JP4361279B2 - アファミンと組み合せたビタミンｅ製剤 - Google Patents

Description

本発明は、アファミンと組み合わせたビタミンＥ製剤に関するものである。

アファミンは、アルブミン群に属し、この群のタンパク質、即ちヒト血清アルブミン、ヒトα−フェトプロテイン又はヒトビタミンＤ結合タンパク質と同様に、構造的及び生化学的に多くのものを有する８７ｋＤａのタンパク質である。アファミンはすでにクローニングされ、配列決定されているため、組換え型も入手可能である（ＷＯ９５／２７０９５９）。

配列相同性の他に、アファミンの機能はほとんど知られていない。アファミンがステロール結合部位を有する可能性が議論されているが、おそらくアクチンには結合しない。刺激的だが圧倒的ではないアファミンとアルブミンとの相同性により、これらのタンパク質が同一リガンドに結合すると疑われている（Lichenstein et al., The Journal of Biological Chemistry, 269 (27) (1994), pp. 18149-18154）。

生化学的及び生理学的な試験は、アファミンがビタミンＥ結合特性を有することを示しており、血液中だけでなく、他の体液又は器官液、例えば髄液、卵胞液及び精液にも見られる。哺乳動物の生殖能を決定するためのアファミンの使用は、ＷＯ０１／０１１４８ Ａｌに記載されている。

ビタミンＥ又はビタミンＥ群は、クロマン構造及びＣ₁₆側鎖を有する脂溶性天然化合物（トコフェロール）を総合した用語として用いられている。トコフェロールは、２位が４，８，１２−トリメチルトリデシル残基で置換されている、クロマン−６−オール（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−オール）である。トコフェロールは、水に不溶だが、脂質及び油、並びに脂質用の通常の溶媒に溶解性の、わずかに黄ばんだ赤みを帯びた油性液体である。とりわけ、α−、β−、γ−、δ−トコフェロールとε−トコフェロールとの間で区別されており、後者は依然として本来の不飽和フェニル側鎖、並びにピラン環系が開裂しているα−トコキノン及びヒドロキノンを有する。最もよくある最も有効な天然のトコフェロールは、α−トコフェロール（２Ｒ，４’Ｒ、８’Ｒ）型であり（慣用名：ＲＲＲ−α−トコフェロール）、他の全ての立体異性体と同様、合成により入手可能である（Rompp Chemie-Lexikon, 10^th Edition, pp. 4572-4573 and 4878-4886）。

もとは抗不妊性ビタミンとして記載されているが、今日では、ビタミンＥ群は主に超過酸化物ラジカル及び過酸化物ラジカルのスカベンジャーとして、不飽和脂肪酸、ＬＤＬ、ビタミンＡ及びカロテンに対する抗酸化剤として、作用するという意見が支配的である。ビタミンＥはまた、炎症阻害及び免疫機能に重要な役割を果たしていると考えられる。

したがって、ビタミンＥ製剤は、主に、ヒト及び動物の循環刺激剤及び脂肪軽減剤に使用されている。

本発明の目的はアファミンの新規な医薬応用を提供することである。更に、特にその抗酸化性に関し改善された活性を有するビタミンＥ製剤が提供される。
本発明によれば、この目的はアファミン含有製剤、特にビタミンＥとの組み合わせによる製剤により達成され、これを用いて酸化ストレス治療用、特に神経変性性疾患の治療用製剤を製造することができる。本発明によれば、驚くべきことに、ビタミンＥとアファミンを組み合わせることにより、改善された特性を有するビタミンＥ製剤、特に増大した抗酸化作用を有するビタミンＥ製剤を提供できることが見い出された。

発明の詳細な説明

アファミンに関し、多くの様々な機能が主張されているが（主に、脂肪酸、ホルモン、酵素、色素、微量元素及び薬物の輸送系として、そして直接抗酸化剤として（ＷＯ９５／２７０５９号を参照））、本発明によれば、更に、アファミン自体が（ビタミンＥがなくても）神経保護機能を有し、この効果はビタミンＥの存在により、驚くべき相乗効果により増大することが示されている。したがって、本発明によれば、主に広範に応用される抗酸化ストレスを治療するためのアファミンとビタミンＥとの組み合わせ製剤が提供される。本発明によれば、アファミンとビタミンＥとの組み合わせは、抗酸化ストレスに関連する神経変性性疾患の治療に特に好適であることが示されている。

これまで、先に主張されているアファミンの適用（ＷＯ９５／２７０５９号を参照、とりわけ慢性関節リウマチ、ＡＲＤＳ、敗血症、動脈硬化症などへの使用が可能であると考えられているが、それらの証明を提供すること又はもっともらしいモデル試験を提示することは可能となってはいない）を確認することが可能ではなかったことが驚きである。より予想外であるのは、主にビタミンＥとの組み合わせによるアファミンが（例えば、アルブミン群の他のタンパク質の公知の結合パートナーであるビタミンＤとの組み合わせではない）、それぞれの成分と比較して、有意に改善された抗酸化作用を発揮することである。

本発明によれば、初めに記載したような全ての天然及び合成の生物学的に活性なトコフェロール製剤、特に天然由来のトコフェロール製剤、特に例えばダイズ、コムギ、トウモロコシ、コメ、綿、ムラサキウマゴヤシ及びナッツのような植物油由来、並びに例えばラズベリー、インゲン豆、エンドウ豆、ウイキョウ、ピーマン、ブラック・サルシファイ及びセロリのような果実及び野菜由来の製剤が、ビタミンＥにより理解される。また、例えば酢酸トコフェリル、コハク酸トコフェリル、ニコチン酸トコフェリル、トコフェリル−ポリ（オキシエチレン）−スクシネートのような誘導体を含む、合成により製造されたトコフェロール製剤は、本発明の範囲内において有用である（Rompp Chemie-Lexikon, pp. 4572-4573を参照）。

本発明によれば、アファミンにより、天然アファミンに共通する生物活性を有する全てのポリペプチド、特に種々のグリコシル化型、脱グリコシル化型、非−グリコシル化型、脂質付加型又は脱脂質型、及び組換え技術により製造されたアファミン変異体が理解される。アファミンの詳細な構造の定義は、例えば本明細書中に援用されるＷＯ９５／２７０５９号に与えられている。更に、組換えにより又はタンパク質分解により製造された単離サブドメイン、並びに化学的に誘導又は改変した形態（例えばリジン側鎖の、例えばアセチル化による）、及び組換えにより又は化学的に製造された、例えば血液脳関門の通過を促進させる機能ペプチド（例えばMazel et al. (Anticancer Drugs 12(2) (2001), 107-116), Temsamani et al. (Pharm. Sci. Technol. today 3(5) (2000), 155-162), Rousselle et al. (Mol. Pharmacol. 57(4) (2000) 679-6866), Rousselle et al. (J. Pharmacol. Exp. Ther. 296(1) (2001), 124-131に記載されている）が付加されたタンパク質の伸長型が含まれる。

多くの急性及び慢性神経障害、特に巣状虚血、外傷、てんかん、ハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ＡＩＤＳ、痴呆、及び他の神経変性性疾患にフリーラジカルが関与している。更に、外傷性脳障害において、反応性酸素種（ＲＯＳ）の関与が示唆されている実験が増加しつつある。また、年齢の増加と共に起こる種々の受容体系の感受性の低下は、酸化ストレスに対する反応低下が増加していることを示す。

グルタメート−誘導細胞毒性は、抗酸化作用に関し化合物を試験するのに有用なモデル系である（Kabayashi et al., Free Radic Res., 32 (2000), 115-124）。Ｈｔ−４神経細胞におけるグルタメート−誘導細胞毒性は、細胞性グルタチオンの減少により引き起こされる酸化ストレスによると考えられている。グルタメートは、システインの取り込みをブロックすることにより、ラットの皮質神経及びマウスの海馬ＨＴ−２２細胞株においてアポトーシスを誘発し、これにより細胞内グルタチオンが減少する。続いてこれはＲＯＳの濃縮をもたらす。低濃度のα−トコフェロールは、神経細胞を細胞毒性から保護するのに非常に有効であることが証明された。

ハンチントン病の神経病理はグルタメート共役イオンチャネルの過剰な活性化により引き起こされ、これにより神経が酸化ストレスによって破壊される。
α−トコフェロールは、細胞膜の酸化ラジカル障害を予防する可能性があり、このような製剤に関し、ハンチントン病の進行の遅延が議論されている。特に、抗酸化療法は、ハンチントン病の進行において、運動能力減少速度を遅延させる可能性がある（Peyser et al., Am. J. Psychiatry, 152 (1995), 1771-1775）。

家族性ＡＬＳに関連する２つの変異体スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の発現は、分化したＰＣ１２細胞、上頚神経節神経及び海馬の錘体ニューロンの細胞死を引き起こす（Chadge et al., J. Neurosci, 17(22) (1997), 8756-8766）。細胞死の際、アポトーシスに典型的な多くの特徴が見いだされるであろう。この細胞死は、ビタミンＥによる有効な治療により予防されるかもしれない（Chadge et al., J. Neurosci, 17(22) (1997), 8756-8766）。

線条体は高濃度の酸化可能なドーパミンを含有する。高齢の生物は、酸化ストレスへの応答能が減少し、これによりこの領域はフリーラジカルにより引き起こされる障害が疑われる。ドーパミンニューロンはそのような障害及び疾患に特に好適である。ドーパミンニューロンの損失は、パーキンソン病に関連する。例えば、この例において、有害な酸素フリーラジカルが蓄積される。α−トコフェロールはドーパミン及びＬ−ドーパにより引き起こされる細胞毒性効果から細胞を保護することが可能であるかもしれない（Ebadi et al., Prog. Neurobiol. 48(1) (1996), 1-19）。

ダウン症候群に苦しむ個人に慢性酸化ストレスが起こることを示す説得力のある疫学的証拠及びin vitroの証拠も存在する（Javanovic et al., Free Radic. Res., 9 (1998), 1044-1048）。このような患者は、３０〜４０歳から脳にアルツハイマー病様の変化を示す。ダウン症候群の神経の生存率の低下がビタミンＥのような抗酸化剤により変化し得ることがin vitro研究において示されている。食物単独でこのような酸化剤を摂取することは、酸化ストレスのバイオマーカーに関し、十分な変化又は改善を引き起こすようには見えない。

酸化障害は、てんかん、外傷及び脳虚血状態、例えば卒中のような急性変性性疾患にも関連している。これらの神経障害において、抗酸化療法が常に好適であると考えられているが、これまで有効な手段がなかった。

ドーパミン受容体アンタゴニストであるハロペリドールは、分裂病及び他の関連疾患の治療によく処方される。酸化ストレスは、ハロペリドールの主な臨床的副作用の１つであると考えられている。この化合物は、マウス海馬のＨＴ２２細胞に対し、濃度依存的な様式で致死的であり、酸化ストレスによる細胞死を引き起こす。ＨＰ−誘導酸化的細胞死は、ビタミンＥ製剤により最もよく予防することができる（Post et al., J. Neurosci, 18(20) (1998), 8236-8246); Sagara, J. Neurochem. 71(3) (1998), 1002-1012）。分子レベルにおいて、ハロベリドールは特異的にレドックス感受性転写因子ＮＦ−κＢの活性を誘発する。この増強されたＮＦ−κＢ活性は、神経保護抗酸化剤によりブロックされるであろう。

抗酸化酵素の効果がアルツハイマー病において相反するものであっても、グルタチオン−ペルオキシド活性又はスーパーオキシド−ジスムターゼ活性の変化は、多くの研究者により観察されており、酸化ストレスがアルツハイマー病においても重要な役割を果たすことを示唆する多くのヒントがある。とりわけ、ビタミンＥのようなフリーラジカルを捕捉可能な物質、セレギリン及びイチョウ抽出物Ｅｇｂ７６１が、アルツハイマー病患者の治療に陽性の効果を示すことが示されている（Christen, Am. J. Clin. Nutr., 71(2) (2000), 621s-629s）。

これらの理由により、本発明のアファミン、特にアファミンとビタミンＥとの組み合わせ製剤は、アルツハイマー病、ハンチントン病又は筋萎縮性側索硬化症の治療に好ましく使用される。

したがって、本発明の組み合わせ製剤は、例えばこれらの疾患と共に起こる神経変性性痴呆の治療に特に有用である。
更なる態様において、本発明は、急性神経変性性疾患、特にてんかん、外傷及び脳虚血（例えば卒中）の治療用製剤を製造するための、アファミンの使用、特にビタミンＥとの組み合わせによる使用に関する。

上記の理由により、アファミン又は本発明の組み合わせ製剤は、パーキンソン病の治療、又はダウン症候群に苦しむ患者に起こる、アルツハイマー病に類似する変化の治療にも好適である。

本発明の他の態様によれば、薬物治療の副作用として起こる酸化ストレスも、アファミン又は本発明の組み合わせ製剤により予防することができる。その際、アファミン又は本発明の組み合わせ製剤は、それぞれの薬物と共に与えることもできるし、別々に投与することもできる。

これら全ての適応症に対し、陽性の治療又は予防効果がすでに記載されているか、あるいは少なくとも当該分野の専門家によりもっもらしく主張されている。本発明によれば、ビタミンＥ製剤の抗酸化作用が明確に改善された本発明の組み合わせ製剤を用いて、これらの適応症をより有効に治療若しくは予防し、又は少なくとも進行を遅延させることができる。

アファミン又は本発明の組み合わせ製剤は、全てのこうした疾患に、治療的に及び予防的に用いることができ、これにより典型的に見られる症状の発症が予防され、又は疾患の進行が遅延する。したがって、本発明はまた、神経保護製剤を製造するための、アファミン又はその進歩的な組み合わせ製剤の使用に関する。

更なる態様において、本発明は、不妊疾患の治療用製剤を製造するための、アファミンの使用、特にビタミンＥとの組み合わせによる使用に関する。本発明によれば、不妊疾患はアファミンの助けにより有効に治療され得ることが示されている。更に、もともと稔性因子として公知となっているビタミンＥは、アファミンとの組み合わせにより、それ自体公知の妊性効果を明確に改善することができる。

更なる態様によれば、本発明は、増大した抗酸化作用を有するビタミンＥ製剤に関するものであり、これは、合成又は天然由来のビタミンＥ製剤に加えて、アファミンを含有することを特徴とする。好ましくは、アファミン及びビタミンＥは、ビタミンＥ／アファミンのモル比が２０：１００である。この比は、１８分子のビタミンＥによるアファミン分子の理論上の最大負荷を考慮するものである（図３を参照）。特に、グリコシル化の様式、脂質含量又はアミノ酸配列において天然のヒトアファミンとは異なっていてもよい組換えアファミンを用いることができる。

有用な医薬担体物質の他に、更に、本発明の製剤に、医薬的に有効な成分、例えばある種の適用に関しすでに公知の成分も混合させることができる。
本発明を以下の実施例及び図面によってより詳細に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。

３−ＮＰ（３−ニトロプロピオン酸）により誘導されたグルタミン合成（ＧＳ）活性の減少
３−ＮＰ病変とハンチントン病（ＨＤ）との機構的及び病理的類似性より、３−ＮＰは代替ＨＤモデルとして提唱されている。マロネート及び３−ＮＰはコハク酸デヒドロゲナーゼのインヒビターであり、ＨＤにおいて観察されるものと類似のエネルギーの損失及び病変を生ずる。３−ＮＰの全身投与は、ＨＤのものに相当する進行性歩行悪化を引き起こす。３−ＮＰは高度に選択的な線条体の変性を引き起こす。３−ＮＰがミトコンドリアのクエン酸回路を不可逆的に阻害し、ＡＴＰ値の減少及びラクテート濃度の増加をもたらすという点で、興奮毒性病変とは機構的に異なる。

アッセイ
脳球状体を抽出して１週間培養後、Ｄ、Ｌ−α−トコフェロール（０．１ｍＭ）を培地に添加した。２週齢の球状体を６ウェルプレートに播いた。曝露後すぐに培地を２ｍｌの新鮮培地と交換した。球状体を、３−ＮＰ（０．５及び５ｍＭ、ｐＨ７〜８に調製）に、又は保護物質であるビタミンＥ（０．１ｍＭ）、グルタチオン（１ｍＭ）、ＤＴＴ（０．２５ｍＭ）、ＬＮＡＭＥ（Ｎ（Ｇ）−ニトロ−Ｌ−アラニン−メチルエステル）（０．１ｍＭ）、アファミン（ビタミンＥ（０．３及び３μｇ／ｍｌ）なし）若しくは３−ＮＰと保護物質との組み合わせに５日間曝露した。２日後、新たに調製した３−ＮＰ及び保護物質を培地に添加した（Mathews et al., J. Neurosci, 18(1) (1998), 156-163); Borlongan et al., Neurosci Biohav. Res. 21(3) (1997), 289-293）。

結果を図１に示す。３−ＮＰによる不活性化からのグルタミン合成酵素（ＧＳ、酸化ストレスに非常に感受性の高い星状細胞の酵素）の保護に関し、試験した全ての物質の中で、アファミンが断然最も高い効果を有することを示している。上記のように、３−ＮＰを用いるこの系は、興奮毒性の認知されたモデルであり、ハンチントン病のモデルとして役立つ。

ニワトリ胚の単離皮質神経における神経保護効果
アファミンの神経保護効果を、ニワトリ胚の単離皮質神経をアッセイすることにより調べた。低血清アッセイ及び２つの病変アッセイ、即ちＰ−アミロイド病変アッセイ及びＨ₂Ｏ₂病変アッセイにおいてアファミンの効果を試験した。

低血清アッセイ又は病変アッセイの後、ＭＴＴアッセイを用いて神経細胞の生存率をチェックする（ＭＴＴ＝３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−チアゾリウムブロミド）。これは非常に再現性のある好適なモデルである。また、この試験は非常に多くの試料をアッセイすることを可能にし、物質の活性に関する用量依存性の差を評価することができる。

ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける神経の細胞生存率は、この比色ＭＴＴ試験により測定することができる。ＭＴＴアッセイは、ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ（例えばコハク酸デヒドロゲナーゼ）による、黄色物質ＭＴＴの暗青色ホルマザン結晶への代謝減少に基づいている。結晶を溶解し、分光学的吸収を好適な波長において測定する。死細胞はＭＴＴを分解することができないことが証明されるであろう；休眠細胞はホルマザンをほとんど産生せず、従って、この反応は生存する活発な細胞によってのみ触媒されるため、このアッセイは細胞生存率の定量に用いることができる（Mosmann et al., J. Immunol. Meth. 65(1983), 55; Bernabei et al., Hemat. Oncol. 7 (1989), 243; Barltrop et al., Bioorg. & Med. Chem. Lett. 1 (1991), 611; Cory et al., Cancer Commun. 3 (1991), 207）。

詳細には、８週齢（病変アッセイ）又は９週齢（低血清アッセイ）のニワトリ胚（White Leghorn又はLohman Brown Hybrid strain）の単離皮質神経を用いた。
神経は、エタノールで処理した卵を破壊し、胚をプラスティックディッシュにおいて調製した。断頭切除後、脳半球を取り出して集めた。遊離組織及び髄膜を除去し、脳半球を機構的に解離させた。

６×１０⁵細胞／ｍｌ栄養培地を含有する８０μｌの細胞懸濁液を、すでに８０μｌの培地（物質を含むか又は含まない）を含むマイクロタイタープレートの各ウェルに添加した。プレートを、３７℃、湿度９５％及び５％ＣＯ₂で培地交換をせずに（８分裂まで）維持した。

低血清培地は、１ｇ／ｌ グルコース、２％ウシ胎仔血清、０．０１％ゲンタマイシン及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含む、１００ｍｌのＤＥＭＥＭを含有する。病変アッセイ用栄養培地は、４．５ｇ／ｌ グルコース、５％ウシ胎仔血清、０．０１％ゲンタマイシン及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含む、１００ｍｌのＤＭＥＭを含有する。

８分裂のとき、細胞を、２０μＭの前もって凝集させたＰ−アミロイドペプチド（Ａβ_25-35；Ｓｉｇｍａ）で７２時間、又は１００μＭ Ｈ₂Ｏ₂で２４時間処理した。
各実験の最後に、培養物の生存率を、ＭＴＴアッセイにより、プレートリーダーを用いて５７０ｎｍで試験した。

結果を図２ａ〜図２ｃに示す。結果は、アファミン、ビタミンＥ、そしてとりわけこれら２つの物質の組み合わせが、対照アッセイにおいて観察される、２％低血清培地（図２ａ）におけるアポトーシス及びＰ−アミロイドペプチド又はＨ₂Ｏ₂による障害を減少させることができたことを示している。

種々の保護物質存在下において３−ＮＰで５日間処理後のグルタミン合成活性を示す図である。 アファミン及びアファミンとビタミンＥとの組み合わせが、血清を２％まで部分的に減少させることにより誘引される神経細胞死から保護することを示す図である。 アファミン及びアファミンとビタミンＥとの組み合わせが、１００μＭ Ｈ₂Ｏ₂により誘引される神経細胞死から保護することを示す図である。 アファミン及びアファミンとビタミンＥとの組み合わせが、２０μＭの前もって凝集させたβ−アミロイドペプチドにより誘引される神経細胞死から保護することを示す図である。 アファミンに対するビタミンＥの結合についてスキャッチャードプロット解析を行った図である。

Claims (6)

1. 神経変性性疾患を治療するための、アファミンを含む医薬組成物。
2. さらにビタミンＥを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 神経変性性疾患が、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、神経変性性痴呆、急性神経変性性疾患、パーキンソン病、及びダウン症候群に苦しむ患者において生じるアルツハイマー病と類似の変化から成る群より選択される、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
4. 急性神経変性性疾患が、てんかん、外傷、及び脳虚血からなる群より選択される、請求項３の医薬組成物。
5. 酸化ストレスに関連する薬物の適用による副作用を治療するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
6. 神経保護剤として使用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

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