JP4275538B2 - アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子 - Google Patents
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Description
本発明は、分岐鎖アミノ酸生合成経路における律速酵素であるアセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子に関する。
背景技術
アセト乳酸シンターゼ(以下、「ALS」という。)は、ロイシン、バリン及びイソロイシン等の分岐鎖アミノ酸生合成経路における律速酵素であり、植物の成長にとって必須な酵素として知られている。ALSは、高等植物全体に渡って広く存在していることが知られており、種々の微生物、例えば酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、大腸菌(Escherichia coli)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)等においても見い出されている。
大腸菌及びネズミチフス菌には、ALSのイソ酵素が3種存在していることが知られている。これら各々のイソ酵素は、酵素の触媒活性を司る分子量の大きい触媒サブユニットと分岐鎖アミノ酸が結合することによりフィードバック阻害剤として機能する分子量の小さい制御サブユニットとからなるヘテロオリゴマーである(Chipman et al.,Biochim.Biophys.Acta.1385,401−419,1998)。触媒サブユニットは、それぞれIlv IH、Ilv GM、Ilv BNオペロンに位置している。一方、酵母菌の場合、ALSは、単一な酵素であるが、細菌と同様に触媒サブユニットと制御サブユニットとからなり(Pang et al.,Biochemistry,38,5222−5231,1999)、触媒蛋白質サブユニットはILV2座位に位置している。
一方、植物におけるALSの場合も、上述した微生物と同じように触媒サブユニットと制御サブユニットとからなることが知られている(Hershey et al.,Plant Molecular Biology.40,795−806,1999)。例えば、双子葉植物のタバコの場合、ALSの触媒サブユニットは、SuRA及びSuRBの2つの遺伝子座位によってコードされ(Lee et al.,EMBO J.7,1241−1248,1988)、トウモロコシの場合、ALSの触媒サブユニットは、als 1及びals 2の2つの遺伝子座位にコードされている(Burr et al.,Trendsin Genetics 7,55−61,1991;Lawrence et al.,Plant Mol.Biol.18,1185−1187,1992)。触媒サブユニットをコードする遺伝子に関しては、双子葉植物の場合、タバコだけでなくアラビドプシス(Arabidopsis)、ナタネ、ワタ、オナモミ(Xanthium)、アマランサス(Amaranthus)及びホウキギ(Kochia)について完全に塩基配列が決定されている(Chipman et al.,Biochim.Biophys.Acta.1385,401−419,1998及び再公表特許 WO97/08327参照)。単子葉植物で塩基配列が完全に決定されているのはトウモロコシとイネ(角ら,日本農薬学会第26回大会講演要旨集,101頁,2001)である。
一方、スルホニルウレア系除草剤、イミダゾリノン系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤並びにピリミジニルカルボキシ系除草剤(以下、「PC系除草剤」という。)等の除草剤は、このALSを阻害することによって植物の成長を抑制することが知られている(Ray,Plant Physiol.75,827−831,1984;Shaner et al.,Plant Physiol.76,545−546,1984;Subramanian et al.,Plant Physiol.96,310−313,1991;Shimizu et al.,J.Pestic.Sci.19,59−67,1994)。
これら除草剤に対して抵抗性を有する植物としては、表1及び表2に示すように、ALSをコードする遺伝子において、種を越えて保存されている保存領域中の1個又は2個のアミノ酸置換を引き起こす1個又は2個の塩基置換を有しているものが知られている。
例えば、スルホニルウレア系除草剤に対して特異的な抵抗性を有するALSをコードするもの(Kathleen et al.,EMBO J.7,1241−1248,1988;Mourad et al.,Planta,188,491−497,1992;Guttieri et al.,Weed Sci.43,175−178,1995;Bernasconi et al.,J.Biol.Chem.270,17381−17385,1995及び特開昭63−71184号公報参照)、イミダゾリノン系除草剤に対して特異的な抵抗性を有するALSをコードするもの(Mourad et al.,Planta,188,491−497,1992;Lee et al.,FEBS Lett.452,341−345,1999及び特開平5−227964号公報参照)、スルホニルウレア系除草剤とイミダゾリノン系除草剤の両方に対して抵抗性を有するALSをコードするもの(Kathleen et al.,EMBO J.7,1241−1248,1988;Bernasconi et al.,J.Biol.Chem.270,17381−17385,1995;Hattori et al.,Mol.Gen.Genet.246,419−425,1995;Alison et al.,Plant Physiol.111,1353,1996;Rajasekarau et al.,Plant Sci.119,115−124,1996、特開昭63−71184号公報、特開平4−311392号公報及びBernasconi et al.,US Patent 5633437,1997参照)、或いはPC系除草剤に高度な抵抗性を有するALSをコードするもの(角ら,日本農薬学会第26回大会講演要旨集,101頁,2001)が挙げられる。スルホニルウレア系除草剤に特異的に抵抗性を示すALSを有する個体とイミダゾリノン系除草剤に特異的に抵抗性を示すALSを有する個体とを掛け合わせて、両方に抵抗性を示す植物体を作る試みもなされている(Mourad et al.,Mol.Gen.Genet,243,178−184,1994)。さらに、ALSをコードする遺伝子を人為的に除草剤抵抗性遺伝子へ変えることも行われており(Ott et al.,J.Mol.Biol.263,359−368,1996、特開昭63−71184号公報、特開平5−227964号公報、特表平11−504213号公報参照)、1個のアミノ酸の欠失がスルホニルウレア系除草剤とイミダゾリノン系除草剤の両方に抵抗性を示すことが明かにされている(特開平5−227964号公報参照)。
上述のように除草剤に対する抵抗性を有するALS及びALSをコードする遺伝子について精力的に研究されてきた経緯があるが、PC系除草剤抵抗性を指標とし、PC系除草剤に対して特異的な抵抗性を有する変異ALS遺伝子については報告例が少なく、また、PC系除草剤及びその他の除草剤に対する抵抗性の検討に関しても報告例は少なかった。
発明の開示
そこで、本発明は、PC系除草剤或いはスルホニルウレア系除草剤に対して高度な抵抗性を示すALSタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子によりコードされるALSタンパク質、該遺伝子を有する組換えベクター、該組換えベクターを有する形質転換体、該遺伝子を有する植物、該植物の育成方法及び、該遺伝子を選択マーカーとして使用する形質転換細胞を選択する方法を提供することを目的とする。
上述した目的を達成するため、本発明者が鋭意検討した結果、野生型ALSにおける所定のアミノ酸残基を、所定のアミノ酸で置換してなる変異ALSがPC系除草剤に対して極めて高度な抵抗性を示すことを見出し本発明を完成するに至った。
(1)すなわち、本発明は、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子である。
(a)配列番号2,4,6および8のいずれか1つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)配列番号2,4,6および8のいずれか1つに記載のアミノ酸配列における少なくとも1以上のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ピリミジニルカルボキシ除草剤に対する抵抗性を有し、アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
(2)また、本発明は、(1)記載の遺伝子によりコードされるアセト乳酸シンターゼタンパク質である。
(3)さらに、本発明は、(1)記載の遺伝子を有する組換えベクターである。
(4)さらにまた、本発明は、(3)記載の組換えベクターを有する形質転換体である。
(5)さらにまた、本発明は、(1)記載の遺伝子を有し、ピリミジニルカルボキシ除草剤に対する抵抗性を有する植物である。
(6)さらにまた、本発明は、(5)記載の植物を、ピリミジニルカルボキシ除草剤存在下で育成することを特徴とする植物育成方法である。
(7)さらにまた、本発明は、(1)記載の遺伝子を選択マーカーとして使用し、該遺伝子を有する形質転換細胞を選択する方法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のアセト乳酸シンターゼ遺伝子をコードする遺伝子(以下、「変異型ALS遺伝子」という)は、野生型アセト乳酸シンターゼタンパク質(以下、「野生型ALSタンパク質」という)と異なるアミノ酸配列を有するアセト乳酸シンターゼタンパク質(以下、「変異型ALSタンパク質」という)をコードするものである。変異型ALSタンパク質は、イネで発現している野生型ALSタンパク質における所定の部位を変異させることによって得ることができる。本発明の変異型ALSタンパク質は、配列番号2,4,6及び8のいずれかのアミノ酸配列を含んでいる。
配列番号2のアミノ酸配列では、野生型ALSタンパク質のアミノ酸配列における171番目のプロリンがヒスチジンに置換されるとともに、野生型ALSタンパク質のアミノ酸配列における172番目のアルギニンがセリンに置換されている。配列番号2のアミノ酸配列を含む変異型ALSタンパク質を、「P171H/R172S変異型ALSタンパク質」又は「P171H/R172S変異型」と呼ぶ。
配列番号4のアミノ酸配列では、野生型ALSタンパク質のアミノ酸配列における171番目のプロリンがヒスチジンに置換されるとともに、野生型ALSタンパク質のアミノ酸配列における548番目のトリプトファンがロイシンに置換されている。配列番号4のアミノ酸配列を含む変異型ALSタンパク質を、「P171H/W548L変異型ALSタンパク質」又は「P171H/W548L変異型」と呼ぶ。
配列番号6のアミノ酸配列では、野生型ALSタンパク質のアミノ酸配列における171番目のプロリンがヒスチジンに置換されるとともに、野生型ALSタンパク質のアミノ酸配列における627番目のセリンがイソロイシンに置換されている。配列番号6のアミノ酸配列を含む変異型ALSタンパク質を、「P171H/S627I変異型ALSタンパク質」又は「P171H/S627I変異型」と呼ぶ。
配列番号8のアミノ酸配列では、野生型ALSタンパク質のアミノ酸配列における171番目のプロリンがヒスチジンに置換されるとともに、野生型ALSタンパク質のアミノ酸配列における548番目のトリプトファンがロイシン置換されるとともに、野生型ALSタンパク質のアミノ酸配列における627番目のセリンがイソロイシンに置換されている。配列番号8のアミノ酸配列を含む変異型ALSタンパク質を、「P171H/W548L/S627I変異型ALSタンパク質」又は「P171H/W548L/S627I変異型」と呼ぶ。
図1A及び図1Bにこれら4種類の変異型ALSタンパク質のアミノ酸配列と野生型ALSタンパク質のアミノ酸配列とを比較した結果を示す。なお、図1A及び図1Bにおいて、一列目のアミノ酸配列は野生型ALSタンパク質を示しており、二列目のアミノ酸配列はP171H/R172S変異型ALSタンパク質を示しており、三列目のアミノ酸配列はP171H/W548L変異型ALSタンパク質を示しており、四列目のアミノ酸配列はP171H/S627I変異型ALSタンパク質を示しており、五列目のアミノ酸配列はP171H/W548L/S627I変異型ALSタンパク質を示している。
これら変異型ALSタンパク質は、野生型ALSタンパク質と比較して、PC系除草剤に対する優れた抵抗性を有するばかりでなく、スルホニルウレア系除草剤及びイミダゾリノン系除草剤に対しても抵抗性を有する。このことは、例えば、変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子をサブクローニングしたpGEX 2Tで形質転換した大腸菌等において、発現した変異型ALSタンパク質の除草剤感受性を調べることにより判断することができる。
ここで、PC系除草剤としては、化1に示すように、bispyribac−sodium,pyrithiobac−sodium,pyriminobacを例示することができる。
スルホニルウレア系除草剤としては、化2に示すように、chlorsulfuronを例示することができる。
イミダゾリノン系除草剤としては、化3に示すように、imazaquinを例示することができる。
特に、P171H/R172S変異型ALSタンパク質は、P171H或いはR172Sを単独で有する変異型ALSタンパク質と比較して所定の除草剤に対して優れた抵抗性を示すだけでなく、P171H或いはR172Sを単独で有する変異型ALSタンパク質それぞれの抵抗性から予測される抵抗性よりも優れた抵抗性を示す。なお、R172Sを単独で有する変異型ALSタンパク質は、いかなる除草剤に対しても抵抗性を示すものではなく、R172S変異はサイレント変異である。換言すれば、P171H/R172S変異型ALSタンパク質は、単独ではサイレント変異であるR172S変異が、P171H変異型ALSタンパク質における抵抗性を向上させている。
また、P171H/W548L変異型タンパク質は、P171H或いはW548Lを単独で有する変異型ALSタンパク質と比較して所定の除草剤に対して優れた抵抗性を示すだけでなく、P171H或いはW548Lを単独で有する変異型ALSタンパク質それぞれの抵抗性から予測される抵抗性よりも優れた抵抗性を示す。換言すれば、P171H/W548L変異型タンパク質は、P171H変異型タンパク質及びW548L変異型タンパク質の両方の抵抗性から予測される相加効果の抵抗性を大幅に上回る抵抗性を示す。
さらに、特に、P171H/S627I変異型タンパク質は、P171H或いはS627Iを単独で有する変異型ALSタンパク質と比較して所定の除草剤に対して優れた抵抗性を示すだけでなく、P171H或いはS627Iを単独で有する変異型ALSタンパク質それぞれの抵抗性から予測される抵抗性よりも優れた抵抗性を示す。換言すれば、P171H/S627I変異型タンパク質は、P171H変異型タンパク質及びS627I変異型タンパク質の両方の抵抗性から予測される相加効果の抵抗性を大幅に上回る抵抗性を示す。
さらにまた、特に、P171H/W548L/S627I変異型タンパク質は、P171H、W548L或いはS627Iを単独で有する変異型ALSタンパク質と比較して所定の除草剤に対して優れた抵抗性を示す。
なお、本発明の変異型ALSタンパク質は、ピリミジニルカルボキシ除草剤に対する抵抗性を有し、且つ、アセト乳酸シンターゼ活性を有するアミノ酸配列であれば、配列番号2、4、6及び8のいずれかのアミノ酸配列において、少なくとも1以上のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるものであってもよい。ここで、「1以上のアミノ酸」とは、1〜30個のアミノ酸であることが好ましく、1個〜20個のアミノ酸であることがより好ましく、1〜10個のアミノ酸であることが更に好ましい。
特に、配列番号2のアミノ酸配列においては、「少なくとも1以上のアミノ酸」として171番目及び172番目のアミノ酸以外のアミノ酸であることが好ましい。配列番号4のアミノ酸配列においては、「少なくとも1以上のアミノ酸」として171番目及び548番目のアミノ酸以外のアミノ酸であることが好ましい。配列番号6のアミノ酸配列においては、「少なくとも1以上のアミノ酸」として171番目及び627番目のアミノ酸以外のアミノ酸であることが好ましい。配列番号8のアミノ酸配列においては、「少なくとも1以上のアミノ酸」として171番目、627番目及び548番目のアミノ酸以外のアミノ酸であることが好ましい。
ところで、本発明の変異型ALS遺伝子は、上述したような変異型ALSタンパク質をコードする塩基配列を有するものであれば特に限定されないが、例えば、配列番号1、3、5及び7のいずれかの塩基配列を挙げることができる。配列番号1の塩基配列は配列番号2のアミノ酸配列をコードし、配列番号3の塩基配列は配列番号4のアミノ酸配列をコードし、配列番号5の塩基配列は配列番号6のアミノ酸配列をコードし、配列番号7の塩基配列は配列番号8のアミノ酸配列をコードしている。変異型ALS遺伝子は、配列番号1、3、5及び7のいずれかの塩基配列において、所定のアミノ酸をコードするコドンを縮重コドンにより置換した塩基配列であっても良い。
図2A、図2B、図2C及び図2Dにこれら4種類の変異型ALSタンパク質をコードする塩基配列と野生型ALSタンパク質をコードする塩基配列とを比較した結果を示す。なお、図2A、図2B、図2C及び図2Dにおいて、一列目の塩基配列は野生型ALSタンパク質を示しており、二列目の塩基配列はP171H/R172S変異型ALSタンパク質を示しており、三列目の塩基配列はP171H/W548L変異型ALSタンパク質を示しており、四列目の塩基配列はP171H/S627I変異型ALSタンパク質を示しており、五列目の塩基配列はP171H/W548L/S627I変異型ALSタンパク質を示している。
また、本発明の変異型ALS遺伝子は、配列番号1、3、5及び7のいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき、且つ、アセト乳酸シンターゼ活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるものであってもよい。ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。ストリンジェントな条件下としては、例えば、相同性が高いDNA同士(例えば50%以上の相同性を有するDNA同士)がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件を挙げることができる。具体的に、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC,0.1%SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1%SDSに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
これら変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子は、日本型イネ品種である金南風のゲノムDNAに存在する野生型ALSタンパク質をコードする遺伝子に対して、上述したような変異を導入することによって得ることができる。変異を導入する手法としては、公知の手法を使用することができ、例えば、部位特異的変異導入法を用いることができる。部位特異的変異導入法は、市販のキット、例えばMutan−K(宝酒造株式会社製)、GeneEditor(プロメガ社製)、ExSite(ストラタジーン社製)等を使用して行うことができる。
また、変異ALSタンパク質をコードする遺伝子は、PC系除草剤感受性の野生株培養細胞をPC系除草剤の存在下で培養し、その後、出現したPC系除草剤に対する抵抗性を示す変異株培養細胞から得ることができる。そして見い出された変異をもとにしてPCR法及びSPR(self polymerase reaction)法により、新たな変異の組み合わせを持つALSタンパク質をコードする遺伝子を、酵素を使って合成することができる。
具体的には、先ず、PC系除草剤抵抗性の変異型培養細胞からmRNAを調製し、cDNAを合成後、λgt11ファージのcDNAライブラリーを作出する。これを、野生型ALSタンパク質をコードする遺伝子の一部を含んでいる核酸プローブを用いてスクリーニングし、得られる陽性クローンのインサートDNAをpBluescript II SK+にサブクローニングし塩基配列を決定する。変異が認められたcDNAインサートについては、インサートDNAを保持するpBluescript II SK+を鋳型として、野性型イネALS遺伝子を元に設計したプライマーを使い、PCR及とSPR法で変異を含む断片を合成する。一方、PC系除草剤抵抗性のイネ培養細胞からゲノムDNAを調製すると伴にイネALS遺伝子を元に各種プライマーを設計する。そしてプライマーウオーキングによって、調製したゲノムDNAに存在するALS遺伝子のシークエンスを決定して変異部位を見つけ出す。変異が見い出された場合に、その変異を含む断片をPCR法及びSPR法で合成する。pBluescript II SK+へクローニングした変異型ALS cDNAから合成した変異を含む断片を含めて、これらの変異を含む断片をpGEX 2Tへサブクローニングし、このベクターで大腸菌を形質転換する。
その結果、配列番号2、4、6及び8に示すアミノ酸配列をコードするインサートDNAを有するクローンを選択することによって、変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子を得ることができる。なお、上述のようにして得られた、配列番号2に示すアミノ酸配列を含む変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子をpGEX 2Tに組み込んだプラスミドはRice Mutant ALS cDNA 1(FERM BP−7944)として、配列番号4に示すアミノ酸配列を含む変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子をpGEX 2Tに組み込んだプラスミドはRice Mutant ALS cDNA 2(FERM BP−7945)として、配列番号6に示すアミノ酸配列を含む変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子をpGEX 2Tに組み込んだプラスミドはRice Mutant ALS cDNA 3(FERM BP−7946)として、配列番号8に示すアミノ酸配列を含む変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子をpGEX 2Tに組み込んだプラスミドはRice Mutant ALS cDNA 4(FERM BP−7947)として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)に、2002年3月8日付けでブタペスト条約に基づき国際寄託されている。
一方、変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子を、標的とする植物に形質転換することによって、当該植物に対してPC系除草剤等の多種の除草剤に対して抵抗性を与えることができる。植物に形質転換する手法としては、公知の手法を使用することができる。例えば、アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)を用いて外来遺伝子を標的植物細胞に導入する手法を例示することができる。
具体的には、アグロバクテリウムのTiプラスミドのT−DNA配列を含んでいるバイナリーベクターに変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子を挿入する。このTiプラスミドを大腸菌等に形質転換する。次に、大腸菌等で増殖させた変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子を保持するバイナリーベクターを、ヘルパープラスミドを含んでいるアグロバクテリウム菌に形質転換する。そして、このアグロバクテリウム菌を、標的とする植物に感染させた後、形質転換植物を同定する。同定された形質転換植物が培養細胞の場合には、公知の手法により、その植物細胞を完全な植物に再生させることができる。
また、変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子を標的とする植物に形質転換する場合、公知の手法を用いて直接的に植物体に導入してもよい。さらに、変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子を有する発現ベクターを形質転換する方法としては、ポリエチレングリコール法、エレクトロポーレーション法、パーティクルガン法等を使用することができる。
一方、変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子は、単子葉植物及び双子葉植物等のいかなる種類の植物に形質転換してもよい。変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子を形質転換する対象の作物としては、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、大豆、棉、アブラナ、サトウダイコン及びタバコ等を挙げることができる。さらに、変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子を導入することによって、芝草や樹木等を形質転換してもよい。
いずれの場合であっても、変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子を植物に形質転換することによって、当該植物に対して、PC系除草剤、スルホニルウレア系除草剤及びイミダゾリノン系除草剤に対する抵抗性を付与することができる。
ところで、変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子は、植物形質転換実験における選択性マーカーとしても使用することができる。例えば、目的遺伝子を用いて植物細胞を形質転換する場合、変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子と目的遺伝子とを有するベクターを植物細胞内に導入した後、当該植物細胞をPC系除草剤等の除草剤の存在下で培養する。その結果、除草剤の存在下で生存する植物細胞には、変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子と共に目的遺伝子が導入されたことが判る。また、目的遺伝子及び変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子が植物細胞の染色体に組み込まれたかどうかは、その植物の表現型を観察した後、ゲノムサザーンハイブリダイゼーション或いはPCRによって、これら遺伝子のゲノム上の存在を調べることで確認することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を、実施例を用いて更に詳細に説明する。ただし、本発明の技術範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例1〕 PC除草剤抵抗性のイネ(金南風)培養細胞の作出
イネの種子(品種;金南風、学名:Oryza sativa var.Kinmaze)の籾を除いた後、当該種子を70%のエタノール中に5分間浸漬し、その後、約5%のアンチホルミン中に20分間浸漬し、その後、滅菌蒸留水で数回洗浄した。次に、この種子を表3に示す組成の培地上で静置培養した。
なお、上記培地組成中、2,4−Dは合成オーキシンである。培地を作製する際には、先ず、上記培地組成を1リッターのビーカーに入れ、蒸留水で1000mlにする。次に、これをpH5.7に調製し、3gのゲルライトを添加する。次に、電子レンジを用いて加熱してゲルライトを解かした状態とし、分注機を用いて30mlずつ培養フラスコに分注する。次に、培養フラスコに3重のアルミ箔をかぶせ、オートクレーブ装置内で121℃、15〜20分間加熱滅菌する。その後、室温にまで冷却することによって、上記種子を静置培養するための培地を作製した。
続いて、この培地上で誘導されたカルスから胚乳の部分を除き継代培養を行った。そして、得られたカルスの一部を、PC系除草剤の1つあるbispyribac−sodiumを1μM添加した液体培地(表3の培地組成と同様であり、ゲルライトを添加しないもの)中でおよそ2週間に1回継代しながら培養を行った。その結果、2週間〜6週間程度で培養細胞が枯死し始め、約2ヵ月後でほとんどが枯死して茶色に変色している培養細胞集団の中に、変色が無く細胞分裂を行っていると考えられる細胞塊が複数個得られた。これら細胞塊を単離し、培養を行った結果、2μMのbispyribac−sodium存在下でも増殖する複数の細胞株を得ることができた。得られた細胞株をそれぞれRb系統、Sr系統、Ga系統及びVg系統と命名した。
その後、得られた複数の細胞株をbispyribac−sodiumの添加濃度を順次上げて培養した結果、100μMのbispyribac−sodium共存下でも増殖できる細胞株が得られた。このbispyribac−sodium抵抗性培養細胞(以下、抵抗性変異株)を1〜10μMのbispyribac−sodiumを添加したMS−2,4−D固体培地で継代培養した。継代培養した抵抗性変異株の一部を採取し、bispyribac−sodium無添加のMS−2,4−D液体培地に添加して、8日〜10日間のサイクルで懸濁培養した。
そして、この抵抗性変異株約1.5g(湿重量)を、MS−2,4−D液体培地50mlと所定の濃度のbispyribac−sodiumとを入れておいた200mlの三角フラスコに移植し、約27℃で所定期間培養した。経時的にカルスの湿重量を測定し、移植した抵抗性変異株の湿重量を基準にして相対的な増殖量を求めた。なお、試験は、bispyribac−sodium濃度を変化させたものを3連で行い、標準誤差(standard error)を算出した。抵抗性変異株におけるbispyribac−sodium濃度変化と8或いは12日目の相対重量との関係を図3〜6に示す。また対照として、金南風の野生株を用いて同様な実験を行い、bispyribac−sodium濃度と8日目の相対重量との関係を測定した結果を図7に示す。
図7から判るように、野生株では、1nMのbispyribac−sodium添加区で増殖阻害されなかったが、10nM以上のbispyribac−sodium添加区で増殖阻害されていることが判る。一方、図3〜6から判るように、抵抗性変異株(Rb系統、Sr系統、Ga系統及びVg系統)では、Vg系統以外は10μMのbispyribac−sodium添加区においてもほとんど増殖に影響を受けていないことが判る。Vg系統であっても、野生株と比較すると、bispyribac−sodiumの増殖に対する影響が小さいことが判る。
一方、bispyribac−sodiumに代えてchlorsulfuronを用いた場合も、上述したように野生株及び抵抗性変異株の増殖率を測定した。野生株におけるchlorsulfuron濃度変化と9日目の相対重量との関係を図8に示す。また、抵抗性変異株、すなわち、Rb系統、Sr系統、Ga系統及びVg系統におけるchlorsulfuron濃度変化と8或いは10日目の相対重量との関係を図9〜12に示す。
図8から判るように、野性株では、1nMのchlorsulfuron添加で増殖阻害を受けており、bispyribac−sodiumの場合よりも高い感受性を示した。一方、図9〜12から判るように、Rb系統、Sr系統、Ga系統及びVg系統では、それぞれ感受性は異なるが、chlorsulfuron添加による増殖阻害の影響が小さく、chlorsulfuronに対する抵抗性を示した。なお、bispyribac−sodium及びchlorsulfuronに対する感受性は、野性株及び抵抗性変異株において、培養時間が長くても共に大きく変化することはなかった。また、増殖速度は、抵抗性変異株及び野性株において、ともにほぼ同じであった。
これらの結果から、抵抗性変異株は、bispyribac−sodiumに対して高い抵抗性を有するものであることが明らかとなった。また、抵抗性変異株は、野生株と比較してchlorsulfuronに対する抵抗性が向上していることも明らかとなった。
〔実施例2〕抵抗性変異株から部分精製したALSタンパク質の薬剤感受性
本例では、実施例1で得られた抵抗性変異株(Ga系統を除く、Rb系統、Sr系統及びVg系統)から変異型ALSタンパク質を部分精製し、得られた変異型ALSタンパク質における薬剤感受性を検討した。変異型ALSタンパク質は以下のようにして部分精製した。
先ず、表3のうちゲルライトを除いた組成で液体培養法(bispyribac−sodium無添加)により抵抗性変異株を200g以上調製した。次に、これらの約150gを組織重量の3倍量の緩衝液−1(20%(v/v)のグリセロール、0.5mMのチアミンピロリン酸(TPP)、10μMのフラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)、0.5mMのMgCl2、組織重量の1/10量のポリビニルポリピロリドンを含む100mMのリン酸カリウム緩衝液pH7.5)でヒスコトロンを用いてホモジナイズした。ホモジネートをナイロンガーゼでろ過した後、15000×gで20分間遠心した。遠心上澄に、50%飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、氷中に約1時間放置した。これを再度、15000×gで20分間遠心し、その沈澱画分を約30mlの緩衝液−2(20%(v/v)のグリセロール、0.5mMのTPP、0.5mMのMgCl2を含む10mMのトリス塩酸緩衝液緩衝液pH7.5)に溶解した。これを再度、15000×gで20分間遠心し、その上澄画分をセファデックスG−25(アマシャム バイオサイエンス社製)にアプライして素通り画分を約40ml採取した。そして、採取した液を「粗酵素液」とした。
次に、粗酵素液のタンパク質の濃度を、Bio−Rad Protein Assayのマニュアルに従ってBradford法で測定した。その後、粗酵素液をワットマンフィルター(ワットマン社製)でろ過し、タンパク質量として適正な量の粗酵素液(10〜15ml)をFPLC装置(アマシャム バイオサイエンス社製)を使用して、3本連結したHiTrapQ(アマシャム バイオサイエンス社製)にアプライした。HiTrap Qを用いてタンパク質成分を吸着させた後、ベッドボリュームの3〜5倍量の緩衝液−2で非吸着画分を流し出した。その後、吸着したタンパク質成分を、ベッドボリュームの10倍量(150ml)の溶出液を用いて溶出した。ここで、溶出液は、0〜0.4Mの直線濃度勾配で緩衝液−2にKClを溶解させたものである。タンパク質成分を溶出した溶出液は、複数の分取用試験管に5mlずつ分取した。なお、溶出したタンパク質成分に含まれるALSタンパク質を安定化するために、20mMのピルビン酸ナトリウムを含む緩衝液−2(0.5ml)を事前に分取用試験管の中へ添加しておいた。
次に、複数の分取用試験管に分取された溶出画分に含まれる変異型ALSタンパク質に由来するALS活性を、以下のように測定した。測定反応に使用する反応溶液は、20mMのピルビン酸ナトリウム、0.5mMのTPP、0.5mMのMgCl2、10μMのFAD及び20mMのリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)からなる溶液に、測定対象の溶出画分を混合したものである。この反応溶液を1ml使用した。測定反応は、測定対象の溶出画分を添加した後、30℃で40分〜60分間行った。また、測定反応は、0.1mlの6N硫酸(あるいは0.25Nの水酸化ナトリウム)を添加することにより停止させた。
次に、反応が終了した反応溶液を60℃で10分間インキュベートした。これにより、反応溶液中に含まれるアセト乳酸をアセトインに変化させた。
次に、反応溶液中に含まれるアセトインを定量するため、0.5%(w/v)のクレアチン1mlと2.5Nの水酸化ナトリウムに溶かした5%(w/v)のα−ナフトール1mlとを添加し、37℃で10分間インキュベートした。その後、反応溶液における吸光度525nmを比色することでアセトインを定量し、ALS活性を評価した。なお、反応溶液中には、少量のピルビン酸ナトリウムが含まれるため、反応0時間をコントロールとした。
その結果、OD525nmにおける吸光度が反応溶液0.2ml当たりで約7という高い値となった。しかしながら、上述した測定反応を水酸化ナトリウムで停止させ、ALS活性以外によるアセトイン生成活性を調べた結果、この見掛け上のALS活性の80%近くが変異型ALSタンパク質以外の直接的なアセトイン生成活性であることが判った。そこで、変異型ALSタンパク質と変異型ALSタンパク質以外のアセトイン生成活性を、陰イオン交換樹脂を使用したFPLCで分離した。抵抗性変異株としてSr系統を用いた場合の結果を図13に示す。図13に示すように、3つの活性ピークが検出された。
これら3つの活性ピークのうち、どちらに変異型ALSタンパク質が含まれているのを判定するために、各ピークのアセトイン生成活性を調べた。その結果、変異型ALSタンパク質は、初めに溶出したピークで示される画分に含まれていることがわかった。
そして、変異型ALSタンパク質を含む酵素溶液を用いて、当該変異型ALSタンパク質のbispyribac−sodium、chlorsulfuron及びimazaquinに対する感受性を調べた。各除草剤に対する感受性は、酵素溶液を添加する前に除草剤を所定の濃度となるように反応液中に添加した以外は、上述した測定反応と同様にしてALS活性を測定することによって評価した。また、比較のために、野生型ALSタンパク質を同様にして分離精製し(図14)、実験に供した。なお、bispyribac−sodiumは水溶液とし、chlorsulfuron及びimazaquinはアセトン溶液とした。アセトン溶液は最終濃度1%とした。
ALS活性阻害率とbispyribac−sodium濃度との関係を図15に示す。ALS活性阻害率とchlorsulfuron濃度との関係を図16に示す。ALS活性阻害率とimazaquin濃度との関係を図17に示す。なお、これら図15〜図17において、野生型ALSタンパク質を破線で示し、Sr系統の変異型ALSタンパク質は二点破線で示し、Rb系統の変異型ALSタンパク質は実線で示し、Vg系統の変異型ALSタンパク質は一点破線で示している。
また、上述した実験から、ALS活性を50%阻害する除草剤濃度(I50値)をプロビット法に準じて算出し、変異ALSタンパク質におけるI50値と野生型ALSタンパク質におけるI50値との比を算出した。結果を表4に示す。
さらに、表4の結果から、各除草剤について抵抗性変異株のI50値を野生株のI50値で除算し、RS値を算出した結果を表5に示す。
これら図15〜図17、表4及び表5に示すように、変異型ALSタンパク質は、野生型ALSタンパク質と比較して除草剤存在下でも比較的高いALS活性を示した。特に、Rb系統及びSr系統由来の変異型ALSタンパク質では、それぞれbispyribac−sodiumに対する感受性が他の除草剤に対する感受性と比較して顕著に優れていることが判った。すなわち、これらRb系統及びSr系統は、特にbispyribac−sodiumに対する抵抗性に優れたものであることが判った。
〔実施例3〕野生型及び変異型ALS遺伝子のクローニング
本例では、野生株から野生型ALSタンパク質をコードする遺伝子(野生型ALS遺伝子)をクローニングするとともに、抵抗性変異株から変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子(変異型ALS遺伝子)をクローニングした。
野生型ALS遺伝子及び変異型ALS遺伝子をクローニングする際に使用するプローブを以下のようにして調製した。本例においてプローブとしては、トウモロコシのALS遺伝子と高い相同性を示したイネ(日本晴)由来部分cDNAを使用した。
(1)トウモロコシのALS遺伝子と高い相同性を示したイネ(日本晴)由来部分cDNAの塩基配列の決定
社団法人農林水産先端技術産業振興センター及び独立行政法人農業生物資源研究所が行っているイネゲノムプロジェクトの一環でイネ(日本晴)のcDNAの部分塩基配列の決定が行われており、cDNAの部分塩基配列データベースが構築されている。このデータベースに含まれる約350bpの塩基配列として既に知られているcDNAクローン(アクセッション番号:C72411)がトウモロコシにおけるALS遺伝子と高い相同性を示した。なお、トウモロコシにおけるALS遺伝子は完全に塩基配列が決定されている。
そして、このcDNAクローン(アクセッション番号:C72411)を農業生物資源研究所から入手し、以下のように塩基配列を決定した。なお、このcDNAクローンは、ALSホモログ遺伝子がpBluescript II SK+中に挿入されており、大腸菌内で自律複製を行うことができる形であった。
先ず、このALSホモログ保持プラスミドベクターを大腸菌(DH5α)へ形質転換した。プレートより得られた白色のコロニーを液体培養し、菌体より常法に従いプラスミドを抽出した。インサートDNAはプラスミドベクター中のマルチクローニングサイトの制限酵素、Sal IとNot Iの間に挿入されていたのでこの2つの酵素でベクターを消化し、アガロース電気泳動でインサートの確認を行った。この後、得られたALSホモログ保持プラスミドベクターをRNaseA、PEG、LiCl等を使用する常法に従って精製し、プライマー及びABI BigDyeTerminator Cycle Sequencing kitを用いシークエンス反応を行った。PCRの条件はプロトコールに従った。またプライマーはM13プライマー及び決定した塩基配列から設計した合成プライマーを用いた。得られたPCR産物をエタノール沈殿で精製し、ABI PRISM 310シークエンサーで塩基配列を決定した。
このALSホモログ保持プラスミドベクターには、1.6kbpのインサートDNAが入っているという情報であった。得られたALSホモログ保持プラスミドベクターをSalIとNotIの制限酵素で消化し、電気泳動を行ったところ、pBluescript II SK+に相当する約3kbpのバンドとインサートDNA断片に相当する1.6kbpのバンドが検出された(図示せず)。インサートDNA部分についての全塩基配列を決定し、トウモロコシの塩基配列の相同性検索を行った結果、図18A及び図18Bに示すように、84.7%の相同性を示した。したがって、このALSホモログは日本晴におけるALS遺伝子の部分cDNAであると判断されたので、Sal I及びNot Iで消化して切り出したインサートDNAをプローブとした。なお、図18A及び図18Bにおいて、一列目は日本晴におけるALS遺伝子のcDNAの塩基配列であり、二列目はトウモロコシにおけるALS遺伝子の塩基配列である。
(2)抵抗性変異株及び野性株からのmRNAの調製
先ず、液体窒素で凍結した抵抗性変異株を、乳鉢と乳棒を用いて摩砕した後、ミキサーにより30秒間細かく粉砕した。粉砕後の粉末を抽出緩衝液〔(100mM Tris−HCl pH9.0,100mM NaCl,1重量% SDS,5mM EDTA):(β−mercaptoethanol):(Tris飽和フェノール)=15:3:20〕中に懸濁し,その後よく撹拌した。この溶液を12000×gで15分間遠心し上澄を回収し、200mlのPCI〔(Tris飽和フェノール):(chloroform):(isoamylalcohol)=25:24:1〕を加え、4℃で10分間振とうした後、12000×gで15分間遠心し上澄を回収した。この操作を2回繰り返した。得られた上澄に1/20量の5MのNaCl、2.2倍量のエタノールを加え、−80℃で30分間静置した後、12000×gで5分間遠心することで沈殿を回収した。沈殿を70%エタノールで洗浄し、乾燥させた後に10mMのβ−メルカプトエタノール溶液に溶かし、この溶液を27000×gで10分間遠心して不溶性画分を除いた後、10MのLiClを1/4量加えて氷上で1時間静置した。これをさらに27000×gで10分間遠心して沈殿を回収し、4mlのH2Oに溶かした後、260nmの吸光度を測定してRNAの濃度を求めた。これに1/20量の5M NaClと2.2倍量のエタノールを加えて、−80℃で30分間静置した後、27000×gで10分間遠心して沈殿を回収し、70%エタノールで洗浄後乾燥させた。これを適量のH2Oに溶かしトータルRNA溶液とした。なお、遠心操作は4℃で行った。
このトータルRNAから次の方法でmRNAの分離精製した。抽出したトータルRNA溶液の液量に対して等量の2×結合バッファー(20mM Tris−HCl(pH7.5),10mM EDTA,1M NaCl)を加えた。0.1gのoligo dT cellulose(アマシャム バイオサイエンス社製)を詰めたカラムを1×結合バッファーで洗浄した後、このトータルRNA溶液をカラムにかけた。1×結合バッファーで洗浄した後、溶出バッファー(10mM Tris−HCl(pH7.5),5mM EDTA)をアプライし、溶出液を0.5mlずつ回収した。なお、カラムを素通りした画分については、別のoligo dT cellulose(アマシャム バイオサイエンス社製)カラムにかけ、同様の操作を行った。各画分の吸光度から溶出されたmRNAの濃度を計算した後、1/10量の10M LiClと2.5倍量のエタノールを加えて−80℃で30分間静置した。これを遠心して沈澱画分を乾燥した後100μlのH2Oに溶かした。こうして得られたmRNAをショ糖密度勾配遠心法によりサイズ分画した。
分離精製したmRNAを、25%ショ糖溶液及び5%ショ糖溶液を用いて密度勾配をつけた遠心管にアプライし、スウィングローターを用いて4℃、27000rpmで15時間超遠心を行った。遠心後、密度勾配の順に各0.5mlずつ分画回収した。それぞれの画分の吸光度を測定し、回収されたmRNAの濃度を計算するとともにECLキット(ECL direct nucleic acid labelling and detection system,アマシャム バイオサイエンス社製)によるハイブリダイゼーションによりALS mRNAの存在を確認した。ハイブリダイゼーションは、上記(1)で調製したプローブを用いて42℃で16時間行った。また、ハイブリダイゼーション後の洗浄は、キット添付の1次洗浄バッファーを用いて42℃で5分間を2回、その後、2×SSC溶液を用いて42℃で5分間を1回行った。洗浄後の膜は、透明のプラスティックフィルムで包みキット付属の発光試薬に浸し多状態を維持し、その後、X線フィルムに感光させた。
これらの操作により、抵抗性変異株としてSr系統を用いた場合には、約35mgのトータルRNAを抽出するとともに、約4mgのmRNAを抽出することができた。また、ショ糖密度勾配遠心法では、予想される画分にハイブリダイゼーション陽性のスポットが認められた。
一方、野生株を用いたところ、約95mgのトータルRNAを抽出するとともに、約7mgのmRNAを抽出することができた。野生株からmRNAを抽出する際には、抵抗性変異株に代えて野生株を使用した以外は、上述した方法を適用した。
(3)抵抗性変異株及び野性株由来のcDNAライブラリの作製
上記(2)で精製したmRNA2μg及びcDNA合成キット(アマシャム バイオサイエンス社製)を用いてcDNAの合成を行い、抵抗性変異株由来のcDNAライブラリの作製した。
先ず、逆転写反応にはキット添付のRTaseを使用し、その後の相補鎖伸長反応にはキットに添付のT4 DNApolymeraseを使用した。相補鎖伸長反応の際には、cDNA合成の収率を計算するために32P−dCTPを加えた。合成したcDNAは、アダプターを付加した後、in vitroパッケージング法によりλファージへ組み込んだ。
cDNAに付加するアダプターとしては、宝酒造株式会社製のEco RI−Not I−Bam HIアダプターを使用した。cDNAを含む溶液にcDNAに対してモル濃度で50倍のアダプターを加え、この混合溶液にT4 DNA Ligase(ファルマシア社製)を加えてライゲーション反応を4℃で一晩行った。この反応溶液をAsahiPak GS 710カラム(旭化成工業株式会社製)を用いてHPCLにアプライし、溶出液を波長260nmの紫外線でモニターした。溶出液を0.5ml程度ずつ25本に分画し、各フラクションをCerenkovカウンターで測定し、カウントの高いフラクションを3〜4本回収した。このフラクションをT4 polynucleotide kinase(宝酒造株式会社社製)を用いてアダプターの5’末端をリン酸化した後、λgt 11 Eco RIアームを加えてライゲーションした。ライゲーション反応は、溶液にGigaPack Gold III(Stratagene社製)を加えて室温で2時間行った。反応終了後、200μlのSMバッファーと8μlのクロロホルムを加えてファージ溶液とした。このファージ溶液を10倍希釈し、これの1μlを大腸菌(Y−1088)に感染させた後、0.7%トップアガーを加え、LBプレートに蒔き、4時間から8時間後にプレートに現れたプラークの数を数えることでタイターを測定した。
DE 81ペーパーとCerenkovカウンティングの結果からSr系統由来のcDNAが約74ng合成されたことが判った。アダプターを付加したベクターのライゲーション後のCerenkovカウンティングの結果からSr系統について約22ngのインサートが挿入されたλDNAが得られた。このλDNAをファージへパッケージングし、これを抵抗性変異株細胞由来のcDNAライブラリとした。このライブラリ溶液のタイターは、16600pfu/μlであった。
一方、野生株から抽出したmRNAを用いて、上述した方法に準じてcDNAライブラリを調製したところ、野生株由来のcDNAが約38ng合成されたことが判った。また、野生株についてインサートが挿入されたλDNAが約5ng得られた。さらに、野生株由来のcDNAライブラリ溶液のタイターは18160pfu/μlであった。
(4)ALS遺伝子を含むcDNAのスクリーニング
プレートに20000個程度のプラークが出るように、上記(3)で調製したライブラリ溶液を希釈した後、野性株由来及びSr系統由来のファージをそれぞれ10枚ずつ蒔いた。プラークをニトロセルロースメンブレン(Schleicher & Schnell社製,PROTORAN BA85,ポアサイズ0.45μm)へ転写し、転写したニトロセルロースメンブレンを変性溶液(0.5M NaOH,1.5M NaCl)、続いて中和溶液(1.5M NaCl,0.5M Tris−HCl(pH7.5),1mM EDTA)に約20秒浸した。濾紙を用いてニトロセルロースメンブレンから余分な水分を除去した後、ニトロセルロースメンブレンを80℃で2時間ベーキングした。なお、ニトロセルロースメンブレンに代えてHybond−N+(アマシャム バイオテック社製)を用いた際には、ベーキング操作は省略し、0.4M NaOHにて20分間固定した。
上記(1)で調製したインサートDNAを、RI及び非RIの2種類の方法でラベル化しプローブDNAとして使用した。RIラベル化とハイブリダイゼーションは次の方法で行った。まず、約200〜500ngのプローブDNAを熱変性させた。BcaBEST DNA labelling kit(宝酒造株式会社製)を用いてラベルを行った。このラベル化反応に際して、キットに添付のバッファー、ランダムプライマー及び32P−dCTPを加えた。BcaBESTを加え、65℃で30分間インキュベートした。その後、EDTAを加えて反応を停止させた。ニトロセルロースメンブレン8枚程度にプローブがおよそ100ng程度含まれる容量を加え、42℃、一晩、微振とうでハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、2×SSC,0.1% SDS溶液で3回洗浄し後、BAS 2000イメージングアナライザー(富士フィルム株式会社製)のイメージングプレートに約1時間露光させた。露光後イメージングアナライザーを用いて陽性クローンを検出した。
一方、非RIラベル化は次の方法で行った。約200〜500ngのプローブDNAを熱変性させた後、ECLダイレクトDNA/RNAラベリング・検出システム(アマシャム バイオサイエンス社製)添付のDNA標識試薬(ペルオキシダーゼ)及びグルタルアルデヒドを加えて37℃でインキュベートした。この場合、ニトロセルロースメンブレン膜8枚程度におよそ100ng程度のラベル化プローブDNAが含まれるように添加した後、42℃、一晩、微振とうでハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、primary washing bufferを室温、10分間、3回、その後2×SSCで室温、10分間、1回で膜の洗浄を行った。膜をECLキット添付の発光液に浸し、30分から3時間でX線フィルムに露光した。
ハイブリダイゼーション(1次スクリーニング)の結果得られた陽性ファージを滅菌した爪楊枝でトップアガーごと掻き取り、200μlのSMバッファーに懸濁し、ファージ溶液を得た。このファージ溶液を各クローンごと適宜希釈を行い、大腸菌Y−1088株に感染させ、LBプレートに蒔いた。この新たに作製したプレートを用いて、同様にハイブリダイゼーション(2次スクリーニング)を行い、陽性ファージを200μlのSMバッファーに懸濁し、シングルファージとした。なお、2次スクリーニングでシングルファージとして単離できなかった場合、もう一度希釈してLBプレートに蒔き、ハイブリダイゼーション(3次スクリーニング)を行ってシングルファージにした。
このシングルファージから次の方法でλDNAを調製した。竹串又は爪楊枝を使って陽性クローンのプラークから集めたλファージを、新鮮な宿主大腸菌(Y1088)懸濁液を5μl含む200μlの2xYT培地(10mM MgCl2と0.2%マルトースを含む)にイノキュレートした。静置状態42℃で一晩インキュベートした後、再度宿主大腸菌(Y1088)懸濁液を25μl含む1mlの2xYT培地(10mM MgCl2と0.2%マルトースを含む)にイノキュレートし一晩振とう培養した(以上が前培養)。前培養した溶液(10〜50μl)を10mMのMgCl2と0.5mlの大腸菌Y1088懸濁液とを含む12mlの2xYT培地にイノキュレートし、比較的強く振とうしながら溶菌後濁度が増すまで42℃で一晩インキュベートした。培養終了後、50μlのクロロホルムと1.2mlの5M NaClを加え、振とうしながら42℃で10分間インキュベートした。これを27000×gで10分間遠心した後、新たに遠心管に移した上澄に5mlの50% PEGを加え、氷上で1時間以上インキュベートした。これを27000×gで10分間遠心し上澄を捨てた後、再度27000×gで遠心して液体部分を捨てた。沈澱画分を4μgのDNase I、20μgのRNase Aならびに10mMのMgCl2を含む30mMのトリス塩酸緩衝液pH7.5の300μlに懸濁させ、1.5mlチューブへ移した。この懸濁液を37℃で30分間インキュベートした後、7.5μlの20%SDS、3μlのproteinase K(10mg/ml)、12μlの0.5M EDTAを加え、さらに55℃で15分間インキュベートした。これに150μlのフェノールを加えて激しく撹拌した後、トミーマイクロ遠心機MR−150(トミー精工社製)を用いて15000rpmで3分間遠心し、水層を回収した。集めた水層に800μlのエチルエーテル(蒸留水を加えて過酸化物を除いておく)を加え激しく撹拌した後、15000rpmで10秒間遠心しエーテル層を捨てた。このエーテル抽出操作を繰り返した後、水層に残存するエーテルを窒素ガスで除去した。水層に30μlの5M NaCl、875μlのエタノールを加えることで沈澱してきたλDNAを速やかに回収し、λDNAを1ml程度の70%エタノールでリンスした後、約1分間減圧下で乾燥させてエタノールを除いた。これを20μl〜50μlのTE緩衝液(pH8.0)に溶かしてλDNA溶液とした。
得られたλDNA中のインサートDNAのサブクローニング及び塩基配列決定は次の方法で行った。得られたλDNA溶液(1μl)をNot Iで消化し、インサートDNAを切り出した。切り出し反応の反応液組成は制限酵素添付の説明書に従い、37℃で約2時間反応させた後、1%アガロースゲルを使用した電気泳動でインサートサイズの確認を行った。インサートDNAを持つλDNA(10μl〜20μl)をNot Iで消化し、インサートDNAを切り出した。これを分取用のアガロースゲルで分離した後、相当するバンドをゲルから切り出し、常法によりインサートDNAを精製した。このインサートDNAとBAP処理(エビのアルカリフォスファターゼを用いた脱リン酸化処理)したベクターとをモル比で1:1の割合で混合し、T4 DNAリガーゼで16℃、2時間以上ライゲーション反応を行った。なお、インサートDNAはNot Iで切り出したものを材料としたので、BAP処理についてもNot Iで切断したベクターについて行った。ライゲーション終了後、その溶液の一部をコンピテントセル(DH5α)と混合し、氷上に30分間放置した。これを42℃で30秒間ヒートショックを行い、さらに氷上に2分間放置した。続いてSOCを添加し37℃で1時間インキュベートした後、2×YT(50μg/mlのアンピシリン入り)の100μ及び3% X−Gal 30μlならびに1M IPTG 3μlを混合したものを事前に均一になるようにまいておいたLB培地上プレートにまき、37℃で10時間以上培養した。形質転換された白色コロニーをアンピシリン入りのLB培地あるいは2xYT培地の2mlに1つのコロニーを接種した後37℃で一晩培養した。この培養液から常法によりプラスミドを調製しH2Oに溶かしDNA濃度を定量した後シークエンス用PCR反応に供した。PCR反応及び塩基配列決定は上述した方法で行った。
以上の実験により、野性型及びSr系統のそれぞれの培養細胞から約2.2kbの不完全長のALS cDNAが得られた。このDNAの5’側から約250bpの位置にSma Iサイトが存在したので、さらに次の方法で新たなプローブを作製した。野生株由来の約2.2kbpの不完全長のALS cDNAを保持するpBluescript II SK+を宿主大腸菌のJM109で増やした後、プラスミドを自動分離装置(KURABO PI−100)で抽出した。このプラスミドを直接Sma Iで消化し、生成した約250bpの断片を1%のアガロース電気泳動で分離精製し濃度を算出後プローブとした。このプローブを用いて上述のRIを使用した方法で再度ライブラリをスクリーニングした。その結果得られたシングファージからλDNAを調製し、そのλDNA溶液(1μl)をEco RIで消化し、電気泳動でサイズを確認した後、ニトロセルロースメンブランに固定した。電気泳動後のゲルを1.5M NaClを含む0.5M NaOH溶液中に浸し15分間程度軽く振とうした。この後ゲルを水洗し、3MのNaClを含む0.5M Tris−HCl(pH7.5)に浸し15分程度振とうしながらゲルを中和した。ステンレスバットに20×SSCを張り、その中に工業用の厚手のろ紙を5枚程度重ねた台座を置いた。その上に中和後のゲル、メンブラン(所定の大きさに切断したニトロセルロースメンブランを蒸留水になじませた後、20×SSCでさらに10分間なじませた)、2枚重ねのろ紙を順番に乗せた後、さらにその上に3cm〜4cm厚のペーパータオルを重ねた。この上にガラス板を乗せ、その上に軽い重しを乗せた後、約5分間ブロッティングを行った。この後、ゲルとメンブランの間に気泡が入っていないことを確かめた上で10分間程度ブロッティングを行った。ブロッティング終了後、メンブランをトランスイルミネーターでUV処理し、15分から30分程度80℃でベーキングした。ベーキング終了後、32Pでラベルした上述の250bpプローブDNAによるハイブリダイゼーション(ハイブリダイゼーション緩衝液組成:5×SSPE,0.5% SDS,5×Denharlts,solum sperm DNA,50%formamide)を行い、結合したバンドの放射能をイメージングプレートへ写し取り、BAS−2000でその結果を解析した。このハイブリダイゼーションで陽性を示したインサートの中で比較的大きなサイズを示したものを大量に調製し、上述した方法でEco RI消化後BAP処理したpBluescript IISK+にサブクローニングした。これを大腸菌(JM105)に形質転換し、得られた形質転換体を液体培養後、常法によりプラスミドを調製し、上述の方法で塩基配列を決定した。
その結果、野性型及びSr系統のそれぞれの培養細胞からALS完全長cDNAを取得することができた。これらの野生型と変異型ALS遺伝子相同性を比較した結果を図19A、図19B及び図19Cに示した。図19A、図19B及び図19Cに示すように、Sr系統では、野性型と比較して、転写開始コドンATGの最初の塩基Aを起点として1643番目及び1880番目の2点の変異が認められた。Sr系統では、野生型における1643番目のGがTに変異(G1643Tと表記する)し、野生型における1880番目のGがTに変異(G1880Tと表記する)していた。これらの変異はアミノ酸に変換すると、Sr系統の変異型ALSタンパク質は、野生型ALSタンパク質における548番目のトリプトファンがロイシンへ変異(すなわち「W548L変異」)し、野生型ALSタンパク質における627番目のセリンがイソロシンへ変異(すなわち「S627I変異」)したアミノ酸配列を有することを意味していた。
(5)pBluescript II SK+へクローニングした野性型ALS cDNAのpGEX 2Tへのサブクローニング
上記(4)で得られた野性型ALS完全長cDNAを組み込んだpBluescript II SK+プラスミドをEco RIで消化して、野性型ALS遺伝子を含むcDNAを切り出した後、大腸菌発現ベクターであるpGEX−2T(アマシャムバイオサイエンス社製)のEco RIサイトに組み込んだ。以下、pGEX−2TにおけるEco RIサイトに野性型ALS完全長cDNAを組み込んだ発現ベクターを、「pGEX−2T(ALS−wild)」と呼ぶ。pGEX−2T(ALS−wild)を大腸菌(JM109)に形質転換し、形質転換により得られたコロニーを液体培養してプラスミドを抽出し、シークエンスによりインサートDNAの挿入方向を確認した。これによりpGEX−2T(ALS−wild)で形質転換した大腸菌(JM109)を作製した。
〔実施例4〕PC除草剤抵抗性イネ培養細胞ALS遺伝子の変異部位の解明
(1)抵抗性変異株(Sr,Rb,Vg,Ga系統株)からのゲノムDNAの抽出
植物DNA抽出キットISOPLANT II(ニッポンジーン社)を用い、添付のプロトコルに従って、Sr、Rb、Vg及びGa系統のぞれぞれの培養細胞0.1gからゲノムDNAを抽出した。上記キットでゲノムDNAを抽出した後、RNase AでRNAを分解除去した。その後、アガロースゲルで電気泳動し、ゲノムDNAを確認した。
(2)ゲノムDNAを鋳型としたALS遺伝子のPCR
それぞれのゲノムDNAを鋳型とし、下記に示すプライマー「ALS−Rsp3」とプライマー「4−83−3」を用いてPCRを行った。PCRは、Ready to Go PCR Beads(アマシャムバイオサイエンス社製)を用い、最終容量25μlで行った。反応条件としては、94℃で5分間初期変性工程を行い、続いて、94℃で30秒間の変性工程、55℃で1分間のアニーリング工程及び72℃で2分間の伸長工程からなるサイクルを40回行うものとし、最終サイクルの伸長工程を72℃で9分間行うものとした。
次に、PCR反応液を2%アガロースゲルで電気泳動(100V,1 X TBE buffer)した後、PCR生成物を含むゲルを切り出し、切り出したゲルを小さな断片に切断した。得られたゲル断片を滅菌イオン交換水で2、3度リンスした後、500μlの滅菌イオン交換水を入れ、凍結・溶解を3回繰り返した。これにより、PCR生成物を水中に溶出することができた。
次に、このPCR生成物が溶存する溶出液を用いたPCRを再度行った。すなわち、このPCRでは、溶液中に含まれるPCR生成物を鋳型とし、同一のプライマーセットを用いるか、或いは内子のプライマー(nested primer)を用い、最終容量100μlで行った。反応終了後、反応液を分取用アガロースゲル(1%)で電気泳動した後、目的のバンドを含むゲルを切り出し、GFX PCR DNA & Gel Band Purification Kit(アマシャムバイオサイエンス社製)を用いて精製した。そして、最終的に75μlの滅菌脱イオン水でPCR生成物を溶出した。
(3)シークエンシング
PCRにより増幅されたDNA断片を鋳型として、ABI PRISM BigDye ver.2(アプライドバイオシステム社製)を用いてシークエンス反応を行った。シークエンス反応に際しては、鋳型DNAを11μl、プライマー(3.2pmol/μl)を1μl、pre−mixを8μlとし、総容量を20μlとした。シークエンス反応条件は、96℃で5分間の初期変性工程、続いて、96℃で5秒間の変性工程、50℃で5秒間のアニーリング工程及び60℃で4分間の伸長工程からなるサイクル40回行い、最終サイクルの伸長工程を60℃で9分間行うものとした。シークエンス反応後、AutoSeq G−50 column(アマシャム バイオテック社製)を用い反応液中の蛍光塩基をゲル濾過により除去し、ABI PRISM 310 DNAシークエンサーにより塩基配列を読んだ。
(4)使用したプライマーの名称及び塩基配列
上記(2)で用いたプライマー及び、以下の実施例で使用したプライマーについて、名称及び塩基配列等を表6にまとめた。
なお、表6中、対応ALS部位は、転写開始コドン(ATG)を起点とした場合の対応する塩基の番号である。また、ALS−Rsp1の塩基配列は配列番号9に示し、ALS−Rsp2の塩基配列は配列番号10に示し、ALS−Rsp3の塩基配列は配列番号11に示し、ALS−Rsp4の塩基配列は配列番号12に示し、ALS−Rsp6の塩基配列は配列番号13に示し、ALS−Rsp7の塩基配列は配列番号14に示し、ALS−RspAの塩基配列は配列番号15に示し、ALS−RspBの塩基配列は配列番号16に示し、ALS−RspCの塩基配列は配列番号17に示し、ALS−RspDの塩基配列は配列番号18に示し、ALS−RspFの塩基配列は配列番号19に示し、ALS−RspEの塩基配列は配列番号20に示し、3−1−1の塩基配列は配列番号21に示し、3−1−2の塩基配列は配列番号22に示し、3−1−3の塩基配列は配列番号23に示し、3−1−4の塩基配列は配列番号24に示し、4−83−1の塩基配列は配列番号25に示し、4−83−3の塩基配列は配列番号26に示し、4−83−10の塩基配列は配列番号27に示し、4−83−15の塩基配列は配列番号28に示し、ALS−DG7の塩基配列は配列番号29に示した。
(5)シークエンスの結果明らかになった各系統における変異
上記(3)で決定した塩基配列解析の結果、Rb系統、Vg系統、Ga系統及びSr系統の変異が明らかとなった。各系統の変異点を表7にまとめる。
表7に示すように、Rb系統株では塩基配列における512番目のCがAにホモに、1643番目のGがTにヘテロに変異していた。これはアミノ酸レベルでは171番目のプロリンと548番目のトリプトファン(W)がそれぞれヒスチジン(H)とロイシン(L)に変異していることを意味している。Vg系統株では塩基配列における1643番目のGがTにヘテロに変異しており、これはアミノ酸レベルでは548番目のトリプトファン(W)がロイシン(L)に変異していることになる。Ga系統株では塩基配列における512番目と514番目のCがAにホモかヘテロ(得られたPCR生成物により異なっていた)に、1643番目のGがTにヘテロに変異していた。これはアミノ酸レベルでは171番目のプロリン(P)と172番目のアルギニン(R)及び548番目のトリプトファン(W)がそれぞれヒスチジン(H)、セリン(S)及びロイシン(L)に変異していることを意味している。またSr系統株では塩基配列における1643番目と1880番目の双方のGがTにヘテロに変異していた。
上述した方法でSr系統株のcDNAライブラリーからALS遺伝子をスクリーニングして単離した際、2点変異型遺伝子だけではなく野性型の遺伝子の遺伝子も単離されたことからゲノムDNAレベルではヘテロに変異していると推定していたが、ゲノムPCRによる結果もそれを裏付ける結果となった。
以上のように全ての抵抗性変異株で548番目のトリプトファン(W)はヘテロにロイシン(L)に変異しており、Vg系統がこの変異のみを有していた。上述したようにbispyribac−sodiumに対する感受性はVg系統株では10μMまで、Sr、Rb、Ga系統株では100μMまで抵抗性を示していた。このことから抵抗性の獲得はその淘汰圧の強度が強くなると共にVg系統を起点にその他の系統に分岐し変異していったと推察された。
〔実施例5〕G1643T(W548L)及びG1880T(S627I)のそれぞれの変異を単独で持つALS cDNAの合成とこれを保持するpGEX 2Tの作製並びにこのベクターによる大腸菌の形質転換
先ず、G1643T(W548L)及びG1880T(S627I)のそれぞれの変異を単独で持つALS cDNAの合成とこれを保持するpGEX 2Tの作製について、図20を用いて説明する。
pBluescript II SK+(ALS−2 point mutant)或いはpBluescript II SK+(ALS−wild)の1μl(各々585ng/μl及び554ng/μl)を鋳型として、LA Taq DNA polymerase(Takara社製)の1μlを用い、最終反応量100μlでPCRを行った。反応条件は95℃で30秒間、55℃で30秒間及び72℃で2分間からなるサイクルを25回繰り返した。なおpBluescript II SK+(ALS−2 point mutant)は、G1643T(W548L)及びG1880T(S627I)の2点変異型のALS遺伝子を含んでいる。pBluescript II SK+(ALS−wild)は、変異を持たない野生型のALS遺伝子を含んでいる。PCRに際して、プライマーはALS−Rsp6とALS−RspFの組み合わせ及びALS−RspEとM13Rの組み合わせを用いた。鋳型となるALS遺伝子と所定の組合せのプライマーとにより増幅される断片の名称を表8にまとめた。なお、プライマーM13Rは、pBluescript II SK+のT3プロモーター近傍のアンチセンスプライマーである。また、M13Rの塩基配列は、5’−GGAAACAGCTATGACCATG−3’(配列番号30)である。
PCRによって得られたPCR−1、PCR−2、PCR−3及びPCR−4をそれぞれアガロースゲル電気泳動で分離した後、アガロースゲルから前述と同様に回収し、50μl滅菌水で溶出した。
次に、PCR−1及びPCR−4のセットと、PCR−2及びPCR−3のセットとを用いてSPR(self polymerase reaction)に供した。SPRは、PCR−1及びPCR−4のセット或いはPCR−2及びPCR−3のセット23.5μlとLA Taq DNA polymerase 1μlとを加え、最終容量75μlとし、95℃で1分間の変性工程、55℃で30秒間のアニーリング工程及び72℃で2分間の伸長工程からなるサイクルを25回行うものとした。PCR−1及びPCR−4のセットを用いたSPRで得られたDNA断片をSPR−1とし、PCR−2及びPCR−3のセットを用いたSPRで得られたDNA断片をSPR−2とした。
なお、本例では、十分量のSPR−1とSPR−2と確保するため、精製されたSPR−1或いはSPR−2を鋳型とし、ALS−Rsp6及びM13Rを用いて再度LA Taq DNA polymeraseにより最終反応量100μlでPCRをそれぞれ行った。このときのPCRは、95℃で30秒間の変性工程、55℃で30秒間のアニーリング工程及び72℃で2分間の伸長工程からなるサイクルを25回繰り返した。このPCRの後、反応溶液をアガロースゲル電気泳動に供し、約2kbpのシングルバンド(PCR産物)をアガロースゲルから回収し、100μl滅菌水で溶出した。
次に、PCRによって増幅したSPR−1とSPR−2をAcc I及びEco RIによりそれぞれ消化し、SPR−1(Acc I/Eco RI消化断片)とSPR−2(Acc I/Eco RI消化断片)を得た。すなわち、PCR産物が溶存する100μlの滅菌水のうち50μlを、10 x M buffer(Takara社製)存在下、Acc I 1μl(12u/μl)及びEco RI 1μl(12u/μl)と混合し、最終容量60μlで37℃、1時間インキュベートした。その後、反応溶液全量をアガロースゲル電気泳動に供し、目的の1.5kbpの断片をGFX PCR and Gel Purification Kitで回収した。回収した1.5kbpの断片を50μlの滅菌水で溶出することによって、SPR−1(Acc I/Eco RI消化断片)を含む溶液とSPR−2(Acc I/Eco RI消化断片)を含む溶液とを調製した。
一方、野性型ALS遺伝子が組み込まれたタンパク質発現ベクター、pGEX−2T(ALS−wild)プラスミド(濃度約50ng/μl)の150μlを、10 X M buffer存在下でAcc I 1μl(12u/μl,Takara社製)と混合し、37℃で2時間インキュベートした。反応終了後、1%アガロースゲル電気泳動により直鎖状になった7.2kbpのバンドを確認した。GFX PCR and Gel Purification Kitのプロトコルに従いこのアガロースゲルから、7.2kbpのバンドに相当するDNAを回収後、180μlの滅菌水で溶出した。その内89μlを、10μlの10 x H buffer(Takara社製)及び1μlのEco RI(12u/μl)と混合し、37℃で1分間反応することによって、回収したDNAをEco RIで部分消化した。反応終了後、10 x loading bufferを加え、1.5%アガロースゲルで電気泳動したところ、4.9kbp、5.7kbp、6.5kbp及び全く切断されない7.2kbpのバンドに分かれ、目的の5.7kbpのバンドをゲルから切り出した。切り出したゲルに含まれる約5.7kbpのDNA断片を、GFX PCR and Gel Purification Kitにより回収し、その後、50μlの滅菌水で溶出した。
そして、このようにして得られたpGEX−2T(ALS−wild)のAcc I消化及びEco RI部分消化断片の3μlとSPR−1(Acc I/Eco RI消化断片)或いはSPR−2(Acc I/Eco RI消化断片)の3μlとを、それぞれTakara ligation buffer(ver.2,I液)6μlと16℃で1晩反応させた。
次に、反応液を大腸菌コンピテントセル(JM109株、Takara社製)に添付のプロトコルに従ってそれぞれ形質転換し、アンピシリン50ppmを含むLB培地に播き、37℃で1晩インキュベートした。この結果、現れたコロニーの中から数点を選び、表6に記載したALS−RspE及びPGEX−3(5’−CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG−3’:配列番号31)のセットと、PGEX−5(5’−GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG−3’:配列番号32)及びPGEX−3のセットと、PGEX−5及び表6に記載したALS−RspAのセットとを用いてコロニーを鋳型にしてダイレクトにPCRを行った。なお、PGEX−3は、ベクターとして使用したpGEX−2Tの3’側に位置するアンチセンス鎖の一部と同じ配列である。PGEX−5は、ベクターとして使用したpGEX−2Tの5’側に位置するセンス鎖の一部と同じ配列である。反応条件としては、ALS−RspE/PGEX−3セットのときには、総量25μl中、各々のプライマーを1μMとPCR bead1個を溶解し、95℃で30秒間の変性工程、55℃で1分間のアニーリング工程及び72℃で2分間の伸長工程からなるサイクルを40回繰り返した。またPGEX−5/PGEX−3セット及びPGEX−5/ALS−RspAセットの場合には、上流部分にGCコンテントが75%程度の領域があるので、上記の溶液に更に最終濃度が5%のDMSOを加えた。このPCRの結果、所望のインサートが挿入されていることを確認した。
所望のインサートの挿入が確認されたコロニー1点を取り、アンピシリン50ppmを含有するLB液体培地(3ml 10本)にて、37℃で12時間振とう培養した。培養後、プラスミド抽出装置(TOMY社製DP−480)で培地からプラスミドを抽出(400〜500μl程度)した後、遠心濃縮により200μl程度まで濃縮した。その後、GFX PCR and Gel Purification Kitを用いて精製及び脱塩し、最後に130μl程度の滅菌水で溶出した。
これらのプラスミドをABI PRISM BigDye ver.2を用いてシークエンス反応を行い、プラスミドに含まれるインサートの塩基配列を解析した。シークエンス反応に際して、反応溶液は、11μlの鋳型DNAと、1μlのプライマー(3.2pmol/μl)と、8μlのpre−mixとを混合して調製し、総容量を20μlとした。シークエンス反応条件としては、96℃で5分間の初期変性工程の後、96℃で5秒間の変性工程、50℃で5秒間のアニーリング工程及び60℃で4分間の伸長工程からなるサイクルを40回繰り返し、最終サイクルの伸長工程は60℃で9分間行うものとした。シークエンス反応終了後、AutoSeq G−50 columnを用い反応液中の蛍光塩基をゲル濾過により除去し、ABI PRISM 310 DNAシークエンサーにより塩基配列を決定した。
なお、シークエンス反応に際しては、表6に記載したプライマーのうち、センスプライマーとしてPGEX−5、ALS−RspC、ALS−Rsp3、ALS−Rsp1、3−1−4及びALS−RspBを用い、アンチセンスプライマーとして4−83−3、PGEX−3、ALS−Rsp2、4−83−10及びALS−Rsp7を用いた。
解析の結果、W548L変異を有する変異ALS遺伝子を有するpGEX 2Tベクター(図20において、「pGEX 2T(ALS−W548L mutant)」と記載)及びS627I変異を有する変異型ALS遺伝子を有するpGEX 2Tベクター(図20において、「pGEX 2T(ALS−S627I mutant)」と記載)が得られたことを確認した。次いで、これらpGEX 2T(ALS−W548L mutant)及びpGEX 2T(ALS−S627I mutant)で大腸菌を形質転換した。
〔実施例6〕Rb系統のゲノムPCRにより見い出されたC512A(P171H)変異及びGa系統のゲノムPCRにより見い出されたC514A(R172S)変異をそれぞれ単独で持つALS cDNAの合成とこれを保持するpGEX 2Tの作製ならびにこのベクターによる大腸菌の形質転換
先ず、C512A(P171H)及びC514A(R172S)のそれぞれの変異を単独で持つALS cDNAの合成とこれを保持するpGEX 2Tの作製について、図21及び22を用いて説明する。
C512A(P171H)変異DNA断片を得るため、Rb系統のゲノムDNAを鋳型として、表6に記載したALS−Rsp6及びALS−Rsp4のプライマーセットを用いてPCRを行った。PCRはReady to Go PCR Beadsを用い、鋳型のゲノムDNAを5μl、各々のプライマー(25pmol/μl)を1μl加え、最終容量25μlで行った。反応条件としては、95℃で5分間の初期変性工程の後、95℃で30秒間の変性工程、55℃で1分間のアニーリング工程及び72℃で2分間の伸長工程からなるサイクルを40回繰り返し、最終サイクルの伸長工程を72℃で9分間行うものとした。
PCR反応終了後、反応溶液を2%アガロースゲルで電気泳動に供し、アガロースゲルからPCR生成物(図21において「PCR−5」と記載)のバンドを切り出し、GFX PCR DNA & Gel Band Purification Kitにより精製した。次に、精製したPCR−5をPCR産物クローニング用ベクター(TAクローニングベクター)であるpT7Blue T−vector(Novagen社製)に組み込んだ。すなわち、精製したPCR生成物1μlを、1μlのpT7Blue T−vector(50ng/μl)、3μlの滅菌脱イオン水及び5μlのligation buffer(ver.2,I液,宝酒造社製)と混合し、16℃で1晩反応させた。
反応終了後、反応液全量を大腸菌(JM109株)へ定法に従い形質転換した。アンピシリン50ppmを含むLB固体培地上で培養後、実施例5と同様にして、出現したシングルコロニーから目的のシークエンスを有するもの選別した。選別したシングルコロニーを、アンピシリン50ppmを含むLB液体培養液(3ml 10本)で、37℃で12時間振とう培養した。培養後、プラスミド抽出装置(TOMY社製DP−480)でプラスミドを抽出(400〜500μl)した。これを遠心濃縮により200μl程度まで濃縮して、GFX PCR and Gel Purification Kitで精製及び脱塩し、80μl程度の滅菌水で溶出した。
次に、溶出液のうち50μlを、10μlの10 X T buffer及び10μlの0.1%BSA存在下で、1μlのAcc I(12u/μl)及び1μlのSma I(10u/μl)と混合し総量100μlとし、37℃で2時間インキュベートした。反応終了後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、目的のバンドを切り出して回収し、GFX PCR and Gel Purification Kitのプロトコルに従ってDNA断片を回収した。これにより、末端にSma IサイトとACC Iサイトを持つC512A(P171H)変異DNA断片を得た。
一方、C514A変異及びC512A変異が近接しているため、Gb系統から抽出したゲノムDNAを鋳型としたPCRでは、C514A(R172S)変異のみを有するDNA断片を得ることができない。したがって、図21に示すように、予め変異点を導入した一対のプライマーを用いることで、C514A(R172S)変異のみを有するDNA断片を調製した。即ち、変異点の入ったプライマーとしてALS−M1(5’−CCCCAGCCGCATGATCGGCACCGACGCCTT−3’:配列番号33、下線のAが変異点)とALS−M2(5’−CGGTGCCGATCATGCGGCTGGGGACCT−3’:配列番号34、下線のTが変異点)を用い、野性型ALS cDNAが組み込まれたpBluescript II SK+を鋳型とし、ALS−Rsp6及びALS−M2のプライマーセットとALS−M1及びALS−Rsp4のプライマーセットとを用いてそれぞれPCRを行った。なお、ALS−M1における1〜23番目の塩基配列とALS−M2における1〜23番目の塩基配列とが相補的な部分である。ALS−Rsp6及びALS−M2のプライマーセットを用いた場合には図21中「PCR−6」と記載したDNA断片が増幅され、ALS−M1及びALS−Rsp4のプライマーセットを用いた場合には図21中「PCR−7」と記載したDNA断片が増幅される。
PCRに際して、反応溶液は、1μlのLA Taq DNA polymerase(5units/μl、TAKARA社製)、10μlの10 X LA buffer、10μlの25mM MgCl2、16μlのdNTPs(それぞれ25mMのdATP、dGTP、dCTP及びdTTPからなる)、1μlの鋳型DNA、それぞれ4μlのセンスプライマー及びアンチセンスプライマー(それぞれ25pmol/μl)を総量100μlに溶解したものを調製した。反応条件としては、95℃で5分間の初期変性工程の後、95℃で30秒間の変性工程、55℃で1分間のアニーリング工程及び72℃で2分間の伸長工程からなるサイクルを25回繰り返し、最終サイクルの伸長工程を72℃で9分間行うものとした。
反応終了後、反応液を分取用1.5%アガロースゲルで電気泳動に供し、目的の213bp(PCR−6)と377bp(PCR−7)のバンドを切り取り、GFX PCR DNA & Gel Band Purification Kitにより精製した後、生成したDNA断片をそれぞれ100μlの滅菌脱イオン水で溶出した。
次に、得られたPCR−6及びPCR−7を用いてSPRを行った。SPRに際して、反応液は、得られた溶出液のうち30μlを、1μlのLA Taq DNA polymerase(5units/μl)、10μlの10 X LA buffer、10μlの25mM MgCl2、16μlのdNTPs(それぞれ25mMのdATP、dGTP、dCTP及びdTTPからなる)と混合して総量100μlに調製した。SPR条件としては、95℃で5分間の初期変性工程の後、95℃で30秒間の変性工程、55℃で1分間のアニーリング工程及び72℃で2分間の伸長工程からなるサイクルを40回繰り返し、最終サイクルの伸長工程を72℃で9分間行うものとした。
反応終了後、反応液を分取用アガロースゲル(1.5%)電気泳動に供し、目的の560bpのバンド(図21において「SPR−3」と記載)を切り出し、GFX PCR DNA & Gel Band Purification Kitにより精製し、生成したDNA断片(SPR−3)を100μlの滅菌脱イオン水で溶出した。これを先に述べた方法と同様に、pT7Blue T−vectorに組み込み、大腸菌(JM109)に形質転換した。この大腸菌を培養し、抽出されたプラスミドをAcc IとSma Iで消化して、末端にSma IサイトとACC Iサイトを持つC514A(R172S)変異DNA断片を得た。
他方、野性型ALS遺伝子が組み込まれたプラスミド、pGEX−2T(ALS−wild)で形質転換された大腸菌(JM109株)を、アンピシリン50ppmを含むLB液体培地(2ml x 15本)にて37℃で1晩振とう培養した。プラスミド抽出装置(DP−480)でプラスミドを抽出後、抽出液(約750μl)を減圧遠心濃縮器で200μl程まで濃縮した。その後、GFX PCR DNA & Gel Band Purification Kitにより脱塩し、最終的にプラスミドを200μlの滅菌脱イオン水で溶出した。
次に、得られたプラスミド、pGEX−2T(ALS−wild)をAcc Iで消化した。すなわち、溶出液のうち75μlを、9μlの10 X M buffer、3μlのAcc I(12u/μl)及び3μlの滅菌脱イオン水と混合し、37℃で3時間反応した。反応終了後、反応液を1.5%分取用アガロースゲル電気泳動に供し、目的のバンドを切り出して回収した後、GFX PCR DNA & Gel Band Purification Kitにより精製し、最終的に100μlの滅菌脱イオン水でDNA断片を溶出した。
次に、Acc Iで消化されたpGEX−2T(ALS−wild)を、Sma Iで部分消化した。すなわち、溶出液のうち79μlを、10μlの10 X T buffer、10μlの0.1% BSA、1μlのSma I(10u/μl)と混合して総量100μlとし、30℃で1分間インキュベートした。なお、pGEX−2T(ALS−wild)には、3箇所のSma I認識配列(pGEX−2TのThrombin切断サイトに隣接するマルチクローニングサイト上、ALS遺伝子276番目及び430番目)があるため、短時間で部分消化した。反応終了後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ALS遺伝子430番目のSma I認識配列のみを消化したプラスミドに相当するバンドを切り出して回収し、GFX PCR DNA & Gel Band Purification Kitを用いて酵素・タンパク質を除去して精製した。そして、最終的に滅菌脱イオン水50μlで溶出した。このAcc I消化/Sma I部分消化処理したpGEX−2T−野性型ALS cDNA断片と、上述の方法で得られた末端にSma IサイトとACC Iサイトを有するC512A(P171H)変異DNA断片並びにC514A(R172S)変異DNA断片を定法によりライゲーションした。なお、図22において、この方法により得られたC512A(P171H)変異のみを単独で有する変異ALS遺伝子を含むプラスミドを「pGEX−2T(ALS P171H mutant)」と記載し、C514A(R172S)変異のみを単独で有する変異ALS遺伝子を含むプラスミドを「pGEX−2T(ALS R172S mutant)」と記載する。
その後、反応液の全量を用いて大腸菌(JM109株)に形質転換し、アンピシリンを含むLB培地上で出現したシングルコロニーを、上述した方法と同様に、PCRによりスクリーニングし、pGEX−2T(ALS P171H mutant)で形質転換された大腸菌及びpGEX−2T(ALS R172S mutant)で形質転換された大腸菌を選抜した。
〔実施例7〕C512A(P171H)/C514A(R172S)の2点変異型ALS cDNAの合成とこれを保持するpGEX−2Tの作製並びにこのベクターによる大腸菌の形質転換
C512A(P171H)/C514A(R172S)の2点変異型ALS cDNAの合成とこれを保持するpGEX−2Tの作製について、図23を用いて説明する。
C512A(P171H)/C514A(R172S)の2点変異型ALS cDNAの合成は、上述の実施例6に記載した方法に準じ、Ga系統から抽出したゲノムDNAを鋳型としたPCRで行った。すなわち、Ga系統から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、ALS−Rsp6及びALS−Rsp4をプライマーセットとしてPCRを行い、図23中「PCR−8」と記載したDNA断片を増幅した。そして、増幅したDNA断片をpT7Blue T−vectorにライゲーションした後、これをAcc I及びSma Iで消化することによって、C512A(P171H)/C514A(R172S)変異DNA断片を得た。次に、図22に示したように、Acc I消化/Sma I部分消化処理したpGEX−2T−野性型ALS cDNA断片と、C512A(P171H)/C514A(R172S)変異DNAとを定法によりライゲーションした。これにより、pGEX−2T(ALS P171H,R172S mutant)を作製した。また、実施例6と同様にして、pGEX−2T(ALS P171H,R172S mutant)で形質転換された大腸菌を作製した。
〔実施例8〕C512A(P171H)/G1643T(W548L)及びC512A(P171H)/G1880T(S627I)の2点変異型ALS cDNAの合成とこれを保持するpGEX−2Tの作製並びにこのベクターによる大腸菌の形質転換
C512A(P171H)/G1643T(W548L)及びC512A(P171H)/G1880T(S627I)の2点変異型ALS cDNAの合成とこれを保持するpGEX−2Tの作製について、図24を用いて説明する。
先ず、実施例5で得たpGEX 2T(ALS−W548L mutant)を、実施例6の方法に準じて、Acc Iで消化した後にSma Iで部分消化することによって、ALS遺伝子における430番目のSma I認識配列からAcc I認識配列までを欠失させる。次に、これと実施例6で作製したC512A(P171H)変異断片とをライゲーションすることによって、C512A(P171H)/G1643T(W548L)2点変異型ALS cDNAを含むプラスミド(図24中、「pGEX−2T(ALS−P171H,W548L mutant)」と記載)を作製した。
一方、pGEX 2T(ALS−W548L mutant)の代わりに、実施例5で得たpGEX 2T(ALS−S627I mutant)を用いることによって、同様にして、C512A(P171H)/G1880T(S627I)2点変異型ALS cDNAを含むプラスミド(図24中、「pGEX−2T(ALS−P171H,S627I mutant)」と記載)を作製した。
さらに、これらpGEX−2T(ALS−P171H,W548L mutant)及びpGEX−2T(ALS−P171H,S627I mutant)を用いて、実施例6の方法と同様にして、大腸菌を形質転換した。
〔実施例9〕C512A(P171H)/G1643T(W548L)/G1880T(S627I)の3点変異型ALS cDNAの合成とこれを保持するpGEX−2Tの作製並びにこのベクターによる大腸菌の形質転換
C512A(P171H)/G1643T(W548L)/G1880T(S627I)の3点変異型ALS cDNAの合成とこれを保持するpGEX−2Tの作製について、図25を用いて説明する。
先ず、実施例5で得たpGEX 2T(ALS−S627I mutant)をXho Iで消化した後、定法に従ってBAP処理を行う。次に、上述した方法に準じて、目的の遺伝子断片(ベクター側)をアガロースゲルから分離・精製した。また、実施例5で得たpGEX 2T(ALS−W548L mutant)をXho Iで消化し、上述した方法に準じて、当該変異を含む断片をアガロースゲルから分離・精製した。
次に、G1880T(S627I)とG1643T(W548L)の2点変異を併せ持つ「pGEX−2T(ALS−W548L,S627I mutant)」を作製する目的で、得られたDNA断片それぞれをライゲーション反応に供した。反応終了後、反応液全量を用いて大腸菌(JM109株)に形質転換し、アンピシリンを含むLB培地上で出現したシングルコロニーを、上述した方法に準じてPCRによりスクリーニングし、目的のプラスミド(pGEX−2T(ALS−W548L,S627I mutant))を持つ大腸菌を選抜した。
選抜した大腸菌を培養後、上述した方法に準じて、pGEX−2T(ALS−W548L,S627I mutant)を調製した。pGEX−2T(ALS−W548L,S627I mutant)をAcc I消化した後、Sma Iによる部分消化を行い、ALS遺伝子における430番目のSma I認識配列からAcc I認識配列までを欠失させたpGEX−2T(ALS−W548L,S627I mutant)を作製した。次に、これと実施例6で作製したC512A(P171H)変異断片とをライゲーションすることによって、C512A(P171H)/G1643T(W548L)/G1880T(S627I)3点変異型ALS cDNAを含むプラスミド(図25中、「pGEX−2T(ALS−P171H,W548L,S627I mutant)と記載」)を作製した。
さらに、pGEX−2T(ALS−P171H,W548L,S627I mutant)を用いて、実施例6の方法と同様にして、大腸菌を形質転換した。
〔実施例10〕変異型ALSタンパク質の発現
実施例3(5)で作製したpGEX−2T(ALS−wild)で形質転換した大腸菌、実施例5で作製したpGEX 2T(ALS−W548L mutant)で形質転換した大腸菌、実施例5で作製したpGEX 2T(ALS−S627I mutant)で形質転換した大腸菌、実施例6で作製したpGEX−2T(ALS P171H mutant)で形質転換された大腸菌、実施例6で作製したpGEX−2T(ALS R172S mutant)で形質転換された大腸菌、実施例7で作製したpGEX−2T(ALS P171H,R172S mutant)で形質転換された大腸菌、実施例8で作製したpGEX−2T(ALS−P171H,W548L mutant)で形質転換された大腸菌、実施例8で作製したpGEX−2T(ALS−P171H,S627I mutant)で形質転換された大腸菌及び実施例9で作製したpGEX−2T(ALS−P171H,W548L,S627I mutant)で形質転換された大腸菌を、2mlのアンピシリンを含むLB液体培地にて27℃でそれぞれ振とう培養(前培養)した。この前培養液1mlを用いて250mlのアンピシリンを含むLB液体培地で、それぞれ本培養を行った。一晩培養後、1mM IPTGを加えてさらに3時間〜4時間培養することによって、GST融合タンパク質の発現誘導を行った。なお、菌体は洗浄後−80℃で保存した。
大腸菌からのALSの調製と精製は次の方法で行った。先ず、−80℃に保存しておいた大腸菌のペレットを、ALS抽出緩衝液(30%グリセロールと0.5mM MgCl2を含んだリン酸カリウム緩衝液pH7.5)に懸濁した(培養液50mlから得られたペレットに対して2.5mlのALS抽出緩衝液を添加)。この懸濁液を超音波処理(Heat Systems−Ultrasonics社製、Sonicator W−225R、マイクロチップ、アウトプットコントロール8、約1秒インターバル、40秒2回)した後、4℃、15000×gで20分間遠心し、その上澄を粗酵素溶液とした。
これにより、GST融合野生型ALSタンパク質、GST融合W548L変異型ALSタンパク質、GST融合S627I変異型ALSタンパク質、GST融合P171H変異型ALSタンパク質、GST融合R172S変異型ALSタンパク質、GST融合P171H/R172S変異型ALSタンパク質、GST融合P171H/W548L変異型ALSタンパク質、GST融合P171H/S627I変異型ALSタンパク質及びGST融合P171H/W548L/S627I変異型ALSタンパク質のいずれかを含む9種類の粗酵素溶液を調製した。
〔実施例11〕変異型ALSタンパク質の薬剤感受性
実施例10で得た9種類の粗酵素溶液を用いて、野生型ALSタンパク質及び変異型ALSタンパク質の薬剤感受性を調べた。薬剤感受性試験は、実施例2とほぼ同様な手順に従って行った。ただし、本例においては、反応温度を37℃、反応時間を30分間とし、また大腸菌由来のALS活性を阻害するために、反応液には10mMのバリンを添加した。また、薬剤には、PC除草剤としてbispyribac−sodium、pyrithiobac−sodium及びpyriminobacの3種類を使用し、スルホニルウレア系除草剤としてchlorsulfuronを使用し、イミダゾリノン系除草剤としてimazaquinを使用した。これら薬剤は、変異型ALSタンパク質を添加する前に、これらの薬剤の所定の濃度の溶液(bispyribac−sodiumとpyrithiobac−sodiumは水溶液、その他はアセトン溶液)を反応液中に添加した。アセトンの最終濃度は1%とした。
9種類の粗酵素溶液について、bispyribac−sodiumによる阻害活性を図26及び27並びに表9に示し、pyrithiobac−sodiumによる阻害活性を表10に示し、pyriminobacによる阻害活性を表11に示し、chlorsulfuronによる阻害活性を表12に示し、imazaquinよる阻害活性を表13に示した。
表9〜13中、薬剤による阻害活性は、供試濃度において50%阻害が得られる場合には、その50%阻害を与える濃度(I50値)で表し、50%阻害が得られない場合には供試濃度の最高濃度における阻害%で表した。また、表9〜13中、予想RS比とは、複数の変異を有する変異型ALSタンパク質について、単独で変異を有する変異型ALSタンパク質のRS比から通常予測されるRS比を意味する。すなわち、予想RS比は、単独で変異を有する変異型ALSタンパク質のRS比から通常予測される相加効果を意味する。具体的には、複数の変異を有する変異型ALSタンパク質に関する予想RS比は、当該複数の変異のうちいずれか1つの変異のみ有する変異型ALSタンパク質のRS比を当該複数の変異全てについて選択し、選択したRS比を乗じることで算出した。複数の変異を有する変異型ALSタンパク質について実際のRS比が予想RS比を上回る場合、当該複数の変異を有する変異型ALSタンパク質は、変異を単独で有する変異型ALSタンパク質の組み合わせから予想される相加効果の抵抗性を超える抵抗性を有するものである。
以上の表9〜13のデータを順に説明する。
まず、bispyribac−sodiumによる阻害活性データ(表9)からは次のことが明らかとなった。1点変異型遺伝子がコードする変異型ALSタンパク質(P171H、R172S、W548L及びS627I)の中では、W548L変異型ALSタンパク質がbispyribac−sodiumに対して最も高い抵抗性を示した(RS比が520)。S627I変異型ALSタンパク質又はP171H変異型ALSタンパク質も高い抵抗性を示した(それぞれ、RS比が41及び8.7)が、R172S変異型ALSタンパク質は野生型ALSタンパク質と同等の抵抗性しか示さなかった(RS比が0.98)。このことから、ALSタンパク質におけるP171H変異、W548L変異及びS627I変異は、bispyribac−sodiumに対する抵抗性を増強させるのに有効な変異であることが明らかとなった。また、ALSタンパク質におけるR172S変異は、サイレント変異であることが明らかとなった。
一方、2点変異型遺伝子がコードする変異型ALSタンパク質の中では、P171H/W548L変異型ALSタンパク質がbispyribac−sodiumに対して最も強い抵抗性を示した(100μMで5.5%の阻害、RS比は>15000)。P171H/S627I変異型ALSタンパク質もbispyribac−sodiumに対して強い抵抗性を示した(RS比が3700)。P171H/R172S変異型ALSタンパク質の抵抗性の度合いは、P171H変異型ALSタンパク質とほぼ同じであった。また、3点変異型遺伝子によりコードされるP171H/W548L/S627I変異型ALSタンパク質もbispyribac−sodiumに対して強い抵抗性を与えた(100μMで1.1%の阻害、RS比は>15000)。なお、これらの結果の元になった実際の薬剤用量応答結果は図26及び27に示した。
2点変異及び3点変異について、予想RS比と実際のRS比とを比較したところ、P171H/W548L変異型ALSタンパク質及びP171H/S627I変異型ALSタンパク質におけるRS比は、予想RS比を有意に上回っていた(RS比と予想RS比の比が1よりも明瞭に大きくなる)。このことから、これらの2つの2点変異型遺伝子(P171H/W548L変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子及びP171H/S627I変異型ALSタンパク質をコードする遺伝子)は、bispyribac−sodiumに対して、1点変異型遺伝子の抵抗性の度合いから予想されるよりも強い抵抗性をALSタンパク質に与えることが判明した。
次に、pyrithiobac−sodiumによる阻害活性(表10)からは次のことが明らかになった。1点変異型遺伝子がコードする変異型ALSタンパク質(P171H、R172S、W548L及びS627I)の中では、W548L変異型ALSタンパク質がpyrithiobac−sodiumに対して最も強い抵抗性を示した(100μMで41%、RS比は>9100)。S627I変異型ALSタンパク質も抵抗性を示した(RS比が200)が、P171H変異型ALSタンパク質の抵抗性の度合いは低く(RS比が3.4)、R172S変異型ALSタンパク質は野生型ALSタンパク質と同等の抵抗性しか示さなかった(RS比が0.85)。このことから、ALSタンパク質におけるP171H変異、W548L変異及びS627I変異は、Pyrithiobac−sodiumに対する抵抗性を増強させるのに有効な変異であることが明らかとなった。また、ALSタンパク質におけるR172S変異は、サイレント変異であることが明らかとなった。
一方、2点変異型遺伝子がコードする変異型ALSタンパク質で最も強い抵抗性を与えたのは、P171H/W548L変異型ALSタンパク質であり(100μMで20%の阻害、RS比は>9100)、続いてP171H/S627I変異型ALSタンパク質であった(RS比が850)。表9に示したbispyribac−sodiumによる阻害活性データとは異なり、pyrithiobac−sodiumの場合、P171H/R172S変異型ALSタンパク質は、P171H変異型ALSタンパク質よりも高い度合いで抵抗性を示しており(RS比13)、単独ではサイレント変異であるR172S変異がP171H変異型ALSタンパク質の抵抗性の度合いを高めることが判明した。
また、2点変異型ALSタンパク質について、1点変異型ALSタンパク質のRS比から予想される予想RS比と実際のRS比と比較したところ、P171H/R172S変異型ALSタンパク質のRS比は予想RS比よりも有意に大きくなっていた(実際のRS比と予想RS比の比が1よも明確に大きくなる)。このことから、P171H/R172S変異型ALSタンパク質は、pyrithiobac−sodiumに対して、1点変異型遺伝子の抵抗性の度合いから予想されるよりも強い抵抗性を示すことが判明した。
次に、pyriminobacによる阻害活性(表11)からは次のことが明らかになった。1点変異型遺伝子(P171H、R172S、W548L及びS627I)がコードする変異型ALSタンパク質の中では、W548L変異型ALSタンパク質がpyriminobacに対して最も強い抵抗性を示した(RS比4500)。S627I変異型ALSタンパク質も強い抵抗性を与えたが(RS比2800)、P171H変異型ALSタンパク質の抵抗性の度合いは低く(RS比5)、R172S変異型ALSタンパク質は野生型ALSタンパク質と同等の抵抗性しか示さなかった(RS比1.2)。このことから、ALSタンパク質におけるP171H変異、W548L変異及びS627I変異は、pyriminobacに対する抵抗性を増強させるのに有効な変異であることが明らかとなった。また、ALSタンパク質におけるR172S変異は、サイレント変異であることが明らかとなった。
2点変異型遺伝子がコードする変異型ALSタンパク質で最も強い抵抗性を与えたのは、P171H/W548L変異型ALSタンパク質であり(100μMで11%の阻害、RS比は>13000)、続いてP171H/S627I変異型ALSタンパク質であった(100μMで21%の阻害、RS比は>13000)。これらP171H/W548L変異型ALSタンパク質及びP171H/S627I変異型ALSタンパク質について、予想RS比と実際のRS比とを比較した結果、1点変異型遺伝子の抵抗性の度合いから予想されるよりも強い抵抗性を示すかどうかを明確にすることはできなかった。
次に、chlorsulfuronによる阻害活性(表12)からは次のことが明らかになった。1点変異型遺伝子がコードする変異型ALSタンパク質(P171H、R172S、W548L及びS627I)の中では、W548L変異型ALSタンパク質がchlorsurfuronに対して最も強い抵抗性を示した(RS比760)。P171H変異型ALSタンパク質も比較的強い抵抗性を示した(RS比85)が、S627I変異型ALSタンパク質の抵抗性の度合いは低く(RS比2.4)、R172S変異型ALSタンパク質は野生型ALSタンパク質と同等の抵抗性しか示さなかった(RS比0.85)。このことから、ALSタンパク質におけるP171H変異及びW548L変異は、chlorsulfuronに対する抵抗性を増強させるのに有効な変異であることが明らかとなった。また、ALSタンパク質におけるR172S変異は、サイレント変異であることが明らかとなった。
2点変異型遺伝子がコードする変異型ALSタンパク質で最も強い抵抗性を与えたのはP171H/W548L変異型ALSタンパク質であり(100μMで16%の阻害、RS比は>7700)、続いてP171H/S627I変異型ALSタンパク質であった(RS比760)。表9に示したbispyribac−sodiumによる阻害活性データとは異なり、chlorsulfuronの場合、P171H/R172S変異型ALSタンパク質の抵抗性の度合い(RS比420)はP171H変異型ALSタンパク質よりも高い度合いで抵抗性を示しており、単独ではサイレント変異であるR172S変異がP171H変異型ALSタンパク質の抵抗性の度合いを高めることが判明した。また、P171H/W548L/S627I変異型ALSタンパク質も強い抵抗性を与えた(500μMで30%の阻害、RS比は>38000)。
P171H/R172S変異型ALSタンパク質及びP171H/S627I変異型ALSタンパク質について、予想RS比と実際のRS比と比較したところ、ともに実際のRS比は予想RS比よりも有意に大きくなっていた。このことから、P171H/R172S変異型ALSタンパク質及びP171H/S627I変異型ALSタンパク質は、chlorsurfuronに対して、1点変異型遺伝子の抵抗性の度合いから予想されるよりも強い抵抗性を示すことが判明した。
次に、Imzaquinによる阻害活性データ(表13)からは次のことが明らかとなった。1点変異型遺伝子がコードする変異型ALSタンパク質(P171H、R172S、W548L及びS627I)の中では、W548L変異型ALSタンパク質がimazaquinに対して最も強い抵抗性を示した(100μMで16%、RS比は>45)。S627I変異型ALSタンパク質も抵抗性を示した(RS比6.8)が、P171H変異型ALSタンパク質はほとんど抵抗性を示さなかった(RS比1.5)。R172S変異型ALSタンパク質は、野生型ALSタンパク質と同等の抵抗性しか示さなかった(RS比1.0)。このことから、ALSタンパク質におけるW548L変異及びS627I変異は、imazaquinに対する抵抗性を増強させるのに有効な変異であることが明らかとなった。また、ALSタンパク質におけるP171H変異及びR172S変異は、imazaquinに対してサイレント変異であることが明らかとなった。
2点変異型遺伝子で最も強い抵抗性を与えたのはP171H/W548L変異型ALSタンパク質であり(100μMで13%の阻害、RS比は>45)、続いてP171H/S627I変異型ALSタンパク質であった(RS比32)。P171H/R172S変異型ALSタンパク質の抵抗性の度合いはP171Hの1点変異遺伝子とほぼ同じであった。また、P171H/W548L/S627I変異型ALSタンパク質も強い抵抗性を与えた(100μMで15%の阻害、RS比は>45)。
これら2点変異型ALSタンパク質及び3点変異型ALSタンパク質について、予想RS比と実際のRS比とを比較した結果、P171H/S627I変異型ALSタンパク質のRS比は予想RS比よりも有意に大きくなっていた(実際のRS比と予想RS比の比が明瞭に1よりも大きくなる)。このことから、P171H/S627I変異型ALSタンパク質は、imazaquinに対して、1点変異型遺伝子の抵抗性の度合いから予想されるよりも強い抵抗性を示すことが判明した。
産業上の利用の可能性
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、様々な除草剤に対して優れた抵抗性を示すアセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子、該遺伝子によりコードされるアセト乳酸シンターゼタンパク質、該遺伝子を有する組換えベクター、該組換えベクターを有する形質転換体、該遺伝子を有する植物、該植物の育成方法及び、該遺伝子を選択マーカーとして使用する形質転換細胞を選択する方法を提供することができる。
配列表フリーテキスト
配列番号9〜34はプライマーである。
配列番号29における第15番目のnはa,c,g又はtを表している。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1Aは、変異型ALSタンパク質のアミノ酸配列及び野生型ALSタンパク質のアミノ酸配列を比較した図である。
図1Bは、図1Aの続きであり、変異型ALSタンパク質のアミノ酸配列及び野生型ALSタンパク質のアミノ酸配列を比較した図である。
図2Aは、変異型ALS遺伝子の塩基配列及び野生型ALS遺伝子の塩基配列を比較した図である。
図2Bは、図2Aの続きであり、変異型ALS遺伝子の塩基配列及び野生型ALS遺伝子の塩基配列を比較した図である。
図2Cは、図2Bの続きであり、変異型ALS遺伝子の塩基配列及び野生型ALS遺伝子の塩基配列を比較した図である。
図2Dは、図2Cの続きであり、変異型ALS遺伝子の塩基配列及び野生型ALS遺伝子の塩基配列を比較した図である。
図3は、Rb系統のbispyribac−sodiumに対する感受性を示す特性図である。
図4は、Sr系統のbispyribac−sodiumに対する感受性を示す特性図である。
図5は、Ga系統のbispyribac−sodiumに対する感受性を示す特性図である。
図6は、Vg系統のbispyribac−sodiumに対する感受性を示す特性図である。
図7は、野性株のbispyribac−sodiumに対する感受性を示す特性図である。
図8は、野性株のchlorsulfuronに対する感受性を示す特性図である。
図9は、Rb系統のchlorsulfuronに対する感受性を示す特性図である。
図10は、Sr系統のchlorsulfuronに対する感受性を示す特性図である。
図11は、Ga系統のchlorsulfuronに対する感受性を示す特性図である。
図12は、Vg系統のchlorsulfuronに対する感受性を示す特性図である。
図13は、抵抗性変異株のALSタンパク質の分離を目的とした陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにおけるフラクション番号とOD 525nmの吸光度との関係を示す特性図である。
図14は、野生株のALSタンパク質の分離を目的とした陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにおけるフラクション番号とOD 525nmの吸光度との関係を示す特性図である。
図15は、野生型ALSタンパク質及び変異型ALSタンパク質におけるbispyribac−sodiumに対する感受性を示す特性図である。
図16は、野生型ALSタンパク質及び変異型ALSタンパク質におけるchlorsulfuronに対する感受性を示す特性図である。
図17は、野生型ALSタンパク質及び変異型ALSタンパク質におけるimazaquinに対する感受性を示す特性図である。
図18Aは、日本晴ESTの塩基配列とトウモロコシALS遺伝子の塩基配列を比較した図である。
図18Bは、図18Aの続きであり、日本晴ESTの塩基配列とトウモロコシALS遺伝子の塩基配列を比較した図である。
図19Aは、Sr系統由来の完全長cDNAの塩基配列と野性型cDNA 1の塩基配列を比較した図である。
図19Bは、図19Aの続きであり、Sr系統由来の完全長cDNAの塩基配列と野性型cDNA 1の塩基配列を比較した図である。
図19Cは、図19Bの続きであり、Sr系統由来の完全長cDNAの塩基配列と野性型cDNA 1の塩基配列を比較した図である。
図20は、G1643T(W548L)変異及びG1880T(S627I)変異をそれぞれ単独で有するALS cDNAの合成とこれを保持するpGEX 2Tの作製方法を示した図である。矢印はプライマー、アスタリスクは変異点を表す。
図21は、C512A(P171H)変異DNA断片及びC514A(R172S)変異DNA断片作製方法を示した図である。矢印はプライマー、アスタリスクは変異点を表す。
図22は、C512A(P171H)変異及びC514A(R172S)変異をそれぞれ単独で有するALS cDNAの合成とこれを保持するpGEX 2Tの作製方法を示した図である。アスタリスクは変異点を表す。
図23は、C512A(P171H)/C514A(R172S)を有するDNA断片の作製方法を示した図である。矢印はプライマー、アスタリスクは変異点を表す。
図24は、P171H/W548L変異型ALS cDNA及びP171H/S627I変異型ALS cDNAの合成とこれを保持するpGEX 2Tの作製方法を示した図である。アスタリスクは変異点を表す。
図25は、P171H/W548L/S627I変異型ALS cDNAの合成とこれを保持するpGEX 2Tの作製方法を示した図である。アスタリスクは変異点を表す。
図26は、1点変異型ALS遺伝子がコードする変異型ALSタンパク質のbispyribac−sodiumに対する感受性を野性型ALSタンパク質と比較した図である。
図27は、2点変異型及び3点変異型ALS遺伝子がコードする変異型ALSタンパク質のbispyribac−sodiumに対する感受性を野性型と比較した図である。
Claims (7)
- 以下の(a)乃至(e)いずれか1つのタンパク質をコードする遺伝子。
(a)配列番号2,4,6および8のいずれか1つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)配列番号2のアミノ酸配列における171番目のヒスチジン及び172番目のセリンを除く、1〜30個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ビスピリバックナトリウム除草剤、ピリチオバックナトリウム除草剤及びピリミノバック除草剤に対する抵抗性を有し、アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
(c)配列番号4のアミノ酸配列における171番目のヒスチジン及び548番目のロイシンを除く、1〜30個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ビスピリバックナトリウム除草剤、ピリチオバックナトリウム除草剤及びピリミノバック除草剤に対する抵抗性を有し、アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
(d)配列番号6のアミノ酸配列における171番目のヒスチジン及び627番目のイソロイシンを除く、1〜30個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ビスピリバックナトリウム除草剤、ピリチオバックナトリウム除草剤及びピリミノバック除草剤に対する抵抗性を有し、アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
(e)配列番号8のアミノ酸配列における171番目のヒスチジン、548番目のロイシン及び627番目のイソロイシンを除く、1〜30個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ビスピリバックナトリウム除草剤、ピリチオバックナトリウム除草剤及びピリミノバック除草剤に対する抵抗性を有し、アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質。 - 請求項1記載の遺伝子によりコードされるアセト乳酸シンターゼタンパク質。
- 請求項1記載の遺伝子を有する組換えベクター。
- 請求項3記載の組換えベクターを有する形質転換体。
- 請求項1記載の遺伝子を有し、ビスピリバックナトリウム除草剤、ピリチオバックナトリウム除草剤及びピリミノバック除草剤に対する抵抗性を有する植物。
- 請求項5記載の植物を、ビスピリバックナトリウム除草剤、ピリチオバックナトリウム除草剤及びピリミノバック除草剤からなる群から選ばれる少なくとも1以上の除草剤の存在下で育成することを特徴とする植物育成方法。
- 請求項1記載の遺伝子を選択マーカーとして使用し、該遺伝子を有する形質転換細胞を選択する方法。
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