトロピック、ポリトロピック(多栄養性)(ミンクフォーカス形成)または10A1のマウス白血病ウイルスenvタンパク質、またはテナガザル白血病ウイルス(GALV)envタンパク質、ヒト免疫不全ウイルスenv(gp160)タンパク質、水疱性口内炎ウイルス(VSV)Gタンパク質、ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV)I型およびII型のenv遺伝子産物をコードする遺伝子、前記のenv遺伝子の1以上の組合せから誘導されるキメラエンベロープ遺伝子、または前記のenv遺伝子産物の細胞質および膜貫通領域と所望の標的細胞上の特定の表面分子に対するモノクローナル抗体をコードするキメラエンベロープ遺伝子から誘導され得る。
本発明のレトロウイルスパッケージングプラスミドの具体例は、pIK6.1MMSVampac、pIK6.1MCVampac、pIK6.1gagpolATGおよびpIK6.1amenvATGである。
本発明は、所望の細胞型においてパッケージ可能なベクター転写物の効率のよい転写を可能とする修飾5’LTRを含むレトロウイルスベクターを含むものである。さらに、本発明は、外来遺伝子をコードするレトロウイルス構築物を含むものである。
本発明の方法では、高力価の組換えレトロウイルスを含有する上清を得るために、パッケージングプラスミドおよびレトロウイルスベクターがウイルス生産能を有する哺乳動物細胞、例えば293細胞(ATCC No. CRL1573, ATCC, Rockville, MD)のようなヒト胚性腎細胞、の第1の集団に一時的に同時トランスフェクションされる。本発明の他の方法では、その後、標的細胞に効率よく外来遺伝子を導入するために、この一時的にトランスフェクションされた第1の細胞集団が哺乳動物標的細胞(例えば、ヒトリンパ球)と共培養される。本発明はさらに、本発明の方法により作られた外来遺伝子を発現する標的細胞を含むものである。外来遺伝子はCD4/ゼータまたは単一抗体鎖/ゼータT細胞受容体のようなキメラT細胞受容体でありうる。
【図面の簡単な説明】
図1は、レトロウイルスベクター転写物をパッケージするために必要なタンパク質の生産に使用する本発明のレトロウイルスパッケージングプラスミド:pIK6.1MMSVampac、pIK6.1MCVampac、pIK6.1gagpolATGおよびpIK6.1amenvATGの模式図を示す。
図2A、2B、2Cおよび2Dは、下記の実施例Iに記載するように、レトロウイルス構築物でトランスフェクトした293細胞のFACSの結果を示す。
図3Aおよび3Bは、下記の実施例Iに記載するように、感染3T3DNAのサザンブロット分析で決定した形質導入効率を示す。
図4は、下記の実施例IIに記載するように、最初にpRTD2.2F3か、またはpRT2.2F15のいずれかとpIK6.1MCVampacで293細胞を一時的にトランスフェクトし、次いで293細胞とCD8+ T細胞を同時培養することによりCD8+ T細胞に導入してFACSで形質導入効率を分析した実験から得られたデータの棒グラフを示す。
図5A、5B、5Cおよび5Dは、下記の実施例IIIに記載するように、KATパッケージング構築物で形質導入し、293細胞と同時培養した造血幹細胞のFACS分析の結果を示す。
図6は、下記の実施例IIIに記載するように、CD34+細胞とKATでトランスフェクトした293細胞との同時培養が高効率の形質導入を誘導するか否かをサザンブロット分析で試験する。
図7は、下記の実施例IIIに記載するように、KATシステムで形質導入したCD34+細胞の形質導入効率と、安定なPA317生産体と同時培養したときの形質導入効率とをサザンブロット分析で比較するものである。
図8A、8B、8C、8Dおよび8Eは、下記の実施例IVに記載するように、pIKTベクターで293細胞をトランスフェクトし、同時培養した後の、KAT pIKTレトロウイルスベクター構築物で形質導入したヒトCD34+造血前駆細胞のFACS分析の結果を示す。
発明の詳細な説明
本発明の十分な理解のために、以下の記載を提供する。
本発明は、ウイルスベクターおよびパッケージング機能プラスミドのプラスミド複製の不在下に、効率のよい一時的トランスフェクションと発現が可能な哺乳動物細胞中にKATプラスミドを導入した後に、極めて安定レベルのレトロウイルスパッケージング機能とパッケージ可能なベクター転写物とが生産されるような、レトロウイルス粒子の生産のための新規な最適化された一時的発現プラスミド(「KAT」と呼ぶ)を提供する。プラスミド複製の不在によって、高力価のウイルス粒子の生産が可能になる一方、組換えにより複製能のある(replication competent)レトロウイルスが生成する可能性を最小にする。KATシステムの使用により、COS細胞へのパッケージング機能およびベクタープラスミドの同時トランスフェクションについて記載する文献(Landau and Litman, J. Virol. 66(8):5110-5113, 1992)に比べて、10〜30倍の高いウイルス力価が得られる。あるいは、KATパッケージング機能およびウイルスベクタープラスミドはSV40複製起点を含むので、tsa201(Heinzel et al., J. Virol. 62(10):3738-3746, 1988)などのSV40 T抗原の発現によるSV40起点含有プラスミドの複製を可能にする細胞系にトランスフェクトできる。KATシステムを使用すると、プラスミド複製の存在下でのウイルス力価は、複製不在下の力価よりも3〜10倍高い。複製プラスミドを使用しても非複製プラスミドを使用してもKATシステムでは安定な生産体系を生成する必要なく高い力価の組換えレトロウイルスの上清を迅速に生産することができる。
本発明のレトロウイルス構築物は、従来法による形質導入では処理しにくい初代ヒト細胞などの哺乳動物細胞との同時培養による高効率の本発明の形質導入法にも使用できる。
本発明のプラスミドは、gag、polおよびenvなどのレトロウイルス粒子の生産にトランスで必要とされるレトロウイルスタンパク質を構成的に生産する安定な細胞系の構築にも使用できる。これらの安定なパッケージング構築物は、neo、DHFR、Glnシンセターゼ、ADAなどの有力な選択マーカーとともにリン酸カルシウム法によるトランスフェクションまたはエレクトロポレーションによってヒト細胞系に導入し、次いで適当な薬剤中で選択してクローンを単離することができる。これによって、これらの細胞へのレトロウイルス構築物の導入後に高い力価の安定な生産体クローンを生産することができる。これらの細胞系は一時的にトランスフェクトされた生産体細胞という同じ性質をすべて有する。しかしながら、パッケージング機能とウイルスベクターの両方を安定に取り込むために、高力価のレトロウイルスを無期限に生産し続ける。
パッケージング機能を含むプラスミドは、gagおよびpol遺伝子をコードする第1のものと、env遺伝子産物をコードする第2のものに分けられる。2つのウイルスゲノムを含むパッケージング系が文献(Bosselman et al., Molec. Cell. Biol. 7(5):1797-1806, 1987; Markowitz et al., J. Virol. 62(4):1120-1124, 1988; Danos and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464, 1988)に記載されており、レトロウイルスベクターとパッケージング構築物との間の組換え後の複製能のあるレトロウイルス(RCR)の生成の機会を有意に減少するので好ましい。本発明のプラスミドを使用すると、一時的システムの高効率の形質導入を生じるパッケージング系をもたらすが、安定なパッケージングシステムの付加的容易性と2ゲノムパッケージングシステムの安全性を伴う。本発明の新規なプラスミドは従来記載された2ゲノムパッケージング系に比較して有意な利点をもたらす。gagpolおよびenv遺伝子をコードするKATプラスミドは、レトロウイルスゲノムからのタンパク質コーディング配列のみが存在するように構築された。本発明に記載するレトロウイルスベクターを用いると、レトロウイルスベクターとパッケージングゲノムとの間でその3’末端にオーバーラップが存在しない。この構造を、ベクター中のgag開始コドン(ATG)の終始コドンによる置換と組み合わせたことによって、複製能のあるレトロウイルスの生成を完全に排除することができ、これは完全ウイルスゲノムが突然変異(Danos and Mulligan, Prc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:6460-6464, 1988)または欠失(Bosselman et al., Molec. Cell. Biol. 7(5):1797-1806, 1987; Markowitz et al., J. Virol. 62(4):1120-1124, 1988)を含む従来のパッケージング系と比べて対照的である。これらの従来公知のパッケージング系はウイルスベクターの3’末端でパッケージング系とのオーバーラップを含み、RCRを生じる可能性がある。
gagpolプラスミドの導入に続いてenv−含有プラスミドを段階的に導入することにより2ゲノムパッケージング系を構築する。env遺伝子は細胞表面受容体の認識を担当する。5つの機能的かつ構造的に異なるenv遺伝子がマウス白血病ウイルスに同定されており、遺伝子的に異なる受容体であることが示されている(Battini et al., J. of Virol. 66:1468-1475, 1992)。アンホトロピックenv遺伝子を、エコトロピックMLV gagpolを発現する細胞系に導入することによって、マウス白血病ウイルスベクターをもつヒト宿主域が可能となる(Danos and Mulligan, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:6460-646, 1988)。ゼノトロピックおよび10A1 MLVウイルスは、テナガザル白血病ウイルスやネコ白血病ウイルスと同様に、ヒト宿主域をもつ。これらのenv遺伝子のcDNAクローンを用いて、1またはそれ以上のものをgagpol系に安定に導入してパッケージング系を作製し、この場合にはレトロウイルスベクターの導入後に生産されるレトロウイルスが複数の遺伝子的に異なる受容体を通して標的に入り得る。これによって明らかなウイルス力価の実質的増加が得られる。本発明のベクターはこれらのタイプの新規なパッケージング系を作製する可能性を提供する。
ベクター、トランスフェクト細胞および感染細胞を構築するために用いるほとんどの技術は当業界で公知であり、特定の条件や方法を記載する標準情報資料は当業者にはよく知られている。しかしながら、便宜のために、以下の記載を指針として提供する。
本発明のベクターの構築は、当業界で公知の標準のライゲーションおよび制限酵素技術を用いる(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. 1982)。単離プラスミド、DNA配列、または合成オリゴヌクレオチドは所望の形に切断、末端修復、または再ライゲーションする。
部位特異的DNA切断は当業界で一般に理解されている条件下に適当な制限酵素(または酵素)で処理することによって行い、その詳細は市販の制限酵素の製造者によって特定されている(例えば、New England Biolabs、製品カタログ参照)。一般に、プラスミドまたはDNA配列約1μgは、緩衝液約20μl中で酵素約1ユニットで切断する。典型的には、DNA基質の完全な消化を確保するために、過剰の制限酵素を使用する。約37℃で1〜2時間のインキュベーション時間で十分であるが、各種の変更が可能である。各インキュベーションの後、フェノール/クロロホルムで抽出し、場合によりその後エーテルで抽出してタンパク質を除去し、エタノール沈殿により水性画分から核酸を回収する。所望の場合には、切断断片のサイズ分画を標準法のポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動により行う。サイズ分画の一般的記載は、Methods of Enzymology 65:499-560, 1980に見られる。
制限酵素で切断した断片は、50mM Tris(pH7.6)、50mM NaCl、6mM MgCl2、6mM DTTおよび5〜10μM dNTP中、20℃で、約15〜25分のインキュベーション時間を用いて、4種のデオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)の存在下に、大腸菌DNAポリメラーゼIの大断片(クレノウ)で処理することにより平滑末端化できる。クレノウ断片は5’付着末端で修復するが、4種のdNTPが存在していても、突き出た3’一本鎖を5’側に順次切断していく。所望する場合には、付着末端の性質によって支持される範囲内で、dNTPのうちの1種だけ、あるいは選択した複数のdNTPを供給することにより選択的修復を行うことができる。クレノウで処理した後、混合物をフェノース/クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させる。適当な条件下でS1ヌクレアーゼまたはBal−31で処理すると、すべての一本鎖部分の加水分解が生じる。
以下の標準条件および温度で15〜50μl容量中でライゲーションを行う:20mM Tris−Cl、pH7.5、10mM MgCl2、10mM DTT、33mg/ml BSA、10mM−50mM NaCl、および0℃で40μM ATP、0.01−0.02(Weiss)ユニットT4DNAリガーゼ(「付着末端」ライゲーション用)、あるいは14℃で1mM ATP、0.3−0.6(Weiss)ユニットT4DNAリガーゼ(「平滑末端」ライゲーション用)。分子間「付着末端」ライゲーションは33−100μg/mlの全DNA濃度(5−100mM全末端濃度)で通常行う。分子間平滑末端ライゲーション(通常10〜30倍モル過剰のリンカーを用いる)は1μMの全末端濃度で行う。
KATシステムのレトロウイルスベクターおよびパッケージングプラスミドは以下のようにして調製した。
新規レトロウイルスベクターおよびパッケージングプラスミドの作製
KAT構築物は、複製能のないレトロウイルスベクターをパッケージするために、そして複製能のあるヘルパーウイルスを生産することなく、高力価で複製能のないレトロウイルスベクターをパッケージすることのできるウイルス粒子タンパク質を生産するために必要なすべてのウイルス粒子タンパク質をトランスでコードする、例えば白血病ウイルスゲノムなどの複製能のないレトロウイルスゲノム由来の少なくとも1つのレトロウイルスヘルパーDNA配列からなるDNAパッケージングプラスミドを含む。ある態様では、レトロウイルスパッケージングDNA配列は、ウイルスのウイルス5’LTRの天然エンハンサーおよび/またはプロモーターをコードする領域をもたず、またヘルパーゲノムをパッケージする役割をもつプサイ機能配列ならびに3’LTRをもたないが、ウイルス生産が好ましいタイプの細胞中で効率のよい転写を支配する外来エンハンサーおよび/またはプロモーターをコードし、そしてSV40ポリアデニル化部位を含む。外来エンハンサーおよびプロモーターの転写開始部位は5’LTRの「R」領域の5’末端で白血病ウイルスゲノムと結合している。
レトロウイルスはモロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)またはテナガザル白血病ウイルス(GALV)でありうる。5’LTRのR領域と結合する外来エンハンサーおよびプロモーターは、モロニーマウス肉腫ウイルス(MMSV)のエンハンサーおよびプロモーター(U3領域)ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)の即時型IE)エンハンサー、ラウス肉腫ウイルス(RSV)のU3領域、脾臓フォーカス形成ウイルス(SFFV)のU3領域、または天然モロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)プロモーターと結合したHCMV IEエンハンサーでありうる。
すべてのプサイ(ψ)−パッケージングプラスミドはプラスミドpKI1.1の誘導体である。pKI1.1はpMF2に4つの挿入物を連続して挿入することによって構築された哺乳動物発現ベクターであり、pMF2はpSKII(Staratagene, San Diego, CA)のKpnIおよびSacI部位の欠失を伴って、pSKIIのKpnIおよびSacI部位に合成ポリリンカー5’−HindIII−SphI−EcoRI−AatII−BglI−XhoI−3’を挿入することによって作製される。まず、SV40T抗原ポリアデニル化部位を含むBamHI−XbaI断片(SV40のヌクレオチド2770〜2533、Reddy et al., Science 200:494-502, 1978)およびSV40複製起点を含むNheI−SalI断片(SV40のヌクレオチド5725〜5578)をBglIIおよびXhoI部位の間に3部分ライゲーションすることによって挿入して、BglII、BamHI、XbaI、NheI、SalIおよびXhoI部位を欠失させる。これらのBamHI−XbaIおよびNheI−SalI断片は、それぞれオリゴヌクレオチドプライマー対3と4、および5と6(それぞれの末端にBamHI、XbaI、NheI、およびSalI部位を導入する)を用いて、pSV2neo(Southern and Berg, J. Mol. Appl. Gen. 1:327-341, 1982)を鋳型とするPCRによって合成する。第二に、ヒトα1グロビン遺伝子第2エクソンのスプライスアクセプターを含むSphI−EcoRI断片(ヌクレオチド+143〜+251)をSphIおよびEcoRI部位の間に挿入する。このSphI−EcoRI断片はオリゴヌクレオチドプライマー7と8(それぞれの末端にSphIおよびEcoRI部位を導入する)を用いて、pπSVαHP(Treisman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:7428-7432, 1983)を鋳型とするPCRによって合成する。第三に、合成ポリリンカー5’−EcoRI−BglII−NcoI−ApaI−AatII−3’をEcoRIとAatII部位の間に挿入する。第四に、CMV IEエンハンサー/プロモーターを含むHindIII−SacI断片(ヌクレオチド−674〜−19:Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985)およびCMV IE第1エクソン/スプライスドナーを含む化学合成SacI−SphI断片(ヌクレオチド−19〜+170)を、HindIIIとSphI部位の間に3部分ライゲーションによって挿入する。HindIII−SacI断片は、オリゴヌクレオチドプライマー9と10(それぞれの末端にHindIIIおよびSacI部位を導入する)を用いて、pCDM8(Seed, Nature 329:840-842, 1987; Seed and Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3365-3369, 1987)を鋳型とするPCRによって調製する。
上述した−19〜+170をコードする化学合成SacI/SphIオリゴヌクレオチドを、ヌクレオチド+1〜+6にあるXbaI部位をあらかじめ導入しておいた化学合成SacI/SPhIオリゴヌクレオチドで置換することによって、pIK1.1中のHCMV IEプロモーターの転写開始部位にXbaI部位を導入し、pIK6.1を得る。これによって、どのようなエンハンサー/プロモーターもHindIII−XbaIカセットとして挿入することが可能になり、所望の細胞型で目的の配列の最高発現レベルを指示するような適当なエンハンサーとプロモーターを挿入できる。マウス線維芽細胞NIH 3T3(ATCC CRL1658)またはM.dunni(ATCC CRL2017)で最高発現レベルを達成するためには、2つのプライマー(1つはHindIII部位およびU3の5’側の21ヌクレオチドをコードし、もう1つはMMLV U3領域の3’側の21ヌクレオチドおよびXbaI部位をコードする)と、プラスミドpN7(Miller et al., Mol. Cell. Biol. 5:431-437, 1985)を鋳型として用いるPCRによって、完全なMMSV U3領域を合成した。このPCR断片をpIK6.1のHindIIIとXbaI部位の間にクローン化してpIK6.1MMSVを作製した。ヒト細胞で高レベルの発現を指示するために、HCMV IEエンハンサー(Boshart et al., 前出)のNcoI/SpeI断片の単離、合成オリゴヌクレオチドBclIリンカーの付加、およびプラスミドp△HB(P.Robbins博士より、ピッツバーグ大学、ピッツバーグ、PA)のBamHI部位への挿入によってpIK6.1MCVを構築した。このプラスミドをpMCVと命名した。p△HBは、3’LTRを含むウイルス配列を含むpZIPneoSVX(Cepko et al., 前出)のClaI−EcoRI断片をpBR322のClaIおよびEcoRI部位にクローン化し、かつMMLV U3のSau3AI−HpaIIエンハンサー断片を除去したものである。MMLV U3とMMSV U3との相同性のために、上述のPCRプライマーを用いてpMCVのU3領域をコードするHindIII/XbaIリンカー断片を作製し、これをpIK6.1にクローン化してpIK6.1MCVを作製した。これらのプラスミドはpIK6.1と同様に、pIKポリリンカーの3’末端にあるApaI部位とSV40ポリアデニル化部位にあるHpaI部位との間のSV40ポリアデニル化部位の112ヌクレオチドの欠失、およびNheIリンカーによる置換によってさらに修飾して、pIK6.1Nhe、pIK6.1MMSV.NheおよびpIK6.1MCV.Nheを作製した。
pMOVpsi−(Mann et al.,前出)のU3領域の一部、R、およびU5領域、gag遺伝子および一部のpol遺伝子をコードする3813塩基のSacI/Sal断片、ならびにpCRIPamgag−2(O.Danos博士より、パスツール研究所、パリ、フランス)由来のpol/envをコードする4140塩基対のSalI−NheI断片を、pIK6.1MMSV.NheまたはpIK6.1MCV.NheのSacIとNheI部位の間にそれぞれ挿入することによって、pIK6.1MMSVampacおよびpIK6.1MCVampacを構築した。pCRIPamgag-2は、pBR322プラスミド骨格をプラスミドpUC19で置換したpCRIPamgagの誘導体である。得られるプラスミドはエコトロピックMMLVからのgagおよびpol遺伝子、ならびに4070AアンホトロピックMLV(Chattopadhyay et al., J. Virol. 39(3):777-791, 1981)からのエンベロープ遺伝子をコードし、図1Aに模式図で示してある。
pIK6.1MCVampacのエンベロープ遺伝子から3’側の非翻訳配列を除去するには、pIK6.1MCVampacを鋳型とし、合成オリゴヌクレオチド5’CTGATCTTACTCTTTGGACC3’と5’GAATTCGCTAGCCTATGGCTCGTACTCTATAG3’を用いてPCR反応を行った。得られる142塩基対のPCR産物をClaIとNheIで切断した。この100塩基対断片を切り出し、pIK6.1MCVampacの対応する172塩基対のClaI−NheI断片と置換してpIK6.1MCVampacUT△を得た。
pIK6.1amenvATGUT△は、pIK6.1amenvATG中の172塩基対のClaI−NheI断片を、pIK6.1MCVampacUT△からの100塩基対のClaI−NheI断片で置換することによって構築した。pIK6.1MCVamenvATGUT△は、pIK6.1amenvATGUT△中のCMVプロモーターおよびαグロビンスプライスアクセプターを含む961塩基対のHindIII−EcoRI断片を、pIK6.1MCVからの対応する896塩基対のHindIII−EcoRI断片で置換することによって構築した。
pIK6.1MCVgagpolATGは、pIK6.1gagpolATG中のCMVプロモーターおよびαグロビンスプライスアクセプターを含む961塩基対のHindIII−EcoRI断片を、pIK6.1MCVからの対応する896塩基対のHindIII−EcoRI断片で置換することによって構築した。
pIK6.1MMSVampacおよびpIK6.1MCVampacと命名された本発明のレトロウイルスパッケージングプラスミドは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)、12301パークローンドライブ、ロックビル、メリーランドにブダペスト条約に基づいて寄託され、以下の受託番号を与えられた:
別の態様では、パッケージング機能は、例えば2つのヘルパー配列などの2つのプラスミドに基づく発現ベクターによってコードされ、ここでは第1ヘルパー配列がエコトロピックMMLVのgagおよびpolタンパク質をコードするcDNAを含み、第2ヘルパー配列がレトロウイルスenvタンパク質をコードするcDNAを含む。宿主域を決定するEnv遺伝子は、ゼノトロピック、アンホトロピック、エコトロピック、ポリトロピック(ミンクフォーカス形成)または10A1マウス白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス(GALV)、ヒト免疫不全ウイルス(gp160)のenvタンパク質、水疱性口内炎ウイルス(VSV)のGタンパク質、ヒトT細胞白血病(HTLV)タイプIおよびIIのenv遺伝子産物をコードする遺伝子;上述のenv遺伝子の1またはそれ以上の組み合わせから誘導されるキメラエンベロープ遺伝子;または上述のenv遺伝子産物の細胞質および膜貫通部分、および所望の標的細胞上の特定表面分子に対するモノクローナル抗体をコードするキメラエンベロープ遺伝子由来のものでありうる。
この態様のプラスミドの構築は以下のようにして実施する:MMLVのgagおよびpol遺伝子をコードするpIK6.1gagpolATGは、まずpMOVpsi−をScaIで消化し、NheI合成リンカーを付加し、AflIIで再消化し、次いで5.2kbのAflII/NheI断片(MMLVのヌクレオチド644〜5869)を単離することによって構築した。MMLVのヌクレオチド621〜644(gag遺伝子のATGからAflII)をコードする合成オリゴヌクレオチド(ただし、ヌクレオチド621におけるATGをNcoI部位に変更してある)を、AflII/NcoI断片とともに、pIK6.1NheのNcoI部位ポリリンカーとSV40ポリアデニル化部位の5’末端にあるNheI部位との間にライゲートした。
MLV4070A Env遺伝子をコードするpIK6.1amenvATGは、pCRIPAMGAG-2(Danos and Mulligan, 前出)をAfl 111で消化し、NheIまたはHinP1で再消化し、0.325bpのHinP1/Afl 111断片(MLV4070A Env遺伝子のヌクレオチド37〜365;Ott et al., J. Virol. 64(2):757-766, 1990)および1.7kbのAfl 111/NheI断片(MLV4070A Env遺伝子のヌクレオチド365から)をそれぞれ、pCRIPAMGAG−2(Danos and Mulligan,前出)のMMLV3’LTRのNheI部位に挿入することによって構築した。MLV4070A Env遺伝子のヌクレオチド37〜43(env遺伝子のATGからHinP1)をコードする合成オリゴヌクレオチド(ただし、ヌクレオチド37におけるATGはNcoIに変更してある)を、HinP1/Afl 111断片およびAfl 111/NheI断片とともに、pIK6.1Nheのポリリンカー中のNcoI部位とSV40ポリアデニル化部位の5’末端にあるNheI部位との間にライゲートした。これらのプラスミドを図1Aに模式図で示してある。
pIK6.1gagpolATGおよびpIK6.1amenvATGと命名された本発明の2つのゲノムレトロウイルスパッケージングプラスミドは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)、12301パークローンドライブ、ロックビル、メリーランドにブダペスト条約に基づいて寄託され、以下の受託番号を与えられた:
レトロウイルスベクター
1ゲノムおよび2ゲノムパッケージング構築物はいずれも、レトロウイルスが生産される細胞型中での効率のよい転写を指示する修飾5’LTRを含むレトロウイルスベクターを利用する。本発明のレトロウイルスベクターは、pZen(Johnson et al., The EMBO Journal 8(2):441-448, 1989)、pZIPneoSVXのneo−改変体(Cepko et al., Cell 37:1053-1062, 1985)をモデルとしており、ここでは発現すべき遺伝子産物が通常はneoカセット(Cepko et al., 前出)で占められている位置でスプライスアクセプターの下流にクローン化される。さらに、MMLVのNarI部位(ヌクレオチド1038)までのウイルスgag配列を加えてパッケージングを改良し(Armentano et al., J. Virol. 61:11647-1650, 1987)、またpZIPneoSVXのXhoI−ClaI断片を除去した(Cepko et al., 前出)。pIK1.1由来のEcoRI−ApaIポリリンカーをスプライスアクセプターの下流に挿入して、pIKプラスミド由来の挿入物をレトロウイルス構築物に転移させることができた。得られるプラスミドをpRTD1.2と命名し、これは5’および3’MMLV LTRの両方を含む。pZIPneoSVXの5’LTR U3領域を、pIKMMSVのHindIII/SacI断片由来のMMSV U3で置換して、pRTD4.2を作製した。pRTD2.2では、pZIPneoSVXの5’LTRのU3領域を、CMV即時型エンハンサー/プロモーターをコードするpIK1.1由来のHindIII/SacI断片で置換し、これを、MMLV(Schinnick et al., Nature 293:543-548, 1989)のヌクレオチド+1〜+32(KpnI)と結合したHCMVプロモーターのヌクレオチド19(SacI)〜+1をコードするオリゴヌクレオチドによってMMLV R領域と融合させた。pRTD2.2SVGは、pRTD2.2の(750bp)SacI−BstEII断片を、LXNS(Miller and Rosman, BioTechniques 7:980-990, 1989)の(736bp)SacI−BstEII断片で置換することによって構築した。pRTD2.2SSAは、pRTD2.2の(1441bp)SacI−EcoRI断片を、LXNS(Millert and Rosman, 前出)の(1053bp)SacI−EcoRI断片で置換することによって構築した。pRTD2.2SVGE−は、その5’末端にApaI部位をあらかじめ付加しておいたpLXSN(GenBank Accession Bank, M28248)のヌクレオチド2878〜2955をコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって構築した。これを用いてpRTD2.2SVGのApaI−NheI断片を置換するが、これはポリリンカーの3’側のDNA配列および3’LTR中のNheI部位の5’側のDNA配列を含む。本発明のこれらのレトロウイルスベクター構築物はpBR322骨格をもち、pRTD2.2、pRTD4.2、pRTD2.2SVG、pRTD2.2SVGE−およびpRTD2.2SSAを含む。
SV40のT抗原を発現する細胞中でのプラスミド複製を可能にするために、pRTD2.2の5’と3’LTRの間の配列を上述のpIK1.1のSacIおよびEcoRIの間にクローン化し、これはSV40複製起点を含み、ベクターpIKT2.2を得た。pIKT2.2SVGは、pRTD2.2SVGのHCMVプロモーター中のSacI部位によって5’末端を規定され、またpRTD2.2SVGの3’LTRの750bp下流に位置するEcoRI部位によって3’末端を規定される断片を、pIK1.1のSacIとEcoRI部位の間に挿入することによって構築した。pIKT2.2SVGE-F3は、pIKT2.2SVGF3の182塩基対のApaI−NheI断片を、上述のpRTD2.2SVGE−F3由来の80塩基対のApaI−NheI断片で置換することによって構築した。
pRT43.2F3は、3’LTRから約750塩基対下流に位置するEcoRI−ApaIポリリンカーを、AscI認識部位を含む合成オリゴヌクレオチドで置換することによってpIKT2.2SVGE-F3から誘導した。さらに、ウイルスgag配列の3’末端にあるNdeI部位をオリゴヌクレオチド挿入によってあらかじめXhoI部位に変更しておいた。pRT43.3PGKF3は、pRT43.2F3中の3’LTRをまず除去し、PvuIIからXbaIまでの配列(MMLV、GenBank session#JO2255ヌクレオチド番号7938〜8115)を欠失させた3’LTRを挿入することによってpRT43.2F3から誘導した。さらに、MMLVスプライスアクセプター領域は、その5’末端にXhoI部位と3’末端にEcoRI部位をもつポリリンカー中にクローン化したヒトホスホグリセレートキナーゼ遺伝子プロモーター(GenBank session#M11958ヌクレオチド2〜516)で置換しておいた。
本発明のレトロウイルスベクターのある態様では、キメラ受容体構築物の発現のために本発明の方法を用いて哺乳動物標的細胞中に形質導入しようとする遺伝子をコードするDNAが調製される。キメラ受容体構築物の構築を以下に記載する。
CD4/CD3ゼータおよび抗HIV/CD3ゼータレトロウイルスベクター
KATレトロウイルスベクターpRTD2.2F3、pRTD2.2SVGF3、pRTD2.2SSAF3、pRTD2.2SVGF3E-、pIKT2.2SVGF3は、pIKF3(上述した)のEcoRI/ApaI消化、1.9kb断片の単離、次いでこの断片を、ベクターpRTD2.2、pRTD2.2SVG、pRTD2.2SSAF3、pRTD2.2SVGE-、pIKT2.2SVGのpIKポリリンカー中のEcoRIとApaI部位の間にライゲートすることによって構築した。KATレトロウイルスベクターpRTD2.2F15は、pIKF15neo(上述した)のEcoRI/ApaI消化、2.2kb断片の単離、次いでこの断片をベクターpRTD2.2のpIKポリリンカー中のEcoRIとApaI部位の間にライゲートすることによって構築した。これらのベクターは、それぞれCD4受容体の細胞質ドメイン(成熟CD4鎖のアミノ酸372〜395)およびCD3−複合関連遺伝子ゼータ(ζ)の膜貫通ドメイン(成熟ζ鎖のアミノ酸372〜395)に融合したヒトCD4(F3誘導体)の細胞外ドメインまたはHIV(F15誘導体)のgp41に対する単鎖抗体を含むキメラ分子をコードする。ヒトCD4受容体(F3という)の細胞外ドメイン(成熟CD4タンパク質のアミノ酸残基1〜371)、またはHIVエンベロープタンパク質(F15という)のgp41部分に特異的なヒト抗体(98.6)由来のHIVgp41に対する単鎖抗体のいずれかをコードするキメラ受容体カセットを、CD3ζ鎖と融合し、上述のpIK1.1のEcoRIとApaI部位の間にクローン化した。単鎖抗体では、H鎖およびL鎖のいずれの可変ドメインもペプチド鎖を介して共有結合して1分子上に抗原結合部位を作り出す。キメラ受容体構築を以下にさらに詳細に記載する。
CD4−ゼータキメラの構築
プラスミドpGEM3zetaは、ヒトζcDNA(Weissman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9709-9713, 1988)をもつ。プラスミドpBS.L3T4はヒトCD4cDNA(Littman and Gettner, Nature 325:453-455, 1987)をもつ。細胞外(EXT)ドメインの残基7からの全ヒトζ鎖コード配列を含むBamHI−ApaI制限断片(約0.64kb)をpGEM3zetaから切り出し、Stratagene社(San Diego,CA)から入手したファージミドに基づくクローニングベクターであるpBluescript II SK(+)9pSKのポリリンカーのBamHIおよびApaI制限部位にサブクローン化して、pSK.zetaを作製した。次いで、全CD4コード配列を含むBamHI制限ファージミド(約1.8kb)をpBS.L3T4から切り出し、pSK.zetaのBamHI部位にサブクローン化してpSK.CD4.zetaを作製した。
pSK.CD4.zetaから一本鎖DNAを調製し(Stratagene pBluescript II プロトコル)、オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発(Zoller and Smith, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500, 1982)の鋳型として用いて、以下に記載する所望の接合部をもつCD4−ゼータキメラを作製した。CD4−ゼータ融合体1、2および3を次にサンガーのジデオキシヌクレオチド法(Sanger et al., Proc. Natl. Avad. Sci. USA 74:5463-5467, 1977)で配列決定し、EcoRI−ApaI制限断片として切り出し、発現ベクターpIK1.1またはpIK1.1.Neoのポリリンカー中に同じ部位でクローン化した。
CD4の全コード領域を含むEcoRI−BamHI制限断片(約1.8kb)をpSK.CD.zetaから切り出し、pIK1.1またはpIK1.1.NeoポリリンカーのEcoRIとBglII部位の間にサブクローン化した。
プラスミドpUCRNeoG(Hudziak et al., Cell 31:137-146, 1982)は、ラウス肉腫ウイルス(RSV)3’LTRの転写制御下にネオマイシン遺伝子をもつ。pUCRNeoGからRSV−neoカセットをHincII制限断片(約2.3kb)として切り出し、pIK.1.1の2つのSspI部位の間にサブクローン化してpIK.1.1.Neoを作製した。
CD4−ゼータキメラ受容体F3は、それぞれCD4およびゼータの細胞外(EC)および細胞質(CYT)ドメインから構築した。この受容体の膜貫通(TM)ドメインはCD4由来であった。F3は4つのVドメインすべてを含むCD4 EXTドメイン(成熟CD4タンパク質の残基1〜371)、CD4のTMドメイン(成熟CD4鎖の残基372〜395)、およびゼータのCYTドメイン(成熟ゼータ鎖の残基31〜142)をもつ。
単鎖抗体−ゼータキメラ受容体の作製
ヒトモノクローナル抗体(mAb)98.6のH鎖をコードする発現ベクターの構築:
ヒトmAb98.6(S. Zolla-Pazner, Proc. Natl. Acad. Sci. 86:1624-1628, 1989)のH鎖の発現を導くために、プラスミドpIK.98.6-γFLを構築した。細胞系SP−1/98.6(Zolla-Pazner, 前出)からオリゴ−dTをプライマーとして用いて得た全RNA5μgの逆転写により全長IgG1 H鎖cDNAを作製し、次にオリゴヌクレオチドプライマー17と2(下記参照)を用いるPCRを行った。1.5kbのEcoI−BglII断片を、pIK1.1のEcoRIとBglII部位の間にクローン化した。H鎖が所望のアロタイプであることを確認するために、cDNAのKasI−BglII断片を、pIK1.Cγ1由来の0.94kbのKasI−BglII断片で置換した。pIK.Cγ1は、ヒト脾臓cDNAライブラリー(Clontech, Inc. パロアルト、CA)由来のDNAを基質として、そしてオリゴヌクレオチドプライマー2と18(下記参照)を用いるPCRによって得られるIgG1 H鎖の不変領域をコードするcDNAを、pIK1.1のEcoRIとBglII部位の間に挿入することによって構築した。
ヒトモノクローナル抗体(mAb)98.6のL鎖をコードする発現ベクターの構築:
mAb98.6のL鎖の発現を導くために、プラスミドpIK.98.6κFLを構築した。pdN6(Pharmacia/LKB)をプライマーとして細胞系SP−1/98.6から得た全RNA5μgの逆転写により全長IgG1 L鎖cDNAを作製し、次にプライマー19と20(下記参照)を用いるPCRを行った。次に0.78kbの断片をEcoRIとBglIIで切り出し、pIK1.1のEcoRIとBglII部位の間にクローン化した。
mAb98.6のH鎖およびL鎖由来のSAbをコードする発現ベクターの構築:
a)pIK98.6−K/L/Hの構築:
一本鎖抗体(SAb)形態のmAb98.6の発現を引き出すため、pIK.98.6−K/L/Hを構築した。発現されたSAbは、配列GSTSGSGSSEGKGを有する14アミノ酸リンカー(L212, Betzykら,J. Biol. Chem.(1990)265:18615-18620)に融合した分泌リーダー(leader)配列および成熟98.6mAbのL鎖可変(VL)部のアミノ酸1−107からなり、これを次に成熟98.6mAbのH鎖可変(VH)部のアミノ酸1に融合させた。次に、分泌の向上を目的としてIgG1 H鎖定常部のCH1ドメインを削除するために、これをアミノ酸113の位置でIgG1 H鎖定常部のアミノ酸234に融合させた。pIK.98.6−K/L/Hは3工程で構築された。
第一に、mAb98.6のVH部のアミノ酸113をIgG1 H鎖のアミノ酸234に融合させるため、鋳型として一本鎖鋳型形態のpIK.98.6−γFLを、またプライマーとしてオリゴヌクレオチド21(下記参照)を用いて、欠失突然変異誘発を実施した。プローブとしてオリゴヌクレオチド22(下記参照)を用いて、正しく欠失したプラスミドを見いだした。このプラスミドをpIK.H/Fc−intと称する。アミノ酸107をリンカーペプチドのアミノ末端に融合させるため、pIK.98.6−κFLを基質として、またオリゴヌクレオチド23および24(下記参照)をプライマーとして用いて、PCRによりmAb98.6L鎖のVL部を作成した。これは、出来上がるタンパク質のアミノ酸配列を変更すること無くSal I部位をVL配列の3’末端に位置させるために行なわれた。この断片はオリゴヌクレオチド25および26(下記参照)と共に、pIK1.1のEco RI部位とBgl II部位の間に連結され、プラスミドpIK.K/L−intを作出した。
最後の工程で、pIK.K/L−intの0.45kb断片をpIK.H/Fc−intのEco RI部位とKpn I部位の間でクローン化し、プラスミドpIK.K/L/H−intを作出した。このプラスミド由来の一本鎖DNAは鋳型として、またオリゴヌクレオチド27はプライマーとして(下記参照)、リンカーのカルボキシ末端アミノ酸をmAb98.6のVH部のアミノ酸1に欠失突然変異誘発により融合させるために使用した。プローブとしてオリゴヌクレオチド28(下記参照)を用いて、正しく欠失したプラスミドを見いだした。出来上がったプラスミドはpIK.98.6K/L/Hである。
b)pIK.CD4γ2の構築:
ヒトIgG2 H鎖定常部のアミノ酸234に融合した分泌リーダー配列および成熟CD4抗原の最初の180個のアミノ酸からなり、したがってヒンジドメインの一部とCH2およびCH3ドメインの全部を含有する融合タンパク質の発現を引き出すため、プラスミドpIK.CD4γ2を構築した。これは、分泌の向上のためIgG2 H鎖のCH1ドメインを欠失させている。pIK.CD4γ2は、ヒト脾臓cDNAライブラリー(Clontech)由来のDNAを基質として、またオリゴヌクレオチド3および4をプライマーとして用いて、PCRによりヒトIgG2 H鎖のFc部分を含有する断片を作成することによって構築した。作成された0.75kbのNhe IからBgl II断片は、pSKCD4ζ由来の0.6kbのEco RIからNhe I断片と共に、pIK1.1のEco RI部位とBgl II部位の間に連結した。
c)pIK.F5の構築
すべてがヒト膜結合IgG膜ヒンジドメイン(Tylerら,(1982)Proc. Natl. Acad. Sci. 79:2008-2012)を含有するCD4/IgG/ゼータ(ζ)融合タンパク質の幾つかの変形を発現させるため、プラスミドpIK.F5を構築した。発現されるべき各タンパク質はCD4受容体のアミノ酸1−180を含有し、これらのアミノ酸の後にヒトIgG2 H鎖定常部のアミノ酸234−445が続き、その後にヒトIgG3の18アミノ酸M1膜ヒンジドメインが続き(BensmanaおよびLefranc,(1990)Immunogenetics, 32:321-330)、その後に膜貫通ドメインが続き、その後にヒトζ鎖のアミノ酸31−142が続いていた。pIK.F7はCD4の膜貫通ドメイン(アミノ酸372−395)を含有する。
このプラスミドを構築するための第一工程はヒトIgG3 M1エクソン(BensmanaおよびLefranc, 前出)のクローニングであった。これは、基質としてヒト細胞系W138を、またオリゴヌクレオチド7および8を用いて、PCRによりM1エクソンを含有する0.13kbのBam HIからBgl II断片を作成し、それをpIK.CD4γ2のBgl II部位にクローン化することにより実施した。得られたプラスミドをpIK.CH3/M1−intと称する。このプラスミド由来の一本鎖DNAを鋳型として、またオリゴヌクレオチド9をプライマーとして、ヒトIgG2のアミノ酸445をIgG3膜ヒンジドメインの最初のアミノ酸に欠失突然変異誘発により融合させるために使用した。この融合は、膜結合IgG分子におけるCH3とM1の間の天然の連結部に見いだされる配列を作り出すように設計されている。プローブとしてオリゴヌクレオチド10を用いて、正しく欠失したクローンを見いだした。得られたプラスミドをpIK.CD4γ2/M1と称する。
pIK.CD4γ2/M1をBgl IIで切断し、T4ポリメラーゼで平滑末端とし、次にNhe Iで切断した。出来上がった0.83kbの断片を、pIK.F3由来の1.3kbのPvu IIからApa I断片と共に、pIK.CD4γ2のNhe I部位とApa I部位の間に連結し、プラスミドpIK.F7−intを作出した。このプラスミド由来の一本鎖DNAを鋳型として、またオリゴヌクレオチド15をプライマーとして、IgG3M1膜ヒンジドメインの最後のアミノ酸をCD4のアミノ酸372に欠失突然変異誘発により融合させるために使用した。プローブとしてオリゴヌクレオチド16を用いて、正しく欠失したクローンを見いだした。得られたプラスミドはpIK.F7である。
プライマーおよびプローブとして使用される上記のオリゴヌクレオチドは以下の通りである。
pIK.F15neoの構築:
IgG1 H鎖のアミノ酸445で18アミノ酸IgG3 M1膜ヒンジドメインに連結し、これが次にCD4膜貫通ドメイン(アミノ酸372−395)およびζ細胞質ドメイン(アミノ酸31−142)に融合している、K/L/H Sab形態のmAb98.6からなる融合タンパク質の発現を引き出すため、pIK.98.6-K/L/H由来の1.5kbのNsi I断片をpIK.F7neoの2つのNsi I部位の間に挿入することによりpIK.F15neoを構築し、正しい向きのクローンを選択した。
哺乳動物細胞におけるレトロウイルスの産生
一本鎖または二本鎖ゲノムKATパッケージングプラスミド(例えば、pIK6.1MMSVampac, pIK6.1MCVampac, またはpIK6.1amenvATGおよびpIK6.1gagpolATG, すべて上記)をKATレトロウイルス構築物(例えば、上記のpRTD2.2F3, pRTD2.2SVGF3, pRDT2.2SSAF3, pRTD2.2SVGF3E-, pIKT2.2SVGF3, pRTD2.2F15を含むが、これらだけに限定されない)と共に、ウイルスを産生できる哺乳動物細胞にリン酸カルシウム同時トランスフェクション(Wiglerら,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:1373-1377(1979))等の標準的手段により導入する。ウイルスを産生することができ、かつ本発明のKAT構築物によってトランスフェクトされうる哺乳動物細胞は、以下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち、293細胞等のヒト胚性腎細胞、tsa201細胞、マウス3T3マウス繊維芽細胞、M.dunni繊維芽細胞、およびアフリカミドリザル腎(COS)細胞である。トランスフェクトした細胞を、FACSによりキメラ受容体の表面発現に関してアッセイし、DNA構築物が上首尾に導入されたことを確認する。
トランスフェクションの48時間後に上清を濾過する等の標準的技法を用いてウイルス上清を集める。8μg/mlポリブレン(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)の存在下で、106個のNIH 3T3細胞を適切な量のウイルス上清を用いて感染させることにより、ウイルス力価を測定する。48時間後に、FACS分析およびサザンブロット法の両方により、3T3細胞の形質導入効率をアッセイする。
標的細胞への高効率形質導入
本発明の方法において、KATでトランスフェクトした細胞を哺乳動物標的細胞と共培養(cocultivation)することにより、外来遺伝子を用いて哺乳動物細胞に高い効率で形質導入を行なうのに本発明のKAT構築物がさらに使用される。好ましい態様において、293細胞等の所望のウイルス産生細胞は適切なKAT構築物によりトランスフェクトされ、トランスフェクションの24時間後に、トランスフェクトされた293細胞は精製哺乳動物標的細胞(例えばCD8+ T細胞)と共に48時間共培養される。標準的方法を用いて標的細胞を集め、膨張させ、フローサイトメトリーまたは蛍光活性化細胞ソーター(FACS)分析およびサザンブロットDNA分析等の周知の方法により形質導入効率を試験する。形質導入効率は、FACSまたはサザンブロット分析により測定された、対照と比較した陽性形質導入細胞のパーセンテージと定義される。
ウイルスを産生するためにヒト293細胞中にトランスフェクトされるKAT構築物を用いると、以前に記述されたCOS一時的ウイルス産生系(LandauおよびLitman、前出)により産生されるウイルスに較べ、樹立細胞系(3T3等)の上清感染により測定されるウイルス力価において5〜50倍の増加が得られる。さらに、造血幹細胞およびヒトT細胞等の主要なヒト細胞は、KATプラスミドによりトランスフェクトされた293細胞との共培養により、PA317(MillerおよびButtimore、前出)等の伝統的なパッケージング系よりも3〜20倍大きいレベルで形質導入がなされる。
何ら特定の推論に束縛されることを望まないが、本発明の方法を用いて得られるヒト標的細胞への高効率の形質導入は、レトロウイルスによって感染させたヒト293細胞と標的細胞との細胞−細胞接触によって媒介されると考えられる。種々の標的細胞への高効率形質導入をもたらすヒト293細胞の成分は、293細胞によって合成されるタンパク質または脂質であろうと予想される。この系の活性成分を確認するため、公知の方法を用いて293細胞の膜タンパク質および脂質を精製し、種々の精製成分の能力を標的細胞への形質導入効果をもたらす能力に関して試験する。いったん活性成分が同定されると、その成分を組換えDNAまたは化学的技法によって合成することができる。これらの合成された成分は、ウイルス粒子に組み込まれて、上清の形質導入効率を増強しうる。
適切な標的細胞は、任意の興味のある哺乳動物細胞であり、以下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち、リンパ球、特に細胞毒性T細胞、ヒト造血幹細胞、繊維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、筋芽細胞、網膜上皮細胞、ランゲルハンス島、副腎髄質細胞、骨芽細胞、破骨細胞、ニューロン、ダリア細胞、神経節細胞、胚性幹細胞、および肝細胞である。
標的細胞に導入しうる遺伝子は、以下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち、リンパ球におけるシグナル伝達のためのキメラ受容体をコードする遺伝子、例えば1992年12月9日に出願された同時係属中の米国特許出願第988,194号(この開示は参照として全体をここに組み入れている)に記載のもの等;G−、M−およびGM−コロニー刺激因子(CSF)、上皮増殖因子、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子(TGF)および幹細胞増殖因子(SCF)等の増殖因子;インターロイキン等のリンホカイン;ACTH、ソマトメジン、インスリン、アンジオテンシン等のホルモン;および因子VIIIならびに因子IX等の凝固因子、多薬剤耐性薬剤(MDR)遺伝子;ヒトアデノシンデアミナーゼ(ADA);グルコースセレブロシダーゼ;正常なβ−グロビン遺伝子およびエリトロポイエチン(EPO)である。
以下の実施例は、本発明を説明し、当業者が同じものを作成し、使用するのを助けるために提供される。これらの実施例は、開示の範囲または特許証によって与えられる保護を制限することを決して意図するものではない。
実施例I
高力価組換えウイルスの時的産生
細胞増殖、トランスフェクションおよび樹立細胞系の感染
293細胞と称されるヒト胚性腎細胞(ATCC CRL 1573, ATCC, Rockville, MD)をDMEM(JHR Biosciences, Lenexa, Kansas)、1g/Lグルコース、10% Donorウシ血清(Tissue Culture Biologics, Tulare, CA)で培養し、3日ごとに1:10に分割した。3T3(ATCC CRL1573)細胞をDMEM(JHR Biosciences)、4.5g/Lグルコース、10% Donorウシ血清(Tissue Culture Biologics)で培養し、3日ごとに1:10に分割した。COS(ATCC CRL1650)細胞をDME/F12(GIBCO, Grand Island, NY)、10%ウシ胎児血清(Tissue Culture Biologics, Tulare, CA)で培養し、3日ごとに1:10に分割した。293sの誘導体であるtsa201細胞はネオマイシン耐性遺伝子(Heinzelら,J. Virol. 62(10):3738-3746(1988))を用いて同時トランスフェクトされたSV40 T抗原の温度感受性突然変異体を含む。この細胞をDME/F12(GIBCO)、10%ウシ胎児血清(Tissue Culture Biologics)で培養し、3日ごとに1:10に分割した。293細胞およびtsa201細胞をトランスフェクションの48時間前に、プレート10cmあたりそれぞれ1 x 106個および0.5 x 106個プレートした。COSおよび3T3細胞をトランスフェクションの24時間前に、プレート10cmあたり0.5 x 106個プレートした。各プラスミドを10μg、単独または種々の組み合わせで、リン酸カルシウム共沈降(Wiglerら,前出)によりすべての細胞型に対しトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に培地を交換した。その24時間後に、ウイルス上清を集め、0.45μmのフィルターで濾過し、ドライアイス上で急速に凍結させた。3T3細胞を感染の24時間前に、プレート10cmあたり0.5 x 106個プレートした。感染は、ウイルス上清および8μg/mlのポリブレン(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)を含有する5mlの培地を用いて実施した。感染の24時間後に、培地をポリブレンを含まない培地に交換し、細胞をさらに24時間培養した。
一時的トランスフェクションの後、293細胞は高力価レトロウイルスを産生した。
KATパッケージングプラスミドpIK6.1MCVampacまたはpIK6.1amenvATGおよびpIK6.1gagpolATG、およびF3またはF15キメラ受容体をコードするレトロウイルスベクターpRTD2.2F3、pRTD2.2SVGF3、pRTD2.2SSAF3、pRTD2.2SVGF3E−、pIKT2.2SVGF3およびpRTD2.2F15を用いて同時トランスフェクションした後の、293細胞の組換えレトロウイルスを一時的に産生する能力についてアッセイした。アッセイは、トランスフェクションの48時間後にウイルス上清を集め、マウス3T3細胞を感染させ、その48時間後にFACs分析を行うことにより実施した。
FACS分析のため、感染させた3T3細胞をトリプシンの不在下で培養皿から除去し、40mM Tris, pH7.5, 150mM NaCl, 1mM EDTA中でインキュベートした後、FACS分析用に処理する。細胞を2%(FCS)ウシ胎児血清(Hyclone)を加えたリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で1回洗浄し、次に適切なFITC-結合検出抗体と共に、PBSプラス2% FCSの存在下で、1mlあたり1 x 106個の密度で、30分間40℃でインキュベートする。細胞をPBSプラス2% FCSで3回洗浄し、最後に0.5ml PBSに再懸濁してフローサイトメトリーにより分析する。
FACS分析の結果を図2に示す。pIK6.1ampacおよびpRTD2.2F3によって同時トランスフェクトされた293細胞は、モック(対照)のトランスフェクトされた細胞(図2A)に較べ、表面に高レベルのF3を発現する(図2B)。トランスフェクトされた293細胞から集めたウイルス上清で感染させた3T3細胞は、未感染および感染3T3細胞に対応する2つのはっきり分離したピークを示した(図2D)。これは、トランスフェクトされた293細胞(図2B)またはモックの感染3T3細胞(図2C)のFACSプロフィールと比較すると、有意に異なっていた。
表1はKATパッケージングプラスミドおよびKATレトロウイルス構築物の同時トランスフェクションが、3T3感染およびFACS分析によりアッセイされる高力価ウイルス上清の産生をトランスフェクションの48時間後にもたらすことを示している。pIK6.1ampacおよびpRTD2.2F3の同時トランスフェクションは、感染時に最初に存在する106個の3T3細胞の50%に形質導入を行なうウイルス上清を生ずる。対照的に、LandauおよびLitman(LandauおよびLitman, 前出)によって記述されているCOS細胞における同時トランスフェクションによって産生されるウイルスは、KATプラスミドの293細胞への同時トランスフェクションによって達成される力価より10倍低い。ウイルス産生は、それぞれ2組の3T3感染を実施した4つのトランスフェクション実験において、高度に再現性を有する。対照的に、レトロウイルス構築物pRTD2.2F3単独でトランスフェクションを行うと、検出可能な3T3感染は観察されない。これは、ウイルス産生がパッケージング構築物およびレトロウイルスベクターの存在に依存することを示している。高力価ウイルス産生はまた、レトロウイルス構築物の存在にも依存する。pIKF3発現ベクター単独のトランスフェクション、またはpIKF3発現ベクターおよびpIK6.1MMSVampacの同時トランスフェクションは、3T3細胞に形質導入をすることができない上清を生ずる。
高力価ウイルスは、pIK6.1amenvATG、pIK6.1gagpolATGおよびpRTD2.2F3(表1参照)の同時トランスフェクションによっても産生することができる。後者のプラスミドのトランスフェクション効率はpIK6.1MCVampacおよびpRTD2.2F3のトランスフェクション効率とほぼ同等であったが、ウイルス産生は2〜27%の率で減少した。同様な結果がLandauおよびLitman(LandauおよびLitman, 前出)によって記述されており、彼らは5倍の減少を観察した。1個または2個のゲノムパッケージングプラスミドを用いるKAT系の全効率はなお、COS細胞系について記述されている全効率の10〜20倍大きい。
KATプラスミドによる293細胞のトランスフェクションの後に産生されたウイルス上清のFACS分析によって観察される3T3細胞への高い形質導入効率は、感染した3T3細胞由来の組み込まれたプロウイルスDNAのサザンブロッティングによって確認された。感染および10μgのDNAのEco RVによる消化の48時間後に、高分子量DNAを調製した。試料は0.8%アガロースゲルを用いた電気泳動にかけ、Zetabindに移し、ゼータ膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする605bpの断片で釣り上げた。トランスフェクトされたプラスミドpRTD2.2F3のEco RV消化は、4.2kbのバンドを生じた。MMLV 5’および3’LTRsを含有するプラスミドpRTD1.2F3のEco RV消化は、3.6kbの断片を生じた。ウイルス感染の後、3’LTRの組み込みおよび複製、ならびにEco RV消化は3.6kbの断片を生じるはずである。これが標的細胞における組み込まれたプロウイルスDNAの存在の確認を可能とする。表2は、Eco RV消化およびゼータプローブへのハイブリダイゼーションを行なった後の、トランスフェクトされたプラスミドおよび組み込まれたプロウイルス由来の予想されるバンドの大きさを示す。
感染3TSから調製された染色体DNAをEco RVで消化し、感染及び対照の細胞からの10μlの消化DNAを0.8%アガロースゲルで電気泳動を行ない、Zetabindに移し、ζ膜内外と細胞質ドメインをコードする605bp断片をプローブとして検出した。293細胞にpRTD2.2F3とpIKMCVampacをコトランスフェクトした後に得られた上清に感染させた3T3細胞から得られたDNAのみが3.6kb断片(図3A、レーン4及び5)を生じ、これはEco RV消化pRTD1.2F3プラスミドコントロールレーン(図3A、レーン11〜14)に見られる断片と同一であって、組込まれたプロウイルスを示している。走査デンシトメトリーによるサザンブロットの定量および3倍増加量において0.1〜3.0コピーを示すプラスミド標準物との比較(図3A、レーン11〜14)は、ウイルス上清1mlあたり0.5コピー/細胞の形質導入効率と一致した。この形質導入効率はFACS分析により観察された効率と同じであった。プローブは、擬似(mock)トランスフェクトさせた293細胞(レーン1)、pRTD2.2F3のみをトランスフェクトさせた293細胞(図3A、レーン2と3)、発現ベクターpIKF3のみをトランスフェクトさせた293細胞(図3A、レーン6と7)またはpIK6.1MCVampacおよびpIKF3を共にトランスフェクトさせた293細胞(図3A、レーン8と9)からのそれぞれの上清ととも感染させた3T3細胞のDNA中にバンドを検出せず、これもFACS分析に合致する。
3つのさらに別のレトロウイルス構築物[その内、2構築物はウイルス骨格が異なるpRTD2.2SSAF3(図3B、レーン4)、pRTD2.2SVGF3(図3B、レーン5)、pRTD2.2SVGE-F3(図3B、レーン6)であり、および1構築物はキメラ受容体挿入物が異なるpRTD2.2F15(図3B、レーン7と8)である]をpIK6.1MCVampacとともに293細胞にトランスフェクトし、その上清を用いて3T3細胞を感染させた後、FACS分析(表1)とサザンブロット(図3B)を行なった。予想されたように、すべてのF3構築物がFACS分析により類似の力価を示し(表1)、同様な強度でゼータプローブにハイブリダイズした。FACS分析(表1)とサザンブロットのデンシトメトリー分析により決定されたように、F15レトロウイルスは約50%高い力価を有していた。各ベクターを有する293中に作られたレトロウイルスは、感染すると、組込まれたプロウイルスに正しい大きさを与えた。したがって、5 KATレトロウイルス構築物のFACSとサザンブロットの結果は、高力価レトロウイルスを293細胞中に作ることができること、生産はレトロウイルス構築物およびパッケージング機能の両者のトランスフェクションに依存すること、並びに293細胞による高力価レトロウイルス上清の生産はレトロウイルス構築物の異常な再構成を導かないことを示している。
哺乳動物細胞系におけるウイルスの生産
KATプラスミドとともにトランスフェクトさせた後にウイルスを集めT3Tを感染させることにより、7種類のさらに別の細胞系を、レトロウイルスの生産能についてスクリーニングを行なった(表3)。
CD4表面発現とウイルス生産は、pIK6.1MCVampacをpRTD2.2F3と共にトランスフェクトした後のL929とCHO D-には見られなかった。しかし、これらの細胞系はlac z遺伝子をコードするプラスミドを用いた条件下では高いトランスフェクションが可能であった。トランスフェクトされたHELA、143B、3T3およびCOSのFACS分析では、4細胞タイプのすべてについて、約50%のトランスフェクション効率を有する高い表面CD4発現が示された。しかし、これらの細胞間のウイルス生産は実質的に異なっていた。HELAと143B細胞はウイルスを全く生産しなかった一方で、3T3細胞は凍結上清1mlあたり3%の3T3の形質導入の可能なウイルスを生産した。COS細胞をKATプラスミドと共にトランスフェクションさせると、レトロウイルス構築物のDNA複製がなくてさえも、3T3細胞により作られたものよりも4.5倍高い力価を有するウイルスが生産された。これらの力価は、ウイルスベクター構築物のプラスミド複製がなくても、LandauおよびLitmanにより記載されたものよりも200倍高かった(上記のLandauおよびLitman)。このことは、多様な細胞のトランスフェクション後、プラスミド複製をすることなくレトロウイルスを生産するKAT構築物の能力が独自なものであることを示している。LandauおよびLitmanが観察したものよりもウイルスベクター構築物のプラスミド複製を用いることで100倍の増加を考慮するならば、KATパッケージング機能およびプラスミド複製を助けるレトロウイルスベクタープラスミドを、プラスミド複製を助ける宿主に導入することで、潜在的に力価をさらに10〜100倍増加させ、KATをトランスフェクトした細胞の実用性をさらに高めて、現在感染させることの困難な種類の細胞を感染させることができるであろう。
実施例II
ヒトT細胞の高効率形質導入
本実施例では、KATでトランスフェクトされた293細胞は、共に培養することで初代の、ヒト標的CD8+ T細胞を高効率で形質導入させることのできる本発明の方法を示す。
レトロウイルスベクターの構築とパッケージングプラスミド
KAT構築物は上記実施例Iに記載のように調製した。
末梢血液からのヒトCD8+ T細胞の単離と活性化
初代ヒトCD8+ T細胞を健康な供与者の末梢血液から以下のように精製した。末梢血液単核球(PBMC)をFicoll-Hypaque密度勾配遠心分離によりヒト血液から単離した。PBMCをD-PBSE/CMF(1mM EDTAを含有し、CaとMgを含有しないPBS)で3回洗浄し、0.5%のヒトガンマグロブリンを含有する4mlのD-PBSE/CMFに5x107細胞で再懸濁し、室温で15分以上インキュベートした。インキュベーション後、CD8+ T細胞を陽性パンニングによりPBMC細胞懸濁物から精製した。具体的には、PBMC懸濁液を、ヒトCD8受容体に特異的な抗体で被覆した、予め洗浄されたT-25組織培養フラスコ(AIS CD8選択フラスコ(カリフォルニア州サンタクレアのApplied Immune Sciences))に1つのT-25フラスコあたり(4mlあたり)5x107細胞の密度で入れた。細胞を1時間室温でインキュベートし、非付着性細胞をピペットを用いてD-PBSE/CMFで静かにフラスコを3回洗って除去した。CD8+ T細胞をフラスコから遊離させ、同時に10ng/ml OKT3(ニュージャージ州ラリタンのOrtho Pharmaceuticals)と10% IL2(Pharmacia)を含有する10mlのT細胞培地(組成については下記参照)を添加して活性化した。細胞をこの培地で48時間インキュベートし、フラスコから細胞を集め、T細胞培地を用いて一回洗浄し、最後に新しいT細胞培地(10% IL2含有)に24ウェルプレート上で0.5〜1.0x106/mlの密度で再度懸濁した。
F3表面発現の検出に用いられるCD4に特異的な抗体、またはF15表面発現の検出に用いられるヒトFcに特異的な抗体のいずれかと交差反応してとどまった細胞(通常は2〜3%存在する)を除去するために、その高密度CD8+ T細胞集団をさらに一連の精製に供し、夾雑細胞を、陰性パンニングにより、抗CD4または抗ヒトFc抗体のいずれかを被覆した上記のようなAIS選択フラスコを用いて除去した。具体的には、前記高密度CD8+ T細胞集団を選択フラスコ中で1時間インキュベートし、次に非付着物(すなわち高度精製CD8+ T細胞)を除去した。次に細胞を洗浄し、T細胞培地(10% IL2含有)中で24時間再生させた。このように調製されたCD8+ T細胞は95% CD8+およびCD3+よりも高く、0.5% CD4+またはFC+よりも低く、次にレトロウイルス形質導入のための標的として用いた。
共培養または上清感染によるレトロウイルスのCD8+ T細胞形質導入
293細胞を1x106細胞/6ウェルプレートで塗布し、次に48時間後に上記のように適当な構築物でトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、トランスフェクション培地を除去し、T細胞成長培地に換えた(組成に関しては下記参照)。
(a)共培養: 2〜4時間後、トランスフェクトされた293細胞を含有する1ウェルあたり、上記のように調製した0.5x106個の精製され、活性化したヒトCD8+ T細胞(通常は精製/活性化後4日または5日目)を添加し、ポリブレンを2μg/mlの最終濃度で添加した。最初のトランスフェクションで293細胞を塗布してから24時間後に、第二組の293細胞を上記のように塗布し、トランスフェクトした。最初の共培養から24時間後に、T細胞を最初の共培養物から取出し、第二の293トランスフェクションプレートに移して、同じ条件を用いて共培養をさらに24時間行なった。類似の条件を用いて、一時的にトランスフェクトされた3T3細胞または安定PA317生産細胞系40.39のいずれかと共に培養することによりCD8+ T細胞の形質導入を行なった(下記参照)。
(b)上清感染: 上記のように調製した0.5x106個の精製され、活性化したヒトCD8+ T細胞(通常は精製/活性化後4日または5日目)を、上記の293一時的トランスフェクションシステムからか、または安定PA317生産細胞系40.39(下記参照)から得られた1mlのウイルス上清とともに、新しい1mlのT細胞培地(10% IL2と2μg/mlポリブレンを含有)中でインキュベートした。8時間のインキュベーション後、1.5mlの培地を各ウェルから除去し、1.0mlのウイルス上清とともに新しい0.5mlの新鮮T細胞培地(2μg/mlのポリブレンおよび10%のIL2を含有)と交換した。12時間のインキュベーション後、上記の2段階上清操作を繰り返した。
共培養と上清感染のために、CD8+ T細胞を新しいT細胞培地(10% IL2を含有)で24〜28時間再生させた。次に、形質導入効率の決定のために、細胞を、CD4(CD4-ζF3受容体に関して)またはFc(F15抗体-ζ受容体に関して)のいずれかの表面発現についてフローサイトメトリーによって分析した。トランスフェクトした293細胞と共に培養したT細胞を、293単層から懸濁物として静かに取り出した。共培養したT細胞と上清感染T細胞は両方ともに2%ウシ胎児血清(FCS)(Hyclone)を含有するリン酸緩衝溶液(PBS)で一回洗浄した。次にT細胞を、2% FCSを含有するPBS存在下に1x106/mlの密度で30分間、40℃で適当なFITC複合検出抗体とともにインキュベートし、PBS(2% FCS含有)で3回洗浄し、最後に0.5ml PBSに再懸濁し、フローサイトメトリーにより分析した。
次に、形質導入したCD8+ T細胞集団をT細胞培地(10% FCS, Hyclone; RPMI1640, GellGro; 10mM Hepes緩衝液(Gibco);1%ピルビン酸ナトリウム(Gibco);1%非必須アミノ酸(Gibco);2mMグルタミン(Gibco);25μM 2-メルカプトエタノール(Sigma)および1%ステレプトマイシン/ペニシリン)中で維持した。T細胞を、7〜10日ごとに10ng/mlのOKT3の添加によるか、またはT-25組織培養フラスコ中で固定化OKT3に細胞を1〜2x107 CD8+ T細胞/10ml T細胞培地(10% IL2を含有)の密度でさらすことにより定期的に再刺激した。細胞を48時間インキュベートし、T細胞培地で1回洗浄し、新しい培地(10% IL2を含有)に0.5〜1.0x106/mlで再懸濁した。
CD8+ T細胞形質導入の分析
KATシステムを用いて一時的に作製したレトロウイルスによる初代ヒトCD8+ T細胞の形質導入効率は、アンホトロピック・パッケージング系PA317に由来する高力価の安定生産クローンから作られたレトロウイルスに匹敵した(上記のMillerおよびButtimore)。F3キメラ受容体を形質導入する安定な生産細胞クローン40.39を、pRTD4.2F3によるエコトロピックパッケージング系gpeのトランスフェクションにより単離し(上記のMarkowitz et al.)、トランスフェクションの48時間後に上清を集め、8マイクログラム/mlのポリブレンの存在下にPA317を感染させた(上記のMiller and Buttimore)。個々のクローンを限界希釈により得て、クローンの培地からウイルスmRNAを単離し、603bpゼータ鎖プローブを用いるドットブロットハイブリダイゼーションにより、ウイルス生産について50クローンを選抜した。最大のハイブリダイゼーションシグナルを示したクローンであるクローン40.39は、106個のNIH 3T3細胞を限界希釈感染させた後のフローサイトメトリーによりアッセイした。50μlの上清は17%の細胞を形質導入させ、これは340%または平均して3.4プロウイルスコピー/細胞/mlと等しい。初代ヒトCD8+ T細胞を40.39生産細胞と48時間の共培養した後の形質導入効率は1%〜3% CD4+(表4)であった。
この結果は、キメラ受容体F3及びF15をCD8+ T細胞に形質導入するために用いられた本発明のKAT一時的トランスフェクション及び共培養法後の形質導入効率に匹敵するものであった(図4)。CD8+ T細胞を、トランスフェクトさせた293細胞上で48時間共培養し、その後にT細胞を集め、14日間生育させ、上記のように形質導入効率のFACSによる分析を行なう4実験を行なった。F3構築物及びF15構築物の両方を用いたCD8細胞の形質導入効率は8%〜38%と変化し、かなりドナー依存的であるように思える。しかし、平均ではこの効率は、試験された高力価安定PA317クローンと共に培養することで得られた形質導入効率よりも8〜12倍高い。さらに、F15構築物は同様な効率で形質導入されるために(図4)、高い形質導入効率はF3構築物に特異なものではない。このデータから、CD8 T細胞は他のいかなる刊行された報告よりも少なくとも5倍以上、又は少なくともそれに等しい効率で形質導入することができること、および安定な生産体の作製が必要とされないことがわかる。
形質導入の3週間後、形質導入されたT細胞の上清を広範囲S+L-アッセイで調べたところ(Miller et al., Mol. Cell. Biol. 5:431-437(1985))、複製能をもつレトロウイルスのないことが示された。
高効率形質導入は細胞-細胞接触により仲介される
KATプラスミドの一時的トランスフェクションおよびCD8+ T細胞との共培養後の高効率CD8 T細胞形質導入の機構を検討するために、以下のアプローチを用いるCD8+ T細胞の形質導入効率を比較した: (1)高力価の安定PA317生産体系から得られた上清を用いる感染、(2)高力価の安定PA317生産体系との共培養、(3)pIK6.1MMSVampacおよびpRTD4.2F3によるNIH 3T3細胞の一時的トランスフェクションから得られた上清を用いる感染、(4)pIK6.1MMSVampacおよびpRTD4.2F3による一時的なトランスフェクション後のNIH 3T3との48時間の共培養、(5)pIK6.1MCVampacおよびpRTD2.2F3による293細胞の一時的トランスフェクションから得られた上清を用いる感染、および(6)pIK6.1MCVampacおよびpRTD2.2F3による一時的トランスフェクション後の293細胞との48時間の共培養(表4)。それぞれの一時的トランスフェクション実験のために、トランスフェクトされた細胞の二重プレートを用いて3T3細胞の上清感染用培地を集め、および二重プレートを用いてCD8 T細胞の共培養に用いた。同じアプローチを適当な生産体のために用いた。
ウイルスが293細胞、3T3細胞および安定PA317生産体のどの細胞で作られたかにかかわらず、上清によるCD8+ T細胞の感染は1%であった(表4、実験1A、2Aおよび2C)。対照的に、pIK6.1MCVampacおよびpRTD2.2F3を共にトランスフェクトした293細胞と共にCD8 T細胞を培養することで、10%〜14%のCD8 T細胞形質導入がもたらされ(表4、実験1D、2D)、これらのプラスミドを293細胞にコトランスフェクションして作られた上清を含めたすべての上清による感染よりも10〜14倍高いものであった。これは、細胞-細胞接触がCD8+ T細胞の高効率形質導入を招くことを示すものである。さらに、KATトランスフェクションとその後の共培養の効率は、3T3細胞を用いる場合は安定PA317生産体と共培養したときの形質導入効果よりも1〜3倍高く(表4の1Bと2Bを1Cと比較されたい)、293細胞を用いる場合は5〜10倍高い。このデータから、293細胞は哺乳動物細胞の高効率形質導入を助ける独自な性質を有することが確認される。
これらの結果を本発明の特別な理論に限定することを欲するものではないが、これらの結果は、培養培地中への高力価ウイルス生産物は十分なT細胞形質導入のためには不十分であって、観察された高い効率の形質導入は293細胞とCD8+ T細胞との細胞-細胞接触により仲介され、10倍までの効率をもたらすことを示唆するものである。
本実施例に示す結果は、選択のない場合では、以前の結果と比較して著しく高い形質導入頻度で10〜40%のCD8+ T細胞がウイルスにより形質導入されることを示すものである。
実施例III
初代ヒト造血幹細胞の形質導入
本実施例では、初代ヒトCD34+骨髄幹細胞を形質導入するためのKAT構築物の利用と本発明の方法を記載する。
骨髄細胞の調製
ヒト骨髄を健康なボランティアから得た。それを最初にFicoll勾配を用いて(ニュージャージ州ピスカタウェイのPharmacia)、単核細胞画分に分画した。CD34+細胞をCellPro CEPTRATE LCTMアフィニティーカラム(ワシントン州ボーテルのCellPro)を用いる陽性選択を用いて単離する。精製後のFACS分析により約90%のCD34+細胞集団を得る。次にこの細胞集団を24ウェルプレートに5x105細胞/mlの密度でまき、Terry Fox Labs(カナダ、バンクーバー)から完全培地として提供されているMyeloid Long Term Culture Medium中に、100ng/mlヒト幹細胞因子(hSCF)(ミネソタ州ミネアポリスのR&D Systems)、50ng/ml hIL-3および10ng/ml hIL-6の存在下で48時間培養した。
CD34+骨髄幹細胞の形質導入
293細胞を形質導入の48時間前に1x106細胞/6ウェルプレートの密度で最初に塗布した後、pRTD2.2F3及びpIK6.1MCVampacをそれぞれ10μgトランスフェクトした。24時間後、トランスフェクション培地を除去し、実施例IIに記載のように50ng/ml hIL-3、100ng/ml hSCFおよび10ng/ml hIL-6を含むT細胞増殖培地に換えた。2〜4時間後、トランスフェクトされた293細胞を、5x105個の精製CD34+細胞/ウェルとともに8μg/mlポリブレンの存在下に培養した。48時間後、細胞を293単層から集め、上記のように増殖因子を有するMyeloid Long Term Mediaに再度塗布した。部分的な細胞群減少により、培地に増殖因子を含む培地を毎日補給した。4日後、培地を補給し、G-CSFを2ng/mlおよびhSCFを20ng/ml加えて、顆粒球への分化を促進した。4〜6日後、細胞を、形質導入遺伝子及びCD15(顆粒球マーカー)からのヒトCD4の表面発現について分析した。さらに、DNAをサザンブロット分析のために調製した。
図5は、形質導入造血幹/始原細胞の顆粒球への生育と分化の14日後のFACS分析を示している。パネルAは、図におけるすべての細胞集団の分析に用いられた前面または側面スキャッターゲートを示している。パネルBには、イソタイプ対照抗体(FITCおよびPE)で染色された非形質導入細胞が示されている。パネルCには、ヒトCD4(形質導入遺伝子、y軸)及びCD15(顆粒球分化マーカー、x軸)に関して抗体で染色された非形質導入細胞が示されている。パネルDでは、KATパッケージングシステムを293細胞共培養と組合わせて用いて造血幹/始原細胞を形質導入した。一番上の右四分円をパネルC及びDに関して比較すると、5〜6%の形質導入細胞がCD4タンパク質を発現したことがわかる。
形質導入効率のサザンブロット分析
造血幹/始原細胞がKATシステムを用いて作られたレトロウイルスに感染したかを決めるためにサザンブロット分析を行なった。染色体DNAを分化幹細胞から調製し、Eco RVで消化した。感染細胞(図6、レーン2)及び対照細胞(図6、レーン1)からの10μgのDNAならびにpRTD1.2F3の二倍体ゲノムあたり0.12、0.6、1.2および6.0コピーに相当するEco RV消化プラスミドDNA(図6、レーン4〜7)並びにpRTD2.2F3の二倍体ゲノムあたり5コピーに相当するEco RV消化プラスミドDNA(図6、レーン8)を0.8%アガロースゲル上で電気泳動し、Zetabindに移し、ゼータ膜内外及び細胞質ドメインをコードする605bp断片をプローブとして用いて検出した。トランスフェクトされたプラスミドpRTD2.2のEco RVによる消化は4.2kbバンド(図6、レーン8)を示す。MMLV 5’LTR及び3’LTRを含有するpRTD1.2のEco RV消化は3.6kb断片(図6、レーン4〜7)を示す。ウイルス感染、組込みおよび3’LTRの複製後にEco RVで消化すると、3.6kb断片を示すに違いない。感染を受けたCD34+細胞において、プローブは、プロウイルスに対応する適当な3.6kb断片とハイブリダイズした(図6、レーン7)。しかし、対照細胞はプロウイルスバンドがなく、プローブは内在性ゼータ遺伝子配列に対応するバンドにハイブリダイズした(図6、レーン8)。走査デンシメトリーを用いて形質導入効率を定量化したところ、感染を受けた細胞で1細胞あたりの平均プロウイルスコピー数は0.5(50%形質導入)であることがわかった。さらに、内在性バンドのデンシメトリーにより、等量のDNAが、感染または未感染の細胞に対応するレーンに載せられていたことが確認された。
第二の実験において、高力価PA317生産体クローンの形質導入効率はKATシステムにより作られたウイルスの形質導入効率を比較した。pIK6.1MCVampacとpRTD2.2F3との両方による293細胞の一時的トランスフェクション、CD34+細胞の単離、共培養、感染細胞の精製は既に記載のように行なった。実施例IIに記載のクローン40.39をCD34+細胞との共培養の開始の24時間前に5x105細胞/6ウェルプレートで塗布した。CD34+細胞の単離、共培養、感染細胞の精製は293細胞で記載したように行なった。形質導入効率は上記のようにEco RV消化DNAのサザンブロットにより分析し、それを図7に示す。KATプラスミドと共培養したCD34+細胞から単離されたDNAに存在するバンドは3.6kbバンドとハイブリダイズし(図7、レーン2)、Eco RV消化プラスミドDNAと大きさが等しく(図7、レーン4〜7)、組込まれたプロウイルスに対応していた。ハイブリダイズするバンドは擬似トランスフェクトされた293細胞(図7、レーン1)または40.39細胞(図7、レーン3)のいずれかと共培養されたCD34+細胞から単離されたDNAには存在しなかった。プラスミド標準物は1細胞あたり0.3〜10コピーの組込みプロウイルスの範囲にあった。したがって、PA317レーンにバンドのないことはKAT形質導入が少なくとも10倍効率的なことを示唆する。
形質導入された遺伝子の表面発現に関するFACS分析はわずかに5〜6%の形質導入効率のみを示しているが、サザン分析はそれよりも非常に高い形質導入効率(50〜100%)を示している。ヒトCD4タンパク質の発現レベルはFACS分析の検出レベル以下であると考えることができ、さもなければ遺伝子が存在していても十分に発現されていないとも考えられる。構築物に改変を行なって発現レベルを高めることができた。293細胞の共培養と組み合わせたKATパッケージングシステムによるヒト造血幹/始原細胞の形質導入の高い効率は、PA317等の在来のマウス繊維芽細胞パッケージングシステムを用いて得られる形質導入とは対照的である(図7)。PA317パッケージング系のデータによれば、マウス細胞を形質導入した場合に高力価ウイルスを作ることができるものの、ヒト骨髄幹/始原細胞の形質導入効率は不十分なことが示されている。
これらの結果は、高力価ウイルス上清の迅速な生産に加えて、KAT構築物を用いれば通常の方法では形質導入の難しい標的細胞(例えばヒトT細胞および造血細胞等)を形質導入することができることを示している。
実施例IV
pIKTレトロウイルスベクターによるヒト細胞での高力価ウイルスの生産及びヒトCD34+造血細胞の高効率形質導入
本実施例では、ヒト細胞系において高力価ウイルスを得るための本発明の新規なレトロウイルスベクターの使用、および初代ヒト造血幹細胞における高い効率の形質導入を得るための該ウイルスの使用を記載する。
上記のパッケージングベクターpIK6.1MCVampac UT△およびレトロウイルスベクターpIKT2.2SVGeF3を、上記のようにヒトtsa54細胞に一時的に(上記のように)コトランスフェクトした。tsa54細胞は293細胞からLarge SV40 T抗原のトランスフェクションにより得たものである(Heinzel et al., J. of Virol. 62(10):3738-3746(1988))。pIKT2.2SVGe-F3は、プラスミド骨格が上記のようにSV40の複製開始点を含有している点でpRTD2.2F3とは異なる。この結果、SV40 t-抗原を有するtsa54細胞での高コピー数プラスミド複製がもたらされる。tsa54をトランスフェクトさせ、ウイルス上清を集め、これを用いて上記のように3T3細胞を感染させた。38% CD4陽性細胞/100μlの凍結ウイルス上清は7x106/mlに等しい。
pIKTベクターを用いて、上記のようにtsa54細胞にレトロウイルスを生産させ、そして共培養により初代ヒトCD34+骨髄幹細胞を形質導入した。以下の変更をした以外は上記実施例IIIに記載のように造血幹細胞を精製し、これをpIKT2.2SVGe-F3で形質導入した。tsa54細胞は5x105細胞/6ウェルプレートの密度でトランスフェクトした。トランスフェクション培地を換えるのに用いた培地はIMDM + 10% FBS(ウシ胎児血清)であった。CD34+細胞をウイルス生産tsa54細胞との2日間の共培養後に集めて、増殖因子を有するMeloid Long Term Media中で培養した。8〜10日後、G-CSFを2ng/mlおよびhSCFを10ng/ml加えて分化を促進した。6〜8日後に細胞のヒトCD4の表面発現を調べた。
図8は、形質導入造血幹/始原細胞の顆粒球への生育と分化の18日後のFACS分析を示している。パネルAは図におけるすべての細胞集団の分析に用いられた前面または側面スキャッターゲートを示している。パネルBでは、イソタイプ対照抗体(FITCおよびPE)で染色された非形質導入細胞が示されている。パネルCでは、ヒトCD4(形質導入遺伝子、y軸)及びCD15(顆粒球分化マーカー、x軸)に関して抗体で染色された非形質導入細胞が示されている。パネルDでは、3T3プレート上の107 neor CFUクローン/mlと等しい力価を有するPA317クローン(78.81)を、安定ウイルス生産細胞として、造血幹細胞との共培養に用いた。パネルEにおいて、KATパッケージングレトロウイルスベクターを293細胞共培養と組合わせて用いて造血幹/始原細胞を形質導入した。一番上の右四分円をパネルCとDおよびCとEとで比較すると、1.7%のPA317形質導入細胞がCD4タンパク質を発現したのに比べて、KAT構築物を用いて形質導入した場合は24%であることがわかる。
実施例V
単一ベクター293またはtsa54安定パッケージングクローンの生産
本実施例では単一ベクターパッケージングクローンの生産及び利用を記載する。ヒト293またはtsa54細胞をトランスフェクションの48時間前にDME(カンサス州レネキサのJRH Biosciences)、1g/lグルコース、10%ドナー子ウシ血清(カリフォルニア州ツラーレのTissue Culture Biologics)中で10cmプレート1枚あたり5x105で塗布した。10μgのMCVampac UT△および0.1μgのMC1 neo(Thomas and Capecchi Cell 51:503-512(1987))をリン酸カルシウム沈殿によりコトランスフェクトした(Wigler et al. Cell 16:777(1979))。クローンはベクターを共にエレクトロポレーションすることによっても効果的に作ることができた(Shigekawa and Dower Biotechniques 6(8):742-751(1988))。トランスフェクションの18時間後に培地を変えた。24時間後、細胞を分け、1mg/ml G418(ニューヨーク州グランドアイスランドのGeneticin, GIBCO)を加えた培地中に、プレート上で1:10、1:20および1:50にしてそれぞれ二重で入れた。培地を14日間にわたって3日ごとに変えた。クローンを取って24ウェルプレートに入れ、密になるまで生育させた。培地をウェルから集め、0.45μmフィルターで濾過し、ドライアイスで瞬時に凍結した。細胞を10% DMSO(ミズリー州セントルイスのSigma Chemical社)を加えた培地に再度懸濁し、ドライアイスで凍結し、−70℃で保存した。上清は、放射能標識したチミジンのRNA鋳型への取込を測定する逆転写酵素のアッセイにより空のウイルス粒子の生産について検定した(Goff et al. J. of Virol. 38:239-2498(1981))。
オートラジオグラフィー後、最大の逆転写酵素シグナルを有するクローンを解凍、生育させ、一時的なトランスフェクション後のウィルス生産を調べた。トランスフェクションは10μgの43.3PGKF3を用いて既に記載のように行なった。培地はトランスフェクションの18時間後に換えた。24時間後にウイルス上清を集め、0.45μmフィルターで濾過し、ドライアイスで瞬時に凍結した。ウイルス上清を、感染の24時間前に10cmのプレート1枚あたり5x105で塗布された3T3細胞を用いて検定した。感染は上記のように行なった。次に細胞を集め、OKT4A抗CD4モノクローナル抗体(ニュージャージー州ラリタンのOrtho Diagnostic Systems社)で染色して上記のようにフローメトリーで分析した。クローンは多様な量のパッケージング機能を示した。最大の一時的力価を有するクローンを選択してさらに特徴付けを行なった(表5)。
クローン90.74、107.75および107.18は長期間培養し、G418の存在または存在しない状態で経時的にパッケージングゲノムを維持する能力を調べた。細胞を3〜4日ごとに1:10〜1:20に分けた。継代1、6および12において、細胞を10μgの43.2で上記のようにトランスフェクトし、一時的ウイルス上清を上記のように3T3細胞感染により分析した。調べられた3クローンのうち、わずかに1クローン(90.74)が12継代にわたって変わらない力価を有しているように思われた(表6)。力価は、継続したG418選択に依存しないようにも思われた。クローン90.74は約107/mlに等しい一時的力価を有している。クローン90.74は、ブタペスト条約に基づいてメリーランド州ロックビル、パークローンドライブ12301のATCCに寄託されており、その同定は以下の通りである:
上清は、PG4を用いるS+/L−アッセイによりRCRの生産についても調べられた。PG4細胞はMoloney肉腫ウイルスにより形質転換されたネコ脳由来の細胞である(ATCC CRL2032)。PG4細胞を能力を有するマウスレトロウイルスに感染させると、該細胞は顕微鏡的に区別することのできる認識できる病巣を作る(Haapala, et al. J. of Virol., 53(3):827-833)。感染の24時間前にPG4細胞を5x106で10cmプレートにまいた。1mlの試験上清および4mlの培地(8μg/mlのポリブレンを含有)を用いて感染を行なった。培地は24時間後に替え、その後病巣が陽性対照プレート上に達するまで培地を2〜3日おきに交換した。調べたすべてのクローンは12継代にわたってRCRがないままであった。
予想されなかったことに、これらの結果は本発明のレトロウイルスベクターを用いて、安定にトランスフェクトされ、gag、polおよびenvのそれぞれのタンパク質を作る293由来細胞系が作られたことを示している。これらの細胞系によるウイルス生産は、パッケージング及びレトロウイルスベクターの一時的共同トランスフェクションから作られたものに等しかった。さらに驚くことに、薬剤選択がない場合に、これらの細胞系はgag、polおよびenvのそれぞれのタンパク質の生産を維持した。文献に記載のレトロウイルス構築物を用いる293起因レトロウイルス生産体を作ろうとするこれまでの試みはうまくいかなかった(Pear et al. Proc. Nat’l. Acad. Sci.(USA)90:8392-8396(1993))。培養での長期継代後、これらのパッケージング細胞系は自発的には複製能をもつレトロウイルスを作らない。
実施例VI
二重ゲノム安定パッケージング細胞の生産
本実施例では293またはtsA54パッケージング細胞中の2ゲノムの構築及びと使用を記載する。最初にgap/polクローンをヒトtsa54細胞で作った。PBSの0.8mlあたり1x106個の細胞に対して15μgのnotI直鎖状gap/pol ATG(既に記載)、及び1μgのMC1 neoを用いてエレクトロポレーションを行なった。エレクトロポレーションは960μF及び260mV(上記のShigekawaおよびDower(1988))をジーンパルサー(カリフォルニア州リッチモンドのBio-Rad)を用いて行なった。すぐに細胞を10cmプレート上にまき、DME、1g/lグルコース、10%ドナー子ウシ血清中で48時間培養した。次に細胞を1.0mg/ml G418選択で、1:5、1:10、1:20および1:50に分けた。培地を3日ごとに替え、G418での12日間の選択後、クローンを集めて24ウェルプレートに移した。細胞が密になったら、培地を集め、0.45μmフィルターで濾過し、ドライアイスで瞬時に凍結した。クローンをトリプシン処理し、−70℃で凍結した。上清を解凍し、その逆転写酵素活性を分析した(上記のGoff et al.(1981))。最大のRT活性を示すクローンを生育させ、上記の5μgのpIK6.1MCVamenvATGUT△、及び上記の10μgのpRT43.2F3のリン酸カルシウムトランスフェクションによる一時的ウイルス生産を算出した。培地は18時間後に替え、さらに24時間後ウイルス上清を集め、濾過し、凍結し、3T3の感染による分析を行なった。一時的ウイルス力価は、pRT43.2F3でトランスフェクトさせた単一ゲノムパック系90.74の一時的ウイルス力価に匹敵し、pIK6.1MCVampacUT△とpRT43.2F3とによるtsA54細胞のコトランスフェクション後のウイルス力価のおよそ50%であった(表7)。
C418選択を使用または使用しない長期安定性の研究から4種類の最も良いクローンを選択した。それらもRCRの生産に関してPG4細胞を用いて検定したが、RCR陰性であった。
クローン111.4をヒスチノール中で、記載されたように選択されたsv2his(Hartman and Mulligan, Proc. Nat’l. Acad. Sci.(USA)85:8047-8051(1988))およびpIK6.1MCVamenvATGUT△によってコトランスフェクトさせる。クローンを集め、ウイルス生産について上記のように一時的トランスフェクションによって特徴付ける。いくつかの高力価クローンの安定性とRCRを上記のように特性付ける。
パッケージング系はpIK6.1MCVamenvATGUT△中のアンホトロピックenv遺伝子を、上記の方法を用いて、他のレトロウイルスエンベロープ、例えばエコトロピック、ゼノトロピック、ポリトロピック、MLV、10A1、テナガザル白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルスC、水疱性口内炎ウイルス(VSV)Gタンパク質、ヒトT細胞白血病(HTLV)IおよびII並びにそれらの組合せに置き換えることによって作ることができる。
本明細書で挙げたすべての刊行物と特許出願は、個々の刊行物と特許出願が参照によって具体的にそして個々に組み入れられるように示されているが如く、ここに組み入れる。
本発明に関連する当業者には明らかなように、本発明は上記に具体的に記載された以外の形で、例えば他の種類の哺乳動物細胞をトランスフェクトまたは形質導入するために、本発明の精神または必須の特徴から離れることなく具体化してもよい。したがって、上記の本発明の特別な実施態様は説明的なものとしてみなされるべきであって、限定的なものとみなされるべきものではない。本発明の範囲は、前記の実施例に限定されるというよりは添付の請求の範囲に記載されている通りである。
アメリカンタイプカルチャー コレクション
アメリカ合衆国 20852 メリーランド州、
ロックビル、パークローンドライブ12301
Claims (13)
- 外来遺伝子を担う複製欠損性レトロウィルスウィルス粒子を生産する方法であって:
ウイルス生産能のある哺乳動物細胞の第1集団を:
(i)レトロウイルスゲノム由来の、gagおよびpolタンパク質をコードする第1のレトロウイルスヘルパーDNA配列およびenvタンパク質をコードする第2のレトロウイルスヘルパーDNA配列を含み、該ウイルスの5’LTRの天然エンハンサーおよび/またはプロモーターをコードする領域を欠き、さらにヘルパーゲノムのパッケージングに関与するプサイ機能配列と3’LTRの両方を欠き、そして所定の哺乳動物細胞内で機能する外来エンハンサーおよび/またはプロモーターが、該ウイルスの5’LTRのR領域に結合される、少なくとも1つのレトロウイルスパッケージングプラスミド;および
(ii)哺乳動物細胞の第1集団において外来遺伝子を担う複製欠損性レトロウイルスウイルス粒子を生産するために外来遺伝子をコードするレトロウイルスベクター、
で一時的に同時トランスフェクションすることを含んでなる上記方法。 - 第1集団の哺乳動物細胞がヒト胚性腎細胞である、請求項1に記載の方法。
- ヒト胚性腎細胞が293(ATCC No.CRL1573)細胞である、請求項2に記載の方法。
- レトロウイルスゲノムが、モロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)、HIVおよびテナガザル(gibbon ape)白血病ウイルス(GALV)ウイルスからなる群から選ばれる白血病レトロウイルスである、請求項1に記載の方法。
- 外来エンハンサーがヒトCMV即時型(immediate early)エンハンサーであり、プロモーターが天然MMLVプロモーターである、請求項1に記載の方法。
- 外来エンハンサーおよびプロモーターがヒトCMV即時型エンハンサーおよびプロモーターである、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のヘルパー配列がエコトロピックMMLVのgagおよびpolタンパク質をコードし、そして前記第2のヘルパー配列がゼノトロピック、アンホトロピック、エコトロピック、ポリトロピック、10A1マウス白血病ウイルス、GALV、HIVのenvタンパク質、水疱性口内炎ウイルス(VSV)のGタンパク質、ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV)I型およびII型のenvタンパク質、およびこれらの組合せよりなる群から選ばれるenvタンパク質をコードする、請求項1に記載の方法。
- ヒト細胞において高力価の組換えレトロウイルスを生産するためのレトロウイルスパッケージングプラスミドであって、レトロウイルスゲノム由来の、gagおよびpolタンパク質をコードする第1のレトロウイルスヘルパーDNA配列およびenvタンパク質をコードする第2のレトロウイルスヘルパーDNA配列を含み、該ウイルスの5’LTRの天然エンハンサーおよび/またはプロモーターをコードする領域を欠き、さらにヘルパーゲノムのパッケージングに関与するプサイ機能配列と3’LTRの両方を欠き、そして所定の哺乳動物細胞内で機能する外来エンハンサーおよび/またはプロモーターが、該ウイルスの5’LTRのR領域に結合される、レトロウイルスパッケージングプラスミド。
- 前記レトロウイルスが白血病レトロウイルスである、請求項8に記載のレトロウイルスパッケージングプラスミド。
- 前記白血病レトロウイルスゲノムが、モロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)、HIVおよびテナガザル(gibbon ape)白血病ウイルス(GALV)およびHIVウイルスからなる群から選ばれる白血病レトロウイルスである、請求項9に記載のレトロウイルスパッケージングプラスミド。
- 前記第1のヘルパー配列がエコトロピックMMLVのgagおよびpolタンパク質をコードし、そして前記第2のヘルパー配列がゼノトロピック、アンホトロピック、エコトロピック、ポリトロピック、10A1マウス白血病ウイルス、GALV、HIVのenvタンパク質、水疱性口内炎ウイルス(VSV)のGタンパク質、ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV)I型およびII型のenvタンパク質、およびこれらの組合せよりなる群から選ばれるenvタンパク質をコードする、請求項8に記載のレトロウイルスパッケージングプラスミド。
- 請求項8のレトロウイルスパッケージングプラスミドを含むトランスフェクションされた細胞。
- 293細胞(ATCC No.CRL1573)である、請求項12に記載のトランスフェクションされた細胞。
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