KR960703169A - 고역가 바이러스 생산과 포유류 세포의 고효율 레트로바이러스 중개된 형질도입 방법(method for rroduction of high titer virus and high efficiency retroviral mediated transduction of mammalian cells) - Google Patents
고역가 바이러스 생산과 포유류 세포의 고효율 레트로바이러스 중개된 형질도입 방법(method for rroduction of high titer virus and high efficiency retroviral mediated transduction of mammalian cells) Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신규한 레트로바이러스성 패키지 시스템을 제공하는데 이때, 레트로바이러스 패키지 구조와 패키지 벡터구조는 사람세포에서 형질감염에 의해 고발현 플라스미드에서 생산한다. 고역가 제조합 레트로바이러스는 감염된 세포에서 생산된다. 본 발명의 방법에는 T세포와 사람 조혈간세포를 포함한 사람세포에 고효율에서 공배양에 의해 외부유전자를 형집도입시키기 위한 신규 레트로바이러스 구조을 이용하는 것을 포함한다. 본 발명은 통상의 수단에 의해 형질도입이 어려운 고효율 세포를 형질도입시키고 고역가 바이러스 상층액을 신속히 생산하는데 유용하다.
Description
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제1도는 레트로바이러스 전사체를 포장하는데 필수적인 단백질을 생산하는데 이용되는 본 발명의 레트로바이러스 패키지 플라스미드의 도형이다 : pIK6. 1MMSVampac, pIK6. 1MCVampac, pIK6. 1gagpolATG, pIK6. 1amenATG,
제2A, 2B, 2C, 2D는 실시예1에서 상술하는 것과 같은 레트로바이러스로 형질 감염된 293세포의 FACS의 프로파일이다.
제3A와 3B는 실시예1에서 상술하는 것과 같이 감염된 3T3 DNA의 서든블랏 분석에 의해 결정된 형질 도입효능을 나타낸다.
Claims (82)
- 외부유전자를 높은 효율로 포유류 표적세포에 형질도입시키는 방법에 있어서 : A) i) 복제-컴피턴트 헬퍼바이러스의 생산없이 고역가에서 복제 인컴피턴트 레트로바이러스 벡터를 포장하고 복제-인컴피턴트 레트로바이러스 벡터를 패키지 할수 있는 비리온 단백질을 생산하는데 요구되는 trans 모든 비리온 단백질을 인코드하는 복제-인컴피턴트 레트로바이러스 게놈에서 유도한 적어도 하나의 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열로 구성된 적어도 하나의 레트로바이러스 패키지 플라스미드이고, 이때 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열은 바이러스의 바이러스성 5′ LTR의 고유 인헨서 그리고/또는 프로모터를 인코드하는 부분이 없고, 패키지 헬퍼 게놈과 3′LTR에 역할을 하는 psi 기능서열이 없고 선택된 포유류 세포에서 외부 인헨서 그리고/또는 기능성 프로모터와 SV40 폴리아데닐화부분을 인코드하고; 그리고 포유류 세포의 제1집단에 있는 외부유전자를 가지는 복제-결합 재조합 레트로바이러스 벡터를 생산하기 위한 외부유전자를 인코드하는 레트로바이러스 벡터를 ; 바이러스를 생산할 수 있는 포유류 세포의 제1집단에 일시적 공형질 감염시키고, B) 외부유전자를 표적세포의 제2집단에 형질도입시키기 위해 외부유전자를 가지는 복제-결합 재조합 레트로바이러스 벡터를 생산하는 포유류 세포의 제1집단과 포유류 표적세포의 제2집단을 공배양시키고 따라서, 외부유전자가 효과적으로 형질도입된 표적세포를 수득하는 것으로 구성된 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 표적세포는 임파세포, 사람 조혈간세포, 섬유아세포, 상피세포, 내피세포, 근원세포, 망막 상피세포, 랑게르한스 샘, 아데느랄 수세포, 조골세포, 파골세포, 뉴우런, 신경교세포, 강글리안 세포, 베아 간세포와 간세포로 구성된 집단에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 포유류 표적세포의 제2집단은 사람인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제3항에 있어서, 사람 표적세포는 암파세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 암파세포는 T세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서 T세포는 세포독성 T세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 임파세포는 CD8+세포독성 T세포, CD4+세포독성 T세포와 종양-침융성 임파세포에 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 포유류 표적세포의 제2집단은 사람 조혈간세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 포유류 표적세포의 제1집단은 사람 배신장세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제9항에 있어서, 사람 배아 신장세포는 293(ATCC NO. CRL1573) 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 도면1에 나타낸 구조를 가지고 ATCC NO. 75484로 기탁된 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 패키지 플라스미드 pIK6.1MMSVampac.
- 도면1에 나타낸 구조를 가지고 ATCC NO. 75483로 기탁된 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 패키지 플라스미드 pIK6.1MCVampac.
- 도면1에 나타낸 구조를 가지고 ATCC NO. 75486로 기탁된 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 패키지 플라스미드 pIK6.1gagpolATG.
- 도면1에 나타낸 구조를 가지고 ATCC NO. 75485로 기탁된 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 패키지 플라스미드 pIK6.1amenvATG.
- 제1항에 있어서, 레트로바이러스 패키지 플라스미드는 제11, 12, 13 또는 제14항에 따른 레트로바이러스 패키지 플라스미드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 레트로바이러스 게놈은 MMLV, HIV와 GALV 바이러스로 구성된 집단에서 선택된 백혈병 바이러스 게놈인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서, 외부인헨서는 사람 CMV 초기 인헨서이고 프로모터는 고유 MMLV 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서, 외부인헨서와 프로모터는 사람 CMV 초기 인헨서와 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서, 외부인헨서와 프로모터는 MMSV 인헨서와 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 레트로바이러스 패키지 플라스미드는 두 개 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제20항에 있어서, 외새 MMLV gag 와 pol 단백질에 대한 제1헬퍼 서열코드와 env 단백질에 대한 제2헬퍼 서열코드는 이종향성, 양종양성, 외생, 다생 10Al 쥐 백혈병 바이러스, GALV, HIV, 소포구강 바이러스(VSV) G 단백질, 사람 T 세포 백혈병(HTLV) 타입I와 II, env 단백질과 이들의 복합으로 구성된 집단에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 따른 방법에 의해 생산된 외부유전자로 형질도입된 것을 특징으로 하는 포유류 표적세포.
- 제22항에 있어서, 세포는 사람세포인 것을 특징으로 하는 포유류 표적세포.
- 제22항에 있어서, 표적세포는 임파세포, 사람 조혈간세포, 섬유아세포, 상피세포, 내피세포, 근원세포, 망막 상피세포, 랑게르한스 샘, 아데느랄 수세포, 조골세포, 파골세포, 뉴우런, 신경교세포, 강글리안 세포, 베아 간세포와 간세포로 구성된 집단에서 선택된 것을 특징으로 하는 포유류 표적세포.
- 제1항에 있어서, 외부유전자는 성장인자, 임포킨, 호르몬과 응집인자에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 외부유전자는 키메라 T세포 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제26항에 있어서, 키메라 T세포 수용체는 : 시그날 서열을 인코드하는 서열; 적어도 하나의 리간드에 특이적으로 결합하는 비-MHC 제한된 세포의 표면 막단백질을 인코드하는 서열; 막통과 도메인을 인코드하는 서열, 그리고 세포내 메신저 시스템을 활성화시키는 단백질의 세포질 신호-형질도입 도메인을 인코드하는 서열로 구성된 리딩프레임으로 구성된 DNA 서열에 의해 인코드된 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제27항에 있어서, 세포질 도메인은 CD3 제타사슬, CD3 에타사슬, CD3 감사마슬, CD3 델타사슬, CD3 입실론사슬에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제27항에 있어서, 세포질도메인은 Fc∈R1 수용체의 특징으로 하는 방법.
- 제29항에 있어서, 세포의 도메인은 CD 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제30항에 있어서, 세포의 도메인은 CD4 또는 CD8 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제27항에 있어서, 세포의 도메인은 단일-사슬 항체 또는 이의 일부인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제27항에 있어서, 단일-사슬 항체는 HIV env 당단백질에 특이적인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제27항에 있어서, 세포의 도메인은 HIV env 당단백질에 대해 특이적인 단일-사슬 항체이고 세포질 도메인은 제타인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제27항에 있어서, 카메라 T 세포 수용체는 CD4/제타 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
- 외부유전자를 높은 효율로 포유류 표적세포에 형질도입시키는 방법에 있어서 : A) i) 복제-컴피턴트 헬퍼 바이러스의 생산없이 고역가에서 복제 인컴피턴트 레트로바이러스 벡터를 포장하고 복제-인컴피턴트 레트로바이러스 벡터를 패키지 할수 있는 비리온 단백질을 생산하는데 요구되는 trans 모든 비리온 단백질을 인코드하는 복제-인컴피턴트 레트로바이러스 게놈에서 유도한 적어도 하나의 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열로 구성된 적어도 하나의 레트로바이러스 패키지 플라스미드이고, 이때 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열은 바이러스의 바이러스성 5′ LTR의 고유 인헨서 그리고/또는 프로모터를 인코드하는 부분이 없고, 패키지 헬퍼 게놈과 3′LTR에 역할을 하는 psi 기능서열이 없고 선택된 포유류 세포에서 외부 인헨서 그리고/또는 기능성 프로모터와 SV40 폴리아데닐화부분을 인코드하고; 그리고 포유류 세포의 제1집단에 있는 외부유전자를 가지는 복제-결합 재조합 레트로바이러스 벡터를 생산하기 위한 외부유전자를 인코드하는 레트로바이러스 벡터를; 바이러스를 생산할 수 있는 293 세포에 일시적 공형질 감염시키고, B) 외부유전자를 표적세포의 제2집단에 형질도입시키기 위해 외부유전자를 가지는 복제-결합 재조합 레트로바이러스 벡터를 생산하는 293 세포와 포유류 표적 세포의 제2집단을 공배양시키고 따라서, 외부유전자가 효과적으로 형질도입된 표적세포를 수득하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제36항에 있어서, 표적세포는 사람표적세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제37항에 있어서, 사람 표적세포는 임파세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제39항에 있어서, 사람 표적세포는 조혈간세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 외부유전자를 고효율로 포유류 표적세포에 형질도입시키는 방법에 있어서, 외부유전자를 표적세포의 제2집단에 형질도입시키기 위해 선택된 외부유전자를 가지는 복제-결합 재조합 레트로바이러스 벡터를 생산하는 293 세포와 포유류 표적세포의 제2집단을 공배양시키고 따라서, 외부유전자가 효과적으로 형질도입된 표적 세포를 수득하는 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제40항에 있어서, 293 세포는 일시적으로 공형질 감염된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제40항에 있어서, 293 세포는 안정하게 형질 감염된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제40항에 있어서, 포유류 표적세포는 사람세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항에 있어서, 사람세포는 임파세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항에 있어서, 사람세포는 조혈간세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제40항에 있어서, 294세포는 : a) 복제-컴피턴트 헬퍼 바이러스의 생산없이 고역가에서 복제 인컴피턴트 레트로바이러스 벡터를 포장하고 복제-인컴피턴트 레트로바이러스 벡터를 패키지 할 수 있는 비리온 단백질을 생산하는데 요구되는 trans 모든 비리온 단백질을 인코드하는 복제-인컴퍼턴트 레트로바이러스 게놈에서 유도한 적어도 하나의 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열로 구성된 적어도 하나의 레트로바이러스 패키지 플라스미드와, 이때 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열은 바이러스의 바이러스성 5′ LTR의 고유 인헨서 그리고/또는 프로모터를 인코드하는 부분이 없고, 패키지 헬퍼 게놈과 3′ LTR에 역할을 하는 psi 기능서열이 없고 선택된 포유류 세포에서 외부 인헨서 그리고/또는 기능성 프로모터와 SV40 폴이아데닐화부분을 인코드하고; 그리고 b) 293 세포에서 외부유전자를 가지는 복제-결합 재조합 레트로바이러스 벡터를 생산하기 위해 외부유전자를 인코드하는 레트로바이러스 벡터로 일시적 공형질 감염시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 사람세포에서 고역가의 재조합 레트로바이러스를 생산하기 위한 레퍼트로바이러스 플라스미드에 있어서, 복제-컴피턴트 헬퍼 바이러스의 생산없이 고역가에서 복제 인컴피턴트 레트로바이러스 벡터를 포장하고 복제-인컴피턴트 레트로바이러스 벡터를 패키지 할수 있는 비리온 단백질을 생산하는데 요구되는 trans 모든 비리온 단백질을 인코드하는 복제-인컴피턴트 레트로바이러스 게놈에서 유도한 적어도 하나의 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열로 구성된 적어도 하나의 레트로바이러스 패키지 플라스미드이고 이때 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열은 바이러스의 바이러스성 5′ LTR의 고유 인헨서 그리고/또는 프로모터를 인코드하는 부분이 없고, 패키지 헬퍼 게놈과 3′ LTR에 역할을 하는 psi 기능서열이 없고 선택된 포유류 세포에서 외부 인헨서 그리고/또는 기능성 프로모터와 SV40 폴리아데닐화 부분을 인코드하는 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 플라스미드.
- 제47항에 있어서, 레트로바이러스는 백혈병 레트로바이러스인 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 플라스미드.
- 제48항에 있어서, 백혈병 바이러스는 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(MMLV), 기봉 아페 백혈병 바이러스(GALV)와 HIV 바이러스인 것을 특징으로 하는 플라스미드.
- 제49항에 있어서, 외부 인헨서는 사람 CMV 초기 인헨서이고 프로모터는 고유 MMLV 프로모터인 것을 특징으로 하는 플라스미드.
- 제49항에 있어서, 외부 인헨서와 프로모터는 사람 CMV 초기 인헨서와 프로모터인 것을 특징으로 하는 플라스미드.
- 제49항에 있어서, 외부 인헨서와 프로모터는 MMSV 인헨서와 프로모터인 것을 특징으로 하는 플라스미드.
- 제49항에 있어서, 레트로바이러스 패키지 플라스미드는 두 개 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 플라스미드.
- 제53항에 있어서, 외생 MMLV gag와 pol 단백질에 대한 제1헬퍼 서열코드와 env 단백질에 대한 제2헬퍼 서열코드는 이종향성, 양종양성, 외생, 다생 10A1 쥐 백혈병 바이러스, GALV, HIV, 소포구강 바이러스(VSV) G 단백질, 사람 T 세포 백혈병(HTLV) 타입 I와 II, env 단백질과 이들의 복합으로 구성된 집단에서 선택된 것을 특징으로 하는 플라스미드.
- 제47항 또는 54항에 따른 레트로바이러스 패키지 플라스미드로 안정하게 형질감염된 것을 특징으로 하는 세포.
- 제55항에 있어서, 사람세포로 구성된 것을 특징으로 하는 세포.
- 고효율로 포유류 세포에서 효과적으로 신속하게 일시적으로 복제-결핍 재조합 레트로바이러스를 생산하는 방법에 있어서, 바이러스를 생산할 수 있는 포유류 세포내로 유입시키고, 레트로바이러스 패키지 플라스미드와 레트로바이러스 벡터를 포함하는 포유류 세포는 감염을 위해 고역가의 레트로바이러스를 생산하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제57항에 있어서, 포유류 세포는 사람세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제58항에 있어서, 사람세포는 사람 배아 신장세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제59항에 있어서, 사람 배아 신장세포는 293세포(ATCC No. CRL1573)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제57항에 따른 방법에 의해 준비된 고역가에서 복제-결합 재조합 레트로바이러스를 생산하는 것을 특징으로 하는 형질도입된 세포.
- 제61항에 있어서, 사람세포로 구성된 것을 특징으로 하는 형질도입된 세포.
- 제62항에 있어서, 사람 배아 신장세포로 구성된 것을 특징으로 하는 형질도입된 세포.
- 제63항에 있어서, 293 세포(ATCC CRL1573)으로 구성된 것을 특징으로 하는 형질도입된 세포.
- pRTD4.2로 지정된 복제-결함 레트로바이러스벡터에 있어서, 5′→3′방향으로 5′ LTR의 U3부분을 MMSV의 U3 부분으로 대체된 부분과, MMLV의 Nar I까지 바이러스성 gag 서열과 레트로 바이러스성 단편 수용체와 3′MMLV LTR 부분으로 구성된 수정된 5′MMLV LTR 부분으로 구성된 것을 특징으로 하는 벡터.
- pRTD4.2로 지정된 복제-결함 레트로바이러스벡터에 있어서, 5′→3′방향으로 MMLV의 뉴클레오티드+1에서 +32(Kpn I)에 연결된 사람 CMV 프로모터와 뉴클레오티드 19(sac I)에서 +1을 인코드하는 올리고뉴클레오티드에 의해 MMLV R 부위에 융합된 사람 CMV 초기 인헨서/프로모터로 5′ LTR을 대체시키고, MMLV의 Nor I 부위까지 바이러스성 gag 서열과 레트로바이러스성 단편 수용제와 MMLV 3′ LTR 부분으로 구성된 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제66항에 따른 pRTD4.2 벡터의 변형으로 구성된 pRTD2.2SSVG로 지정된 복제-결함 레트로바이러스 벡터에 있어서, 벡터 pRTD2.2의 Sac I에서 Bst EII 단편은 벡터 LXSN의 Sac I 내지 Bst EII 단편으로 대체되는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 벡터.
- pIKT2.2로 지정된 복제-결함 레트로바이러스벡터에 있어서, 이 벡터는 SV40 T항원 폴리아데닐화 부위와 SV40 복제 원점으로 구성된 pIK1.1 벡터의 수정된 것으로 구성되고 이때 수정은 pIK1.1의 SacI와 Eco RI 사이에서 제66항에 따른 pRTD2.2 벡터의 5′ LTR의 3′ LTR 사이에 DNA 서열이 삽입된 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 벡터.
- pIKT2.2SVG로 지정한 복제-결함 레트로바이러스벡터에 있어서, 이는 SV40 T항원 폴리아데닐화 부위의 SV40 복제원점을 포함하는 pIKT1.1 벡터의 수정으로 구성되고 이때, pITK1.1의 Sac I와 Eco RI 부위 사이에 제67항에 따른 벡터 pPTD2.2SVG의 3′ LTR의 약 750bp에 위치한 Eco RI 부위의 3′ 단부와 사람 CMV 프로모터에서 Sac I 부위의 5′ 단부에 DNA삽입으로 구성된 것을 특징으로 하는 벡터.
- pIK1.1의 변형된 것으로 구성된 복제-결함 레트로바이러스벡터에 있어서, 제1레트로바이러스 벡터의 5′R 부분에서 제1레트로바이러스 벡터의 3′ LTR의 하류 제한효소 부위까지의 단편을 사람 CMV 초기 인헨서/프로모터의 하류와 SV40 복제원점과 SV40 폴리아데닐화 부위의 상류 pIK1.1 서열에 대체시키는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제70항에 있어서, 제1레트로바이러스성 벡터는 MMLV 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제69항에 있어서, 단편수용체는 프로모터, 인헨서, 인헨서/프로모터와 우성 콘트롤 부분에서 선택된 벡터의 전사 조절기소로 데체된 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제65, 66, 67, 68, 69 또는 72항에 있어서, 단편수용체의 하류에 삽입된 외부유전자를 인코드하는 DNA로 구성된 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제73항에 있어서, 외부유전자는 키메라 T세포 수용체인 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제74항에 있어서, 수용체는 CD4/제타 또는 단일-사슬 항체 사슬/제타 T세포 수용체인 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제73항에 따른 복제-결함성 레트로바이러스 벡터를 사용하는 방법에 있어서, 패키지 플라스미드와 레트로바이러스 벡터를 포유류 세포의 제1집단에 일시적으로 공형질감염 시킴으로써 바이러스를 생산할 수 있는 포유류 세포에서 패키지 가능한 게놈 레트로바이러스성 전사체를 다량 발현시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제76항의 방법에 따라 생산된 재조합 레트로바이러스를 생산하는 것을 특징으로 하는 포유류 세포.
- 제77항에 있어서, 포유류 세포는 사람세포인 것을 특징으로 하는 포유류 세포.
- 제78항에 있어서, 사람세포는 293 세포인 것을 특징으로 하는 포유류 세포.
- 제76항에 있어서, 표적세포에 외부유전자를 형질도입시키기 위해 표적세포의 제2집단과 포유류 세포의 제1집단을 공배양하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제80항에 있어서, 표적세포는 임파세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 90, 74로 지정되고 ATCC CRL 11654로 기탁된 것을 특징으로 하는 세포주.※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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