AT507325A1 - Verwendung von afamin - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft Afamin-Inhibitoren. die Verwendung von Afamin und Vitamin E wurde 1922 von Evans und Bishop als fettlöslicher Faktor entdeckt, der für die normale Fortpflanzung bei Ratten notwendig ist. Seither wird der Mangel an Vitamin E mit verschiedenen chronischen Erkrankungen, wie Arteriosklerose, ischämische Herzerkrankung, Immunmangel, verschiedene Arten von Krebs und neurologischen Syndromen in Zusammenhang gebracht, die eine starke oxidative Stresskomponente aufweisen und erfolgreich mit einer Vitamin E-Nahrungsergänzung behandelt werden können. Die zentrale Rolle von Vitamin E zur Aufrechterhaltung der physiologischen Zell- und Gewebefunktion wurde daher zwei primären Faktoren zugeschrieben: als potenter Scavenger und Antioxidans von reaktionsfähigen Sauerstoff- und Stickstoffspezies und, vor kurzem, als Modulator von Zellfunktionen, wie Adhäsion, Proliferation und Apoptose.

Aufgrund seiner Hydrophobie und primären Anordnung in der Plasmamembran erfordert Vitamin E besondere Träger/Transportmechanismen in der wässrigen Umgebung von Plasma, anderer Körperflüssigkeiten und Zellen. Dietätisches Vitamin E wird gemeinsam mit Lipiden durch Schleimhautzellen des proximalen Darms absorbiert, im Golgi-Apparat zu Chylomikronen formiert und über lymphatische Flüssigkeit in den Kreislauf sezerniert. Vitamin E enthaltende Chylomikronen werden dann teilweise im Plasma zu Chylomikronresten abgebaut und von spezifischen hepatischen Rezeptoren aufgenommen. Im Gegensatz zu der unspezifischen Vitamin E-Aufnahme durch Darmzellen arbeitet die Leber vorzugsweise Alpha-Tokopherol in naszierendes VLDL ein, das in den Blutstrom sezerniert und durch die lipolytische Kaskade zu LDL und HDL umgewandelt wird. Vitamin E wird vorzugsweise durch LDL-Rezeptor vermittelte Aufnahme an Gewebe, wie Niere, Nebennieren, Eierstöcke und Fettgewebe abgegeben oder als

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Alternative über HDL an andere Gewebe mit oder ohne Internalisierung von Lipoprotein. Während der Vitamin E-Transport durch das Plasma-Lipoproteinsystem gut dokumentiert und allgemein verständlich ist (1), ist wenig über seinen Transport in anderen Körperflüssigkeiten bekannt. Gehirn- und Rückmarksund Follikelflüssigkeit des Menschen mangelt es an triglyceridreichen, Apolipoprotein B-haltigen

Lipoproteinen, die die Vitamin E-Hauptträger in Plasma sind. Stattdessen enthalten sie HDL-Partikel, die sich qualitativ und quantitativ von jenen in Humanplasma unterscheiden. Der Transportmechanismus von Vitamin E in diesen Körperflüssigkeiten ist weitgehend unbekannt. Die Suche nach einem Vitamin E-Trägerprotein führte zu Afamin, einem Mitglied der Albumin-Genfamilie (2, 3, 4).

Afamin ist ein 75 kDa Humanserumglykoprotein mit Vitamin E-Bindungseigenschaften. Das Afamin-Gen liegt auf Chromosom 4qll-ql3 als Teil der Albumin-Genfamilie. Diese Familie besteht aus Humanserumalbumin (HSA), Vitamin D-Bindungsprotein (DBP), Afamin und Alpha-Fetoprotein (AFP). Albumin, das am reichlichsten vorhandene Plasmaprotein, weist mehrere Funktionen auf, wie Transport und Abgabe von Metaboliten und Fettsäuren, wie auch Regulierung des osmotischen Drucks in Blut. Aus einem Sequenzvergleich mit DBP wurde spekuliert, dass Afamin auch Sterol-Bindungseigenschaften besitzen könnte (2, WO95/27059 Al).

Afamin wird vorwiegend in der Leber exprimiert und in das Plasma sezerniert. Eine wesentliche Expression wurde auch in der Niere und den Hoden beobachtet. Signifikante Mengen wurden auch in Follikel- und Samenflüssigkeit nachgewiesen, was mögliche Aufgaben für Afamin beim Vitamin E-Transport in diesen Körperflüssigkeiten mit einer möglichen Bedeutung für die Fruchtbarkeit nahe legt. Da die meisten Proteine in Gehirn- und Rückmarks- und Follikelflüssigkeit des Menschen von Plasma stammen, wurde Afamin auch bis zur Homogenität mit Vitamin E-Bindungseigenschaften aus Humanplasma unter Verwendung

NACHGEREICHT • · • · - 3 - radioaktiv markierten Alpha-Tokopherols gereinigt. Seine Aktivität wurde durch mehrstufige Chromatographie von Lipoprotein-verarmtem Plasma verfolgt (3, 4) . Afamin wurde zuvor als Glykoprotein mit vier oder fünf möglichen N-Glykosylierungsstellen beschrieben. Die Glykosylierungsanalyse zeigte, dass >90% der Glykane sialylierte biantennäre komplexe Strukturen sind.

Es zeigte sich auch, dass Afamin-Plasmakonzentrationen mit der Dauer einer Schwangerschaft beim Menschen Zusammenhängen, was wieder auf einen Zusammenhang zwischen Afamin und Fruchtbarkeit hinweist. Afamin-Plasmawerte schwangerer Frauen stiegen im Verlauf einer normalen Schwangerschaft durchschnittlich um 50%. Afamin korreliert positiv mit der Follikelgröße und -reifung.

Afamin wird daher als Fruchtbarkeits-Marker (W001/01148 Al) verwendet. Es ist auch ein Tumormarker für Tumore der Fortpflanzungsorgane (W02006/079136 Al). Aufgrund seiner spezifischen Eigenschaften kann es für die Behandlung oxidativen Stresses verwendet werden, insbesondere in Kombination mit Vitamin E (W002/087604 A2) .

Vitamin E wurde auch in Follikel-, Samen-, und Gehirn-und Rückenmarksflüssigkeit nachgewiesen und es zeigte sich, dass es mit der Eierstockfollikelreifung, Spermamotilität und neurodegenerativen Erkrankungen, wie der Alzheimer und Parkinson Krankheit, in Zusammenhang steht, wodurch seine zentrale Bedeutung für Fortpflanzungs- und neurologische Funktionen betont wird.

In einer kürzlich durchgeführten Studie wurden die Vitamin E-Bindungseigenschaften von Human-Afamin durch einen Radioligand-Assay, gefolgt von einer Scatchard-und-Hill-Analyse untersucht, die eine Bindungsaffinität von Afamin sowohl für Alpha- wie auch Gamma-Tokopherol zeigte (4) . Die Bindungsdissoziationskonstante wurde mit 18 μΜ bestimmt, was darauf hinweist, dass Afamin eine Rolle als Vitamin E-Träger in Körperflüssigkeiten wie Humanplasma und Follikelflüssigkeit unter physiologischen Bedingungen spielt. In dieser Studie wurde ferner gezeigt, dass Afamin | NACHGEREICHT | 4 mehrere Bindungsstellen sowohl für Alpha- wie auch Gamma-Tokopherol hat. Schließlich wurden ein Homologie-Modell und Andockberechnungen an der vorhergesagten tertiären Struktur von Afamin durchgeführt, die eine Übereinstimmung zwischen berechneten und In-Vitro-Ergebnissen zeigten. Die Vitamin E-Bindungseigenschaften wurden unter Verwendung von rekombinant exprimiertem Afamin bestätigt.

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, weitere Anwendungen von Afamin- und von mit Afamin zusammenhängenden Stoffwechseleigenschaften bereitzustellen.

Daher stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Afamin für die Herstellung eines pharmazeutischen Präparates für die Prävention oder Behandlung von Fruchtbarkeitsstörungen bereit.

Im Laufe der vorliegenden Erfindung wurden weitere Untersuchungen der Rolle von Afamin in der Fruchtbarkeit durchgeführt. Eine relativ hohe Konzentration von Afamin in Follikelflüssigkeit führte zu der Annahme, dass Afamin eine Rolle in der Reifung von Follikeln spielt. Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass Afamin-Konzentrationen in Follikelflüssigkeit nicht nur mit Afamin-Konzentrationen in Plasma korrelierten, sondern auch mit der Größe und daher Reifung von Follikeln. Die Vitamin E-Assoziation von Afamin in Follikelflüssigkeit wurde direkt durch Gelfiltrationschromatographie und Immunpräzipitation nachgewiesen, die die In-Vitro-Befunde für gereinigtes natives und rekombinantes Afamin bestätigt (3).

Zur ausführlichen Untersuchung der physiologischen Rolle von Afamin wurden Gen-Knock-out Mäuse geschaffen und charakterisiert. Chimäre (teilweise Afamin-Knock-out) Mäuse hatten nicht nachweisbare Afamin-Blutwerte und waren vollständig unfruchtbar. Homozygote Afamin-Knock-out Tiere konnten daher nicht gezüchtet werden. Eine histologische Charakterisierung männlicher chimärer Tiere zeigt eine beeinträchtigte/dysfunktioneile Spermiogenese, weibliche Tiere waren histologisch frei von pathologischen Befunden,

NACHGEREICHT • · · · « ·· I ··* ··· • · · · · · · ·· · · • · · · · ·· ·· · · 5 -....... aber ebenso unfruchtbar. Eine Ergänzung mit rekombinant erzeugtem, murinem Afamin durch eine konstante Diffusionspumpenvorrichtung führte zu einer

Wiederherstellung einer normalen Hodenhistologie, Speriogenese und Fruchtbarkeit.

Zur näheren Untersuchung der Rolle von Afamin in der Fruchtbarkeit wurde die Expression von Afamin in normalen Mäusen durch RT-PCR in mehreren Organgeweben untersucht. Abgesehen von der allgemein bekannten Expression von Afamin in der Leber wurden starke Signale in Hoden und Niere beobachtet.

Diese Daten zeigten, dass Afamin nicht nur ein Marker für die Fruchtbarkeit ist, wie in W001/01148 Al gezeigt, sondern sich überraschenderweise als ein Protein mit signifikantem Einfluss auf die Fruchtbarkeitseigenschaften eines Individuums herausgestellt hat. Dies zeigt, dass Afamin auch ein geeignetes Ziel zur Korrektur von Mängeln in der Fruchtbarkeit oder zur Modulierung der Fruchtbarkeit ist.

Zur Untersuchung, ob Schlussfolgerungen aus diesen Befunden im Tiermodell auch für die Fruchtbarkeit des Menschen gezogen werden können, wurden Afamin-Plasmakonzentrationen in einer Gruppe von Männern mit verschiedenen Fruchtbarkeitsstörungen gemessen, einschließlich des Sertoli-Cell-Only Syndroms (SCO). Dieses Syndrom ist selten, dient aber als praktisch relevantes und interessantes Modell für den Zweck der vorliegenden Erfindung, da die Hodenhistologie und vollständige dysfunktionelle Spermiogenese der beobachteten Histologie der^ untersuchten männlichen Afamin-Knock-out Mäuse sehr ähnlich sind. Patienten mit Fruchtbarkeitsstörungen, einschließlich des SCO-Syndroms, hatten signifikant verringerte Plasmawerte von Afamin, wie durch ELISA gemessen wurde.

Daher zeigen diese Befunde, dass Afamin auch als Marker für Fruchtbarkeitsstörungen verwendet werden kann, insbesondere für die nicht obstruktive Azoospermie, wie das

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Certoli-Cell-Only Muster, den Reifungsblock oder die Hypospermatogenese.

Diese Befunde zeigen jedoch auch die Relevanz der Tierstudien der vorliegenden Erfindung für das menschliche System, sowohl für die Verwendung von Afamin zur Prävention und Behandlung von Fruchtbarkeitsstörungen, wie auch für die Verwendung von Substanzen, die die Afamin-Aktivität in vivo für die Modulation der Fruchtbarkeit bei Menschen und Tieren modulieren, insbesondere für Verhütungszwecke. Im Zuge der vorliegenden Erfindung wurden Afamin-Knock-out Mäuse bereitgestellt, die unfruchtbar sind. Diese Mäuse konnten jedoch erfolgreich mit exogenem Afamin behandelt werden, was das therapeutische Potenzial für die Behandlung der Fruchtbarkeit des Menschen mit Afamin zeigt.

Ein Hauptaspekt der vorliegenden Erfindung ist daher die Prävention oder Behandlung von Fruchtbarkeitsstörungen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde Afamin als

Schlüsselmolekül zur Definition des Fruchtbarkeitsstatus eines Individuums identifiziert. Die Beeinflussung des Afamin-Wertes in vivo führt direkt zu einer Änderung im Fruchtbarkeitsstatus. Das Tiermodell gemäß der vorliegenden Erfindung zeigte deutlich, dass Afamin imstande ist, Fruchtbarkeitstörungen effektiv zu behandeln. Es wurde jedoch auch gezeigt, dass Afamin zur Prävention einer Fruchtbarkeitsstörung verwendet werden kann, so dass z.B. eine genetische Disposition (Afamin-Knock-out Mutanten) durch exogene Afaminzufuhr überwunden wird, so dass sich keine Fruchtbarkeitsstörung in den Tieren entwickelt. Aus den Ergebnissen, die durch das Tiermodell gemäß der vorliegenden Erfindung und durch die Messung von

Afaminwerten in menschlichen Patienten mit spezifischer Fruchtbarkeitsstörung erhalten wurden, folgt, dass die bevorzugten Fruchtbarkeitsstörungen, die mit der vorliegenden Erfindung verhindert oder behandelt werden können, jene Fruchtbarkeitsstörungen sind, die mit einem gesenkten Afamin-Zustand des Patienten Zusammenhängen. Daher sind bevorzugte Fruchtbarkeitsstörungen, die

[ NACHGEREICHT • ·· · t · · ·· · • · · · · ·· · ♦ ·· ··· • · t · · ·· · · · · • ·t ·· ·· ·· · · - 7 - verhindert oder behandelt werden, Azoospermie, insbesondere das Sertoli-Cell-Only Muster, der Reifungsblock oder die Hypospermatogenese.

Afamin kann in jeder passenden Form verabreicht werden, zum Beispiel intravenös, parenteral oder lokal (in der Nähe der Hoden oder Eier stocke) . Es kann auch über implantierte (Mikro-) Pupen oder durch Depots mit verzögerter Freisetzung verabreicht werden. Für diesen Zweck und diese Verabreichungswege können übliche pharmazeutische Formulierungen und Träger verwendet werden. Zum Beispiel können für eine vierwöchige Verabreichung von Afamin über implantierte Mikropumpen 50 Mikrogramm bis 1 Gramm Afamin pro kg Körpergewicht des Individuums verabreicht werden, vorzugsweise 0,1 mg bis 100 mg, insbesondere 1 bis 10 mg. Tagesdosen können vorzugsweise im Bereich von 1 Mikrogramm bis 50 mg, vorzugsweise 10 Mikrogramm bis 5 mg, insbesondere 0,1 mg bis 1 mg pro kg Körpergewicht festgelegt werden. Vorzugsweise wird an menschliche Patienten Human-Afamin abgegeben, insbesondere rekombinantes Human-Afamin. Die vorliegende Erfindung umfasst auch rekombinante Varianten von Albumin in Bezug auf Glykosylierungsmuster, Deletions- und

Insertionsmutanten als Äquivalente, solange die Afamin-Aktivität in Bezug auf die Fruchtbarkeit nicht signifikant im Vergleich zu Afamin verringert ist, das aus Humanplasma hergestellt wird.

Ferner eröffnen Ergebnisse aus der Inhibierung von Afamin in Wild-Typ-Mäusen auch die Möglichkeit zu einer verhütenden Anwendung, indem die Afamin-Expression bei Menschen gehemmt wird.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines Afamin-Inhibitors für die Herstellung eines pharmazeutischen Verhütungspräparates. Ein Afamin-Inhibitor ist eine Verbindung, die die In-Vivo-Wirkung von Afamin in einem Menschen oder in einem (nicht menschlichen) Säugetier hemmt. Die Hemmung der Afamin-Expression kann durch jede bekannte Verbindung bereitgestellt werden, die

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- 8 - die Afamin-Aktivität hemmt, z.B. Afamin-Antikörper (monoklonale wie auch polyklonale), Afamin-siRNA, Afamin-mikroRNA, Afamin-Antisense-DNA, kompetitiv bindende Afamin-Liganden, wie Tokopherolderivate, die irreversibel mit Dissoziationskonstanten < 18 MikroM (vorzugsweise unter 10 MikroM, insbesondere unter 1 MikroM) binden und die Afamin-Funktion inaktivieren. Die spezifischen Sequenzen für siRNA, Antsense, usw., können von öffentlichen Datenbanken erhalten werden, z.B. als Referenzsequenzen NM_001133 (mRNA) und NP_001124 (Protein).

Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen ist der Afamin-Inhibitor ein Afamin-Antikörper, insbesondere ein humanisierter monoklonaler Antikörper, oder eine Afamin-Antisense-Nukleinsäure. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung enthält der Begriff "Antikörper" auch funktionelle Antikörperfragmente (wie Fab, einkettige Antikörper) und Derivate (insbesondere humanisierte monoklonale Antikörper), solange die Bindungsspezifität und Kapazität des "ursprünglichen" Antikörpers erhalten bleiben. Die Verabreichung der Antikörper kann mit Einzeldosen oder langfristigen Anwendungen erfolgen, wie zuvor für die Verabreichung von Afamin angeführt wurde. Ein humanisierter monoklonaler Antikörper kann z.B. in einer Einzeldosis von 0,01 bis 100, vorzugsweise 0,1 bis 10, insbesondere 0,5 bis 5 mg pro kg Körpergewicht verabreicht werden. Für langfristige Versorgungen könnten zum Beispiel Suppositorien geeignet sein, die eine Verzögerungsformulierung der Antikörper mit 0,1 mg bis 1 g, vorzugsweise 1 bis 100 mg, pro kg Körpergewicht enthalten.

Die Verabreichung der Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung an Menschen oder Säugetiere kann vorzugsweise durch orale oder injektive Verabreichung oder mit Hilfe von Diffusionspumpenvorrichtungen (ähnliche "Insulinpumpen") erfolgen.

Gemäß den Ergebnissen, die in dem Tiermodell gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, wird vorzugsweise eine spezifische Hemmung der männlichen Fruchtbarkeit bei nachgereicht

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Menschen erreicht. Da aber eine Afamin-Gendeletion auch bei weiblichen Mäusen zur Unfruchtbarkeit führte, kann sowohl eine Unfruchtbarkeitsbehandlung mit exogenem Afamin wie auch eine Kontrazeption durch Hemmung von Afamin bei Frauen wie auch bei Männern (Menschen oder Säugetieren) funktionieren.

Die Chimären Knock-out Tiere, die im Zuge der

vorliegenden Erfindung geschaffen wurden, stellen hoch relevante Tiermodelle dar. Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch Chimäre Afamin-Knock-out Säugetiere (natürlich nicht Menschen), die kein oder ein nicht funktionierendes Afamin-Gen tragen. Vorzugsweise wird das gesamte Afamin-Gen ausgeknockt, oder mindestens 50 % des Gens; Punkt- oder Rasterschubmutanten sind auch möglich (solange sie zu einer nicht funktionellen Form von Afamin führen), aber weniger bevorzugt. Die Tiere gemäß der vorliegenden Erfindung sind chimär, nicht homozygot; wie in dem Abschnitt "Beispiele" dargestellt, zeigen die Chimären Knock-outs bereits den gewünschten Mangel an Fruchtbarkeitseigenschaft. Das Tiermodell gemäß der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein Nagermodell, insbesondere ein Ratten- oder Mausmodell. Ein besonders bevorzugtes Mausmodell ist in dem folgenden Abschnitt "Beispiele" beschrieben und wird durch Mikroinjektion von ES-Zellen, die das aufgebrochene Afamin-Allel tragen, in Mausembryos gebildet (z.B. des C57B1/J-Mausstammes). Chimäre Tiere wurden mit Partnern (z.B. C57B1/J beziehungsweise 129/Sv Partnern) gepaart, um das Afamin-Mutantenallel auf einem Hybrid- oder Inzuchthintergrund zu etablieren (z.B. C57B1/J x 129/Sv Hybrid, und auf einem 129/Sv genetischen Inzuchtshintergrund).

Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen und den Figuren in den Zeichnungen näher beschrieben, ohne aber darauf beschränkt zu- sein.

NACHGEREICHT

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Fig. 1 zeigt die deutlich verringerte Organgröße von Hoden von einem 95% Chimären Tier (links) nach einem Afamin Gen-Knock-out im Vergleich zu einer Wildtyp-Maus (rechts);

Fig. 2zeigt einen histologischen Schnitt von Hoden von denselben Tieren. Das Chimäre Tier (KO) zeigt den Großteil seines Hodengewebes degeneriert, mit stark beeinträchtigter Spermatogenese im Vergleich zu der Wildtyp- (WT) Maus;

Fig. 3 zeigt die Gewebeexpression von Afamin in Wildtyp-Mäusen durch RT-PCR; und

Fig. 4 zeigt Afamin-Plasmakonzentrationen bei 400 schwangeren Frauen zu verschiedenen Zeitpunkten in deren Schwangerschaften. BEISPIELE:

Die folgenden Beispiele resultieren aus Studien an Tieren und Menschen, die durchgeführt wurden, um eine mögliche kausale Funktion von Afamin in der Fruchtbarkeit und Fortpflanzung ausführlich zu charakterisieren.

Afamin Knock-out Tiere

Der erste Schritt zur Erzeugung von Afamin Knock-out Mäusen war die Isolierung des genomischen Fragments, das das Maus-Afamin-Gen enthält. Für diesen Zweck wurde die 129/Sv Maus Cosmid-Bank von dem Deutschen Ressourcenzentrum (RZPD) mit Afamin cDNA-Fragmenten durchmustert. Nach dem Subklonen der Restriktionsfragmente in einen Plasmidvektor wurde die Restriktionskarte der Afamin-Stelle bestimmt und durch teilweise Sequenzierung bestätigt. Zur Konstruktion des zielgerichteten Vektors und Selektion homologer rekombinanter embryonaler Stamm- (ES) Zellklone wurde der zielgerichtete Vektor durch Ersatz interner Exone durch die Pgk-neo Kassette gebildet. Nach der Transfektion von ES-Zellen mit dem linearisierten, zielgerichteten Vektor wurde der individuelle, arzneimittelbeständige Klon auf homologe Targeting-Ereignisse durchmustert. Für den Nachweis des rekombinanten Allels wurde eine externe Sonde verwendet. Eine Rehybridisierung mit einer internen und der Neomycin- ) nachgereicht | ΐ ijä 11

Sonde bestätigte eine homologe Rekombination und detektierte eine weitere Integration auf dem zielgerichteten Vektor.

Chimäre Afamin-Tiere

Chimäre Mäuse von ES-Zellen, die das zerstörte Afamin-Allel tragen, wurden durch Mikroinjektion von 10 bis 15 ES-Zellen in 3,5 Tage alte Embryos des C57B1/J Mausstammes gebildet. Die Chimären Tiere wurden mit C57B1/J beziehungsweise 129/Sv Partnern gepaart, um das mutante Afamin-Allel auf einem C57B1/J x 129/Sv Hybrid und auf einem 129/Sv genetischen Inzuchtshintergrund zu etablieren. Ein Verlust der Afamin-mRNA und des Proteins wurde durch Northern und Western Blot-Analyse geprüft.

Bisher wurden 31 chimäre Mäuse (25 Männchen, 6 Weibchen) verschiedenen Grades (20 bis 100%) geschaffen. Mäuse mit einem hohen Chimären Grad waren vollständig unfruchtbar, jene mit einem geringen Grad erzeugten Nachkommen, die nur das Wildtyp-Afamin-Allel trugen. Eierstöcke und Uteri hatten normale Größe und Form, während die Hoden der Chimären Mäuse im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen signifikant kleiner waren (Fig. 1) . Histologische Untersuchungen zeigten keine pathologischen Befunde bei EierStöcken und Uteri, aber äußerst degeneriertes Hodengewebe, das vor allem die Sperma produzierenden Zellen betraf, was zu einer massiven Beeinträchtigung (wenn nicht Dysfunktion) der Spermatogenese führte (Fig. 2).

Zur Analyse der Afamin-Konzentrationen in den partiellen Knock-out Mäusen wurde ein ELISA-Kit zur Quantifizierung von Afamin in Mausplasma entwickelt. Für diesen Zweck wurde ein polyklonaler Antikörper gegen Maus-Afamin durch Immunisieren von Kaninchen mit gereinigtem, rekombinantem, murinem Afamin erhalten. Die rekombinante Expression von murinem Afamin wurde durch stabile Transfektion von CHO-Zellen mit Maus-Afamin-cDNA erreicht, gefolgt von einer Reinigung von Serum freien

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Kulturüberständen. Der erhaltene polyklonale Anti-Maus-Afamin-Antikörper wurde durch Affinitätschromatographie auf einer Sepharosesäule gereinigt, an die rekombinantes Afamin kovalent gebunden war. Dieser affinitätsgereinigte Antikörper wurde zum Beschichten von ELISA-Platten verwendet und, nach der Konjugation mit Meerrettich-Peroxidase, auch zur Detektion unter Verwendung einer passenden Substratreaktion. Gereinigtes rekombinantes Afamin (quantifiziert durch Aminosäure-Zusammensetzungsanalyse) diente als Standard. Mit diesem ELISA wurde eine Afamin-Plasmakonzentration im Bereich von 6 bis 10 mg/1 in Wildtyp-Mäusen gemessen, die ungefähr nur 10% entsprechender Plasmawerte bei Menschen ist (3). Überraschenderweise hatten Chimäre Afamin-Knock-out Tiere mit hohen (annähernd 100%) chimärem Grad nicht nachweisbare Plasmawerte von Afamin. *

Nach der Paarung männlicher chimärer Tiere mit Wildtyp-Mäusen konnte in Uteri oder Eierstöcken kein Sperma gefunden werden, was zu einer vollständigen Unfruchtbarkeit führt. Die wenigen fruchtbaren gering-chimären Mäuse erzeugten nur Wildtyp-Nachkommen, was auf eine Nicht-Übertragung des rekombinanten Allels hinweist.

Zur Bestätigung der Rolle von Afamin für die Fruchtbarkeit wurden unfruchtbare männliche Chimäre Tiere mit rekombinant erzeugtem, murinem Afamin über eine Minipumpe substituiert, die intraperitoneal eingesetzt wurde und kontinuierlich über 28 Tage Afamin in den Organismus abgab (was der Zeit entspricht, die für eine Spermiogenese bei Mäusen erforderlich ist) . Kontrollmäuse erhielten physiologische Kochsalzlösung anstelle des Afamins. In wöchentlichen Zeitintervallen wurde Plasma von substituierten Mäusen erhalten. Plasmakonzentrationen von Afamin stiegen sofort auf physiologische Werte und blieben während der Infusionsperiode konstant. Während der gesamten Afamin-Substitutionsperiode wurden Mäuse mit Wildtyp-Weibchen gepaart, was zu mehreren Schwangerschaften und Geburten führte. Die Nachkommen waren jedoch ausschließlich

NACHGEREICHT 13 vom Wildtyp und trugen das rekombinante Allel nicht. Eine histologische Untersuchung von Hoden nach der Afamin-Substitution und Tötung der Mäuse zeigte vollständig normalisiertes Hodengewebe und Spermiogenese.

Gewebeexpression von Afamin in normalen Mäusen

Zur ausführlichen Untersuchung der beobachteten kritischen Rolle von Afamin in der männlichen Unfruchtbarkeit wurde eine ausführliche Expressionsanalyse von Afamin in mehreren Hauptorganen in normalen Mäusen durchgeführt und es zeigte sich neben der Expression in der Leber und Niere auch ein starkes Expressionssignal in Hoden in Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Funktion von Afamin in der Speriogenese und Fruchtbarkeit (Fig. 3).

Insgesamt beeinträchtigte ein zielgerichtetes Zerstören des murinen Afamin-Gens die Spermiogenese bereits auf der Chimären "heterozygoten") Ebene deutlich. Somit spielt das Vitamin E-Bindungsprotein Afamin eine zentrale Rolle in der (männlichen) Fruchtbarkeit. Männliche Unfruchtbarkeitssyndrome: Hoden männlicher chimärer Tiere scheinen dem menschlichen männlichen Unfruchtbarkeits-Phänotyp des SCO (Sertoli-Cell-Only) Syndroms ähnlich zu sein, das eine spezielle Form der Azoospermie ist. Basierend auf diesem und bekräftigt durch diesen Phänotyp der vorliegenden Tiermodelle wurde eine Fall/Kontrollstudie durch Messung von Afamin in verschiedenen männlichen Unfruchtbarkeitssyndromen im Vergleich mit altersabgestimmten fruchtbaren männlichen Kontrollen eingeleitet. Diese Messungen zeigten signifikant verringerte Afamin-Plasmawerte (55,7 + 23,4 mg/1) bei unfruchtbaren Patienten (n=95), einschließlich des seltenen Sertoly-Cell-Only (SCO) Syndroms (n=9) im Vergleich zu der fruchtbaren Kontrollgruppe (71,4 + 15,3 mg/1, n=95, p < 0,001) (Tabelle 1). Das SCO-Syndrom beschreibt einen Zustand der Hoden, in dem nur Sertoli-Zellen die Hodenkanälchen auskleiden. Daher zeigen diese Männer Azoospermie, die als das Fehlen von Sperma im Ejakulat NACHGEREICHT | 14 definiert ist. Das Auftreten von SCO ist in der allgemeinen Population extrem selten. Weniger als 5 bis 10% unfruchtbarer Männer haben SCO. Die Diagnose ist jedoch nur durch Hodenbiopsie möglich und es gibt keine effektive Behandlung.

Diagnose N Afamin- Plasmakonzentration (mg/1 + SD) Signifikanz (Gesamtpatienten gegenüber Kontrolle) Astenozoospermie 24 57,4 + 26,0 Azoospermie 22 57,2 + 20,2 Kryptozoospermia 5 69,2 + 28,6 OAT Syndrom 35 59,0 + 26,3 SCO 9 50,4 + 15,3 Gesamtpatienten 95 55,5 + 23,4 P < 0,001 Fruchtbare Kontrollen 95 71,4 + 15,3

Ferner wurden Afamin-Plasmakonzentrationen bei 400 schwangeren Frauen verschiedenen Zeitpunkten während ihrer Schwangerschaft gemessen. Afamin korrelierte positiv und signifikant mit der Dauer der Schwangerschaft (r = 0,609, p < 0,001). Durchschnittlich war Afamin während einer physiologischen Schwangerschaft etwa 100% erhöht (Fig. 4).

Als Schlussfolgerung zeigen die Ergebnisse aus den Studien an Tier und Mensch gemäß der vorliegenden Erfindung eine klare und kausale Rolle von Afamin in der Fruchtbarkeit und Fortpflanzung. Die erhaltenen Daten ermöglichen nicht nur die Verwendung von Afamin als neuartigen diagnostischen Marker für Fruchtbarkeitsstörungen beim Menschen, sondern bieten auch ein therapeutisches Potenzial sowohl zur Behandlung von Fruchtbarkeitsstörungen beim Menschen mit Afamin wie auch für die Anwendung eines Afamin-Hemmprinzips für eine mögliche Verhütungsmedikation für den Mann.

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In Bezug auf die Behandlung einer Unfruchtbarkeit sind die wesentlichen bekannten Fruchtbarkeitsstörungen (wie die oben genannten) das primäre Ziel für die Behandlung mit Afamin. Diese enthalten im Allgemeinen alle jene Störungen, die zu Azoospermie führen (d.h., wenn kein Sperma im Ejakulat nachgewiesen werden kann).

Referenzen 1. Kayden et al., 1993, J. Lipid Res. 34: 343-358 2. Lichenstein et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:18149-18154. 3. Jerkovic et al., 2005, J Proteome Res 4:889-899 4. Voegele et al., 2002, Biochemistry 41:14532-14538

NACHGEREICHT

Claims (1)

16 PATENTANSPRÜCHE Verwendung von Afamin für die Herstellung eines pharmazeutischen Präparates für die Prävention oder Behandlung von Fruchtbarkeitsstörungen. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Fruchtbarkeitsstörung mit einem gesenkten Afamin-Zustand des Patienten in Zusammenhang steht. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Fruchtbarkeitsstörung eine nicht obstruktive Azoospermie, insbesondere das Sertoly-Cell-Only Muster, ein Reifungsblock oder eine Hypospermatogenese ist. Verwendung eines Afamin-Inhibitors für die Herstellung eines pharmazeutischen Verhütungspräparates. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Afamin-Inhibitor ein Afamin-Antikörper ist. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,, dass der Afamin-Inhibitor eine Afamin-Antisense-Nukleinsäure ist. Nicht humanes, chimäres Afamin-Knock-out Säugetier, vorzugsweise ein chimäres Afamin-Knock-out Nagetier. NACHGEREICHT