JP4351629B2

JP4351629B2 - 新規なミクロモノスポラ種からのバフィロマイシン−様代謝産物

Info

Publication number: JP4351629B2
Application number: JP2004518781A
Authority: JP
Inventors: バン・ドウン，ヤコブス・アルフオンスス・ジヨセフス; ウータース，ワルター・ブーデウイーン・レオポルト; ジヤニコト，ミシエル・マリー・フランソワ; モセク，ウルスラ・マリア; ラークソ，ジヨデイ・アン
Original assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Current assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Priority date: 2002-07-02
Filing date: 2003-06-30
Publication date: 2009-10-28
Anticipated expiration: 2023-06-30
Also published as: EP1521765A1; EP1521765B1; CA2489041C; WO2004005311A1; AU2003251730B2; US20050245598A1; JP2005534680A; CA2489041A1; ES2571778T3; US7803600B2; US7214705B2; AU2003251730A1; US20070148744A1

Description

本発明は、有力な抗増殖活性を有する新規なミクロモノスポラ（ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）種から単離される新規なバフィロマイシン−様代謝産物ならびに該代謝産物の単離法、この代謝産物を含有する製薬学的組成物及び該代謝産物を用いる処置の方法に関する。

主な細胞シグナリング経路の基礎知識の増加は、ガンとの闘いを助けるために有望な「標的化療法（ｔａｒｇｅｔｅｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」の最近の発見を可能にしたが（例えばファルネシルトランスフェラーゼの阻害剤、成長因子レセプターチロシンキナーゼ、Ｂｃｒ／ａｂｌなど）、もっと古典的な細胞毒がまだ近代の製薬産業における腫瘍学成果一覧表（ｏｎｃｏｌｏｇｙｐｒｏｄｕｃｔｐｏｒｔｆｏｌｉｏ）の基礎の重要な部分として留まっている。従来のガン細胞毒化学療法の部分的な成功は、大部分において天然源に由来する薬剤から発している。

マクロライドは、天然のメンバーを含む抗生物質の１つのグループである。マクロライドのほとんどは、ストレプトミセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐｐ．）バクテリアにより生産される。しかしながらミクロモノスポラ種により生産されるマクロライドも既知である。マクロライドは、それらが大きなアグリコン環（１４〜１６個の炭素原子）から構成され、それに数個の糖が結合していることを特徴とする。これらのマクロライドの１つの特別な系列はバフィロマイシンである。これらの化合物は、１６−員大環状ラクトン環及び１個もしくは２個の側鎖糖を有する構造的特徴を共有する。前記のバフィロマイシンは以前、抗寄生虫薬、アンチテルミンティックス（ａｎｔｉｔｈｅｌｍｉｎｔｉｃｓ）、抗生物質、殺虫剤、抗菌・カビ剤、骨の疾患の治療のための薬剤としてならびに空胞−型ＡＴＰａｓｅプロトンポンプ（ｖ−ＡＴＰａｓｅ）阻害剤としての活性を有するとして既知であった。後に、全腫瘍−細胞アッセイを一通りやってみると、このグループからの化合物が抗腫瘍活性を示すことが見出された。

特許文献１は、式（ＩＩ）

［式中、Ｒは−Ｈ又は−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯＨである］
のバフィロマイシン誘導体ならびにその製薬学的に許容され得る塩及びエステルを開示している。化合物は哺乳類における腫瘍成長に対抗する活性を示す。特許文献１はさらに、式（ＩＩ）の化合物又は既知のマクロライド化合物の投与による腫瘍浸潤の処置もしくは予防のための方法を提供している。
国際公開第０１／０２４１３号パンフレット

本発明は、Ｃ２３に新しいヘキサジエン側鎖を有する式（Ｉ）の新規な構造、その互変異性体又はその製薬学的に許容され得る塩を包含する。式（Ｉ）の化合物は抗増殖活性を示し、且つＰ−糖タンパク質及び／又は多剤耐性タンパク質（ＭｕｌｔｉｄｒｕｇＲｅｓｉｓｔａｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）に関する基質であるとは全く考えられない。

式（Ｉ）の化合物は、ミクロモノスポラ属の新規な放線菌類の液体発酵培養物から単離される新規なバフィロマイシン−様誘導体である。

式（Ｉ）の化合物は、腫瘍細胞成長を阻止するその能力に関して広範囲に特性化された。４つの選ばれた腫瘍細胞増殖アッセイにおける式（Ｉ）の化合物の用量−依存性阻止は、古典的細胞毒に関して典型的であり、非常に傾斜が大きく且つ狭い用量−応答曲線を有した。腫瘍細胞増殖の阻止への初期の観察は卵巣、前立腺、膵臓、結腸及び肺起源からの多様なヒト腫瘍細胞系に拡大され、ｎＭ範囲内の濃度におけるＩＣ_５０値が観察された。

多剤耐性は、臨床試験における抗ガン治療の失敗における主な要素の１つと考えられる。多剤耐性系の主な要素を代表するＰ−糖タンパク質及び多剤耐性タンパク質の両方の過剰発現により、腫瘍は治療薬に耐性になる。さらに、腸上皮におけるＰ−糖タンパク質の構成的発現は、経口的投与の場合、化合物がＰ−糖タンパク質に関する基質であると吸収を顕著に減少させるであろう。Ｐ−糖タンパク質又は多剤耐性タンパク質−発現腫瘍細胞系及びそれぞれの親細胞への式（Ｉ）の化合物の活性を、Ｐ−糖タンパク質／多剤耐性タンパク質に関する既知の基質であるアドリアマイシンのそれと比較した。式（Ｉ）の化合物は、Ｐ−糖タンパク質及び／又は多剤耐性タンパク質の発現の事情に無関係に、ｎＭ範囲内の濃度において細胞増殖を阻止した。これらの結果は、Ｐ−糖タンパク質及び多剤耐性タンパク質ポンプタンパク質による式（Ｉ）の化合物の実質的認識がないことを強く示唆している。

本新規なガン治療薬は、この化合物の種類のほとんどのメンバーと同様に、高濃度においていくらかの急性毒性を示す。しかしながら、当該技術分野における熟練者は、患者の状態に依存して適した治療範囲を決定できるであろう。

製薬学的に許容され得る付加塩は、製薬学的に許容され得る酸付加塩及び製薬学的に許容され得る塩基付加塩を包含する。塩基性を有する式（Ｉ）の化合物を、適した酸を用いてそれを処理することにより、その製薬学的に許容され得る酸付加塩に転換することができる。適した酸には例えば無機酸、例えばハロゲン化水素酸、例えば塩酸もしくは臭化水素酸；硫酸；硝酸；リン酸などの酸；あるいは有機酸、例えば酢酸、プロパン酸、ヒドロキシ酢酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸（すなわちブタン二酸）、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクラミン酸、サリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸、パモ酸などの酸が含まれる。

酸性を有する式（Ｉ）の化合物を、適した有機もしくは無機塩基を用いてそれを処理することにより、その製薬学的に許容され得る塩基付加塩に転換することができる。適した塩基塩の形態は例えばアンモニウム塩、アルカリ及びアルカリ土類金属塩、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム塩など、有機塩基との塩、例えばベンザチン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ヒドラバミン塩、ならびに例えばアルギニン、リシンなどのようなアミノ酸との塩を含む。

「酸もしくは塩基付加塩」という用語は、式（Ｉ）の化合物が形成することができる水和物及び溶媒付加形態も含む。そのような形態の例は、例えば水和物、アルコラートなどである。

構造はいくつかのカルボニル基を包含する。これらのカルボニル基は、一般にケト−エノール互変異性と呼ばれるものを生じ得る。例として、平衡にあるケト−エノール互変異性体を下記に示す。単純な脂肪族ケトンの場合、平衡においてエノール形態はほとんど存在しない。しかし他の場合、エノール形態は比較的高濃度で存在し得る。

互変異性は、異性体がプロトンの配置及び対応する二重結合の位置によってのみ異なる異性の１つの型である。溶液中で平衡にある異性体は互変異性体と呼ばれる。

本発明の構造のいずれの互変異性体も本出願の範囲内に含まれるべく意図されていることが明らかでなければならない。

本発明は、腫瘍成長の阻止のための方法、ガンの処置の必要のある患者、例えば哺乳類（そしてより特定的にはヒト）に本発明の化合物の有効量を投与することによるガンの処置のための方法も提供する。阻止され得るガンの型の例には充実性及び血液学的ガン、白血病、皮膚ガン、例えば黒色腫及び基底細胞ガン、腎臓ガン、肺ガン、例えば小細胞肺ガン、非−小細胞肺ガン及び肺胞細胞ガン、結腸ガン、乳ガン、前立腺ガン、膵臓ガン、胃ガン、髄様甲状腺ガン（ｍｅｄｕｌｌａｒｙｔｈｙｒｏｉｄｃａｎｃｅｒ）、脳ガン及び頭／頸ガンが含まれるが、これらに限られない。

これらの化合物は、神経線維腫症、慢性関節リウマチ、再狭窄及び他の増殖性疾患の処置においても有用であることができる。

本化合物は、その抗バクテリア性を見ると、抗バクテリア性薬剤としても有用である。本発明はバクテリア感染の処置の必要のある患者、例えば哺乳類（そしてさらに特定的にはヒト）に本発明の化合物の有効量を投与することによる、バクテリア感染の処置のための方法も提供する。

本発明は薬剤として用いるための式（Ｉ）の化合物ならびに腫瘍成長の阻止用の薬剤の製造のためのこれらの式（Ｉ）の化合物の使用を開示する。

本化合物の有用な薬理学的性質を見ると、本化合物を投与目的のための種々の製薬学的形態に調製することができる。

本発明の製薬学的組成物の調製のために、塩基もしくは酸付加塩の形態における特定の化合物の活性成分として有効な量を、製薬学的に許容され得る担体と緊密な混合物において合わせ、その担体は投与のために望ましい調製物の形態に依存して多様な形態をとることができる。望ましくはこれらの製薬学的組成物は、好ましくは経口的、直腸的、経皮的又は非経口的注入による投与に適した単位投薬形態にある。例えば経口的投薬形態における組成物の調製において、通常の製薬学的媒体のいずれか、例えば懸濁剤、シロップ、エリキサー及び溶液のような経口用液体調製物の場合、水、グリコール、油、アルコールなど；あるいは粉剤、丸薬、カプセル及び錠剤の場合、澱粉、糖類、カオリン、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などのような固体担体を用いることができる。

それらの投与の容易さのために、錠剤及びカプセルは最も有利な経口的投薬単位形態物を与え、その場合には固体の製薬学的担体が用いられるのは明らかである。非経口用組成物の場合、担体は通常少なくとも大部分において無菌水を含むが、例えば溶解性を助けるための他の成分が含まれることができる。例えば担体が食塩水、グルコース溶液又は食塩水とグルコース溶液の混合物を含む注入可能な溶液を調製することができる。注入可能な懸濁剤も調製することができ、その場合には適した液体担体、懸濁化剤などを用いることができる。経皮的投与に適した組成物においては、担体は場合により浸透促進剤及び／又は適した湿潤剤を含むことができ、それらは場合により皮膚に有意な悪影響を引き起こさない小さい割合におけるいずれかの性質の適した添加剤と組み合わされていることができる。該添加剤は皮膚への投与を容易にすることができ、及び／又は所望の組成物の調製の助けとなることができる。これらの組成物を種々の方法で、例えば経皮パッチとして、スポット−オンとして又は軟膏として投与することができる。

投与の容易さ及び投薬量の均一性のために、前記の製薬学的組成物を投薬単位形態物において調製するのが特に有利である。明細書及び本明細書中の請求項で用いられる投薬単位形態物は、１回の投薬量として適した物理的に分離した単位を指し、各単位は所望の治療効果を生むために計算されたあらかじめ決められた量の活性成分を、必要な製薬学的担体と一緒に含有する。そのような単位投薬形態物の例は錠剤（刻み付き又はコーティング錠を含む）、カプセル、丸薬、粉剤小包、ウェハース、注入可能な溶液又は懸濁剤、小さじ一杯、大さじ一杯などならびに分離されたそれらの複数である。

当該技術分野における熟練者は、下記に示す試験結果から有効な量を容易に決定することができるはずである。一般に、治療的に有効な量は体重のｋｇ当たり０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ、そして特に体重のｋｇ当たり０．５ｍｇ〜１００ｍｇであることが意図されている。必要な投薬量を２、３、４回もしくはそれより多い細分−投薬量として１日を通じての適した間隔で投与するのが適切であり得る。該細分−投薬量を、例えば単位投薬形態物当たりに０．５〜５００ｍｇ、そして特に１０ｍｇ〜５００ｍｇの活性成分を含有する単位投薬形態物として調製することができる。
図面の簡単な記述
図１Ａ：式（Ｉ）の化合物による腫瘍細胞増殖の用量−依存性阻止（バイオアッセイ）。ヒトＭＣＦ−７腫瘍細胞を、示される濃度の式（Ｉ）の化合物を用いて４日間処理した。標準未処理細胞の％として表される結果は、少なくとも３回の異なる実験の平均±ＳＥである。
図１Ｂ：式（Ｉ）の化合物による腫瘍細胞増殖の用量−依存性阻止（バイオアッセイ）。ヒトＨＴ−２９腫瘍細胞を、示される濃度の式（Ｉ）の化合物を用いて４日間処理した。標準未処理細胞の％として表される結果は、少なくとも３回の異なる実験の平均±ＳＥである。
図１Ｃ：式（Ｉ）の化合物による腫瘍細胞増殖の用量−依存性阻止（バイオアッセイ）。ヒトＫ５６２／Ｃ１，０００腫瘍細胞を、示される濃度の式（Ｉ）の化合物を用いて４日間処理した。標準未処理細胞の％として表される結果は、少なくとも３回の異なる実験の平均±ＳＥである。
図１Ｄ：式（Ｉ）の化合物による腫瘍細胞増殖の用量−依存性阻止（バイオアッセイ）。ヒトＭａｌｍｅ−３Ｍ腫瘍細胞を、示される濃度の式（Ｉ）の化合物を用いて４日間処理した。標準未処理細胞の％として表される結果は、少なくとも３回の異なる実験の平均±ＳＥである。

実験部分
新規な抗腫瘍化合物（細胞毒）の同定のために設計されたスクリーニングプログラムの経過中に、新規なバフィロマイシン−様代謝産物が単離された。同じ代謝産物がミクロモノスポラ属の２種の放線菌の液体発酵培養物から単離された。ミクロモノスポラ種ＪＳ１０３５はＳｏｍｂｏ，Ｃａｍｅｒｏｏｎからの川の沈殿物から単離され、ミクロモノスポラ種ＪＳ１０４４はＭｕｎｄｅｍｂａ，Ｃａｍｅｒｏｏｎからの川の沈殿物から単離された。両方の株が同じ活性化合物を生産することが検出されるとすぐに、ミクロモノスポラ種ＪＳ１０３５からの液体発酵培養物中に存在する化合物をさらに特性化することが決定された。これらの新規なマクロライドの生産に使用される各微生物の培養物は、Ｇｅｎｔ大学のＢｅｌｇｉａｎＣｏｏｒｄｉｎａｔｅｄＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍにおけるＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙに、ミクロモノスポラ種ＪＳ１０３５の場合は受託番号ＬＭＧＰ−２１５２５の下に、及びミクロモノスポラ種ＪＳ１０４４の場合は受託番号ＬＭＧＰ−２１５２６の下に寄託された。これらの寄託はブタペスト条約の規定の下に成され、それらの公共への利用性についてのすべての制限は、最終的に本出願への特許の付与の際に保持されるであろう。
一般
発酵及び単離
ミクロモノスポラ種ＪＳ１０３５の液体発酵培養物を、酢酸エチルを用いて抽出して粗抽出物を得、それを続いて向流分配クロマトグラフィー（ＣＰＣ）を用いて精製した。異なる条件を用いる２回の連続的ＣＰＣ分別の後に、構造解明のための純粋な材料を得た。この材料の質量スペクトル分析（表１を参照されたい）は、８５３の分子量及びＣ_４７Ｈ_６７ＮＯ_１３の分子式を示した。

構造決定
式（Ｉ）の化合物に関するＮＭＲデータを最初にＣＤＣｌ_３中で得た。しかしながらすぐに、式（Ｉ）の化合物がこの溶媒中で安定でないことが見出された。その後のＮＭＲ研究はアセトン−ｄ_６を用いて行なわれ、複雑なプロトンＮＭＲスペクトルを与えた。^１３ＣＮＭＲ、分極移行による無変形増強（ＤｉｓｔｏｒｔｉｏｎｌｅｓｓＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｂｙＰｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎＴｒａｎｓｆｅｒ（ＤＥＰＴ））、相関分光学（ＣＯＳＹ）、異核多重量子コヒーレンス（ＨｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒＭｕｌｔｉｐｌｅＱｕａｎｔｕｍＣｏｈｅｒｅｎｃｅ（ＨＭＱＣ））及び異核多重バンドコヒーレンス（ＨｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒＭｕｌｔｉｐｌｅＢａｎｄＢｏｈｅｒｅｎｃｅ（ＨＭＢＣ））を含むＮＭＲ実験の完全な１組を得た。

式（Ｉ）の化合物に関する部分的構造の組み立ては直接的であった。マクロライドに関するＮＭＲデータ（表２）、Ｃ１６−Ｃ２３及びＣ１’−Ｃ４’は公開されているデータと十分に一致した。（ＷｅｒｎｅｒＧ．ｅｔａｌ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ３７：１１０−１１７，１９８４）新しいヘキサジエン側鎖（Ｃ２４−Ｃ２９）の結合は、関連する原子の間の相関を注意深く研究することにより行なわれた。例えばＨ２４はＣ２２及びＣ２３にＨＭＢＣ相関を示し、Ｈ２５もＣ２３にＨＭＢＣ相関を示した。ＣＯＳＹデータもＣ２３における新しい側鎖の配置と一致した。シクロペンテノン環に対応するいくつかの^１３ＣＮＭＲシグナル（Ｃ５’，Ｃ６’及びＣ９’）は、おそらくビニル性ＯＨとカルボニル基の間の共鳴構造の存在の故に、^１３ＣＮＭＲスペクトルにおいて隠された。

他の公開されている報告は、他のバフィロマイシン及びこの種類の他のメンバーに関する立体化学を詳述している（Ｏ’ＳｈｅａＭ．ｅｔａｌＪ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ５０：１０７３−１０７７，１９９７）。この種類内の分子はラクトン環、テトラヒドロピリン環及びＣ１６−Ｃ１８結合に関して同じ立体化学を有する。すべてがＣ１９ＯＨ、Ｃ１７ＯＨ及びＣ１＝Ｏを含む水素−結合網目を有するようである。この網目は側鎖の立体配置を有効に規定する。カップリング定数、化学シフト及び回転枠オーバーハウザー効果分光学（ＲｏｔａｔｉｎｇＦｒａｍｅＯｖｅｒｈａｕｓｅｒＥｆｆｅｃｔＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）（ＲＯＥＳＹ））データの分析に基づき、提案される式（Ｉ）の化合物の立体化学はこのコンフォーメーションと一致する。Ｃ２３における新しいヘキサジエン側鎖は、２つの重要なＲＯＥＳＹ相関に基づき、環に対してアルファと指定された。Ｈ２３とＣＨ_３−３６の間及びまたＨ２３とＨ２１の間に相関がある。これらの相関は、Ｈ２３が環の上に位置しなければ、ありそうにない。

生物学的活性
選ばれたヒト腫瘍細胞系（乳ガンＭＣＦ−７、結腸ガンＨＴ−２９、白血病Ｋ５６２／Ｃ１，０００及び黒色腫Ｍａｌｍｅ−３Ｍ）における細胞増殖の阻止に基づく細胞増殖アッセイ（本明細書で「バイオアッセイ」と呼ぶ）のパネルを用い、精製法全体を通じての種々の試料における抗増殖活性を同定した。４種の培地中で生育した株ＪＳ１０３５からの抽出物をバイオアッセイにおいて調べた；抗増殖活性のほとんどを含有したものをさらなる研究のために選択した。活性抽出物の１：１，０００−希釈物は、調べられた３つの細胞系（黒色腫Ｍａｌｍｅ−３Ｍ細胞系はこの段階で省略された）において細胞増殖のほとんど完全な阻止を生じた。この最初の粗抽出物から、向流分配クロマトグラフィーから集められた画分をＭＣＦ−７細胞増殖につきそれぞれに分析した。主要な１つの画分が抗増殖活性を含有することが示され、それを次いでＨＰＬＣによりさらに精製した。１つのＨＰＬＣピークが、バイオアッセイにおける細胞増殖の阻止により測定される抗増殖活性を含有することが見出された。このピークを用いて式（Ｉ）の活性化合物の構造解明を開始した。その後の構造研究は、２つの連続的ＣＰＣ段階を用いて単離される材料を用いて完了した。

精製された式（Ｉ）の化合物を、腫瘍細胞成長を阻止するその能力に関して広範囲に特性化した。図１Ａ〜Ｄに示される通り、４つの選ばれた腫瘍細胞増殖アッセイにおける式（Ｉ）の化合物の用量−依存性阻止は古典的細胞毒に関して典型的であり、非常に傾斜が大きく且つ狭い用量−応答曲線を有した。式（Ｉ）の化合物はｎＭ範囲内の濃度において腫瘍細胞増殖の阻止に関する類似の力価を示し、結腸ＨＴ−２９ガン細胞にわずかにより高い活性を有した（ナノモル以下の濃度）（表３）。腫瘍細胞増殖の阻止についての初期の観察は卵巣、前立腺、膵臓、結腸及び肺起源からの多様なヒト腫瘍細胞系に拡大され、ｎＭ範囲内の濃度におけるＩＣ_５０値が観察された（表４）。

Ｐ−糖タンパク質−又は多剤耐性タンパク質−発現性腫瘍細胞系及びそれぞれの親細胞、Ｋ５６２／Ｃ１，０００＋及びＫ５６２Ａ７、ＣＯＲ−Ｌ２３／Ｒ及びＣＯＲ−Ｌ２３への式（Ｉ）の化合物の活性を、Ｐ−糖タンパク質／多剤耐性タンパク質に関する既知の基質であるアドリアマイシンのそれと比較した。表５に示される通り、式（Ｉ）の化合物は、Ｐ−糖タンパク質及び／又は多剤耐性タンパク質発現状況に無関係にｎＭの範囲内の濃度において細胞増殖を阻止した（ＩＣ_５０値における有意な相違なし）。対照的に、Ｋ５６２／Ｃ１，０００＋及びＣＯＲＬ２３／Ｒ細胞は、それらのそれぞれの親細胞系と比較して、アドリアマイシンによる細胞殺害にそれぞれ２５０−倍及び２０−倍の耐性を示した。これらの結果は、Ｐ−糖タンパク質及び多剤耐性タンパク質ポンプタンパク質による式（Ｉ）の化合物の実質的認識がないことを強く示唆している。

構造決定
^１Ｈ及び^１３ＣＮＭＲスペクトルは、それぞれ５００及び１２５ＭＨｚで運転されるＢｒｕｋｅｒＡｖａｎｃｅＤＲＸ５００分光計上で３００Ｋにおいて記録された。ＤＥＰＴ、ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ及びＨＭＢＣ実験のために標準的パルス配列（ｓｔａｎｄａｒｄｐｕｌｓｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を用いた。ＲＯＥＳＹデータは、３００，０００μｓ（２２ｄＢにおいて）のスピンロックパルスを用いて取得された。融点はＥｌｅｃｔｒｏｔｈｅｒｍａｌ９１００融点装置を用いて決定され、未修正である。反転回復（ＩＲ）データはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ１６００ＳｅｒｉｅｓＦＴＩＲ分光光度計を用いて取得された。旋光データを得るために、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ２４３Ｂ旋光計を用いた。高分解能ＭＳデータは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ７０ＳＥＱＴａｎｄｅｍＨｙｂｒｉｄＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いて得た。ＣＰＣは、Ｗａｔｅｒｓ９９１ＰｈｏｔｏｄｉｏｄｅＡｒｒａｙ検出器（２７０ｎｍにおいて監視）と接触した（ｉｎｔｅｒｆａｃｅｄ）Ｉｔｏ多層コイルカラムが備えられたＰ．Ｃ．，Ｉｎｃ．高速向流クロマトグラフ上で行なわれた。
発酵及び単離
放線菌株ＪＳ１０３５は、Ｓｏｍｂｏ，Ｃａｍｅｒｏｏｎの近くで集められた川底沈殿物から単離された。種培地（ｓｅｅｄｍｅｄｉｕｍ）は、ｐＨが６．５に調節された１Ｌの蒸留水中にグルコース２０ｇ、Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ（Ｔｒａｄｅｒ’ｓＰｒｏｔｅｉｎ）１５．０ｇ、酵母抽出物５．０ｇ、ＣａＣＯ_３４．０ｇ、（ＮＨ_４）_２（ＳＯ_４）３．０ｇ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．０３ｇを含有した。生産培地は、ｐＨが７．０に調節された１Ｌの蒸留水中にグルコース２０．０ｇ、デキストリン５０．０ｇ、Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ（Ｔｒａｄｅｒ’ｓＰｒｏｔｅｉｎ）３０．０、酵母抽出物１．０ｇ、ＣａＣＯ_３５．０ｇ、ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ０．００１ｇを含有した。培地を２５又は３０ｍＬのアリコートにおいて２５０ｍＬのフラスコに分配し、１５分間オートクレーブにかけた。出発培養物（２５０ｍＬのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ当たりに２５ｍＬの種培地）に接種するために凍結保存胞子（ｆｒｏｚｅｎｓｐｏｒｅｓｔｏｃｋｓ）（１．０ｍＬ）を用いた。出発培養物を２８℃及び約７５％の湿度において、軌道振盪機（２“スロー（ｔｈｒｏｗ），２５０ｒｐｍ）上で４８時間インキュベーションした。出発培養物（１ｍＬ）を用いて２００個の生産培地フラスコ（２５０ｍＬのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ当たりに３０ｍＬの生産培地）に接種し、それを次いで上記の条件で６日間インキュベーションした。

各フラスコに酢酸エチル（２２．５ｍＬ）を加え、フラスコの内容物を５００ｍＬの遠心ボトル（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｂｏｔｔｌｅｓ）中にプールした。各ボトルを激しく振り、６０００ｘｇで８分間遠心した。各ボトルから酢酸エチルを除去し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥した。遠心ボトルに再び酢酸エチルを約４５０ｍＬの合計容積まで加え、プロセスを繰り返した。抽出物を減圧下で乾燥し、粗抽出物（５．４ｇ）を得た。

粗抽出物のアリコート（４００ｍｇ）をＣＰＣに供した。溶媒系はｎ−ヘキサン、ＥｔＯＡｃ、ＭｅＯＨ及び水（１：３：３：３，ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）の平衡化混合物から成った。下相は固定相として用いられ、上相は移動相として働き、それは３ｍＬ／分においてポンプ輸送された。カラム回転速度は８００ｒｐｍであった。粗抽出物は、それを上相と下相の混合物中に溶解することにより、調製された。次いで材料をカラム上に負荷した。溶離する第１のピークを集め、乾燥して３０３ｍｇの精製材料を得た。この精製材料を、修正された条件を用いて再びＣＰＣクロマトグラフィーに供した。修正された溶媒系は水、ＭｅＯＨ及びｎ−ヘキサン（１：９：１０，ｖ／ｖ／ｖ）の平衡化混合物から成った。再び下相は固定相として用いられ、上相は移動相として働いた。９０分後、上相及び下相を切り替え、溶媒変更の後に溶離する第１のピークを集めて乾燥し、９．２ｍｇの純粋な式（Ｉ）の化合物を得た。

初期に、式（Ｉ）の化合物は最初のＣＰＣ分離に続いてＨＰＬＣを用いて単離された。その場合、活性なＣＰＣ画分は逆相ＨＰＬＣ（ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ，１０μｍ，１０ｘ２５ｍｍ，Ｃ_１８）を用いてさらに分離された。９５：５ＣＨ_３ＣＮ：Ｈ_２Ｏで開始して１００％ＣＨ_３ＣＮまでの２５分に及ぶ線状勾配を用いて式（Ｉ）の化合物を単離した。５−ｍｇのＨＰＬＣ注入は０．５ｍｇの化合物（Ｉ）を与えた。
薬剤
調べられたすべての試料はＤＭＳＯ中に溶解され、培地中でさらに希釈され（典型的には１：１，０００）、細胞増殖アッセイにおいて最終的ＤＭＳＯ濃度は０．１％（ｖ／ｖ）を決して超えなかった。ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］、ＭＴＳ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム内部塩］及びＰＭＳ［フェナジンメトサルフェート］をホスフェート−緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に溶解した。ＭＴＴ及びＭＴＳは両方とも細胞増殖及び毒性試験において広く用いられるテトラゾリウム塩である。生存細胞中に入ると、これらのテトラゾリウム塩は強く着色したホルマザン誘導体に（生物）還元される。ＭＴＴの場合、生成するホルマザンは結晶性であり、比色定量の前に溶解しなければならない。ＭＴＳは、可溶性ホルマザン最終的生成物へのその有効な還元のために、中間電子受容体（ＰＭＳ）を必要とし、懸濁細胞系（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｅｌｌｌｉｎｅ）の場合に用いられる。
細胞系及び細胞培養
ヒトＭＣＦ−７乳腺ガン細胞を、２ｍＭＬ−グルタミン、１ｍＭＮａＰｙｒｕｖａｔｅ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン及び５％胎児ウシ血清が補足されたＤｕｌｂｅｃｃｏの修正Ｅａｇｌｅ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）中で培養した。ヒトＨＴ−２９結腸ガン細胞を、２ｍＭＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン及び５％胎児ウシ血清が補足されたＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地中で培養した。ヒトＭａｌｍｅ−３Ｍ黒色腫細胞を、２ｍＭＬ−グルタミン、１ｍＭＮａＰｙｒｕｖａｔｅ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン及び１０％胎児ウシ血清が補足されたＤＭＥＭ培地中で培養した。ヒトＤＵ１４５前立腺ガン細胞を、２ｍＭＬ−グルタミン、１ｍＭＮａＰｙｒｕｖａｔｅ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン及び１０％胎児ウシ血清が補足されたＤＭＥＭ培地中で培養した。ヒトＣａｐａｎ−１膵臓腺ガン細胞を、２ｍＭＬ−グルタミン、１ｍＭＮａＰｙｒｕｖａｔｅ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン及び１０％熱不活化胎児ウシ血清が補足されたＤＭＥＭ培地中で培養した。ヒトＨＣＴ１１６結腸直腸ガン細胞を、２ｍＭＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン及び１０％胎児ウシ血清が補足されたＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地中で培養した。ヒトＨ１２９９非−小肺ガン細胞を、２ｍＭＬ−グルタミン、１ｍＭＮａＰｙｒｕｖａｔｅ、１０ｍＭＨＥＰＥＳ及び１０％熱不活化胎児ウシ血清が補足されたＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。これらの細胞系のすべてはＡＴＣＣ［ＡｍｅｒｏｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ］から得た。ヒトＡ２７８０卵巣ガン細胞系は、Ｄｒ．Ｔ．Ｃ．Ｈａｍｉｌｔｏｎ［ＦｏｘＣｈａｓｅＣｅｎｔｒｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ］からの一種の寄贈品であり、２ｍＭＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン及び１０％胎児ウシ血清が補足されたＲＰＭＩ１６４０培地中で培養された。ヒトＬｏｖｏ結腸腺ガン細胞系は、Ｄｒ．Ｍ．Ｇｒａｎｄｉ［Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｆｉｃｅ，Ｎｅｒｖｉａｎｏ，Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ］からの一種の寄贈品であり、２ｍＭＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１％ビタミン類（ＢＭＥ）及び１０％胎児ウシ血清が補足されたＨＡＭ’ｓＦ１２培地中で培養された。細胞は慣例的に、加湿された５％ＣＯ_２雰囲気中で３７℃において、単層培養物として保持された。ヒトＫ５６２／Ｃ１，０００白血病細胞系は、Ｄｒ．Ｈ．Ｈｅｙｌｉｇｅｎ［Ｄｒ．ＷｉｌｌｅｍｓＩｎｓｔｉｔｕｕｔ，Ｄｉｅｐｅｎｂｅｅｋ，Ｂｅｌｇｉｕｍ］による一種の寄贈品であり、コルヒチンの増加する濃度において細胞を培養することにより得られるＰ−糖タンパク質発現性細胞系である。細胞は、２ｍＭＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン及び５％胎児ウシ血清が補足されたＲＰＭＩ１６４０培地中で、加湿された５％ＣＯ_２雰囲気下に３７℃において懸濁培養物として保持された。ヒトＫ５６２Ａ７白血病細胞系は、Ｄｒ．Ｈ．Ｈｅｙｌｉｇｅｎによる一種の寄贈品であり、Ｋ５６２／Ｃ１，０００細胞の親の薬剤感受性細胞系である。Ｋ５６２／Ｃ１，０００＋細胞系は、Ｋ５６２／Ｃ１，０００細胞を１μＭコルヒチンと一緒にさらに２週間培養することにより得られた。この処理はより多量のＰ−糖タンパク質及びｍＲＮＡならびにより安定な耐性側面を誘導する。細胞は、２ｍＭＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン及び５％胎児ウシ血清が補足されたＲＰＭＩ１６４０培地中で、加湿された５％ＣＯ_２雰囲気下に３７℃において懸濁培養物として保たれた。ヒト大細胞肺ガン細胞系はＥＣＡＣＣ（ＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｕ．Ｋ．）から得た。ＣＯＲ−Ｌ２３は親の薬剤感受性細胞系であり、ＣＯＲ−Ｌ２３／Ｒは多剤耐性タンパク質−発現性多剤耐性−変異型であり、増加する濃度のドキソルビシンと一緒にＣＯＲ−Ｌ２３細胞を連続段階的試験管内インキュベーションすることにより発現した。両細胞系のための培地は２ｍＭＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン及び１０％胎児ウシ血清が補足されたＲＰＭＩ１６４０から成った。細胞は慣例的に、加湿された５％ＣＯ_２雰囲気中で３７℃において単層培養物として保持された。

すべての培地及び補足物は、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｅｒｅｌｂｅｋｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍから得た。細胞はマイコプラズマ汚染されていないことが、Ｇｅｎ−ＰｒｏｂｅＭｙｃｏｐｌａｓｍａＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅキット［ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｂｒｕｓｓｅｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍ］を用いて決定された。
細胞増殖アッセイ
細胞増殖アッセイは記載されている通りに行なわれた（ＡｃｒｉｔｉｃａｌａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｔｈｅｕｓｅｏｆｍｉｃｒｏｃｕｌｔｕｒｅＴｅｔｒａｚｏｌｉｕｍａｓｓａｙｓｔｏｍｅａｓｕｒｅｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｍｏｓｓｍａｎ，Ｔ．Ｊ．ＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈ６５：５５−６３，（１９８３））。

付着性細胞系の場合、細胞をＦａｌｃｏｎ／ＮＵＮＣ９６−ウェル培養プレート［ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｅｒｅｌｂｅｋｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ］中に播種し、１８〜４８時間プラスチックに付着させた。次いで培地を変え、薬剤及び／又は溶媒を加えた。４−日間のインキュベーションの後、Ｅｍａｘ９６−ウェル分光光度計［Ｓｏｐａｃｈｅｍ，Ｂｒｕｓｓｅｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍ］を用いて５４０ｎｍにおける吸光度を測定するＭＴＴに基づくアッセイを用いて細胞密度を評価した。懸濁培養物を用いる実験の場合、Ｋ５６２Ａ７、Ｋ５６２／Ｃ１，０００及びＫ５６２／Ｃ１，０００＋細胞をＦａｌｃｏｎ^（Ｒ）９６−ウェル培養プレート中に播種した。試験薬剤及び／又は培地を播種の直後に加えた。４−日間のインキュベーションの後、Ｅｍａｘ９６−ウェル分光光度計を用いて４９０ｎｍにおける吸光度を測定するＭＴＳ／ＰＭＳに基づくアッセイを用いて細胞成長を評価した。

標準（未処理細胞）条件における残留生存細胞に対する処理条件における残留生存細胞のパーセンテージとして抗増殖活性を算出する。結果をＩＣ_５０値として表し、それは細胞増殖を５０％阻止するのに必要な化合物の濃度を示す。１つの実験内で、各実験条件に関する結果は、少なくとも３つの複製ウェル（ａｔｌｅａｓｔ３ｒｅｐｌｉｃａｔｅｗｅｌｌ）の平均である。

式（Ｉ）の化合物による腫瘍細胞増殖の用量−依存性阻止。式（Ｉ）の化合物による腫瘍細胞増殖の用量−依存性阻止。式（Ｉ）の化合物による腫瘍細胞増殖の用量−依存性阻止。式（Ｉ）の化合物による腫瘍細胞増殖の用量−依存性阻止。

Claims

式（Ｉ）

の化合物、その互変異性体又はその製薬学的に許容され得る塩。
製薬学的に許容され得る担体及び活性成分として請求項１に記載の化合物の治療的に有効な量を含んでなる製薬学的組成物。
請求項１に記載の化合物の治療的に有効な量を製薬学的に許容され得る担体と緊密に混合する請求項２に記載の製薬学的組成物の調製法。
式（Ｉ）の化合物を生産できる微生物の株を培養し、培養ブロスから式（Ｉ）の化合物を回収し、場合により回収された化合物を塩化することを含んでなる請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物の生産法であって、
ここで該微生物が、ミクロモノスポラ属ＪＳ１０３５寄託番号ＬＭＧＰ−２１５２５またはミクロモノスポラ属ＪＳ１０４４寄託番号ＬＭＧＰ−２１５２６である、上記生産法。
薬剤としての使用のための請求項１に従う化合物。
腫瘍細胞増殖の阻止のための薬剤の製造における請求項１に従う化合物の使用。
請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物を有効成分として含んでなる、ガンの処置のための医薬組成物。
抗腫瘍活性を有するミクロモノスポラ属ＪＳ１０３５寄託番号ＬＭＧＰ−２１５２５から単離される、請求項１に従う化合物。
化合物が８５３の分子量及びＣ_４７Ｈ_６７ＮＯ_１３の分子式を有する請求項８に記載の化合物。
寄託番号ＬＭＧＰ−２１５２５の下に寄託される微生物。
寄託番号ＬＭＧＰ−２１５２６の下に寄託される微生物。