JP4385445B2 - 新規蛋白質 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、セラミドのスフィンゴシンと脂肪酸の酸アミド結合を加水分解する活性、即ち、セラミダーゼ活性を有する新規な蛋白質及びそれをコードする遺伝子に関する。
セラミダーゼはスフィンゴ脂質の代謝産物であるセラミドのスフィンゴシンと脂肪酸の酸アミド結合を加水分解し、スフィンゴシンと脂肪酸を生成させる酵素である。スフィンゴシンは生体膜に微量に存在するが、生体内では新生合成されず、その生成はすべてセラミダーゼに依存している。また、セラミダーゼにはその酵素活性の至適pHが酸性で、リソソームに局在する酸性セラミダーゼと、細胞質あるいは形質膜に存在し、中性またはアルカリ性域に至適pHをもつ中性・アルカリ性セラミダーゼがある。セラミド、スフィンゴシン、及びそのリン酸化物であるスフィンゴシン−1−リン酸は、細胞増殖、および分化、細胞死、特にアポトーシスを制御する情報分子であること、また神経細胞においては細胞の生命維持、突起伸張に不可欠であり、生体の機能維持に重要な役割を担っている物質である。
【0002】
【従来の技術】
セラミダーゼ活性を有する蛋白質は、ファーバー病患者に欠損している蛋白質として、ヒト尿より最初に単離された(Bernardo,K .ら、J.Biol.Chem.,270,11098−11102,1995)。この蛋白質は酵素活性の至適pHを酸性域に持つ酸性セラミダーゼであった。このアミノ酸配列をもとにヒト(Koch、J.ら、J.Biol.Chem.,271,33110−33115,1996)、及びマウス(Li,C−M.ら、Genomics,50,267−274,1998)からこの蛋白質をコードするcDNAがクローニングされている。
【0003】
また、モルモットの皮膚からはアルカリ性セラミダーゼ蛋白質が単離精製されている(Yada,Y.ら、J.Biol.Chem.,270,12677−12684,1995)。マウス肝臓からは中性域に至適pHを持つ中性セラミダーゼが単離、精製されており(谷 元洋ら:平成10年度日本生化学会)、そのcDNAもクローニングされている(谷 元洋ら:平成11年度日本生化学会発表予定)。さらに、ほ乳類以外では緑膿菌からアルカリ性セラミダーゼ蛋白質が単離、精製されており(Okino,N.ら、J.Bio.Chem.,273,14368−14373,1998)、そのcDNAもクローニングされている(沖野 望ら:平成10年度日本生化学会)。このセラミダーゼを産生する緑膿菌はアトピー性皮膚炎患者の皮膚から採取されたものであり、この場合、産生されたセラミダ―ゼやそれにより分解生成されたスフィンゴシンがアトピー性皮膚炎の症状を引き起こす原因の1つとなっていると考えられている。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規なセラミダーゼ及び、それをコードする遺伝子を提供することを目的としている。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ラット由来の細胞の摩砕懸濁上清に含まれるセラミダーゼ活性を有する蛋白質について検索を進めた結果、その腎臓細胞の摩砕懸濁上清より、従来報告されているセラミダーゼとは至適pHや生体内での存在状態が異なり、またアミノ酸配列においても、公知のセラミダーゼやそれ以外の蛋白質と一致しない蛋白質を見いだし、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、次の(A)又は(B)の性質を有する蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子、該遺伝子を有する組換えベクター、及び該組換えベクターにより形質転換された形質転換体を提供するものである。
(A)配列表の配列番号:5に記載のアミノ酸配列を有する。
(B)配列表の配列番号:5に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、セラミドのスフィンゴシンと脂肪酸の酸アミド結合を加水分解する活性を有する。
【0006】
【発明の実施の形態】
本発明の蛋白質及び該蛋白質をコードする遺伝子は、例えば次の様にして調製される。
先ず、(1)ラットの腎臓や心臓などの各臓器を摩砕した細胞懸濁液中で、セラミダーゼ蛋白を可溶化し、(2)可溶化された蛋白質の中から、セラミダーゼ活性を測定しながら、(3)セラミダーゼ蛋白質を分離、精製する。次に、(4)得られたセラミダーゼ蛋白質を酵素により消化し、それぞれのアミノ酸配列を解析し、(5)このアミノ酸配列を蛋白質およびDNAデータベースを検索し、既知のアミノ酸配列又は塩基配列との相同性を解析する。続いて、(6)このアミノ酸配列より、これをコードする塩基配列を推定し、その塩基配列と、共通にm−RNAの3' 末端に付加されるポリ−A配列をプライマーとしてPCRを行い、得られたDNA断片をプローブとし、ラットの腎臓などのcDNAライブラリーをスクリーニングして、目的とする塩基配列のcDNAを有するクローンを得て、このクローンの該cDNAの塩基配列を解析すればよい。また、(7)このcDNAを適当なプロモーターと共にベクターに組み込んだ組替えベクターを作成し、該ベクターで適当な宿主微生物を形質転換することにより形質転換体を作成する。
以下、本発明の蛋白質、遺伝子、組換えベクター及び形質転換体について更に詳細に説明する。
【0007】
(1)セラミダーゼ蛋白質の可溶化
ラットセラミダーゼはラットの生体膜中の成分であるので、腎臓、心臓、肝臓などの臓器や、皮膚組織などから得ることができる。これらの臓器の中では特に腎臓でセラミダーゼ活性が高いことから腎臓を用いることが好ましい。この臓器、あるいは組織を摩砕したのち、例えばA Practical Guideto Membrane Protein Purification,Gebhard von Jagow and Hermann Sehaegger,Academic Press,San Diego,1994の記載に準じて、遠心分離や、界面活性剤を用いて、セラミダーゼ蛋白質を可溶化する。
【0008】
(2)セラミダーゼ活性の測定
セラミダーゼ蛋白質の可溶化、精製工程では、各画分のセラミダーゼ活性を測定しながら行う必要がある。活性の測定は、公知の方法(谷ら、Anal.Biochem.,263,183−188,1998;光武ら、Anal.Biochem.,247,52−57,1997)を用いて放射線同位体、14Cなどや蛍光物質、NBD(7−nitrobenz−2−oxa−1,3−diazole)などでラベルされたセラミドを基質として用い、セラミダーゼ蛋白質画分の一部を一定時間反応させた後、その反応液中の基質と分解生成物をゲルろ過クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーなどを用いて分離する。セラミドのラベルはNBDを、分離は薄層クロマトグラフィーを用いるのが好ましい。残存した基質と分解生成物のそれぞれのラベル量を薄層クロマトスキャナーや、イメージングアナライザーを用いて測定することにより、測定しようとする画分中のセラミダーゼ活性を求めることができる。セラミダーゼ活性の単位は、1分間に1μmolの基質を分解するセラミダーゼの量を1Uと定義した。
【0009】
(3)セラミダーゼ蛋白質の精製
可溶化されたセラミダーゼ蛋白質は、公知の塩析法、溶媒沈殿法、透析法、限外濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、電気泳動法などを組み合わせて分離精製することができる。特に、DEAEセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、Cu2+キレーティングセファロースクロマトグラフィー、レクチンアフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、電気泳動法等の組み合わせが好ましい精製法である。また、電気泳動にかける画分の濃縮、脱塩には、セラミダーゼ蛋白質のように生体内での存在量が非常に少ない蛋白質の場合は、特にY字型ゲル(一ノ瀬ら:平成10年度日本生化学会)を用いるのが好ましい。
【0010】
(4)セラミダーゼ蛋白質のアミノ酸配列解析
精製されたセラミダーゼ蛋白質は、例えば細胞工学別冊8、新細胞工学実験プロトコール(監修・豊島久眞男、山本 雅)p.304−309,1993(秀潤社)に示されるようにIn Gel Digestion法により酵素消化を行う。消化に使われる蛋白質分解酵素はリジルエンドプロテアーゼ、V8プロテアーゼ、エンドプロテアーゼAsp−N、エンドプロテアーゼArg−C、トリプシン、キモトリプシンなどがあるが、これらのなかで基質特異性、安定性、界面活性剤の存在下での活性などの点から、リジルエンドペプチダーゼを用いるのが好ましい。消化して得られたモノまたはポリペプチドの分離法には、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー(逆相HPLC)、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、濾紙電気泳動法、キャピラリー電気泳動などがあるが、精度や再現性の点から特に逆相HPLCを用いるのが好ましい。分離されたペプチドはアミノ酸配列分析器を用いてそのアミノ酸配列を分析し、その結果を市販の解析ソフトを用いて解析し、配列を特定する。解析ソフトで解析不可能であった部分については解析者の目視による解析でまかなう。かくして得られるセラミダーゼ蛋白質の部分アミノ酸配列として、例えば配列番号:1〜3に示す配列を挙げることができる。
【0011】
(5)蛋白質およびDNAデータベースの検索
得られたアミノ酸配列について、既知のアミノ酸配列およびDNA配列のデータベース中に同一配列を含むものが存在するかどうか解析する。アミノ酸配列のデータベースには、例えばSWISS−PROT(European Bioinformatics Institute)や、NBRF(NationalBiomedical Research Foundation)などがあるが、SWISS−PROTを用いるのがが好ましい。またDNA配列のデータベースについては、アミノ酸配列をコードするDNAの相補鎖を含め両鎖について3フレーム、計6フレームについて検索する。これに用いるDNAデータベースとしては例えばGenBankやEMBL(European Molecular Biology Laboratory)が挙げられる。検索に用いるソフトは例えばGenetyx(ソフトウェア開発株式会社製)、IG−Suite、EUGENE、UWGCG、Bioresearch(富士通社製)等が用いられる。
【0012】
(6)セラミダーゼ蛋白質cDNAの単離とその塩基配列の決定
上記(4)で得られたアミノ酸配列からそれをコードする塩基配列を推定し、その塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをDNAシンセサイザーにより合成する。このオリゴヌクレオチドプライマーと、共通にm−RNAの3' 末端に付加されるポリ−A配列のアンチセンスであるポリ−T配列等の市販のプライマーを用いて、ラット腎臓等のcDNAライブラリーから得られたDNAを鋳型としてPCRを行う。得られたPCR産物(例えば、配列番号:7に示す塩基配列)をプローブとして同ライブラリーをスクリーニングし、cDNA全長を含むクローンを得る。このクローンについて、塩基配列を既知の方法で解析する。かくして得られるセラミダーゼ蛋白質及びそれをコードする遺伝子として、例えば配列番号:4に示す配列を有するものを挙げることができる。なお、配列番号:4のセラミダーゼ遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列を配列番号:5に示す。
【0013】
本発明の蛋白質は、配列番号:5に示すアミノ酸配列を有するものに制限されるものではなく、上記したセラミダーゼ活性を有するものであれば、配列番号:5のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものであってもよい。
また、本発明の遺伝子も、配列番号:4に示す塩基配列を有するものに制限されるものではなく、上記した蛋白質を構成し得るポリペプチドをコードするものであれば如何なる塩基配列であってもよい。
上記配列の改変は、それ自体既知の部位特異的変異誘発法等(例えばKunkel,T.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,82,488,1985、Deng,W.P.and Nickoloff,J.A.,Anal.Biochem.,200,81,1992)の記載に準じて行うことができる。
【0014】
(7)セラミダーゼ蛋白質cDNAを含む組換えベクター及びこの組換えベクターを保持する形質転換体の作成
前記(6)で述べたラット腎臓等のcDNAライブラリーからスクリーニングされ、目的とする塩基配列を含むクローンは、セラミダーゼ遺伝子の全長を有するプラスミドを保有している。このセラミダーゼ遺伝子またはこれを含むDNA断片は、これを適当な発現用ベクター、若しくは適当なベクターに適当なプロモーターとともに挿入して組換えベクターを作成し、この組換えベクターで適当な宿主微生物を形質転換したり、適当な培養細胞に導入して形質転換体を調整し、該形質転換体を適当な培地で培養することにより、発現させることができる。
【0015】
組換えベクターの作成に用いるベクターは、宿主微生物または培養細胞内で複製可能で、本発明の遺伝子またはそれを含むDNA断片が適当な宿主微生物形質転換体または培養細胞の遺伝子誘導株により発現されるものであれば特に制限はないが、通常宿主微生物または培養細胞に適したプロモ―ターが挿入されている市販の蛋白質発現用ベクターを用いる。またプラスミドベクター、ファージベクターともに使うことができる。
蛋白質発現用ベクターとしては、宿主微生物が大腸菌の場合では、例えばpET3、pET11(ストラタジーン社製)等が挙げられ、酵母の場合ではpESP−I expression vector(ストラタジーン社製)等が、昆虫細胞の場合では、例えばBacPAK6(クロンテック社製)等が用いられる。また動物細胞の場合では、ZAP Express(ストラタジーン社製)、pSVK3(アマシャムファルマシアバイオテク社製)等が挙げられる。
【0016】
本発明のセラミダーゼ遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、宿主微生物又は培養細胞が保有するプロモーターを一般に用いることができるが、これに限られるものではなく、具体的には宿主微生物が大腸菌の場合にはT3、T7プロモーター等を用いることができ、酵母の場合にはnmt1プロモーター、Gal1プロモーター等が挙げられる。また動物培養細胞の場合にはSV40プロモーター、CMVプロモーター等が挙げられる。また、ほ乳類由来のプロモーターが機能可能な宿主を用いる場合には、本発明のセラミダーゼ遺伝子に固有のプロモーターを用いることもできる。
これらのベクターへのセラミダーゼ遺伝子の挿入は、該遺伝子またはこれを含むDNA断片をベクター中のプロモーターの下流に該遺伝子のコーディング領域の5' 末端がフレームをあわせて連結されるようにして行う。
【0017】
かくして得られたセラミダーゼ組換え発現ベクターは、ヒートショック法(J.Mol.Biol.,53,154,1970)、リン酸カルシウム法(Science,221,551,1983)、DEAEデキストラン法(Science,215,166,1982)、電気パルス法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,81,7161,1984)、インビトロパッケージング法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,72,581,1975)、ウィルスベクター法(Cell,37,1053,1984)等によって宿主に導入され、形質転換体が作製される。
【0018】
このとき、セラミダーゼ遺伝子を導入する宿主としては、該遺伝子を含む発現ベクターが体内で複製可能であり、かつ該遺伝子がコードする蛋白質が生成されるものであれば特に限定されないが、例えば大腸菌、酵母、バキュロウィルス(節足動物多角体ウイルス)−昆虫細胞、動物培養細胞等が挙げられる。具体的には、大腸菌ではBL21(ストラタジーン社製)等、酵母では例えばSP−Q01(ストラタジーン社製)等、バキュロウィルスでは例えばAcNPV(J.Biol.Chem.,263,7406,1988)とその宿主であるSf−9(J.Biol.Chem.,263,7406,1988)等が挙げられる。また動物細胞としてはマウス繊維芽細胞C127(J.Viol.,26,291,1978)やチャイニーズハムスター卵巣細胞CHO(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216,1980)やアフリカミドリザル腎臓由来のCOS細胞(ATCC:アメリカン タイプ カルチャー コレクション)等が挙げられる。
【0019】
上記したような発現ベクターを用いた発現方法の他に、プロモーターを連結したセラミダーゼ遺伝子を含むDNA断片を宿主微生物の染色体中に直接挿入する相同組換え技術(A.A.Vertes,et al.,Biosci.Biotechnol.Biochem.,57,2036,1993)、あるいはトランスポゾンや挿入配列(A.A.Vertes,et al.,Molecular Microbiol.,11,739,1994)等を用いて発現させることができる。
得られた形質転換体は、それぞれに適した培地により培養される。培地中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物、ビタミン、血清および耐性スクリーニングに用いられる薬剤などが含有される。具体的には、形質転換体の宿主が大腸菌の場合には、例えばLB培地(日水製薬)等、酵母の場合には、例えばYPD培地(Genetic Engineering,1,117,Plenum Press,1979)等、宿主が昆虫細胞および動物細胞の場合は、例えば20%以下のウシ胎児血清を含有するMEM培地、DMEM培地、RPMI1640培地(日水製薬)等を挙げることができる。形質転換体の培養は、通常、温度20℃〜45℃、pHは5〜8の範囲で行われ、必要に応じて通気、攪拌が行われる。これら以外の培地組成あるいは培養条件下でも形質転換体が生育し、挿入された遺伝子がコードする蛋白質が生成されれば如何なるものであってもよい。
【0020】
このようにして得られた形質転換体の培養上清、あるいは形質転換体、又は遺伝子導入細胞を破壊して得た蛋白質を、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動等で分離し、適当な蛋白質の検出法、例えばCBB(シグマ社製)等の色素で染色することによりセラミダーゼ蛋白質の生成が確認できる。この形質転換体の培養物から、前記したセラミダーゼ蛋白質の分離、精製法に準じた方法により、本発明の蛋白質を取得することができる。
【0021】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。
実施例1
1.ラットセラミダーゼ蛋白質の可溶化
ラット53匹の腎臓(計106個、141g)を0.25mM蔗糖、1mM
EDTAを含む溶液、300mlの中で摩砕し、その摩砕懸濁液を600×gで5分間遠心し、核画分を沈殿させた。この上清をさらに27,000×gで30分遠心した後、沈殿に10mMリン酸Na緩衝液(pH7.0、1%TritonX−100、1%Tween20)200mlを加え、氷冷しながら摩砕した。氷上で2時間放置した後、さらに、超音波粉砕を2分間ずつ、3回行った。この懸濁液をさらに粉砕し、105,000×gで1時間遠心した。
【0022】
2.セラミダーゼ活性の測定
基質としてNBD(和光純薬社製)でラベルしたC12−NBDセラミドを用いた。C12−NBDセラミド500pmol/(25mM Tris−HCl(pH7.5)0.25%TritonX−100)、20μlと各セラミダーゼ蛋白質を含む溶液の1部を37℃で30分間反応させた。クロロフォルム/メタノール(2:1、v/v)100μlを加え反応を止めた後、この反応混合液を真空遠心濃縮器(サヴァント社製)を用いて乾燥させ、再びクロロフォルム/メタノール(2:1、v/v)15μlに溶解した。これを薄層クロマトプレート(メルク社製)にスポッティングし、展開液(クロロフォルム/メタノール/25%アンモニア(90:20:0.5、v/v/v))で展開した。これをTLCクロマトスキャナー(島津製作所社製:CS−9300)を用いて、エキサイテーション470nm、エミッション525nmで残存した基質と分解生成物のラベル量を測定し、セラミダーゼ活性をユニット数で表した。上記1で得られたラット腎臓細胞の可溶化懸濁液中のセラミダーゼ活性は総量で1.1Uであった。
【0023】
3.ラットセラミダーゼ蛋白質の精製
(1)陰イオン交換クロマトフラフィーによる精製
上記1で得られた上清をあらかじめ緩衝液A(20mMリン酸Na緩衝液(pH7.0)0.1%Lubrol−PX)で平衡化しておいたDEAE−セファロースFF(アマシャムファルマシアバイオテク社製:カラムサイズ内径3.0cm、高さ25cm)に添加した。緩衝液Aで未吸着物質を洗浄後、1M NaClによる直接濃度勾配(全量440ml)で吸着物を溶出し、これをDEAE−セファロース溶出液とした。この溶出液中のセラミダーゼ活性を前記2の方法で確認した。
【0024】
(2)疎水性クロマトグラフィーによる精製
DEAE−セファロース溶出液を、あらかじめ緩衝液20mM Tris−HCl(pH7.5)2M NaClで平衡化したフェニル−セファロース6FF(アマシャムファルマシアバイオテク社製:カラムサイズ内径3.0cm、高さ12cm)に添加した。同緩衝液でカラムを洗浄後、20mM Tris−HCl(pH7.5)1%Lubrol−PX緩衝液、910mlでNaCl濃度0%に下げて溶出し、フェニル−セファロース溶出液とした。このフェニル−セファロース溶出液中のセラミダーゼ活性を前記2の方法で確認した。
【0025】
(3)アフィニティクロマトグラフィーによる精製
フェニル−セファロース溶出液をB緩衝液(20mM Tris−HCl(pH7.5)0.1%Lubrol−PX)で平衡化したCu2+でキレートしたキレーティング−セファロースFF(アマシャムファルマシアバイオテク社製:カラムサイズ内径1.5cm、高さ15cm)に添加した。B緩衝液でカラムを洗浄後、セラミダーゼ活性成分は2M NH4 Clを加えたB緩衝液170mlで溶出した。このキレーティング−セファロース溶出液中のセラミダーゼ活性を同様の方法で測定したところ860mUであった。
【0026】
(4)アフィニティークロマトグラフィーによる精製
キレーティング−セファロース溶出液を緩衝液(20mM Tris−HCl(pH7.5)1mM MnCl2 、1mM CaCl2 、0.5M NaCl)で平衡化したレクチン−アフィニティクロマトグラフィー(アマシャムファルマシアバイオテク社製:ハイトラップ レンチル レクチン、1ml)に添加した。同緩衝液でカラムを洗浄後、20mM Tris−HCl(pH7.5)0.5M methyl−α−D−glucosideで吸着物を溶出した。この溶出液中のセラミダーゼ活性を同様の方法で測定したところ148mUであった。
【0027】
(5)ゲル濾過クロマトグラフィーによる精製
レクチン−アフィニティクロマトグラフィー溶出液をゲル濾過カラム(アマシャムファルマシアバイオテク社製:HiLoad 16/60 Superdex 200pg)に添加し、20mM Tris−HCl(pH7.5)0.15M NaCl、0.3%Lubrol−PX緩衝液により流速0.8ml/minで溶出した。各画分についてセラミダーゼ活性を同様にして測定したところ91.7mUであった。これをセラミダーゼ蛋白質粗精製標品とした。
【0028】
(6)分子量測定
同じゲル濾過カラムに、蛋白質のサイズマーカーを添加し、同条件で溶出された蛋白質のサイズと溶出時間との検量線を引いた。この結果をもとに、セラミダーゼ蛋白が含まれる画分の平均分子量を求めたところ約200kDaであった。
【0029】
(7)SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による精製度の確認
このセラミダーゼ蛋白質粗精製標品を2−メルカプトエタノール還元下SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)にかけたところ、多くのバンドがみられたが、目的のセラミダーゼ蛋白質は他のバンドと区別できるバンドとして確認できた。そこで、さらに分離、精製するためにSDS−ポリアクリルアミドゲルからの切り出し法を利用することとした。
【0030】
(8)濃縮、脱塩
SDS−ポリアクリルアミドゲルにロードするために、以下の要領で濃縮と脱塩を行った。
ロート型ゲル(W.Staudemann.et al.Sample handling for proteome analysis,Electrophoresis,19,901−908,1998)を一部変更したY字型ゲル(一ノ瀬ら;平成10年度日本生化学会発表)により上記(5)で得られたセラミダーゼ蛋白質粗精製標品を電気泳動した後、蛋白が濃縮された部分のゲルをかみそりを用いて切り出した。切り出したゲルはサンプリングチューブ(1.5ml)に移し、SDS―PAGEの試料用緩衝液(17.5%Glycerol、31.3mM Tris−HCl(pH6.8)、2.5%beta−mercaptoethanol、1.5%SDS)60μlを加え、マイクロ乳棒を用いて摩砕した。
【0031】
(9)セラミダーゼの分離、取得
上記摩砕液を、濃縮ゲル厚3mm、分離ゲル厚1mmのSDS―ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色し、セラミダーゼ蛋白質のバンドをかみそりを用いて切り取った。
【0032】
実施例2
1.アミノ酸配列分析
(1)酵素消化
切り取ったゲルをサンプリングチューブ(1.5ml)に入れ、これに25%イソプロパノール、1.0mlを加え、室温で30分間振とう攪拌した。上清を捨て、さらに25%イソプロパノール、1.0mlを加え、室温で30分間振とう攪拌した。上清を捨て、100mM Tris−HCl緩衝液(pH9.0)、0.5ml加え、室温で15分間振とう攪拌した。これをもう1度繰り返した後、上清を捨てた。蛋白質消化酵素(和光純薬社製:リジルエンドプロテアーゼAP−1)を0.2μg加え、100mM Tris−HCl緩衝液(pH9.0)をゲルが浸るほど加えた。マイクロ乳棒でゲルを摩砕した後、一晩37℃で激しく振とう攪拌した。
【0033】
(2)ペプチドの溶出
酵素消化した反応液を遠心(16,000rpm、10分間)し、上清を集めた。これを上清1とした。沈殿に100mM Tris−HCl緩衝液(pH9.0)、0.1ml加え、37℃で20分間振とう攪拌した後、遠心(16,000rpm、10分間)し、上清を集めた。これを上清2とした。沈殿に60%アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸、0.1ml加え37℃で20分間振とう攪拌した後、遠心(16,000rpm、10分間)し、上清を集めた。これを上清3とした。さらに沈殿に60%アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸、0.02%Tween20を0.1ml加え37℃で20分間振とう攪拌した後、遠心(16,000rpm、10分間)し、上清を集め、これを上清4とした。集めた上清1〜4は再度遠心(16,000rpm、10分間)した後、真空遠心濃縮器(イワキガラス社製:VEC−50)で0.1mlまで濃縮した。
【0034】
(3)逆相HPLCによる分離
0.1%トリフルオロ酢酸/H2 O(v/v%)で平衡化したC8 RP−300カラム(PEアプライドバイオシステムズ社製:内径1mm、長さ100mm)に上記濃縮ペプチド溶液を添加し、0.1%トリフルオロ酢酸を含む、0%から70%へのアセトニトリルの濃度勾配により溶出を行った。流速は0.05ml/min、カラム温度は35℃で行った。波長215nmの吸光度を測定し、ポリペプチドを含む各画分をアミノ酸配列分析の試料とした。
【0035】
(4)アミノ酸配列分析
上記HPLCで得た各ポリペプチド画分を、アミノ酸配列分析装置(PEアプライドバイオシステムズ社製:Procise cLC492)、分析用プログラム(PEアプライドバイオシステムズ社製:610A)を用いて、アミノ酸配列を分析した。その結果を配列表の配列番号:1〜3に示す。
2.データベース解析
得られた配列番号:1〜3に示したアミノ酸配列を、蛋白質データベース(SWISS−PROT)、DNAデータベース(GenBank)に対し、検索ソフト(Genetyx、ソフトウェア開発株式会社)を用いて解析した結果、いずれもデータベース中に登録されていなかった。
【0036】
実施例3 cDNAクローニング
1.ラットセラミダーゼDNAプローブ作成
(1)PCRプライマー作成
配列番号:3のアミノ酸配列の1部をコードするオリゴヌクレオチド(配列番号:6)をDNAシンセサイザー(PEアプライドバイオシステムズ社製:381A)を用いて合成した。
【0037】
(2)PCRとPCR産物の解析
ラット腎臓cDNAライブラリー(宝酒造社製)から得たDNA10ngを鋳型とし、上記オリゴヌクレオチド(配列番号:6)10pmolと、共通にm−RNAの3’末端に付加されるポリ−A配列のアンチセンスであるポリ−T配列(アマシャムファルマシアバイオテク社製:NotI−d(T)18プライマー)10pmolをプライマーとして用いてPCRを行った。DNA合成酵素はアンプリタックゴールド(パーキンエルマー社製)を用いた。
【0038】
上記PCRで539bpのDNA断片を得た。このPCR反応混合液を1 %アガロースゲル中で電気泳動し、ゲルから上記539bpのDNA断片のバンドを切り出し、セファグラスバンドプレップキット(アマシャムファルマシアバイオテク社製)を用いてDNA断片を抽出した。得られたDNA断片はTA−クローニングキット(プロメガ社製)を用いてpGEMT−Easyベクター(プロメガ社製)にライゲーシヨンした。これを大腸菌JM109(宝酒造社製)にコールドショック法を用いて形質転換し、目的のDNA断片が挿入されているクローンをBlue−Whiteセレクションにより選択した。得られたプラスミドはM13シーケンスプライマー及びM13リバースシーケンスプライマー(パーキンエルマー社製)を用いたPCRによって反応させ、オートDNAシークエンサー(PEアプライドバイオシステムズ社製:プリズム377)を用いて塩基配列を決定した。この配列を配列表の配列番号:7に示す。この配列番号:7のDNA断片をcDNAライブラリーのスクリーニング用のプローブとして用いた。
【0039】
2.ラット腎臓cDNAライブラリーからのセラミダーゼcDNAのスクリーニング
ラット腎臓cDNAライブラリー(宝酒造社製)から上記1.(2)で得られたDNA断片(配列番号:7)をプローブとして、クローンキャプチャー(クロンテック社製)を用いて、目的遺伝子を含むプラスミドの濃縮を行った。この濃縮したプラスミドを大腸菌DH5α(宝酒造社製)にエレクトロポレーター(バイオラッド社製:ジーンパルサー)を用いて電気的に形質転換を行った。この形質転換体を100μg/mlのアンピシリン(ナカライ社製)を含むLB培地(日水製薬)プレートにまいた。1.(2)で得られたDNA断片(配列番号:7)をランダムプライミングキット(アマシャムファルマシアバイオテク社製:Ready to go)を用いて[32P]−dCTPで標識し、これをプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行った。得られた目的遺伝子を含むクローンは約2.5kbのDNAが挿入されていた。このプラスミドに挿入された塩基配列をT3およびT7シーケンスプライマー(パーキンエルマー社製)を用いたPCRによって反応させ、DNAシークエンサー(PEアプライドバイオシステムズ社製:プリズム377)を用いて塩基配列を決定した。この塩基配列には一つの大きなオープンリーディングフレーム(ORF)が存在しており、セラミダーゼ蛋白質のコーディング領域の配列が全て含まれていることが確認できた。この配列を配列番号:4に示す。
【0040】
【発明の効果】
セラミダーゼ蛋白質はヒト、マウスおよび緑膿菌より単離、同定されているが、その活性至適pHの違いや、アミノ酸配列の相同性の低さ等からさまざまな種類が存在すると考えられている。このセラミダーゼ活性を、研究、医療などに有効に利用するためにはその活性の作用機構についての研究が必須である。しかし、生体内ではセラミダーゼは膜に微量に存在するのみでその解析は非常に困難であった。本発明の新規蛋白質は公知のセラミダーゼとはその至適pHや生体内での存在状態(可溶化されにくい)が異なることから、この蛋白質に特異の性質を利用することにより、より有利に産業に利用できる可能性がある。また本発明においてこの蛋白質の遺伝子を同定し、大量に合成できるようになったことで本蛋白質の解析が非常に容易となった。また本蛋白質はスフィンゴシンの産生系及びそれを介したシグナル伝達系の研究に有用であるとともに、癌をはじめとする細胞増殖異常による疾患治療薬、脳・神経系疾患治療薬への利用が期待できる。また、ファーバー病のようなスフィンゴ脂質代謝異常疾患への遺伝子治療にも利用可能である。
【0041】
【配列表】
Claims (5)
- 次の(A)又は(B)の性質を有する蛋白質。
(A)配列表の配列番号:5に記載のアミノ酸配列を有する。
(B)配列表の配列番号:5に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、セラミドのスフィンゴシンと脂肪酸の酸アミド結合を加水分解する活性を有する。 - 請求項1に記載の蛋白質をコードする遺伝子。
- 遺伝子が、配列表の配列番号:4に示す塩基配列を有するものである請求項2に記載の遺伝子。
- 請求項2又は3に記載の遺伝子を有する組換えベクター。
- 請求項4に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
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