JP4381618B2 - 神経保護作用を有するオウゴン抽出物及びこれを含む薬剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、神経保護作用を有するオウゴン(Scutellariae Radix)抽出物及び有効成分として前記オウゴンを含む脳疾患の予防及び治療のための使用に適した薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
漢方薬(oriental medicine)において薬剤に用いられるオウゴンは、シソ科に属する多年草であるゴガネバナ(Scutellatia baicalensis Georgi)の根の表皮を剥ぎ乾燥させることによって得られる。オウゴンは、ウゴニン(wogonin)、バイカリン(baicalin)及びバイカレイン(baicalein)のような様々なフラボノイドを含むことが知られている。
【０００３】
漢方薬では、湿熱除去(wet-heat removal)、止血(hemostasis)、及び胎児の安定(fetus settlement)のために植物を通常使用している。近年では、抗バクテリア作用、抗炎症作用（ミチノリ・クボら、Chem. Pharm. Bull.、32(7)、1984）、抗アレルギー作用、胆汁分泌促進作用、肝臓保護作用、利尿、高脂血症治療、腸運動阻害作用、及び抗癌作用（ステート・アドミニストレーション・オブ・トラディショナル・チャイニーズ・メディスン(State Administration of Traditional Chinese Medicine)；中国薬局方(Chinese Pharmacopoeia)、上海、上海サイエンス・アンド・テクノロジー・プレス(Shanghai Science & Technology Press)、1998、1682-1694頁）のような様々な効能が、新たに開示されている。臨床的には、オウゴンは、高血圧症(hypertension)、流行性脳脊髄膜炎(epidemic cerebro-spinal meningitis)、弱い麻痺(mild paralysis)等の治療のための様々な処方において使用されている（キム(Kim)ら、プレスクリプション(Prescription)、ヤング・リム・パブリケーションズ、ソウル、1990、111-113頁、263-264頁、338頁）。例えば、オウゴンは、有害な効果に対抗するための頓服水剤中のオウレン系(Coptidis Rhizoma-based)薬剤、肝臓の機能を活性化する頓服水剤(draught)であるホリバリンドウ系 (Gentiana Scabra Bunge. Var. buergeri Max.-based)薬剤、心臓を活性化するためのオキシベンゾール系(ox benzoar-based)丸薬、並びに麻痺を治療するための頓服水剤であるオステリカム・コレアナム(Maximowz)キタガワ系(Ostericum Koreanum (Maximowz) Kitagawa-based)薬剤、及び突発性心臓疾患を防ぐためのオキシベンゾール系丸薬中に含まれる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
本発明において、麻痺の治療のための頓服水剤であるオステリカム・コレアナム(Maximowz)キタガワ系(Ostericum Koreanum (Maximowz) Kitagawa-based)薬剤及び突発性心臓疾患を防ぐためのオキシベンゾール(ox benzoar-based)系丸薬の主成分であるオウゴンの、神経細胞の損傷に対する保護作用を試験する。これまでは、麻痺を初期段階で治療するために効果的な化学的薬剤は開発されていなかった。
【０００５】
大量のデータが蓄積されている初期段階の麻痺に対する効果的な治療を漢方薬に基づいて提供するために、本発明者らは、初期段階の麻痺に対するオウゴンの薬効及びその治癒機構について徹底的な調査を行い、最終的に、オウゴン抽出物が神経細胞の損傷に対する保護作用を有することを見出した。
【０００６】
そこで、本発明の第一の目的は、神経保護作用を示すオウゴン抽出物を提供することである。
本発明の第二の目的は、神経細胞の損傷に関連する脳疾患の予防及び治療に対する効能を有する薬剤を提供することである。
【０００７】
本発明の第一の態様によれば、水、低級アルコール、及びそれらの混合物から選択される抽出溶媒中へ胚盤を浸漬し、得られた抽出溶媒を濃縮し、得られた濃縮物を凍結乾燥することによって調製される神経保護作用を有するオウゴンが提供される。
【０００８】
本発明の第二の態様によれば、水、低級アルコール、及びそれらの混合物から選択される抽出溶媒中へオウゴンを浸漬し、得られた抽出溶媒を濃縮し、得られた濃縮物を凍結乾燥することによって調製されたオウゴン抽出物を有効成分として薬学適用可能な基剤とともに含む神経保護作用を有する薬剤が提供される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
プルシネリ(Pulsinelli)によって１９７９年に開発された４-血管閉塞モデル(4-vessel occlusion model)において、麻痺に対するオウゴンの効能を試験した。前脳虚血の動物モデルを表すこのモデルにおいて、ラットの脳へ血液を供給する血管が一時的にふさがれ、そして再度灌流されることにより、海馬(hippocampus)領域における神経細胞の損傷が引き起こされる。神経細胞の損傷は、自然の細胞壊死であり、アポプトシス過程(apoptotic pathway)から進行する。このモデルにおいて効能を有する薬剤は、ヒトの麻痺のような局所的な虚血を患っている全ての動物モデルに対して治癒効果を発揮することが知られている。実際に、それらの薬剤は、臨床的に有用である可能性を示している。虚血性神経細胞損傷の研究のためには、完全な前脳虚血を患う動物モデルよりも４-血管閉塞によって引き起こされる前脳虚血を患う動物モデルが好ましい。なぜなら、後脳における血流は、４-血管閉塞の場合は影響を受けないので、この研究における呼吸及び全身血液循環の影響が除外されるからである。
【００１０】
本発明において、大脳虚血によって引き起こされる神経細胞の損傷に対するオウゴンの保護効果を説明する。このために、オウゴン抽出物を大脳虚血の発生直後に注射し、注射の１週間後に、海馬のＣＡ１サブフィールド(subfield)において生存している神経細胞数を計測し、オウゴンが神経細胞のアポプトシスにより引き起こされる麻痺の治療のために有効であるか否かを確認する。更に、その神経保護機構を調べるために、オウゴンの抗酸化作用を試験した。ここでは、抗酸化作用を調べるため、ＰＣ１２細胞系を培養し、過酸化水素によって酸化することにより損傷させてインビボで(in vivo)観察する。このモデルにおいて、細胞損傷は、アポプトシス過程において役割を担うカスパゼ(caspase)群の導入と関連することが知られているため、免疫組織化学は、オウゴンがカスパゼ群の酵素反応において主要な役割を果たすカスパゼ３(cpp32)の誘発に対する阻害効果を有するか否かを確認するために使用される。
【００１１】
このような実験において使用するために、溶媒抽出を用いてオウゴンから抽出物を得る。この抽出に適当な溶媒として、水、低級アルコール及びそれらの混合物を使用することができる。低級アルコールの例としては、メタノール、エタノール、ｎ-プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ-ブチルアルコール及びｔ-ブチルアルコールが挙げられ、中でもメタノール及びエタノールが好ましい。抽出物を得るためにオウゴンを溶媒中に浸漬し、その抽出物を濾過して濃縮し、次いで凍結乾燥する。
【００１２】
本発明は、以下に示す明確に説明された実施例により、更に理解され得るが、これにより本発明が限定されるものではない。
【００１３】
【実施例】
実施例１
オウゴン抽出物の調製
乾燥オウゴン３ｋｇを、７０％エタノール水溶液中で１５分間３回超音波処理した。これらを混合した後、抽出物を濾過して真空下で濃縮し、次いで濃縮物を凍結乾燥し、凍結乾燥抽出物１６０ｇを得た。
【００１４】
実施例２
乾燥オウゴン３ｋｇを、蒸留水中で１５分間３回超音波処理した。これらを混合した後、抽出物を濾過して真空下で濃縮し、次いで濃縮物を凍結乾燥し、凍結乾燥抽出物１５０ｇを得た。
【００１５】
実施例３
乾燥オウゴン３ｋｇを、特級エタノール中で１５分間３回超音波処理した。これらを混合した後、抽出物を濾過して真空下で濃縮し、次いで濃縮物を真空乾燥し、乾燥抽出物１４５０ｇを得た。
【００１６】
実験例
実験動物
体重約１７０ｇの生後５週の雌のウイスター・ホワイト・ラット(Wister white rats)（ＳＬＣ、日本）を、試験前に１週間、食料及び水を十分に与えて実験環境に適応させた。
【００１７】
原料
試験前に、韓国慶煕大学校漢医科大学本草学研究室(the Laboratory of Herbology, College of Oriental Medicine, Kyung Hee University, Korea)によってオウゴンの証明を受けた。
【００１８】
虚血の誘発
ウイスター・ラットを、麻酔を投与した後に尾を装置の水平ダイ(die)上に３０°の角度で下向きに固定し、麻酔器(オーアメダ(Ohameda) V.M.C./Boc Health Care、シプレーン(Cyprane)、英国)につなげられたプラスチックコーンを鼻と口にはめ、脳定位固定装置上に仰向けに寝かせた。５％のイソフルラン(isoflurane)を含有する窒素と酸素との混合気体（Ｎ2７０％及びＯ2３０％）を用いて麻酔を行い、その後イソフルラン含有量を１．５％に維持した。
【００１９】
頚椎を伸ばした状態で、尾を手術台の上に固定した。まず、咽喉部位を切開した。その後、虚血を引き起こすために、再灌流を行うことができるように設計して総頚動脈にシリコンチューブでリングを作った。虚血誘発時に毛細血管を通る血液循環を遮断するために、糸上に頸部及び脊髄傍筋肉が位置し、気管、食道、外部頸静脈、及び総頚動脈の前を通るように、ラットの体に糸を通し、その後切開部を手術用クリップで縫合した。
【００２０】
次いで、後頭骨部を手術するためにラットをうつ伏せにした。手術用拡大鏡を用いて後頭骨の下の第一頚椎部を手術した。１ｍｍ以下のサイズの微小な電気焼灼針を、筋肉を損傷しないように注意しながら翼状孔(alar foramina)に近づけ、第一頚椎の翼状孔へ通して頚静脈が流れるトンネルへ挿入した。針から断続的に電流を流して頚静脈を電気焼灼した。手術用顕微鏡を用いて脊椎中のトンネルを流れる頚静脈の完全な電気焼灼及び閉塞を確認した後、手術用クリップを用いて縫合を行った。２４時間後に手術用クリップを取り除いた。次いで、総頚動脈を動脈瘤(aneurysm)クリップを用いて１０分間閉じて虚血を引き起こした。軽い反射行動が１分以内に消えた場合には、頸部を更にきつく縫合した。きつく縫合したにもかかわらず軽い反射行動が消えなかったラットは、ＣＡ１神経細胞の反対側に完全な平行損傷(parallel damage)を受けたと判断されるので、実験から除外した。痙攣を起こしたものも除外した。１０分後に総頚動脈から動脈瘤クリップを取り除き、次いで動脈を再灌流させた。再灌流後に意識を失っている時間が２０±５分であったラットのみを選んで更に研究を行った。
【００２１】
虚血誘発後、３０分間隔で６時間に渡りラットの体温を測定した。一つの態様では、体温が低下した場合に体温の調整を行わずに体温変化を記録した。もう一つの態様では、神経細胞における低体温に起因する保護効果を取り除くために、体温低下を阻止した。この場合には、直腸の温度を利用することができる自動温度調節機を用いて、虚血誘発、再灌流及び回復期間の間、ラットの体温を３７±０．５℃に維持した。直腸温度は脳温度を反映するので、直腸中に少なくとも６ｃｍの長さで挿入したプローブを用いて体温を測定した（ミヤザワ(Miyazawa) Tら、J. Cereb Blood Flow Metab 1992: 12: 817-822）。
【００２２】
本草試料の投与及び実験グループの選択
ラットにおける前脳虚血に対するオウゴンの効能を測定するために、本草抽出物を様々な投与量でラットに投与した。抽出物の投与は、前脳虚血の誘発直後（０分後）及び９０分後に行った。上記の実施例で調製されたオウゴン抽出物を、０．８９％食塩水に溶解し、体重１ｋｇ当たりの成分量が２５０ｍｇ、５００ｍｇ及び１，０００ｍｇとなる濃度としてそれぞれ同体積で腹膜注射した。擬似グループ (mock group)として、第一グループにも同じ方法で外科手術を行ったが、前脳虚血は誘発されなかった。対照グループとして用いた第二グループに対して、同じ方法で、前記グループでの前脳虚血誘発後の本草抽出物の投与と同様の時間間隔で、生理食塩水を２．０ｍｌ／ｋｇの投与量で腹膜注射した。前脳虚血の誘発直後（０分）及び９０分後に、第３、第４及び第５グループそれぞれへ、２５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ及び１，０００ｍｇ／ｋｇの投与量を腹膜注射した。
【００２３】
組織試験品の調製
前脳虚血誘発の一週間後、クロラール水和物(chloral hydrate)（３５．０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を用いてラットを麻痺させ、それらの胸を切開した。右心房を切り開き、左心室へシリンジを慎重に挿入し、その後ヘパリン処理された(heparinized)０．５％硝酸ナトリウム含有生理食塩水を心臓へゆっくりではあるが絶え間なく灌流させ、次いで４．０％ホルマリン固定剤を心臓へ灌流させた。その後、脳を除去し０．１Ｍリン酸緩衝ホルマリン固定剤中で２時間、後固定(postfixation)を行った後、４℃で一晩３０％ショ糖を注入した。固定された脳から、ブレグマ点(bregma point)から−２．５ｍｍ〜―４．０ｍｍの間に広がる背部海馬(dorsal hippocampus)の冠状塊(coronal block)を調製した。次いで、スライドミクロトーム(sliding microtome)を用いて冠状塊を凍結切断した(cryosectioned)。３０μｍの厚さを有する海馬組織断片を収集して試料を調製した。
【００２４】
損傷神経細胞の観察
背部海馬を含む組織断片をクレシルバイオレット(cresyl violet)を用いて着色して固定した後、背部海馬のＣＡ１における遅延性神経死(delayed neuronal death)の影響を最も受け易い１，０００μｍの長さの中間領域において神経細胞数を計測した（クレイン(Crain) B.J.ら、ニューロサイエンス(Neuroscience) 1988; 27; 387-402）。３人の異なる観察者によって、２５０倍の倍率で、脳組織の３つの異なる部位の左側と右側において、即ち、合計６箇所において、正常な形状 (morphology)の角錐状細胞数の平均を求めることによって神経細胞を測定した。
【００２５】
ＰＣ１２細胞の培養及び抗酸化作用の測定
それぞれのウェルが１％ペニシリン-ストレプトマイシン（ギブコＢＲＬ、米国）及び１０％ウシ胎児血清（ギブコＢＲＬ、米国）が添加されたＤＭＥＭ（ダルベッコ変形イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle Medium)、ギブコＢＲＬ、米国）を含む９６-ウェルプレートにおいて、韓国細胞系銀行(Korean Cell Line Bank)により購入したＰＣ１２細胞（ラット褐色細胞腫系）をインキュベーターにおいて３７℃で一晩、ウェル当たり３×１０4個(3×104 cells/well)の細胞密度で培養した。オウゴン抽出物を１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、シグマ(Sigma)、米国）溶液を含むＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝食塩水(Dulbecco's phosphate buffered saline)、シグマ、米国）中で溶解し、この抽出物を１０．０、２５．０、５０．０及び１００．０μｇ／ｍｌの最終濃度で含む溶液を得た。これらの溶液を用いて細胞を３時間前処理した。比較のため、同体積の１０％ＤＭＳＯ含有ＤＰＢＳ溶液をコントロールとして加えた。培地において、ＤＭＳＯは、最終濃度０．５％で培地中に含有された。前処理の３時間後に、抽出物を添加した培地を０．５ｍＭのＨ2Ｏ2を含む新しい培地と交換し、３７℃において２４時間インキュベートした。
【００２６】
ＬＤＨ（ラクトース脱水素酵素）活性を分析するために、培地３０μｌを新しい９６-ウェルプレートのそれぞれのウェルに移し、その後そのウェルに０．７５ｍＭのピルビン酸塩及び１．４ｍＭのＮＡＤＨを含む溶液３０μｌを添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、着色溶液（２，４-ジニトロフェニルヒドラジン(2,4-dinitrophenylhydrazine)、ヨンドン(Young Dong)、韓国）を培地と反応させ、０．４ＮのＮａＯＨによって塩基性にして発色させ、マイクロプレートリーダー(microplate reader)において４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。細胞が完全に溶解するまでの測定値を、１０％のトリトンを最終濃度０．１％で添加したウェルにおいて測定した吸光度を基準として百分率として表した。重要な試験のために、測定値を１０％ＤＭＳＯ溶液を含有するＤＰＢＳが添加されたコントロールの測定値と比較した。９６-ウェルプレートにおける各ウェル上の細胞を、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度のＭＴＴ１５０．０μｌによって３７℃において４時間処理し、次いでＤＭＳＯ５０．０μｌの存在下で攪拌し、その後マイクロプレートリーダーを用いて５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。測定した吸光度は、１０％ＤＭＳＯ／ＤＰＢＳを添加したコントロールにおいて測定した吸光度を基準とした百分率として表した。
【００２７】
ＴＮＦ - αに対する阻害作用
オウゴンの神経保護機構を調べるために、ＴＮＦ-αに対する阻害作用の測定も行った。ＬＰＳと混合した様々な濃度のオウゴン抽出物を用いてＢＶ-２細胞を処理し、処理の２０時間後に上清を採取した。それとは別に、Ｌ９２９細胞を９６-ウェルプレートにおいて培養し、各ウェルの使用済み培地を血清を含まない新しいＤＭＥＭ５０μｌと交換した。培地５０μｌ、ｒＴＮＦ５０μｌ及び上清５０μｌを各ウェルへ添加し、連続希釈(serial dilution)を行い、次いで５０μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋アクチノマイシン(Actinomycin)Ｄ（５μｌ／ｍｌ）を添加した。
【００２８】
１８時間インキュベートした後、各ウェルから上清を採取した。クリスタルバイオレット(crystal violet)を１００μｌ添加した後、１０分間流水で洗浄し、その後乾燥させた。０．５％のＳＤＳ１００μｌ中で細胞を懸濁させ、３０分間ボルテックスミキサーで攪拌してプレートリーダーで５９０ｎｍにおける吸光度を測定した。ＮＯ生成の分析のために、グリース（Griess）反応を利用した。ここでは、各ウェルへ５０μｌのグリース試薬を添加し、１０分間室温で維持した。プレートリーダーにおいて５５０ｎｍの吸光度を測定し、オウゴンのＮＯ生成に対する阻害効果を分析した。結果を下記表１に示す。
【００２９】
【表１】
【００３０】
免疫組織化学
あらかじめ灌流された４０μｍの厚さを有する組織断片を選択した。ｃｐｐ３２抗体を、免疫染色(immunostaining)のための第一抗体として使用し、一方、抗ラビット抗体を第二抗体として使用した。０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中へ組織断片を５分間浸漬し、１５分間トリトンＸ-１００によって２回、１５分間０．１ＭのＰＢＳと０．５％のＢＳＡとの混合溶液によって２回洗浄し、一晩室温で第一抗体と反応させた。これら断片を、０．１ＭのＰＢＳと０．５％のＢＳＡとの混合溶液によって２回洗浄した後、第二抗体と６０分間反応させた。０．１ＭのＰＢＳと０．５％のＢＳＡとの混合溶液による処理を１５分間２回繰り返し、その後、組織断片を、室温で６０分間、ＡＢＣ（アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ(avidin-biotin-peroxidase)）複合体と５０：１の比率で反応させた。各組織断片を、０．１ＭのＰＢＳによって１５分間洗浄した後、０．０５％のＤＡＢ（３，３´-ジアミノベンジジン(3,3'-diaminobenzidine)、シグマ、米国）及び０．０３％の過酸化水素を含む０．１ＭのＰＢＳと反応させた。発色後、各組織断片に０．１ＭのＰＢＳを添加することにより反応を終了させた後、それら組織断片を試験品に調製した。
【００３１】
統計
本草抽出物の効能を確認するために、スチューデントｔ-検定(Student's t-test)を用い、各実験グループをコントロールと比較した。
【００３２】
結果
１．投与量、体温の影響及び虚血誘発時間
投与量による効能を確認するために、様々な量の０．８９％の生理食塩水にオウゴン抽出物を溶解し、総体積２．０ｍｌで体重１ｋｇあたり２５０ｍｇ、５００ｍｇ及び１，０００ｍｇの投与量で腹膜内注射した。これらの投与量は、乾燥オウゴン重量を基準として計算すると、それぞれ０．７３ｇ／ｋｇ、１．４５ｇ／ｋｇ及び２．８９ｇ／ｋｇに相当する。
【００３３】
ラットにおいて虚血を誘発する最適期間を確認するために、４匹のラットをそれぞれ５、１０、２０及び３０分間虚血させた。再灌流後、それらを殺して海馬組織断片を採取し、その後、それら断片を用いて神経細胞損失について研究した。１０分間虚血誘発が行われた場合、海馬ＣＡ１サブフィールド中の損傷された角錐状細胞の総細胞数が１／４になることを観察し、これにより、この場合が本草の薬効の分析に最適であることを確認した。
【００３４】
温度パラメーターに関して、大脳虚血が誘発され、且つ再灌流が行われたラットの体温を、その中の滅菌試料の濃度を最も高くして注射した後に６時間に渡り測定した。結果をＦＩＧ．１ａ及び１ｂに示す。ＦＩＧ．１ａにプロットされた体温は、虚血誘発後にオウゴン抽出物が様々な投与量で注射されたラットの体温が低下することを示す。一方、ＦＩＧ．１ｂにおいて、オウゴン抽出物が様々な投与量（２５０、５００及び１，０００ｍｇ／ｋｇ）で注射されたラットの体温を、一過性の広範囲に亘る大脳虚血の間、一定（正常体温）に維持した（直腸温度：３６．５-３７．５℃）。いずれの場合にも、一過性の広範囲に亘る大脳虚血直後（０分）及び９０分後に、０．８９％の生理食塩水２．０ｍｌ中に溶解したオウゴン溶液を、２５０ｍｇ、５００ｍｇ及び１，０００ｍｇ／ｋｇの投与量で腹膜内注射し、ラットの直腸内の体温を測定した。ＦＩＧ．１ａ及び１ｂに平均値±標準偏差を示す。括弧内の数字は、使用したラットの数を意味する。
【００３５】
この間、オウゴンを投与したグループの体温低下を観察した。虚血誘発中の体温低下は、神経細胞を損傷から守り、それにより神経保護効果を示すことが知られている（ブスト(Busto)ら、J.Cereb.Blood Flow Metab. 1987、7：720-738）。虚血誘発及び再灌流の後に、２５０ｍｇ／ｋｇの投与量でオウゴンを投与した場合には体温低下は観察されなかったが、５００及び１，０００ｍｇ／ｋｇの投与量でオウゴンを投与した場合には体温低下が観察された（ＦＩＧ．１ａ）。ここでは、虚血誘発直後（０分）及び９０分後に腹膜内注射により薬剤を投与した。詳しくは、１，０００ｍｇ／ｋｇの投与量でオウゴンを投与した場合には虚血誘発時には３７．６±０．５℃であった体温が、２時間後には３６．９±０．４℃に低下した。その後、体温は徐々に低下し、虚血誘発の６時間後には、虚血誘導時の温度（３７．７±０．５℃）よりも約２．５℃低い３５．１±０．４℃であった。５００ｍｇ／ｋｇの量を投与した場合、虚血誘発時には３７．７±０．５℃であった体温は、２時間後には３７．１±０．３℃に低下し、６時間後には３５．９±０．４℃であり、体温低下は約１．８℃であった。
【００３６】
オウゴンの神経保護効果が体温低下と関連するか否かを確認するために、オウゴン抽出物が注射されたラットの体温を強制的に一定に維持した。即ち、体温低下を示した２種類の抽出物が注射されたグループの体温を、虚血誘発後１２時間一定に維持させ（ＦＩＧ．１ｂ）、神経細胞の損失を観察した。体温の大幅な低下を示さなかった２５０ｍｇ／ｋｇの量を投与されたグループを、部分的な体温低下を防ぐために、３７℃において自動温度調節機にセットすることにより、正常体温状態に維持した。
【００３７】
２．損傷神経細胞の観察
４-血管閉塞により引き起こされる大脳虚血後に再灌流を行う場合、海馬ＣＡ１サブフィールド中の角錐状神経細胞は、虚血の影響を最も受け易く、再灌流の７２時間後には細胞が死に始める（プルシネリ(Pulsinelli) W.A.ら、Ann Neurol 1982、11、491-498）。この研究において、神経細胞が完全に損傷される時点である再灌流の一週間後にラットを殺し、反対側の海馬から得られた組織断片を光学顕微鏡に置いて海馬ＣＡ１サブフィールドにおける遅延性神経死を観察した。結果をＦＩＧ．２ａ〜２ｆに示す。これらは、擬似グループ、対照グループ及びオウゴン処理されたグループにおいて１０分間虚血誘発を行ってから７日後のラットの左海馬の顕微鏡写真である。
【００３８】
冠状縫合後、背部海馬の脳組織断片をクレシルバイオレットによって染色し、広範囲に亘る虚血による海馬ＣＡ１サブフィールドにおいて引き起こされる選択的な遅延性神経損失を表示した。
【００３９】
ＦＩＧ．２ａの擬似グループにおいて、矢印はＣＡ１角錐状神経細胞の軌跡を示す。ＦＩＧ．２ｂに示す海馬組織断片は、ＣＡ１サブフィールド中の角錐状神経細胞の殆どが変化しない（正常な）染色模様を有するため注目に値する。ＦＩＧ．２ｃの対照グループにおいて、矢印で示した角錐層(stratum pyramidale)がわずかに染色され、且つ神経細胞の損傷が、ＣＡ１サブフィールド内でのみ発生した。角錐状神経細胞が凝固して細胞変化を起こし、特有の明らかな神経膠症(gliosis)より損傷されたことがＦＩＧ．２ｄに示されている。１，０００ｍｇ／ｋｇの量のオウゴン抽出物を投与されたグループは、ＦＩＧ．２ｅ及び２ｆに示すように、回復できないほど損傷されたので、それらのＣＡ１サブフィールド中の角錐状神経細胞の数は著しく減少した。ＦＩＧ．２ａ〜２ｆにおいて、長さは１００．０μｍである。
【００４０】
虚血を施さなかった擬似されたラットにおいて、４９０μｍ長の角錐層中の通常の海馬神経細胞を観察した（ＦＩＧ．２ａ及び２ｂ）。
【００４１】
ＦＩＧ．２ｃ及び２ｄに示すように、対照グループにおいてアポプトシスが誘発された。一般に、いくつかの外的又は内的刺激によりアポプトシスが誘発されると、細胞が収縮し、分化により形成されたそれら本来の形状を失う。更に、収縮により周辺細胞との結合が切断され、それによりアポプトシス細胞の近傍の細胞との相互作用が妨げられる。収縮が進行すると、アポプトシス体が形成されるとともに、細胞膜が水泡状に膨れるように見える。虚血誘発後に生理食塩水が投与された対照グループの海馬ＣＡ１サブフィールドにおいて、神経細胞にＦＩＧ．２ｄ中の形状の変化によって検出されるようなアポプトシスが生じたことがわかった。ＦＩＧ．２ｄにおいて、ＦＩＧ．２ｂの現象とは異なり、目的の細胞が周辺細胞から離れるとともにその組織が分解する現象が示される。更に、アポプトシスが発生した神経細胞の細胞体は、それらの特徴的な角錐状形状を失い、一種の単一細胞を形成した。アポプトシスが更に進行すると、核膜(nuclear envelope)の破壊により核クロマチンが濃縮された。一方、薬剤処理されたグループの海馬ＣＡ１サブフィールド中の神経細胞は、ＦＩＧ．２ｅ及び２ｆにより明らかなように、通常の細胞と同じような形状を有する。ここでは、ＣＡ１サブフィールド周辺の壊死神経細胞を成長中の小膠細胞と区別することが非常に困難なので、ＣＡ１サブフィールドの生存可能な角錐状神経細胞のみを計測した。それらの周核体(perikaryons)は健全に発育し、且つ中央に位置するそれらの周辺核は近傍の好中球と明らかに異なるので、これらの細胞は容易に観察することができる。ＦＩＧ．２ｆにおいて、収縮した細胞体とともに、遊離細胞が海馬全体において観察され、このことは、この損傷は、アポプトシスを誘発するのに極めて充分であることを間接的に示す。このような大きな損傷にもかかわらず、多数の細胞がアポプトシスから保護され、正常な角錐形状をなす。また、前述のように、細胞が近隣の細胞との結合を維持することがわかった。これらの結果は、オウゴン抽出物が４-血管閉塞によって引き起こされる損傷から海馬ＣＡ１サブフィールドの神経細胞を保護することを示す。本発明のオウゴン抽出物が、アポプトシス過程のどの段階において、神経細胞の細胞循環を、アポプトシス過程から細胞生存過程へ転ずるかについては確認されていないが、オウゴン抽出物がアポプトシスからの保護に極めて有用であることがわかる（ＦＩＧ．２ｅ及び２ｆ）。
【００４２】
３．オウゴン抽出物の神経細胞における保護効果
オウゴン抽出物を、その神経保護効果を調べるために、大脳虚血の誘発直後（０分）及び９０分後に腹膜内注射した。
【００４３】
体温が３７℃以下に低下しないように調整されたラットにおいて観察された神経保護効果をＦＩＧ．３に示す。虚血誘発直後（０分）及び９０分後に、本発明のオウゴン抽出物を２５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ及び１，０００ｍｇ／ｋｇの投与量で注射した。対照グループには、０．８９％の生理食塩水を２．０ｍｌ／ｋｇの体積で用いた。ヒストグラムを作成するために、３つの脳半球断片において正常であることが観察された１×１ｍｍの大きさを有するＣＡ１角錐状神経細胞を計測し、平均値を算出した。括弧内の数字は使用した実験動物の数を表す。平均値±標準偏差を基準としてヒストグラムをプロットした。スチューデントｔ-検定によって、各試験グループを対照グループと比較して各グループからのデータを分析した（*ｐ＜０．０５）。
【００４４】
生理食塩水が注射された対照グループにおいて、生存可能な細胞数を測定したところ、１ｍｌ当たり４７．８±３．１個(47.8±3.1 cells/ml)であった。これは、１ｍｌ当たりの生存可能な細胞数の測定値が１８１±７．９個(181±7.9 cells/ml)であった擬似グループよりもはるかに低い値である。一方、試験グループで生存可能な細胞数を測定したところ、オウゴン抽出物が１，０００ｍｇ／ｋｇの投与量で注射された場合は１ｍｌ当たり８４．４±１４．７個(84.4±14.7 cells/ml)であり、オウゴン抽出物が５００ｍｇ／ｋｇの投与量で注射された場合は１ｍｌ当たり７８．８±１１．２個(78.8±11.2 cells/ml)であるように、顕著な保護効果がもたらされた（ｐ＜０．０５）。しかし、２５０ｍｇ／ｋｇの投与量では生存可能な細胞数は１ｍｌ当たり６１．４±１４．８個(61.4±14.8 cells/ml)であり、前記測定で確認されたような顕著な神経保護効果はもたらされなかった。効果的に神経を保護する投与量は１，０００ｍｇ／ｋｇ及び５００ｍｇ／ｋｇであり、神経細胞をそれぞれ２７．４％及び２３．２％保護し、これらの保護効果は対照グループよりもはるかに高かった。２つの効果的な投与量の間の相違は大きくない（表２、ＦＩＧ．３）。
【００４５】
【表２】
【００４６】
４．オウゴンの抗酸化効果
ウェル当たり３×１０4個のＰＣ１２細胞を添加し、３７℃でウェルに粘着するのに充分な期間培養した。培養の２１時間後に、粘着細胞を１０．０μｇ／ｍｌ、２０．０μｇ／ｍｌ、５０．０μｇ／ｍｌ又は１００．０μｇ／ｍｌの濃度のオウゴンによって３時間前処理を行い、その後０．５ｍＭのＨ2Ｏ2を含有する新しい培地中で３７℃で２４時間培養した。新しい培地とともに前処理と同じ濃度のオウゴン抽出物も添加した。結果をＦＩＧ．４ａ及び４ｂに示す。１０％のＤＭＳＯ／ＤＰＢＳ溶液によって処理した対照グループと比較するためにスチューデントｔ-検定を行った。ＦＩＧ．４ａにＭＴＴ還元検定 (MTT reduction assay)の結果を平均値±標準偏差（ｎ＝６）で示す。ＦＩＧ．４ｂのヒストグラム中の棒グラフは、ＬＤＨ検定（ｎ＝６）の結果であり、総細胞溶解(total cell lysis)の百分率の平均値±標準偏差を基準として作成した。*ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１であった。
【００４７】
１０．０、２５．０、５０．０及び１００．０μｇ／ｍｌの濃度のオウゴン抽出物によって３時間前処理をした後、同じ濃度のオウゴン抽出物及び０．５ｍＭのＨ2Ｏ2存在下で２４時間粘着細胞に酸化ストレス(oxidative stress)をかけると、ＭＴＴ検定によって測定値した場合、細胞は、対照グループの場合よりも高い、１１３．９％（２５．０μｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０５）、１１１．１％（５０．０μｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０５）及び１１３．７％（１００．０μｇ・ｍｌ、ｐ＜０．０５）の酸化ストレス抵抗性(oxidative stress-resistance)を示すことがわかった（ＦＩＧ．４ａ）。しかし、ＬＤＨ検定によって測定した場合には、オウゴン抽出物によって処理したグループは顕著な抗酸化効果を示さなかった（ＦＩＧ．４ｂ）。
【００４８】
薬効のみを考えた場合、以下の理由から、オウゴン抽出物の神経保護効果は優れている。４-ＶＯモデルによる神経防御の試験において使用するための薬剤としては、グルタメート受容体拮抗剤(glutamate receptor antagonists)、カルシウムチャンネル拮抗剤(calcium channel antagonists)、ＧＡＢＡ神経伝達促進剤(GABA neurotransmission promoters)、ＮＯＳ阻害剤及び抗酸化剤が主に挙げられる。試験データがないのでそれらの効能を比較することはできないが、これらの薬剤の殆どは、１５―２５％の防御効果ももたらし、例えばＬＹ２３１６１７は２５−３０％、Ｌ-ＮＡＭＥは２３％、３-ブロモ-７-ニトロインダゾールは２０％、ＭＫ-８０１（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）は２４％、エリプロジル(eliprodil)（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）は２５％、ＮＢＱＸ（３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）は４２％、７-ＮＩは１７．５％、ＧＹＫ１５２４６６は１１％、ＬＹ３００１６８は２３％である（オニール(O'Neill)M.J.ら、Eur.J.Pharmacol.1996、310）。本草薬(herb medicines)は、それらの殆どが様々な本草の混合物からなるので副作用が極めて少ない。この事実を考慮すると、オウゴン抽出物の重要性はさらに高まる。更に、他の本草の既知のデータと比べると、大黄(rhubarb)は１，０００ｍｇ／ｋｇで１６．８％、５００ｍｇ／ｋｇで１６．３％であり、ガストロディア・エデータ(Gastrodia edata)Ｂ１は、１，２００ｍｇ／ｋｇで１７．８％、６００ｍｇ／ｋｇで１５．６％であり、マグノリア・オボベート(Magnolia obovata)は１，０００ｍｇ／ｋｇで１３．７％であり、大黄、マグノリア・オボベート、ポンシラス・トリフォリエート・ラフィンの果実(fruits of Poncirus trifoliate Rafin)、及びエリゲロン・カナデンシスＬ(Erigeron Canadensis L.)の混合物は、１，０００ｍｇ／ｋｇで１８．４％、５００ｍｇ／ｋｇで１６．６％であるのに対し、本発明のオウゴン抽出物は著しく高い抗酸化作用を有する。
【００４９】
結論
４-血管閉塞によって引き起こされるラットの前脳虚血に対するオウゴン抽出物の神経保護効果の観察により、以下の結論が得られる。
【００５０】
１．オウゴン抽出物を２５０ｍｇ／ｋｇの投与量で注射することにより体温低下は引き起こされなかったのに対し、注射量を１，０００ｍｇ／ｋｇ又は５００ｍｇ／ｋｇに増加すると、大脳虚血の誘発の１時間後から体温低下が始まり、大脳虚血の誘発の６時間後まで低体温が維持された。
【００５１】
２．大脳虚血を誘発した後に体温調節を行う条件下では、１，０００ｍｇ／ｋｇ及び５００ｍｇ／ｋｇの量でオウゴン抽出物を注射することにより大脳虚血が誘発された場合の神経細胞の損傷からラットが保護され、オウゴン抽出物を注射しなかった場合よりも、１，０００ｍｇ／ｋｇの投与量の場合には２７．４％、５００ｍｇ／ｋｇの投与量の場合には２３．２％高い効果を示した。
【００５２】
３．オウゴン抽出物の神経保護効果が抗酸化と関連するか否かについて研究した。１０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、及び１００μｇ／ｍｌの濃度のオウゴン抽出物によって前処理をした後、同じ濃度のオウゴン抽出物存在下で、０．５ｍＭのＨ2Ｏ2によって酸化ストレスをかけると、ＭＴＴ検定によって測定した場合、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌの濃度のオウゴン抽出物によって処理されたグループから、Ｈ2Ｏ2による細胞損傷に対する顕著な防御効果が得られた。また、１０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌの濃度のオウゴン抽出物は、ＮＯ生成に対する顕著な阻害作用を示した。
【００５３】
４．オウゴン抽出物は、１０μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌの投与量に依存した態様でＢＶ２細胞におけるＴＮＦ-αの生成を阻害した。
その結果、オウゴン抽出物が４-血管閉塞により引き起こされる前脳虚血による神経細胞の損傷に対する保護作用を示すことにより、神経細胞がアポプトシスへの抵抗性を有するようにし、且つＴＮＦ-α生成を阻害し、並びに抗酸化作用を示すようにすることができることが観察された。これらの作用により、オウゴン抽出物は神経保護剤(neuroprotectant)として使用することができる。
【００５４】
実施例３
急性毒性試験
１．経口投与
ＩＣＲ系マウス（生後２５±５週）を１０匹ずつ４つのグループに分類し、オウゴン抽出物を、５００、７２５、１，０００及び５，０００ｍｇ／ｋｇの投与量でそれぞれ経口投与した。スプレーグ・ダウリー(Sprague Dawley)系マウスを１０匹ずつの４つのグループに分類し、同様の経口投与を行った。経口投与後４週間は、いずれのグループのマウスも死ななかった。また、被投与グループと対照グループとの間には、外見上の違いはなかった。
【００５５】
２．腹膜投与
ＩＣＲ系マウス（生後２５±５週）を１０匹ずつ４つのグループに分類し、２５、２５０、５００及び７２５ｍｇ／ｋｇの投与量でそれぞれ腹膜内注射を行った。スプレーグ・ダウリー系マウスを１０匹ずつの４つのグループに分類し、同様の腹膜注射を行った。腹膜投与後４週間は、いずれのグループのマウスも死ななかった。また、被投与グループと対照グループとの間には、外見上の違いはなかった。
【００５６】
上記の結果から、本発明のオウゴン抽出物は急激な毒性を持たないという結論が得られる。
従って、本発明のオウゴン抽出物は、神経系機能障害の予防及び治療における使用に適した薬剤に調製することができる。この点において、この抽出物は、薬学的に適用可能な手段(expedients)及びキャリアー(carriers)とともに用いることができ、注射、液体、シロップ、丸薬、カプセル等のいずれの形状でも使用することができる。
【００５７】
本発明のオウゴン抽出物は、患者の性別、年齢、体重及び病気の程度によって１日当たり１０ｍｇ〜５，０００ｍｇの投与量を１〜３回にわけて投与することもできる。
【００５８】
以下の配合例により本発明をより具体的に説明する。
体積２ｍｌまで滅菌水を加えながらこれらの成分を混合し、２ｍｌのアンプルに詰め注射溶液とした。
【００５９】
これらの成分を混合して錠剤に調製した。
【００６０】
これらの成分を混合し、通常の方法でゼラチンカプセルに詰めた。
【００６１】
これら成分を通常の方法で混合し、１００ｍｌの茶瓶に詰めて滅菌し、液剤とした。
【００６２】
上記の実施例において得られたデータを総合すると、本発明のオウゴン抽出物及びその薬剤が毒性なしに神経保護作用を示すため、脳卒中、パーキンソン病及び痴呆症のような脳疾患の予防及び治療における使用に適している。
【００６３】
本発明は、例示的に記載され、使用された専門用語は限定するよりもむしろ説明することを目的としている。
本発明の多くの修正及び変形は、上記の説明に照らして可能である。それ故、添付の特許請求の範囲内で、本発明は具体的に説明された以外の別の方法で実施することもできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】体温を調整しなかった場合の虚血誘発及び再灌流の完了後のラットの体温をオウゴン抽出物の注射からの時間に対してプロットした曲線を示す（ＦＩＧ．１ａ）。
【図２】体温を外的に調整した場合の虚血誘発及び再灌流の完了後のラットの体温をオウゴン抽出物の注射からの時間に対してプロットした曲線を示す（ＦＩＧ．１ｂ）。
【図３】擬似グループのラットの１０分間虚血誘発を行ってから７日後の左海馬の顕微鏡写真を示す（ＦＩＧ．２ａ）。
【図４】擬似グループのラットの１０分間虚血誘発を行ってから７日後の左海馬の顕微鏡写真を示す（ＦＩＧ．２ｂ）。
【図５】対照グループのラットの１０分間虚血誘発を行ってから７日後の左海馬の顕微鏡写真を示す（ＦＩＧ．２ｃ）。
【図６】オウゴン処理されたグループのラットの１０分間虚血誘発を行ってから７日後の左海馬の顕微鏡写真を示す（ＦＩＧ．２ｄ）。
【図７】オウゴン処理されたグループのラットの１０分間虚血誘発を行ってから７日後の左海馬の顕微鏡写真を示す（ＦＩＧ．２ｅ）。
【図８】オウゴン処理されたグループのラットの１０分間虚血誘発を行ってから７日後の左海馬の顕微鏡写真を示す（ＦＩＧ．２ｆ）。
【図９】１０分間虚血誘発を行ってから７日後のオウゴン抽出物の投与量に依存した態様の神経保護効果を示すヒストグラムである（ＦＩＧ．３）。
【図１０】ＭＴＴ検定によって測定されたオウゴン抽出物の抗酸化作用のヒストグラムを示す（ＦＩＧ．４ａ）。
【図１１】ＬＤＨ検定によって測定されたオウゴン抽出物の抗酸化作用のヒストグラムを示す（ＦＩＧ．４ｂ）。
【発明の属する技術分野】
本発明は、神経保護作用を有するオウゴン(Scutellariae Radix)抽出物及び有効成分として前記オウゴンを含む脳疾患の予防及び治療のための使用に適した薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
漢方薬(oriental medicine)において薬剤に用いられるオウゴンは、シソ科に属する多年草であるゴガネバナ(Scutellatia baicalensis Georgi)の根の表皮を剥ぎ乾燥させることによって得られる。オウゴンは、ウゴニン(wogonin)、バイカリン(baicalin)及びバイカレイン(baicalein)のような様々なフラボノイドを含むことが知られている。
【０００３】
漢方薬では、湿熱除去(wet-heat removal)、止血(hemostasis)、及び胎児の安定(fetus settlement)のために植物を通常使用している。近年では、抗バクテリア作用、抗炎症作用（ミチノリ・クボら、Chem. Pharm. Bull.、32(7)、1984）、抗アレルギー作用、胆汁分泌促進作用、肝臓保護作用、利尿、高脂血症治療、腸運動阻害作用、及び抗癌作用（ステート・アドミニストレーション・オブ・トラディショナル・チャイニーズ・メディスン(State Administration of Traditional Chinese Medicine)；中国薬局方(Chinese Pharmacopoeia)、上海、上海サイエンス・アンド・テクノロジー・プレス(Shanghai Science & Technology Press)、1998、1682-1694頁）のような様々な効能が、新たに開示されている。臨床的には、オウゴンは、高血圧症(hypertension)、流行性脳脊髄膜炎(epidemic cerebro-spinal meningitis)、弱い麻痺(mild paralysis)等の治療のための様々な処方において使用されている（キム(Kim)ら、プレスクリプション(Prescription)、ヤング・リム・パブリケーションズ、ソウル、1990、111-113頁、263-264頁、338頁）。例えば、オウゴンは、有害な効果に対抗するための頓服水剤中のオウレン系(Coptidis Rhizoma-based)薬剤、肝臓の機能を活性化する頓服水剤(draught)であるホリバリンドウ系 (Gentiana Scabra Bunge. Var. buergeri Max.-based)薬剤、心臓を活性化するためのオキシベンゾール系(ox benzoar-based)丸薬、並びに麻痺を治療するための頓服水剤であるオステリカム・コレアナム(Maximowz)キタガワ系(Ostericum Koreanum (Maximowz) Kitagawa-based)薬剤、及び突発性心臓疾患を防ぐためのオキシベンゾール系丸薬中に含まれる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
本発明において、麻痺の治療のための頓服水剤であるオステリカム・コレアナム(Maximowz)キタガワ系(Ostericum Koreanum (Maximowz) Kitagawa-based)薬剤及び突発性心臓疾患を防ぐためのオキシベンゾール(ox benzoar-based)系丸薬の主成分であるオウゴンの、神経細胞の損傷に対する保護作用を試験する。これまでは、麻痺を初期段階で治療するために効果的な化学的薬剤は開発されていなかった。
【０００５】
大量のデータが蓄積されている初期段階の麻痺に対する効果的な治療を漢方薬に基づいて提供するために、本発明者らは、初期段階の麻痺に対するオウゴンの薬効及びその治癒機構について徹底的な調査を行い、最終的に、オウゴン抽出物が神経細胞の損傷に対する保護作用を有することを見出した。
【０００６】
そこで、本発明の第一の目的は、神経保護作用を示すオウゴン抽出物を提供することである。
本発明の第二の目的は、神経細胞の損傷に関連する脳疾患の予防及び治療に対する効能を有する薬剤を提供することである。
【０００７】
本発明の第一の態様によれば、水、低級アルコール、及びそれらの混合物から選択される抽出溶媒中へ胚盤を浸漬し、得られた抽出溶媒を濃縮し、得られた濃縮物を凍結乾燥することによって調製される神経保護作用を有するオウゴンが提供される。
【０００８】
本発明の第二の態様によれば、水、低級アルコール、及びそれらの混合物から選択される抽出溶媒中へオウゴンを浸漬し、得られた抽出溶媒を濃縮し、得られた濃縮物を凍結乾燥することによって調製されたオウゴン抽出物を有効成分として薬学適用可能な基剤とともに含む神経保護作用を有する薬剤が提供される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
プルシネリ(Pulsinelli)によって１９７９年に開発された４-血管閉塞モデル(4-vessel occlusion model)において、麻痺に対するオウゴンの効能を試験した。前脳虚血の動物モデルを表すこのモデルにおいて、ラットの脳へ血液を供給する血管が一時的にふさがれ、そして再度灌流されることにより、海馬(hippocampus)領域における神経細胞の損傷が引き起こされる。神経細胞の損傷は、自然の細胞壊死であり、アポプトシス過程(apoptotic pathway)から進行する。このモデルにおいて効能を有する薬剤は、ヒトの麻痺のような局所的な虚血を患っている全ての動物モデルに対して治癒効果を発揮することが知られている。実際に、それらの薬剤は、臨床的に有用である可能性を示している。虚血性神経細胞損傷の研究のためには、完全な前脳虚血を患う動物モデルよりも４-血管閉塞によって引き起こされる前脳虚血を患う動物モデルが好ましい。なぜなら、後脳における血流は、４-血管閉塞の場合は影響を受けないので、この研究における呼吸及び全身血液循環の影響が除外されるからである。
【００１０】
本発明において、大脳虚血によって引き起こされる神経細胞の損傷に対するオウゴンの保護効果を説明する。このために、オウゴン抽出物を大脳虚血の発生直後に注射し、注射の１週間後に、海馬のＣＡ１サブフィールド(subfield)において生存している神経細胞数を計測し、オウゴンが神経細胞のアポプトシスにより引き起こされる麻痺の治療のために有効であるか否かを確認する。更に、その神経保護機構を調べるために、オウゴンの抗酸化作用を試験した。ここでは、抗酸化作用を調べるため、ＰＣ１２細胞系を培養し、過酸化水素によって酸化することにより損傷させてインビボで(in vivo)観察する。このモデルにおいて、細胞損傷は、アポプトシス過程において役割を担うカスパゼ(caspase)群の導入と関連することが知られているため、免疫組織化学は、オウゴンがカスパゼ群の酵素反応において主要な役割を果たすカスパゼ３(cpp32)の誘発に対する阻害効果を有するか否かを確認するために使用される。
【００１１】
このような実験において使用するために、溶媒抽出を用いてオウゴンから抽出物を得る。この抽出に適当な溶媒として、水、低級アルコール及びそれらの混合物を使用することができる。低級アルコールの例としては、メタノール、エタノール、ｎ-プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ-ブチルアルコール及びｔ-ブチルアルコールが挙げられ、中でもメタノール及びエタノールが好ましい。抽出物を得るためにオウゴンを溶媒中に浸漬し、その抽出物を濾過して濃縮し、次いで凍結乾燥する。
【００１２】
本発明は、以下に示す明確に説明された実施例により、更に理解され得るが、これにより本発明が限定されるものではない。
【００１３】
【実施例】
実施例１
オウゴン抽出物の調製
乾燥オウゴン３ｋｇを、７０％エタノール水溶液中で１５分間３回超音波処理した。これらを混合した後、抽出物を濾過して真空下で濃縮し、次いで濃縮物を凍結乾燥し、凍結乾燥抽出物１６０ｇを得た。
【００１４】
実施例２
乾燥オウゴン３ｋｇを、蒸留水中で１５分間３回超音波処理した。これらを混合した後、抽出物を濾過して真空下で濃縮し、次いで濃縮物を凍結乾燥し、凍結乾燥抽出物１５０ｇを得た。
【００１５】
実施例３
乾燥オウゴン３ｋｇを、特級エタノール中で１５分間３回超音波処理した。これらを混合した後、抽出物を濾過して真空下で濃縮し、次いで濃縮物を真空乾燥し、乾燥抽出物１４５０ｇを得た。
【００１６】
実験例
実験動物
体重約１７０ｇの生後５週の雌のウイスター・ホワイト・ラット(Wister white rats)（ＳＬＣ、日本）を、試験前に１週間、食料及び水を十分に与えて実験環境に適応させた。
【００１７】
原料
試験前に、韓国慶煕大学校漢医科大学本草学研究室(the Laboratory of Herbology, College of Oriental Medicine, Kyung Hee University, Korea)によってオウゴンの証明を受けた。
【００１８】
虚血の誘発
ウイスター・ラットを、麻酔を投与した後に尾を装置の水平ダイ(die)上に３０°の角度で下向きに固定し、麻酔器(オーアメダ(Ohameda) V.M.C./Boc Health Care、シプレーン(Cyprane)、英国)につなげられたプラスチックコーンを鼻と口にはめ、脳定位固定装置上に仰向けに寝かせた。５％のイソフルラン(isoflurane)を含有する窒素と酸素との混合気体（Ｎ2７０％及びＯ2３０％）を用いて麻酔を行い、その後イソフルラン含有量を１．５％に維持した。
【００１９】
頚椎を伸ばした状態で、尾を手術台の上に固定した。まず、咽喉部位を切開した。その後、虚血を引き起こすために、再灌流を行うことができるように設計して総頚動脈にシリコンチューブでリングを作った。虚血誘発時に毛細血管を通る血液循環を遮断するために、糸上に頸部及び脊髄傍筋肉が位置し、気管、食道、外部頸静脈、及び総頚動脈の前を通るように、ラットの体に糸を通し、その後切開部を手術用クリップで縫合した。
【００２０】
次いで、後頭骨部を手術するためにラットをうつ伏せにした。手術用拡大鏡を用いて後頭骨の下の第一頚椎部を手術した。１ｍｍ以下のサイズの微小な電気焼灼針を、筋肉を損傷しないように注意しながら翼状孔(alar foramina)に近づけ、第一頚椎の翼状孔へ通して頚静脈が流れるトンネルへ挿入した。針から断続的に電流を流して頚静脈を電気焼灼した。手術用顕微鏡を用いて脊椎中のトンネルを流れる頚静脈の完全な電気焼灼及び閉塞を確認した後、手術用クリップを用いて縫合を行った。２４時間後に手術用クリップを取り除いた。次いで、総頚動脈を動脈瘤(aneurysm)クリップを用いて１０分間閉じて虚血を引き起こした。軽い反射行動が１分以内に消えた場合には、頸部を更にきつく縫合した。きつく縫合したにもかかわらず軽い反射行動が消えなかったラットは、ＣＡ１神経細胞の反対側に完全な平行損傷(parallel damage)を受けたと判断されるので、実験から除外した。痙攣を起こしたものも除外した。１０分後に総頚動脈から動脈瘤クリップを取り除き、次いで動脈を再灌流させた。再灌流後に意識を失っている時間が２０±５分であったラットのみを選んで更に研究を行った。
【００２１】
虚血誘発後、３０分間隔で６時間に渡りラットの体温を測定した。一つの態様では、体温が低下した場合に体温の調整を行わずに体温変化を記録した。もう一つの態様では、神経細胞における低体温に起因する保護効果を取り除くために、体温低下を阻止した。この場合には、直腸の温度を利用することができる自動温度調節機を用いて、虚血誘発、再灌流及び回復期間の間、ラットの体温を３７±０．５℃に維持した。直腸温度は脳温度を反映するので、直腸中に少なくとも６ｃｍの長さで挿入したプローブを用いて体温を測定した（ミヤザワ(Miyazawa) Tら、J. Cereb Blood Flow Metab 1992: 12: 817-822）。
【００２２】
本草試料の投与及び実験グループの選択
ラットにおける前脳虚血に対するオウゴンの効能を測定するために、本草抽出物を様々な投与量でラットに投与した。抽出物の投与は、前脳虚血の誘発直後（０分後）及び９０分後に行った。上記の実施例で調製されたオウゴン抽出物を、０．８９％食塩水に溶解し、体重１ｋｇ当たりの成分量が２５０ｍｇ、５００ｍｇ及び１，０００ｍｇとなる濃度としてそれぞれ同体積で腹膜注射した。擬似グループ (mock group)として、第一グループにも同じ方法で外科手術を行ったが、前脳虚血は誘発されなかった。対照グループとして用いた第二グループに対して、同じ方法で、前記グループでの前脳虚血誘発後の本草抽出物の投与と同様の時間間隔で、生理食塩水を２．０ｍｌ／ｋｇの投与量で腹膜注射した。前脳虚血の誘発直後（０分）及び９０分後に、第３、第４及び第５グループそれぞれへ、２５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ及び１，０００ｍｇ／ｋｇの投与量を腹膜注射した。
【００２３】
組織試験品の調製
前脳虚血誘発の一週間後、クロラール水和物(chloral hydrate)（３５．０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を用いてラットを麻痺させ、それらの胸を切開した。右心房を切り開き、左心室へシリンジを慎重に挿入し、その後ヘパリン処理された(heparinized)０．５％硝酸ナトリウム含有生理食塩水を心臓へゆっくりではあるが絶え間なく灌流させ、次いで４．０％ホルマリン固定剤を心臓へ灌流させた。その後、脳を除去し０．１Ｍリン酸緩衝ホルマリン固定剤中で２時間、後固定(postfixation)を行った後、４℃で一晩３０％ショ糖を注入した。固定された脳から、ブレグマ点(bregma point)から−２．５ｍｍ〜―４．０ｍｍの間に広がる背部海馬(dorsal hippocampus)の冠状塊(coronal block)を調製した。次いで、スライドミクロトーム(sliding microtome)を用いて冠状塊を凍結切断した(cryosectioned)。３０μｍの厚さを有する海馬組織断片を収集して試料を調製した。
【００２４】
損傷神経細胞の観察
背部海馬を含む組織断片をクレシルバイオレット(cresyl violet)を用いて着色して固定した後、背部海馬のＣＡ１における遅延性神経死(delayed neuronal death)の影響を最も受け易い１，０００μｍの長さの中間領域において神経細胞数を計測した（クレイン(Crain) B.J.ら、ニューロサイエンス(Neuroscience) 1988; 27; 387-402）。３人の異なる観察者によって、２５０倍の倍率で、脳組織の３つの異なる部位の左側と右側において、即ち、合計６箇所において、正常な形状 (morphology)の角錐状細胞数の平均を求めることによって神経細胞を測定した。
【００２５】
ＰＣ１２細胞の培養及び抗酸化作用の測定
それぞれのウェルが１％ペニシリン-ストレプトマイシン（ギブコＢＲＬ、米国）及び１０％ウシ胎児血清（ギブコＢＲＬ、米国）が添加されたＤＭＥＭ（ダルベッコ変形イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle Medium)、ギブコＢＲＬ、米国）を含む９６-ウェルプレートにおいて、韓国細胞系銀行(Korean Cell Line Bank)により購入したＰＣ１２細胞（ラット褐色細胞腫系）をインキュベーターにおいて３７℃で一晩、ウェル当たり３×１０4個(3×104 cells/well)の細胞密度で培養した。オウゴン抽出物を１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、シグマ(Sigma)、米国）溶液を含むＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝食塩水(Dulbecco's phosphate buffered saline)、シグマ、米国）中で溶解し、この抽出物を１０．０、２５．０、５０．０及び１００．０μｇ／ｍｌの最終濃度で含む溶液を得た。これらの溶液を用いて細胞を３時間前処理した。比較のため、同体積の１０％ＤＭＳＯ含有ＤＰＢＳ溶液をコントロールとして加えた。培地において、ＤＭＳＯは、最終濃度０．５％で培地中に含有された。前処理の３時間後に、抽出物を添加した培地を０．５ｍＭのＨ2Ｏ2を含む新しい培地と交換し、３７℃において２４時間インキュベートした。
【００２６】
ＬＤＨ（ラクトース脱水素酵素）活性を分析するために、培地３０μｌを新しい９６-ウェルプレートのそれぞれのウェルに移し、その後そのウェルに０．７５ｍＭのピルビン酸塩及び１．４ｍＭのＮＡＤＨを含む溶液３０μｌを添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、着色溶液（２，４-ジニトロフェニルヒドラジン(2,4-dinitrophenylhydrazine)、ヨンドン(Young Dong)、韓国）を培地と反応させ、０．４ＮのＮａＯＨによって塩基性にして発色させ、マイクロプレートリーダー(microplate reader)において４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。細胞が完全に溶解するまでの測定値を、１０％のトリトンを最終濃度０．１％で添加したウェルにおいて測定した吸光度を基準として百分率として表した。重要な試験のために、測定値を１０％ＤＭＳＯ溶液を含有するＤＰＢＳが添加されたコントロールの測定値と比較した。９６-ウェルプレートにおける各ウェル上の細胞を、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度のＭＴＴ１５０．０μｌによって３７℃において４時間処理し、次いでＤＭＳＯ５０．０μｌの存在下で攪拌し、その後マイクロプレートリーダーを用いて５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。測定した吸光度は、１０％ＤＭＳＯ／ＤＰＢＳを添加したコントロールにおいて測定した吸光度を基準とした百分率として表した。
【００２７】
ＴＮＦ - αに対する阻害作用
オウゴンの神経保護機構を調べるために、ＴＮＦ-αに対する阻害作用の測定も行った。ＬＰＳと混合した様々な濃度のオウゴン抽出物を用いてＢＶ-２細胞を処理し、処理の２０時間後に上清を採取した。それとは別に、Ｌ９２９細胞を９６-ウェルプレートにおいて培養し、各ウェルの使用済み培地を血清を含まない新しいＤＭＥＭ５０μｌと交換した。培地５０μｌ、ｒＴＮＦ５０μｌ及び上清５０μｌを各ウェルへ添加し、連続希釈(serial dilution)を行い、次いで５０μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋アクチノマイシン(Actinomycin)Ｄ（５μｌ／ｍｌ）を添加した。
【００２８】
１８時間インキュベートした後、各ウェルから上清を採取した。クリスタルバイオレット(crystal violet)を１００μｌ添加した後、１０分間流水で洗浄し、その後乾燥させた。０．５％のＳＤＳ１００μｌ中で細胞を懸濁させ、３０分間ボルテックスミキサーで攪拌してプレートリーダーで５９０ｎｍにおける吸光度を測定した。ＮＯ生成の分析のために、グリース（Griess）反応を利用した。ここでは、各ウェルへ５０μｌのグリース試薬を添加し、１０分間室温で維持した。プレートリーダーにおいて５５０ｎｍの吸光度を測定し、オウゴンのＮＯ生成に対する阻害効果を分析した。結果を下記表１に示す。
【００２９】
【表１】
免疫組織化学
あらかじめ灌流された４０μｍの厚さを有する組織断片を選択した。ｃｐｐ３２抗体を、免疫染色(immunostaining)のための第一抗体として使用し、一方、抗ラビット抗体を第二抗体として使用した。０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中へ組織断片を５分間浸漬し、１５分間トリトンＸ-１００によって２回、１５分間０．１ＭのＰＢＳと０．５％のＢＳＡとの混合溶液によって２回洗浄し、一晩室温で第一抗体と反応させた。これら断片を、０．１ＭのＰＢＳと０．５％のＢＳＡとの混合溶液によって２回洗浄した後、第二抗体と６０分間反応させた。０．１ＭのＰＢＳと０．５％のＢＳＡとの混合溶液による処理を１５分間２回繰り返し、その後、組織断片を、室温で６０分間、ＡＢＣ（アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ(avidin-biotin-peroxidase)）複合体と５０：１の比率で反応させた。各組織断片を、０．１ＭのＰＢＳによって１５分間洗浄した後、０．０５％のＤＡＢ（３，３´-ジアミノベンジジン(3,3'-diaminobenzidine)、シグマ、米国）及び０．０３％の過酸化水素を含む０．１ＭのＰＢＳと反応させた。発色後、各組織断片に０．１ＭのＰＢＳを添加することにより反応を終了させた後、それら組織断片を試験品に調製した。
【００３１】
統計
本草抽出物の効能を確認するために、スチューデントｔ-検定(Student's t-test)を用い、各実験グループをコントロールと比較した。
【００３２】
結果
１．投与量、体温の影響及び虚血誘発時間
投与量による効能を確認するために、様々な量の０．８９％の生理食塩水にオウゴン抽出物を溶解し、総体積２．０ｍｌで体重１ｋｇあたり２５０ｍｇ、５００ｍｇ及び１，０００ｍｇの投与量で腹膜内注射した。これらの投与量は、乾燥オウゴン重量を基準として計算すると、それぞれ０．７３ｇ／ｋｇ、１．４５ｇ／ｋｇ及び２．８９ｇ／ｋｇに相当する。
【００３３】
ラットにおいて虚血を誘発する最適期間を確認するために、４匹のラットをそれぞれ５、１０、２０及び３０分間虚血させた。再灌流後、それらを殺して海馬組織断片を採取し、その後、それら断片を用いて神経細胞損失について研究した。１０分間虚血誘発が行われた場合、海馬ＣＡ１サブフィールド中の損傷された角錐状細胞の総細胞数が１／４になることを観察し、これにより、この場合が本草の薬効の分析に最適であることを確認した。
【００３４】
温度パラメーターに関して、大脳虚血が誘発され、且つ再灌流が行われたラットの体温を、その中の滅菌試料の濃度を最も高くして注射した後に６時間に渡り測定した。結果をＦＩＧ．１ａ及び１ｂに示す。ＦＩＧ．１ａにプロットされた体温は、虚血誘発後にオウゴン抽出物が様々な投与量で注射されたラットの体温が低下することを示す。一方、ＦＩＧ．１ｂにおいて、オウゴン抽出物が様々な投与量（２５０、５００及び１，０００ｍｇ／ｋｇ）で注射されたラットの体温を、一過性の広範囲に亘る大脳虚血の間、一定（正常体温）に維持した（直腸温度：３６．５-３７．５℃）。いずれの場合にも、一過性の広範囲に亘る大脳虚血直後（０分）及び９０分後に、０．８９％の生理食塩水２．０ｍｌ中に溶解したオウゴン溶液を、２５０ｍｇ、５００ｍｇ及び１，０００ｍｇ／ｋｇの投与量で腹膜内注射し、ラットの直腸内の体温を測定した。ＦＩＧ．１ａ及び１ｂに平均値±標準偏差を示す。括弧内の数字は、使用したラットの数を意味する。
【００３５】
この間、オウゴンを投与したグループの体温低下を観察した。虚血誘発中の体温低下は、神経細胞を損傷から守り、それにより神経保護効果を示すことが知られている（ブスト(Busto)ら、J.Cereb.Blood Flow Metab. 1987、7：720-738）。虚血誘発及び再灌流の後に、２５０ｍｇ／ｋｇの投与量でオウゴンを投与した場合には体温低下は観察されなかったが、５００及び１，０００ｍｇ／ｋｇの投与量でオウゴンを投与した場合には体温低下が観察された（ＦＩＧ．１ａ）。ここでは、虚血誘発直後（０分）及び９０分後に腹膜内注射により薬剤を投与した。詳しくは、１，０００ｍｇ／ｋｇの投与量でオウゴンを投与した場合には虚血誘発時には３７．６±０．５℃であった体温が、２時間後には３６．９±０．４℃に低下した。その後、体温は徐々に低下し、虚血誘発の６時間後には、虚血誘導時の温度（３７．７±０．５℃）よりも約２．５℃低い３５．１±０．４℃であった。５００ｍｇ／ｋｇの量を投与した場合、虚血誘発時には３７．７±０．５℃であった体温は、２時間後には３７．１±０．３℃に低下し、６時間後には３５．９±０．４℃であり、体温低下は約１．８℃であった。
【００３６】
オウゴンの神経保護効果が体温低下と関連するか否かを確認するために、オウゴン抽出物が注射されたラットの体温を強制的に一定に維持した。即ち、体温低下を示した２種類の抽出物が注射されたグループの体温を、虚血誘発後１２時間一定に維持させ（ＦＩＧ．１ｂ）、神経細胞の損失を観察した。体温の大幅な低下を示さなかった２５０ｍｇ／ｋｇの量を投与されたグループを、部分的な体温低下を防ぐために、３７℃において自動温度調節機にセットすることにより、正常体温状態に維持した。
【００３７】
２．損傷神経細胞の観察
４-血管閉塞により引き起こされる大脳虚血後に再灌流を行う場合、海馬ＣＡ１サブフィールド中の角錐状神経細胞は、虚血の影響を最も受け易く、再灌流の７２時間後には細胞が死に始める（プルシネリ(Pulsinelli) W.A.ら、Ann Neurol 1982、11、491-498）。この研究において、神経細胞が完全に損傷される時点である再灌流の一週間後にラットを殺し、反対側の海馬から得られた組織断片を光学顕微鏡に置いて海馬ＣＡ１サブフィールドにおける遅延性神経死を観察した。結果をＦＩＧ．２ａ〜２ｆに示す。これらは、擬似グループ、対照グループ及びオウゴン処理されたグループにおいて１０分間虚血誘発を行ってから７日後のラットの左海馬の顕微鏡写真である。
【００３８】
冠状縫合後、背部海馬の脳組織断片をクレシルバイオレットによって染色し、広範囲に亘る虚血による海馬ＣＡ１サブフィールドにおいて引き起こされる選択的な遅延性神経損失を表示した。
【００３９】
ＦＩＧ．２ａの擬似グループにおいて、矢印はＣＡ１角錐状神経細胞の軌跡を示す。ＦＩＧ．２ｂに示す海馬組織断片は、ＣＡ１サブフィールド中の角錐状神経細胞の殆どが変化しない（正常な）染色模様を有するため注目に値する。ＦＩＧ．２ｃの対照グループにおいて、矢印で示した角錐層(stratum pyramidale)がわずかに染色され、且つ神経細胞の損傷が、ＣＡ１サブフィールド内でのみ発生した。角錐状神経細胞が凝固して細胞変化を起こし、特有の明らかな神経膠症(gliosis)より損傷されたことがＦＩＧ．２ｄに示されている。１，０００ｍｇ／ｋｇの量のオウゴン抽出物を投与されたグループは、ＦＩＧ．２ｅ及び２ｆに示すように、回復できないほど損傷されたので、それらのＣＡ１サブフィールド中の角錐状神経細胞の数は著しく減少した。ＦＩＧ．２ａ〜２ｆにおいて、長さは１００．０μｍである。
【００４０】
虚血を施さなかった擬似されたラットにおいて、４９０μｍ長の角錐層中の通常の海馬神経細胞を観察した（ＦＩＧ．２ａ及び２ｂ）。
【００４１】
ＦＩＧ．２ｃ及び２ｄに示すように、対照グループにおいてアポプトシスが誘発された。一般に、いくつかの外的又は内的刺激によりアポプトシスが誘発されると、細胞が収縮し、分化により形成されたそれら本来の形状を失う。更に、収縮により周辺細胞との結合が切断され、それによりアポプトシス細胞の近傍の細胞との相互作用が妨げられる。収縮が進行すると、アポプトシス体が形成されるとともに、細胞膜が水泡状に膨れるように見える。虚血誘発後に生理食塩水が投与された対照グループの海馬ＣＡ１サブフィールドにおいて、神経細胞にＦＩＧ．２ｄ中の形状の変化によって検出されるようなアポプトシスが生じたことがわかった。ＦＩＧ．２ｄにおいて、ＦＩＧ．２ｂの現象とは異なり、目的の細胞が周辺細胞から離れるとともにその組織が分解する現象が示される。更に、アポプトシスが発生した神経細胞の細胞体は、それらの特徴的な角錐状形状を失い、一種の単一細胞を形成した。アポプトシスが更に進行すると、核膜(nuclear envelope)の破壊により核クロマチンが濃縮された。一方、薬剤処理されたグループの海馬ＣＡ１サブフィールド中の神経細胞は、ＦＩＧ．２ｅ及び２ｆにより明らかなように、通常の細胞と同じような形状を有する。ここでは、ＣＡ１サブフィールド周辺の壊死神経細胞を成長中の小膠細胞と区別することが非常に困難なので、ＣＡ１サブフィールドの生存可能な角錐状神経細胞のみを計測した。それらの周核体(perikaryons)は健全に発育し、且つ中央に位置するそれらの周辺核は近傍の好中球と明らかに異なるので、これらの細胞は容易に観察することができる。ＦＩＧ．２ｆにおいて、収縮した細胞体とともに、遊離細胞が海馬全体において観察され、このことは、この損傷は、アポプトシスを誘発するのに極めて充分であることを間接的に示す。このような大きな損傷にもかかわらず、多数の細胞がアポプトシスから保護され、正常な角錐形状をなす。また、前述のように、細胞が近隣の細胞との結合を維持することがわかった。これらの結果は、オウゴン抽出物が４-血管閉塞によって引き起こされる損傷から海馬ＣＡ１サブフィールドの神経細胞を保護することを示す。本発明のオウゴン抽出物が、アポプトシス過程のどの段階において、神経細胞の細胞循環を、アポプトシス過程から細胞生存過程へ転ずるかについては確認されていないが、オウゴン抽出物がアポプトシスからの保護に極めて有用であることがわかる（ＦＩＧ．２ｅ及び２ｆ）。
【００４２】
３．オウゴン抽出物の神経細胞における保護効果
オウゴン抽出物を、その神経保護効果を調べるために、大脳虚血の誘発直後（０分）及び９０分後に腹膜内注射した。
【００４３】
体温が３７℃以下に低下しないように調整されたラットにおいて観察された神経保護効果をＦＩＧ．３に示す。虚血誘発直後（０分）及び９０分後に、本発明のオウゴン抽出物を２５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ及び１，０００ｍｇ／ｋｇの投与量で注射した。対照グループには、０．８９％の生理食塩水を２．０ｍｌ／ｋｇの体積で用いた。ヒストグラムを作成するために、３つの脳半球断片において正常であることが観察された１×１ｍｍの大きさを有するＣＡ１角錐状神経細胞を計測し、平均値を算出した。括弧内の数字は使用した実験動物の数を表す。平均値±標準偏差を基準としてヒストグラムをプロットした。スチューデントｔ-検定によって、各試験グループを対照グループと比較して各グループからのデータを分析した（*ｐ＜０．０５）。
【００４４】
生理食塩水が注射された対照グループにおいて、生存可能な細胞数を測定したところ、１ｍｌ当たり４７．８±３．１個(47.8±3.1 cells/ml)であった。これは、１ｍｌ当たりの生存可能な細胞数の測定値が１８１±７．９個(181±7.9 cells/ml)であった擬似グループよりもはるかに低い値である。一方、試験グループで生存可能な細胞数を測定したところ、オウゴン抽出物が１，０００ｍｇ／ｋｇの投与量で注射された場合は１ｍｌ当たり８４．４±１４．７個(84.4±14.7 cells/ml)であり、オウゴン抽出物が５００ｍｇ／ｋｇの投与量で注射された場合は１ｍｌ当たり７８．８±１１．２個(78.8±11.2 cells/ml)であるように、顕著な保護効果がもたらされた（ｐ＜０．０５）。しかし、２５０ｍｇ／ｋｇの投与量では生存可能な細胞数は１ｍｌ当たり６１．４±１４．８個(61.4±14.8 cells/ml)であり、前記測定で確認されたような顕著な神経保護効果はもたらされなかった。効果的に神経を保護する投与量は１，０００ｍｇ／ｋｇ及び５００ｍｇ／ｋｇであり、神経細胞をそれぞれ２７．４％及び２３．２％保護し、これらの保護効果は対照グループよりもはるかに高かった。２つの効果的な投与量の間の相違は大きくない（表２、ＦＩＧ．３）。
【００４５】
【表２】
４．オウゴンの抗酸化効果
ウェル当たり３×１０4個のＰＣ１２細胞を添加し、３７℃でウェルに粘着するのに充分な期間培養した。培養の２１時間後に、粘着細胞を１０．０μｇ／ｍｌ、２０．０μｇ／ｍｌ、５０．０μｇ／ｍｌ又は１００．０μｇ／ｍｌの濃度のオウゴンによって３時間前処理を行い、その後０．５ｍＭのＨ2Ｏ2を含有する新しい培地中で３７℃で２４時間培養した。新しい培地とともに前処理と同じ濃度のオウゴン抽出物も添加した。結果をＦＩＧ．４ａ及び４ｂに示す。１０％のＤＭＳＯ／ＤＰＢＳ溶液によって処理した対照グループと比較するためにスチューデントｔ-検定を行った。ＦＩＧ．４ａにＭＴＴ還元検定 (MTT reduction assay)の結果を平均値±標準偏差（ｎ＝６）で示す。ＦＩＧ．４ｂのヒストグラム中の棒グラフは、ＬＤＨ検定（ｎ＝６）の結果であり、総細胞溶解(total cell lysis)の百分率の平均値±標準偏差を基準として作成した。*ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１であった。
【００４７】
１０．０、２５．０、５０．０及び１００．０μｇ／ｍｌの濃度のオウゴン抽出物によって３時間前処理をした後、同じ濃度のオウゴン抽出物及び０．５ｍＭのＨ2Ｏ2存在下で２４時間粘着細胞に酸化ストレス(oxidative stress)をかけると、ＭＴＴ検定によって測定値した場合、細胞は、対照グループの場合よりも高い、１１３．９％（２５．０μｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０５）、１１１．１％（５０．０μｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０５）及び１１３．７％（１００．０μｇ・ｍｌ、ｐ＜０．０５）の酸化ストレス抵抗性(oxidative stress-resistance)を示すことがわかった（ＦＩＧ．４ａ）。しかし、ＬＤＨ検定によって測定した場合には、オウゴン抽出物によって処理したグループは顕著な抗酸化効果を示さなかった（ＦＩＧ．４ｂ）。
【００４８】
薬効のみを考えた場合、以下の理由から、オウゴン抽出物の神経保護効果は優れている。４-ＶＯモデルによる神経防御の試験において使用するための薬剤としては、グルタメート受容体拮抗剤(glutamate receptor antagonists)、カルシウムチャンネル拮抗剤(calcium channel antagonists)、ＧＡＢＡ神経伝達促進剤(GABA neurotransmission promoters)、ＮＯＳ阻害剤及び抗酸化剤が主に挙げられる。試験データがないのでそれらの効能を比較することはできないが、これらの薬剤の殆どは、１５―２５％の防御効果ももたらし、例えばＬＹ２３１６１７は２５−３０％、Ｌ-ＮＡＭＥは２３％、３-ブロモ-７-ニトロインダゾールは２０％、ＭＫ-８０１（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）は２４％、エリプロジル(eliprodil)（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）は２５％、ＮＢＱＸ（３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）は４２％、７-ＮＩは１７．５％、ＧＹＫ１５２４６６は１１％、ＬＹ３００１６８は２３％である（オニール(O'Neill)M.J.ら、Eur.J.Pharmacol.1996、310）。本草薬(herb medicines)は、それらの殆どが様々な本草の混合物からなるので副作用が極めて少ない。この事実を考慮すると、オウゴン抽出物の重要性はさらに高まる。更に、他の本草の既知のデータと比べると、大黄(rhubarb)は１，０００ｍｇ／ｋｇで１６．８％、５００ｍｇ／ｋｇで１６．３％であり、ガストロディア・エデータ(Gastrodia edata)Ｂ１は、１，２００ｍｇ／ｋｇで１７．８％、６００ｍｇ／ｋｇで１５．６％であり、マグノリア・オボベート(Magnolia obovata)は１，０００ｍｇ／ｋｇで１３．７％であり、大黄、マグノリア・オボベート、ポンシラス・トリフォリエート・ラフィンの果実(fruits of Poncirus trifoliate Rafin)、及びエリゲロン・カナデンシスＬ(Erigeron Canadensis L.)の混合物は、１，０００ｍｇ／ｋｇで１８．４％、５００ｍｇ／ｋｇで１６．６％であるのに対し、本発明のオウゴン抽出物は著しく高い抗酸化作用を有する。
【００４９】
結論
４-血管閉塞によって引き起こされるラットの前脳虚血に対するオウゴン抽出物の神経保護効果の観察により、以下の結論が得られる。
【００５０】
１．オウゴン抽出物を２５０ｍｇ／ｋｇの投与量で注射することにより体温低下は引き起こされなかったのに対し、注射量を１，０００ｍｇ／ｋｇ又は５００ｍｇ／ｋｇに増加すると、大脳虚血の誘発の１時間後から体温低下が始まり、大脳虚血の誘発の６時間後まで低体温が維持された。
【００５１】
２．大脳虚血を誘発した後に体温調節を行う条件下では、１，０００ｍｇ／ｋｇ及び５００ｍｇ／ｋｇの量でオウゴン抽出物を注射することにより大脳虚血が誘発された場合の神経細胞の損傷からラットが保護され、オウゴン抽出物を注射しなかった場合よりも、１，０００ｍｇ／ｋｇの投与量の場合には２７．４％、５００ｍｇ／ｋｇの投与量の場合には２３．２％高い効果を示した。
【００５２】
３．オウゴン抽出物の神経保護効果が抗酸化と関連するか否かについて研究した。１０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、及び１００μｇ／ｍｌの濃度のオウゴン抽出物によって前処理をした後、同じ濃度のオウゴン抽出物存在下で、０．５ｍＭのＨ2Ｏ2によって酸化ストレスをかけると、ＭＴＴ検定によって測定した場合、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌの濃度のオウゴン抽出物によって処理されたグループから、Ｈ2Ｏ2による細胞損傷に対する顕著な防御効果が得られた。また、１０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌの濃度のオウゴン抽出物は、ＮＯ生成に対する顕著な阻害作用を示した。
【００５３】
４．オウゴン抽出物は、１０μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌの投与量に依存した態様でＢＶ２細胞におけるＴＮＦ-αの生成を阻害した。
その結果、オウゴン抽出物が４-血管閉塞により引き起こされる前脳虚血による神経細胞の損傷に対する保護作用を示すことにより、神経細胞がアポプトシスへの抵抗性を有するようにし、且つＴＮＦ-α生成を阻害し、並びに抗酸化作用を示すようにすることができることが観察された。これらの作用により、オウゴン抽出物は神経保護剤(neuroprotectant)として使用することができる。
【００５４】
実施例３
急性毒性試験
１．経口投与
ＩＣＲ系マウス（生後２５±５週）を１０匹ずつ４つのグループに分類し、オウゴン抽出物を、５００、７２５、１，０００及び５，０００ｍｇ／ｋｇの投与量でそれぞれ経口投与した。スプレーグ・ダウリー(Sprague Dawley)系マウスを１０匹ずつの４つのグループに分類し、同様の経口投与を行った。経口投与後４週間は、いずれのグループのマウスも死ななかった。また、被投与グループと対照グループとの間には、外見上の違いはなかった。
【００５５】
２．腹膜投与
ＩＣＲ系マウス（生後２５±５週）を１０匹ずつ４つのグループに分類し、２５、２５０、５００及び７２５ｍｇ／ｋｇの投与量でそれぞれ腹膜内注射を行った。スプレーグ・ダウリー系マウスを１０匹ずつの４つのグループに分類し、同様の腹膜注射を行った。腹膜投与後４週間は、いずれのグループのマウスも死ななかった。また、被投与グループと対照グループとの間には、外見上の違いはなかった。
【００５６】
上記の結果から、本発明のオウゴン抽出物は急激な毒性を持たないという結論が得られる。
従って、本発明のオウゴン抽出物は、神経系機能障害の予防及び治療における使用に適した薬剤に調製することができる。この点において、この抽出物は、薬学的に適用可能な手段(expedients)及びキャリアー(carriers)とともに用いることができ、注射、液体、シロップ、丸薬、カプセル等のいずれの形状でも使用することができる。
【００５７】
本発明のオウゴン抽出物は、患者の性別、年齢、体重及び病気の程度によって１日当たり１０ｍｇ〜５，０００ｍｇの投与量を１〜３回にわけて投与することもできる。
【００５８】
以下の配合例により本発明をより具体的に説明する。
【００５９】
【００６０】
【００６１】
【００６２】
上記の実施例において得られたデータを総合すると、本発明のオウゴン抽出物及びその薬剤が毒性なしに神経保護作用を示すため、脳卒中、パーキンソン病及び痴呆症のような脳疾患の予防及び治療における使用に適している。
【００６３】
本発明は、例示的に記載され、使用された専門用語は限定するよりもむしろ説明することを目的としている。
本発明の多くの修正及び変形は、上記の説明に照らして可能である。それ故、添付の特許請求の範囲内で、本発明は具体的に説明された以外の別の方法で実施することもできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】体温を調整しなかった場合の虚血誘発及び再灌流の完了後のラットの体温をオウゴン抽出物の注射からの時間に対してプロットした曲線を示す（ＦＩＧ．１ａ）。
【図２】体温を外的に調整した場合の虚血誘発及び再灌流の完了後のラットの体温をオウゴン抽出物の注射からの時間に対してプロットした曲線を示す（ＦＩＧ．１ｂ）。
【図３】擬似グループのラットの１０分間虚血誘発を行ってから７日後の左海馬の顕微鏡写真を示す（ＦＩＧ．２ａ）。
【図４】擬似グループのラットの１０分間虚血誘発を行ってから７日後の左海馬の顕微鏡写真を示す（ＦＩＧ．２ｂ）。
【図５】対照グループのラットの１０分間虚血誘発を行ってから７日後の左海馬の顕微鏡写真を示す（ＦＩＧ．２ｃ）。
【図６】オウゴン処理されたグループのラットの１０分間虚血誘発を行ってから７日後の左海馬の顕微鏡写真を示す（ＦＩＧ．２ｄ）。
【図７】オウゴン処理されたグループのラットの１０分間虚血誘発を行ってから７日後の左海馬の顕微鏡写真を示す（ＦＩＧ．２ｅ）。
【図８】オウゴン処理されたグループのラットの１０分間虚血誘発を行ってから７日後の左海馬の顕微鏡写真を示す（ＦＩＧ．２ｆ）。
【図９】１０分間虚血誘発を行ってから７日後のオウゴン抽出物の投与量に依存した態様の神経保護効果を示すヒストグラムである（ＦＩＧ．３）。
【図１０】ＭＴＴ検定によって測定されたオウゴン抽出物の抗酸化作用のヒストグラムを示す（ＦＩＧ．４ａ）。
【図１１】ＬＤＨ検定によって測定されたオウゴン抽出物の抗酸化作用のヒストグラムを示す（ＦＩＧ．４ｂ）。
Claims (2)
- メタノール、エタノール、水、またはそれらの混合物中にオウゴン(Scutellariae Radix)を浸漬し、超音波処理して抽出し、得られた抽出溶媒を濃縮し、得られた濃縮物を凍結乾燥することにより調製されるオウゴン抽出物を薬学的有効成分として薬学適用可能な基剤とともに含む脳卒中、パーキンソン病及び痴呆症を含む脳疾患の治療のための医薬組成物。
- 脳卒中、パーキンソン病及び痴呆症を含む脳疾患の予防及び治療のために用いられる請求項１に記載の医薬組成物。
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