JP4270548B2 - Ｃｄｃ７−ＡＳＫキナーゼ複合体、該キナーゼ複合体の基質、及び該基質に特異的な抗体、並びにこれらを用いたＣｄｃ７−ＡＳＫキナーゼ阻害能を有する化合物のスクリーニング方法 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、Ｃｄｃ７−ＡＳＫキナーゼ複合体のリン酸化酵素活性測定方法に関する。
背景技術
細胞は増殖する際に、そのゲノムＤＮＡを複製し、娘細胞へ均等に分配した後分裂するという過程を周期的に繰り返す。このような周期は細胞周期と呼ばれている。細胞周期はＧ１期（ＤＮＡ合成準備期）、Ｓ期（ＤＮＡ合成期）、Ｇ２期（分裂準備期）、Ｍ期（分裂期）に分けることができ、各段階を順番に経て細胞は分裂する。細胞周期の進行は数多くの分子により精緻な調節を受け、不必要な細胞の増殖を制御している。これまでに細胞周期の進行に関与する分子のクローニングや機能解析が数多く行われ、多くの癌においてこれらの細胞周期の進行に関する分子の異常が報告され、それが発癌の原因となっていると考えられている。
これまで、種々の制癌剤ないしは抗癌剤が開発されてきた。癌細胞の増殖異常の原因の多くが、細胞周期の進行の異常に由来することが認識されるにしたがって、細胞周期進行制御因子を標的とした制癌剤が精力的に開発されている。中でも、機能の解析が進んでいるＣｄｋ−Ｃｙｃｌｉｎは、抗癌剤の標的として最も広く研究されている。そしてＣｄｋ−Ｃｙｃｌｉｎを標的とする多くの制癌剤の候補分子が既に報告されている。
Ｃｄｋは多くの構造類似分子がファミリーを構成し、それぞれが種々の細胞周期特異的なＣｙｃｌｉｎ分子と複合体を形成して、細胞周期の種々のステージを制御する。現状では、これらの構造類似分子の中で、特定のＣｄｋ−Ｃｙｃｌｉｎのみを特異的に阻害する分子の特定には至っていない。つまり、Ｃｄｋ−Ｃｙｃｌｉｎを標的として、癌細胞に対して特異的かつ選択的に作用する分子を得ることは難しかった。また、これまでのところ細胞分裂、あるいはＧ１（休止）期の制御因子を標的とした制癌剤は多く探索されてきたが、細胞増殖のもうひとつの重要な制御点であるＤＮＡ複製の過程を標的とした創薬は少なかった。
さて、Ｓ期の開始時（Ｇ１−Ｓ移行）においては、Ｃｄｋ−Ｃｙｃｌｉｎとは別のセリン／スレオニンキナーゼが重要な役割を果たしていることが明らかになっている。すなわち、細胞分裂周期変異株の一つとして単離されたＣｄｃ７変異株（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５９：１８３−１９４，１９７１）において、Ｃｄｃ７蛋白質キナーゼは染色体ＤＮＡの複製の開始直前に機能すること、そしてＳ期を通じて各複製起点の活性化に必要であることが明らかにされた（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１５９０−１５９８，１９８６；Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８０−４９０，１９９８；Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４９１−５０１，１９９８）。また酵母Ｃｄｃ７のキナーゼ活性は、制御サブユニットであるＤｂｆ４に依存することも知られている（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３１：２１−２９，１９９２；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２８９９−２９０８，１９９３）。
酵母におけるＤｂｆ４の発現は周期的で、転写レベルおよび翻訳後レベルの両方で制御されている（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１８０：４１９−４２８，１９８９）。Ｇ１−Ｓ境界期におけるＣｄｃ７キナーゼ活性の増加の少なくとも一部は、Ｄｂｆ４の発現がＧ１後期に増加することによって説明されている（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２８９９−２９０８，１９９３；Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１８０：４１９−４２８，１９８９）。更にＤｂｆ４は細胞内で複製起点と相互に作用する（Ｓｃｉｅｎｃｅ２６５：１２４３−１２４６，１９９４）ことから、Ｃｄｃ７は複製起点上に形成される複製装置を直接的に活性化することによりＳ期の開始をトリガーしていると考えられている。
本発明者は、既にヒトにおける酵母Ｄｂｆ４のヒトにおけるホモログＨ３７蛋白質とそれをコードするＤＮＡの単離に成功している（特開２０００−１３５０９０号公報、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２７５，Ｎｏ．３７，２９０４２−２９０５２，２０００）。Ｈ３７は、ＤＮＡ複製の開始のｏｎ／ｏｆｆを司る重要な制御因子である。Ｈ３７は、後にヒトａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｓ ｐｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ（ＡＳＫ）と名付けられた。
ＡＳＫはヒト染色体上のユニークな遺伝子で、その機能は染色体複製に必須である。マウスを用いた発生工学的遺伝解析から、Ｃｄｃ７の機能は細胞レベル及び動物レベルで必須であることが証明された。Ｃｄｃ７はキナーゼ触媒サブユニットをコードし、ＡＳＫは活性サブユニットをそれぞれコードする。両者は複合体を形成し、活性を有するキナーゼとなる。Ｃｄｃ７−ＡＳＫキナーゼの活性は細胞周期で厳密に制御されており、ＤＮＡの複製が起こるＳ期に上昇する。そのキナーゼ活性はＳ期を通じて高く保たれるが、Ｍ期からＧ１期には検出されなくなる。この活性制御は、主にＡＳＫ蛋白質の発現レベルの変動に依存している。すなわち、ＡＳＫ蛋白質はその量が細胞周期で変動し、その結果ＡＳＫが結合し制御するヒトＣｄｃ７キナーゼの活性も細胞周期中に変動する。
また増殖の盛んな癌細胞においては、一般にヒトＣｄｃ７−ＡＳＫの発現レベル、およびその活性の昂進が観察される。このような癌細胞ではＡＳＫ蛋白質の発現の昂進によって、ヒトＣｄｃ７キナーゼ活性が増加していると考えられる。さらに興味深いことに、本発明者らはＡＳＫの発現レベルが種々の培養癌細胞においてその増殖能の上昇に呼応して増加していることを見出している。
本発明者のその後の研究によって、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体によってリン酸化される特異的な基質が、染色体の複製開始に必須なＭＣＭ（ｍｉｎｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）複合体（ヘテロ６量体）であることが証明された（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２７５，Ｎｏ．３７，２９０４２−２９０５２，２０００）。このような知見を踏まえ、本発明者らは、Ｃｄｃ７−ＡＳＫは複製開始複合体内に存在するＭＣＭをリン酸化し、その結果サブユニット構造の再構成を誘導して複製開始に必須な二本鎖ＤＮＡの開裂を引き起こすというモデルを提唱している。
このような背景から、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体による基質蛋白質のリン酸化は、がん細胞の増殖制御における重要な現象であると認識されている。しかし、そのリン酸化の機構には、今なお解明すべき点が多く残されている。
発明の開示
本発明は、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体による基質蛋白質のリン酸化の機構を明らかにし、その活性を評価するための方法の提供を課題とする。また本発明は、前記評価方法に基づいて、被験化合物のＣｄｃ−ＡＳＫ複合体による基質のリン酸化作用に与える影響を測定するための方法の提供を課題とする。更に本発明は、これらの方法に有用な、基質、抗体、あるいはＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体の提供を課題とする。
本発明者らはＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体は制癌剤の新規かつ重要な標的になると考えた。つまり、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体のリン酸化作用に対する阻害剤は、癌細胞の増殖を選択的に抑制することができ、有効な制癌剤の候補になると考えた。
Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体のリン酸化作用の阻害作用を評価するには、まずＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体のリン酸化作用を評価する方法の確立が必須である。この課題を解決するために、まず本発明者らは、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体による基質蛋白質のリン酸化の機構を明らかにした。そしてこの知見に基づいて、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体のキナーゼ活性を測定しうることを確認して本発明を完成した。
次に、このキナーゼ活性の測定方法を応用して、被験化合物のＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体による基質蛋白質のリン酸化作用に与える影響を評価できることを見出した。この知見に基づいて、Ｃｄｃ７−ＡＳＫキナーゼに対する被験化合物の阻害（または促進）作用を評価する方法と、このような作用を有する化合物のスクリーニング方法を確立し、本発明を完成した。
更に本発明者らは、これらの方法の確立を通じて、これらの方法に有用な新規な基質化合物、抗体、あるいはＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体等を見出し本発明を完成した。すなわち本発明は、以下のＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体のキナーゼ活性の測定方法に関する。あるいは本発明は、被験化合物がＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体のキナーゼ活性に与える影響を評価する方法、およびこの方法に基づくスクリーニング方法に関する。更に本発明は、これらの方法に有用な、基質化合物、抗体、あるいはＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体、若しくはそれらの調製方法に関する。
〔１〕次の工程を含む、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体のキナーゼ活性の測定方法。
ａ）基質蛋白質を、基質蛋白質のリン酸化が可能な条件下でＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体と接触させる工程、；ただし基質蛋白質は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質、または該蛋白質と機能的に同等な蛋白質である、
ｂ）基質蛋白質の、配列番号：１に示すアミノ酸配列において１７位に相当する位置のセリン残基におけるリン酸化のレベルを測定する工程、および
ｃ）前記リン酸化のレベルをを指標としてＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体のキナーゼ活性を測定する工程
〔２〕リン酸化のレベルを、前記セリン残基におけるリン酸化のレベルを識別する抗体の結合のレベルに基づいて測定する〔１〕に記載の方法。
〔３〕Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体が、生体試料に由来する〔１〕に記載の方法。
〔４〕次の工程を含む、被験化合物のＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体のキナーゼ活性に与える影響の測定方法。
ａ）被験化合物、基質蛋白質、およびＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質とを、次のｉ）〜ｉｉｉ）のいずれかに記載の順序で接触させる工程、；ただし基質蛋白質は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質、または該蛋白質と機能的に同等な蛋白質である
ｉ）被験化合物と基質蛋白質とを接触後にＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質を接触させる
ｉｉ）被験化合物の共存下で、基質蛋白質とＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質を接触させる、
ｉｉｉ）基質蛋白質、およびＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質とを接触後に、被験化合物を接触させる
ｂ）基質蛋白質の、配列番号：１に示すアミノ酸配列において１７位に相当する位置のセリン残基におけるリン酸化のレベルを測定する工程、および
ｃ）前記リン酸化のレベルをを指標として、被験化合物のＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質のキナーゼ活性に与える影響を測定する工程
〔５〕次の工程を含む、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体のキナーゼ活性を調節する作用を有する化合物のスクリーニング方法。
ａ）〔４〕に記載の方法によって、被験化合物のＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体のキナーゼ活性に与える影響を測定する工程、および
ｂ）被験化合物を接触させない対照と比較して、リン酸化レベルが高い、または低い被験化合物を選択する工程
〔６〕〔５〕のｂ）において、リン酸化レベルが低い化合物を選択する、〔５〕に記載のスクリーニング方法。
〔７〕〔６〕のスクリーニング方法によって選択される化合物を有効成分として含有する、細胞増殖の抑制剤。
〔８〕次の要素を含む、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体のキナーゼ活性測定用キット。 ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列の１７位のセリン残基を含み、かつ当該アミノ酸配列から選択された連続するアミノ酸配列を有する基質蛋白質、および
ｂ）基質蛋白質の、配列番号：１に示すアミノ酸配列において１７位に相当する位置のセリン残基におけるリン酸化のレベルを識別する抗体
〔９〕次の要素を含む、被験化合物のＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体のキナーゼ活性に与える影響を評価するためのキット。
ａ）Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質、および
ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列の１７位のセリン残基を含み、かつ当該アミノ酸配列から選択された連続するアミノ酸配列を有する基質蛋白質、
〔１０〕次の工程を含むＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質の製造方法。
ａ）ヒトＣｄｃ７蛋白質をコードするＤＮＡと、配列番号：１０に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質または該蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡとを、モノシストロニックに発現可能な状態で原核細胞に導入する工程、
ｂ）前記２つのＤＮＡを発現させる工程、および
ｃ）発現された蛋白質を回収する工程、
〔１１〕配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する蛋白質の１７位セリン残基におけるリン酸化のレベルを識別する抗体
〔１２〕以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質。
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質、
（ｂ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列から選択され、かつ１７位のセリンを含む連続するアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が、置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、ヒトＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体によってリン酸化される蛋白質
（ｄ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体によってリン酸化される蛋白質
〔１３〕配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号：９に記載のアミノ酸配列から選択された連続するアミノ酸配列を有する蛋白質。
〔１４〕配列番号：１０に記載のアミノ酸配列からなる、〔１３〕に記載のポリペプチド。
あるいは本発明は、〔６〕のスクリーニング方法によって選択される化合物を投与する工程を含む、細胞増殖の抑制方法に関する。また本発明は、〔６〕のスクリーニング方法によって選択される化合物の、細胞増殖の抑制剤の製造における使用に関する。
本発明は、次の工程を含む、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体のキナーゼ活性の測定方法に関する。
ａ）基質蛋白質を、基質蛋白質のリン酸化が可能な条件下でＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体と接触させる工程；ただし基質蛋白質は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、または該蛋白質と機能的に同等な蛋白質である
ｂ）基質蛋白質の、配列番号：１に示すアミノ酸配列において１７位に相当する位置のセリン残基におけるリン酸化のレベルを測定する工程、および
ｃ）前記リン酸化のレベルをを指標としてＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体のキナーゼ活性を測定する工程
本発明において、基質蛋白質としては、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、または該蛋白質と機能的に同等な蛋白質が用いられる。
ＭＣＭ２蛋白質の構造は公知である。ヒトＭＣＭ２のアミノ酸配列とそれをコードするｃＤＮＡの塩基配列を、配列番号：２および配列番号：３にそれぞれ示した。Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体は、配列番号：３に示すヒトＭＣＭ２の、特定のアミノ酸残基をリン酸化する。Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体が、ＭＣＭ複合体、あるいはフリーのＭＣＭ２をリン酸化することは、既に本発明者らによって明らかにされている。しかし、ＭＣＭ２のＮ末端から数えて１７番目に位置するセリンが、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体によって特異的にリン酸化されることは、本発明者らが明らかにした新規な知見である。
したがって、１７位セリンを含み、配列番号：３に示すアミノ酸配列から選択された連続するアミノ酸配列を含む蛋白質は、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体によるリン酸化が可能な限り、本発明における基質蛋白質に用いることができる。この他本発明の基質蛋白質として、たとえば次の蛋白質を用いることができる。基質蛋白質には、タグを付加することができる。また後に述べるように、基質蛋白質を固相に結合させておくこともできる。
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質、
（ｂ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列から選択され、かつ１７位のセリンを含む連続するアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が、置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、ヒトＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体によってリン酸化される蛋白質
（ｄ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体によってリン酸化される蛋白質
本発明において、ある蛋白質がＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体によってリン酸化されることは、たとえば実施例に記載したような反応の結果に基づいて、確認することができる。すなわち、リン酸化合物およびＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体とともに、基質蛋白質のリン酸化が可能な条件（後述）の元でその蛋白質をインキュベートする。次に、その蛋白質の配列番号：１に示すアミノ酸配列において１７位に相当する位置のセリン残基におけるリン酸化のレベルを測定する。測定されたリン酸化のレベルが、たとえば配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質を基質蛋白質に用いた場合と有意な差が見られないとき、その蛋白質は、ヒトＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体によってリン酸化される蛋白質であると判定される。
本発明の基質蛋白質を構成するアミノ酸は、通常５以上、通常１０以上、好ましくは５０以上とすることができる。また基質蛋白質の大きさには制限はないが、たとえば４００、通常３００、あるいは２００以下の短い断片とすることもできる。基質蛋白質を短い断片とすることによって、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体によるリン酸化をより特異的に観察することができる。
本発明において、好ましい基質蛋白質として、例えば配列番号：１のアミノ酸配列を含む蛋白質を示すことができる。配列番号：１のアミノ酸配列は、配列番号：３に示したヒトＭＣＭ２のＮ末端側の１３０アミノ酸からなる断片配列である。Ｎ末端から数えて１７番目に位置するセリンが、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体によってリン酸化される。
この他、配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が、置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、ヒトＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体によってリン酸化される蛋白質を基質蛋白質として用いることができる。本発明において変異の対象となるアミノ酸の数は、例えば１〜１０個であり、好ましくは１〜６個、更に好ましくは１〜３個である。
アミノ酸配列の変異は、人為的なものであっても、自然において生じる変異であってもよい。アミノ酸を置換する場合には、保存的置換を利用することができる。一般に蛋白質の機能の維持のためには、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸残基の置換が、保存的置換と呼ばれている。
例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐは、いずれも非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性のアミノ酸としては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。あるいは、酸性アミノ酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが挙げられる。更に、塩基性アミノ酸としては、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓが挙げられる。これらの各グループを構成するアミノ酸は、互いに似た性質を有している。そのため、グループ内の他のアミノ酸に置換したときに、蛋白質の機能が維持される可能性が高い。
このような蛋白質は、配列番号：１に記載のヒトＭＣＭ２のｃＤＮＡの塩基配列に変異を導入することによって得ることができる。既知の塩基配列からなる遺伝子に変異を導入する技術は公知である。あるいは、化学合成によって目的とするアミノ酸配列からなる蛋白質を調製することもできる。
本発明の基質蛋白質において、配列番号：１に示すアミノ酸配列における１７位に相当する位置にあるセリンは、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体のリン酸化の標的として重要である。したがって、アミノ酸配列に変異を有する蛋白質を基質蛋白質として用いる場合であっても、１７位、または１７位に相同な位置にあるセリンは、保存することが重要である。１７位に相同な位置とは、あるアミノ酸配列を配列番号：１のアミノ酸配列と整列させたときに、配列番号：１のアミノ酸配列における１７位に相当する位置に配置される位置を言う。複数のアミノ酸配列を整列させる方法は公知である。たとえば、ｂｌａｓｔなどのアルゴリズムに基づいて、異なるアミノ酸配列を整列させるさまざまなソフトウエアが実用化されている。
また本発明の基質蛋白質として、配列番号：３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体によってリン酸化される蛋白質を用いることもできる。たとえばヒトＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体は、ヒトＭＣＭ２のみならず、マウスのＭＣＭ２もリン酸化する。したがって、マウスＭＣＭ２は、本発明における基質蛋白質として利用することができる。マウスＭＣＭ２のアミノ酸配列は配列番号：５に、このアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号：４に示した。マウスＭＣＭ２とヒトＭＣＭ２のホモロジーは、９９％である。したがって、ヒト配列番号：３に記載のアミノ酸配列（ヒトＭＣＭ２の全長アミノ酸配列）と９９％以上のホモロジーを有する蛋白質は、本発明の基質蛋白質として有用である。
ただし、本発明においては、ヒトＭＣＭ２の１７位のセリン、またはこのセリンに相同な位置にあるセリンにおけるリン酸化のレベルを指標として測定している。配列番号：１や配列番号：３に示したアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列からなる蛋白質を基質蛋白質とする場合には、配列番号：１における１７位、または１７位に相同な位置にあるセリンを保存することが重要である。たとえばマウスのＭＣＭ２においては、２６位のセリンが、１７位に相同な位置にあるセリンとなる。したがって、マウスのＭＣＭ２断片を基質蛋白質に利用する場合には、２６位のセリンを含むアミノ酸配列からなる蛋白質を用いるのが望ましい。
本発明の基質蛋白質は、遺伝子工学的な手法に基づいて得ることができる。すなわち、ＭＣＭ２をコードするＤＮＡを適当な発現系によって発現させることにより、目的とするアミノ酸配列を有する蛋白質を得ることができる。ＭＣＭ２をコードするＤＮＡの塩基配列は、配列番号：２に示した。
たとえば、大腸菌によってＭＣＭ２遺伝子を発現させた例を実施例に示した。発現産物は、塩析、ゲルろ過、あるいはイオン交換クロマトグラフィー等の手法を利用して精製することができる。ＭＣＭ２に結合親和性を有するタグを融合させておき、このタグに対する結合親和性物質を利用したアフィニティクロマトグラフィーによる精製を利用することもできる。結合性のタグとしては、数個のヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、チオレドキシン、マルトース結合タンパク、Ｍｙｃ、Ｘｐｒｅｓｓ、ＦＬＡＧ等を用いることができる。例えば、ＧＳＴを用いれば、発現した蛋白質をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂカラムなどで容易に精製することができる。
なお発現系によっては、ＭＣＭ２がリン酸化された状態で回収される場合がある。基質蛋白質が発現系においてリン酸化されてしまった場合には、フォスファターゼ等のリン酸基に作用する酵素で処理することによって、蛋白質を脱リン酸化しておくこともできる。本発明の測定方法は、基質蛋白質のリン酸化を指標として測定する工程を含む。したがって、基質蛋白質の、特にＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体によってリン酸化される部位は、リン酸化されていない方が望ましい。また、目的とするアミノ酸配列からなる蛋白質を、化学的に合成する方法も公知である。
本発明のＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体のキナーゼ活性の測定方法は、前記基質蛋白質と、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体のキナーゼ活性を測定すべき試料とを、基質蛋白質のリン酸化が可能な条件下で接触させる工程を含む。本発明において、基質蛋白質のリン酸化が可能な条件とは、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体のキナーゼ活性の発現に好適な条件下を言う。より具体的には、酵素活性の発現に適した温度、塩濃度、ｐＨに調節され、かつ基質蛋白質のリン酸化のためのリン酸化合物を共存させる。酵素活性に適した条件とは、たとえば次のような条件を示すことができる。すなわち、ｐＨ７．０−７．５に調節されたＨＥＰＥＳ緩衝液中で、上記成分を接触させることによって、このような反応条件を与えることができる。
また本発明において、基質蛋白質のリン酸化が可能な条件とは、基質蛋白質のリン酸化に必要なリン酸基を有する化合物の存在下で、試料と基質蛋白質とを接触させることを言う。リン酸基は、たとえばアデノシン３リン酸（以下、ＡＴＰと記載する）を共存させることにより、供給することができる。
前記反応を構成する基質蛋白質とリン酸化合物は、試料中のＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体のキナーゼ活性に対して過剰となるように添加するのが望ましい。一般的には、試料に含まれるＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体のキナーゼ活性を正確に予測することは難しい。しかし当業者は、反応に必要な成分が酵素反応に不足しないように、予め十分量の基質化合物、あるいはリン酸化合物を経験的に設定することができる。たとえば、ヒトに由来する生体試料を測定する場合には、基質蛋白質としてたとえば０．１μｇ以上、通常０．２〜１μｇを用いる。またリン酸化合物は、ＡＴＰとしてたとえば０．０１ｍＭ以上、通常０．１〜１ｍＭとなるように添加すれば良い。なおリン酸化合物は、反応系に用いられる基質蛋白質のリン酸化に必要かつ十分な量を添加するようにする。
またリン酸化のための反応時間は、一般に１０分以上、好ましくは３０分以上、たとえば５０−１００分間の反応により、基質蛋白質の確実なリン酸化が期待できる。リン酸化に必要な時間は、基質蛋白質の使用量、反応液中のＣｄｃ−ＡＳＫ複合体の活性のレベルによって変動する。当業者は、与えられた条件の元で、リン酸化に必要な反応時間を適宜設定することができる。
本発明の測定方法においては、一定時間内での基質蛋白質リン酸化のレベルが、試料中のリン酸化活性と相関する。あるいは、基質蛋白質を所定のレベルまでリン酸化するのに必要な反応時間を指標として、試料中のリン酸化活性を測定することもできる。すなわち、試料中のリン酸化活性が大きいほど、基質蛋白質のリン酸化は短時間で所定のレベルに達する。更に、基質蛋白質を所定のレベルまでリン酸化するのに必要な試料の量を指標として、試料中のリン酸化活性を測定することもできる。この態様においては、試料中のリン酸化活性の大きさに逆比例して、リン酸化に必要な試料の量は小さくなる。
なお試料中のリン酸化活性が予想をはるかに超える場合には、短時間のうちに基質蛋白質の大部分がリン酸化されてしまうことになる。このような状態では、正確にリン酸化活性を評価することができない可能性がある。したがって、このような結果となった場合には、反応に加える試料の量を少なくしたうえで改めてリン酸化活性を測定するのが望ましい。
本発明の測定方法は、基質蛋白質の、配列番号：１に示すアミノ酸配列において１７位に相当する位置のセリン残基におけるリン酸化のレベルを測定する工程を含む。当該部位におけるリン酸化のレベルは、たとえば、１７位に相当する位置のセリン残基におけるリン酸化の状態を識別する抗体を使って、免疫学的に測定することができる。
より具体的には、１７位に相当するセリンを含むアミノ酸配列からなる蛋白質の、リン酸化されたセリン残基を含む抗原決定基に対する結合活性と比較して、セリンの脱リン酸化によって結合活性が低下する抗体を用いることができる。あるいは逆に、リン酸化されていないセリン残基を含む抗原決定基に結合するが、当該セリン残基のリン酸化によって結合活性が低下する抗体を用いることもできる。
本発明の測定方法において、リン酸化のレベルを測定するために用いる、前記セリン残基におけるリン酸化のレベルを識別する抗体は、たとえば次のようにして得ることができる。まず免疫原には、当該セリン残基を含む連続したアミノ酸配列からなる合成ペプチドを用いることができる。免疫原とする合成ペプチドの長さは、少なくとも３以上、たとえば５以上、通常１０以上、好ましくは１０〜２０アミノ酸とすることができる。たとえば、１７位のセリンを含み、配列番号：１に記載のアミノ酸配列から選択された連続する１５のアミノ酸で構成されるアミノ酸配列は、免疫原として好ましい。セリンの位置は、任意とすることができる。たとえば実施例においては、１５アミノ酸の中央にセリンが位置するアミノ酸配列からなる合成ペプチドを免疫原としている。合成ペプチドは、キャリアー蛋白質と結合させることができる。キャリアー蛋白質としては、たとえばキーホールリンペットヘモシアニン等が用いられる。
免疫原における１７位に相当するセリン残基は、リン酸化しておくことができる。特定のアミノ酸をリン酸化した合成ペプチドを得る方法は公知である。免疫原におけるセリンがリン酸化されていた場合には、リン酸化されたセリンに対する結合活性を有する抗体を得ることができる。
免疫原は、適当なアジュバントと混合して、免疫動物に投与される。免疫は、通常、複数回行われ、抗体価の十分な上昇を確認して、免疫動物の血液を採取する。採取された血液から回収された血清は、本発明の抗体を含む抗血清として用いることができる。抗血清からは、イムノグロブリンを精製することによって、精製抗体を得ることができる。
あるいは、免疫動物の抗体産生細胞を不死化し、目的とする反応性を有する抗体を産生するクローンを選択することによって、モノクローナル抗体を産生する細胞を樹立することもできる。たとえば、抗体産生細胞をミエローマなどと細胞融合させてハイブリドーマを作成すれば、抗体産生細胞を不死化することができる。
抗体が目的とする反応性を有することは、免疫原として用いた合成ペプチドを用いて確認することができる。たとえば、リン酸化されたセリンを含む合成ペプチドに結合する抗体を選択することによって、リン酸化した基質蛋白質を認識する抗体を得ることができる。更に、この抗体から、リン酸化していないセリンを含む合成ペプチドに結合する抗体を除くことにより、リン酸化した基質蛋白質に特異的に結合する抗体を得ることができる。このような選択工程によって、抗血清や精製抗体を処理することによって、本発明に必要な基質蛋白質のリン酸化状態を識別する抗体を得ることができる。
同様の選択工程にしたがってハイブリドーマが産生する抗体をスクリーニングすれば、基質蛋白質のリン酸化状態を識別しうるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
本発明の測定方法において、前記抗体は予め標識しておくことができる。抗体の標識によって、リン酸化部位に結合した抗体を容易に検出することができる。また、標識に由来するシグナルを増幅することができれば、より高感度な測定を期待することができる。
抗体の標識には、任意の標識成分を用いることができる。たとえば、蛍光色素、酵素、あるいは放射性物質等を標識として用いることができる。また、フェリチン、コロイド金等の電子密度の高い物質を標識に用いることもできる。
蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンβイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）等が挙げられる。酵素としては、ペルオキシシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、シトクロムｃ等が挙げられる。放射性物質としては、^１２５Ｉ、^１４Ｃ、^３Ｈ等が挙げられる。これらの標識成分で抗体を標識する方法は公知である。
また、リン酸化状態を識別する抗体（一次抗体）に対して結合する抗体（以下、「二次抗体」という）を用いて抗体を標識することもできる。例えば、基質蛋白質にリン酸化状態を識別する抗体を接触させた後、二次抗体を反応させる。そして、間接的に基質に結合した２次抗体量を測定し、この測定量から一次抗体の結合量を求め、そして基質のリン酸化レベルを知ることができる。たとえば一次抗体にマウスモノクローナル抗体を用いる場合には、抗マウスＩｇＧヤギ抗体を二次抗体として用いることができる。
あるいは、一次抗体を結合親和性物質で標識しておき、この親和性物質に対する結合パートナーの親和性を利用して、抗体を間接的に標識することもできる。たとえば一次抗体をアビジン化しておけば、ビオチン化した酵素をアビジン−ビオチン間の親和性によって、抗体に酵素を結合することができる。
本発明の測定方法においては、Ｃｄｃ７−ＡＳＫの基質蛋白質を予め不溶性支持体に結合させ、固相化した状態で用いることができる。基質蛋白質を固相化することにより、前記リン酸化状態を識別する抗体との結合を容易に検出することができる。つまり、基質蛋白質に抗体を接触させた後、液相を分離して固相を洗浄することにより、結合した抗体と結合しなかった抗体は容易に分離される。その後、固相（または液相）における抗体を測定すれば、基質蛋白質に結合した（またはしなかった）抗体の量を容易に測定することができる。基質蛋白質の固相への固定化は、基質蛋白質の安定化にも貢献する。
基質蛋白質を固定化するための不溶性支持体としては、例えばポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂等の樹脂、ガラス、やミセル粒子等の水に不溶性の物質が用いられ、特にその材質は限定されない。また、不溶性支持体の形状も特に限定されず、トレイ状、球状、棒状、繊維状、セル状、試験管状等の形状のものを採用することができる。基質蛋白質は、物理吸着、または化学結合によって不溶性支持体に固相化することができる。基質蛋白質を固相化した不溶性支持体は、必要に応じてブロッキングすることができる。ブロッキングには、アルブミンやスキムミルクなどが用いられる。不溶性支持体のブロッキングにより、抗体の不溶性支持体に対する非特異的な結合が抑制される。また、ブロッキングによって基質蛋白質の保護作用も期待できる。
本発明において、基質蛋白質と結合した（またはしなかった）抗体の量は、試料中に存在するＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体のリン酸化酵素活性と関連付けられる。より具体的には、たとえば基質蛋白質のリン酸化されたセリンを含む抗原決定基に結合する抗体を用いた場合には、基質蛋白質に結合した抗体の量は、試料中のＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体のリン酸化酵素活性の大きさに比例する。リン酸化酵素活性のレベルが予めわかっているＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体標品による測定結果との対比によって、試料中のリン酸化酵素活性を定量的に知ることもできる。
本発明は、基質蛋白質のＣｄｃ７−ＡＳＫによる被リン酸化領域におけるリン酸化の状態に基づいて、そのキナーゼ活性を測定している。したがって、試料中に共存する可能性があるその他のリン酸化作用を有する物質の影響を受けることなく、Ｃｄｃ７−ＡＳＫのキナーゼ活性を特異的に測定することができる。その結果、本発明の方法に基づいてＣｄｃ７−ＡＳＫのキナーゼ活性を測定することによって、細胞増殖の状態を特異的に検知することができる。
Ｃｄｃ７−ＡＳＫは、細胞周期においては、特にＳ期に高い活性を維持し、Ｇ１期には活性が低下する。したがって、Ｃｄｃ７−ＡＳＫのキナーゼ活性の測定は、細胞のＧ１期からＳ期への移行の指標として有用である。Ｓ期は細胞の増殖に備えて核酸の複製が進行する時期である。したがって、たとえばある生体試料中の細胞にＳ期にある細胞が多く見出されることは、その試料では、細胞の増殖が進行していることを意味している。より具体的には、癌組織中に本発明の測定方法によってＣｄｃ７−ＡＳＫのキナーゼ活性の高い細胞が多く見出されれば、その癌組織には活発に増殖している細胞が多く含まれることを示している。つまり、悪性度の高い癌である可能性がある。
また本発明は、次の工程を含む、被験化合物のＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体のキナーゼ活性に与える影響の測定方法に関する。
ａ）被験化合物、基質蛋白質、およびＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質とを、次のｉ）〜ｉｉｉ）のいずれかに記載の順序で接触させる工程、；ただし基質蛋白質は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質、または該蛋白質と機能的に同等な蛋白質である
ｉ）被験化合物と基質蛋白質とを接触後にＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質を接触させる
ｉｉ）被験化合物の共存下で、基質蛋白質とＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質を接触させる、
ｉｉｉ）基質蛋白質、およびＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質とを接触後に、被験化合物を接触させる
ｂ）基質蛋白質の、配列番号：１に示すアミノ酸配列において１７位に相当する位置のセリン残基におけるリン酸化のレベルを測定する工程、および
ｃ）前記リン酸化のレベルをを指標として、被験化合物のＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質のキナーゼ活性に与える影響を測定する工程
上記方法において、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質とは、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体と機能的に同等な複合体を言う。より具体的には、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質とは、基質蛋白質における被リン酸化セリンをリン酸化する作用を有する複合体と定義される。したがって、複合体を構成するＣｄｃ７、あるいはＡＳＫが、ヒト由来の蛋白質とは異なる構造を有するものであっても、当該活性を有する複合体を構成する場合には、本発明のＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質として利用することができる。
ある蛋白質複合体が、基質蛋白質における被リン酸化セリンをリン酸化する作用を有することは、たとえば実施例に示すような方法に基づいて確認することができる。すなわち、前記基質蛋白質とその蛋白質複合体とを、基質蛋白質のリン酸化が可能な条件下でインキュベートする。インキュベート後の基質蛋白質のリン酸化のレベルが、ヒトＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体とインキュベートした場合と比較して、有意な差が見られない場合に、その蛋白質複合体は、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体と機能的に同等であると判定される。
ヒトに由来するＣｄｃ７とＡＳＫの構造は公知である。ヒトＣｄｃ７をコードするｃＤＮＡの塩基配列を塩基配列：６に、またヒトＣｄｃ７のアミノ酸配列を配列番号：７に示した。またヒトＡＳＫをコードするｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：８に、またヒトＡＳＫのアミノ酸配列を配列番号：９に示した。これら公知のＣｄｃ７、あるいはＡＳＫに対して、本発明のＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質を構成する各サブユニットとして、たとえば次のような蛋白質を用いることができる。本発明において、天然のヒトＣｄｃ７、あるいはヒトＡＳＫと異なる構造を有するが、キナーゼ活性を有するＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質を構成することができるサブユニットを、それぞれＣｄｃ７サブユニット、およびＡＳＫサブユニットと言う。
まずＣｄｃ７サブユニットとしては、以下のポリヌクレオチドによってコードされ、前記ヒトＡＳＫとの複合体を形成して基質蛋白質のリン酸化作用を有する複合体を構成する蛋白質を用いることができる。
（ａ）配列番号：６に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：７に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：７に記載のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が、置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、前記ヒトＡＳＫとの複合体を形成して基質蛋白質のリン酸化作用を有する複合体を構成する蛋白質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号：６に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記ヒトＡＳＫとの複合体を形成して基質蛋白質のリン酸化作用を有する複合体を構成する蛋白質をコードするポリヌクレオチド
本発明において、上記ポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質が、前記ヒトＡＳＫとの複合体を形成して基質蛋白質のリン酸化作用を有する複合体を構成することは、次のようにして確認することができる。すなわち、まず上記ポリヌクレオチドをヒトＡＳＫをコードする塩基配列からなるＤＮＡとともに適当な宿主細胞で共発現させる。得られた発現産物について、たとえば実施例に記載したような方法によって、リン酸化活性を評価し、Ｃｄｃ７−ＡＳＫが有するリン酸化活性と比較する。その結果、両者のリン酸化活性に有意な差が見られない場合には、その複合体を構成するＣｄｃ７サブユニットは、前記ヒトＡＳＫとの複合体を形成して基質蛋白質のリン酸化作用を有する複合体を構成する蛋白質であると判断される。
一方、ＡＳＫサブユニットとしては、以下のポリヌクレオチドによってコードされ、前記ヒトＣｄｃ７との複合体を形成して基質蛋白質のリン酸化作用を有する複合体を構成する蛋白質は、本発明のＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質を構成するＡＳＫサブユニットとして用いることができる。
（ａ）配列番号：８に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：９に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：９に記載のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が、置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、前記ヒトＣｄｃ７との複合体を形成して基質蛋白質のリン酸化作用を有する複合体を構成する蛋白質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号：８に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記ヒトＣｄｃ７との複合体を形成して基質蛋白質のリン酸化作用を有する複合体を構成する蛋白質をコードするポリヌクレオチド
本発明において、上記ポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質が、前記ヒトＣｄｃ７との複合体を形成して基質蛋白質のリン酸化作用を有する複合体を構成することは、次のようにして確認することができる。すなわち、まず上記ポリヌクレオチドをヒトＣｄｃ７をコードする塩基配列からなるＤＮＡとともに適当な宿主細胞で共発現させる。得られた発現産物について、たとえば実施例に記載したような方法によって、リン酸化活性を評価し、Ｃｄｃ７−ＡＳＫが有するリン酸化活性と比較する。その結果、両者のリン酸化活性に有意な差が見られない場合には、その複合体を構成するＡＳＫサブユニットは、前記ヒトＣｄｃ７との複合体を形成して基質蛋白質のリン酸化作用を有する複合体を構成する蛋白質であると判断される。
たとえば本発明者らは、ヒトＡＳＫを構成する６７４個のアミノ酸配列中、Ｎ末端側からカウントして１７４−３４９の位置に相当するアミノ酸配列からなる蛋白質は、Ｃｄｃ７との複合体の形成と、キナーゼ活性の発現に必須の領域であることを明らかにした。当該領域を構成するアミノ酸配列を配列番号：１０に示した。このようなヒトＡＳＫ蛋白質の断片は、前記活性を有する限り、本発明におけるＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質を構成するＡＳＫサブユニットとして用いることができる。
本発明において、上記のＣｄｃ７サブユニット、あるいはＡＳＫサブユニットをコードするポリヌクレオチドは、任意のｃＤＮＡライブラリからＰＣＲやハイブリダイズスクリーニングによって取得することができる。ｃＤＮＡライブラリーとしては、ヒトをはじめとして、マウスやラットなどのヒト以外の哺乳動物、あるいは線虫や分裂酵母などの真核細胞に由来するライブラリーを用いることができる。
本発明のＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質は、細胞から抽出することもできるし、遺伝子工学的手法によって製造することもできる。遺伝子工学的な手法による製造方法は、多量の蛋白質を容易に得ることができるので望ましい。本発明のＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質として、たとえば昆虫細胞で発現させたヒトＣｄｃ７とＡＳＫからなる複合体を用いることができる。
たとえば本発明者らは、このような複合体の製造に既に成功している（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２７５，Ｎｏ．３７，２９０４２−２９０５２，２０００）。より具体的には、たとえば次の工程ａ）−ｃ）にしたがって昆虫細胞を利用して、本発明に用いるＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質を得ることができる。
ａ）ヒトＣｄｃ７サブユニットをコードするＤＮＡと、ヒトＡＳＫサブユニットをコードするＤＮＡとを昆虫細胞に導入するステップ、
ｂ）前記昆虫細胞において、導入した前記二つのＤＮＡを共発現させるステップ、及び
ｃ）発現された蛋白質（複合体）を精製するステップ、
前記ステップａ）で用いられるヒトＣｄｃ７サブユニットをコードするＤＮＡは、前記ａ）−ｅ）に記載のいずれかのポリヌクレオチドを用いることができる。また、その形態も限定されず、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡが含まれる。例えば、ヒトＣｄｃ７サブユニットをコードするＤＮＡとして、配列番号：６に示した塩基配列を有するＤＮＡを利用することができる。
同様に、ステップａ）で用いられるヒトＡＳＫサブユニットをコードするＤＮＡは、前記ａ）−ｅ）に記載のいずれかのポリヌクレオチドを用いることができる。例えば、ヒトＡＳＫ蛋白質をコードするＤＮＡとして、配列番号：８に示した塩基配列を有するＤＮＡを利用することができる。
昆虫細胞には、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＳｆ９細胞やＳｆ２１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ由来のＴｎ５細胞を用いることができる。これらの細胞は市販されており（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｐｈａｍｉｎｇｅｎ社製）、またＡＴＣＣから入手することもできる。Ｃｄｃ７サブユニット、およびＡＳＫサブユニットをコードするＤＮＡは、バキュロウイルスを利用して昆虫細胞へ導入することができる。たとえば、トランスファーベクターへこれらのＤＮＡをサブクローニングし、得られたプラスミドとバキュロウイルスＤＮＡとを同時に昆虫細胞にトランスフェクションすることによって、相同組み換えにより組換え体ウイルスが作製される。この組換え体ウイルスを昆虫細胞に感染させ、昆虫細胞内でＣｄｃ７サブユニットとＡＳＫサブユニットとを共発現させる。発現される蛋白質量を増大させるために、この蛋白質の発現に先立って組換え体ウイルスの精製、増幅などを行うことが好ましい。
トランスファーベクターとしては、市販のｐＶＬ１３９２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、ｐＰＡＫ８（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、ｐＡｃＵＷ５１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、ｐＡｃＵＷ３１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、ｐＡｃＡＢ３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）などを用いることができる。特に、Ｃｄｃ７サブユニットおよびＡＳＫサブユニットを同時にサブクローニングできるものはトランスファーベクターとして好ましい。たとえば、ｐＡｃＵＷ５１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）などのプロモーターを２つ有するトランスファーベクターや、ｐＡｃＡＢ３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）などのプロモーターを３つ有するトランスファーベクターを利用することにより、２つの遺伝子をサブクローニングすることができる。あるいは、Ｃｄｃ７サブユニット、およびＡＳＫサブユニットをサブクローニングするトランスファーベクターとしてそれぞれ異なるものを利用することもできる。
また、バキュロウイルスＤＮＡとしては、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ Ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ（商品名、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、野生型Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＡｃＮＶ ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などを用いることができる。尚、バキュロウイルスを利用した発現系については各種キットが市販されており、それらを利用してもよい。
以上のトランスファーベクターとバキュロウイルスとを用いて、外来遺伝子であるＣｄｃ７サブユニットとＡＳＫサブユニットの遺伝子を昆虫細胞において共発現させることができる。発現可能な条件下で形質転換細胞を培養し、発現生成物を回収することにより、本発明に用いるＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質を得ることができる。回収を容易にするために、Ｃｄｃ７およびＡＳＫのいずれか、あるいは両方に、適当なタグを融合させておくこともできる。
また、次に述べる方法にしたがって、原核細胞において、Ｃｄｃ７サブユニットとＡＳＫサブユニットの複合体を得ることもできる。たとえば原核細胞として大腸菌を用いる場合には、以下の工程により、Ｃｄｃ７−ＡＳＫキナーゼ複合体活性物質を調製することができる。
Ａ）ヒトＣｄｃ７サブユニットをコードするＤＮＡと、配列番号：１０に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質または該蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡとを、モノシストロニックに発現可能な状態で大腸菌に導入する工程、
Ｂ）前記二つのＤＮＡを発現させる工程、および
Ｃ）発現された蛋白質を回収する工程、
本発明者らの検討によれば、大腸菌の系においてはヒトＡＳＫ蛋白質の全長ではなく部分ＡＳＫ（配列番号：１０）を導入して発現させることにより、最終的にキナーゼ活性を有するＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質を取得することができた。また本発明において、配列番号：１０に示すアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質とは、Ｃｄｃ７サブユニットと複合体を構成してキナーゼ活性を発現することができる蛋白質を言う。
ある蛋白質がＣｄｃ７サブユニットと複合体を構成してキナーゼ活性を発現することは、次のようにして確認することができる。すなわち、まずその蛋白質をコードするＤＮＡをヒトＣｄｃ７をコードする塩基配列からなるＤＮＡとともに適当な宿主細胞で共発現させる。得られた発現産物について、たとえば実施例に記載したような方法によって、リン酸化活性を評価し、Ｃｄｃ７−ＡＳＫが有するリン酸化活性と比較する。その結果、両者のリン酸化活性に有意な差が見られない場合には、その複合体を構成するＡＳＫサブユニットは、前記ヒトＣｄｃ７との複合体を形成して基質蛋白質のリン酸化作用を有する複合体を構成する蛋白質であると判断される。
機能的に同等な蛋白質として、配列番号：１０に示すアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し、前記活性を保持した蛋白質を示すことができる。また、配列番号：１０に示すアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が、置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、前記活性を保持した蛋白質は、機能的に同等な蛋白質に含まれる。変異を加えるアミノ酸の数は、通常２０以下、たとえば１０以下、好ましくは５以下、たとえば１〜３である。アミノ酸は、保存的置換により置換することができる。本発明における機能的に同等な蛋白質には、配列番号：１０に示すアミノ酸配列にタグを融合させた蛋白質が含まれる。
工程Ａ）では、上記と同様のヒトＣｄｃ７サブユニットをコードするＤＮＡと、ヒトＡＳＫサブユニットの断片配列をコードするＤＮＡ（以下、略して「部分ＡＳＫ」ともいう）が使用される。断片配列からなる蛋白質には、配列番号：１０に示すアミノ酸配列からなる蛋白質、または該蛋白質と機能的に同等な蛋白質を用いる。配列番号：１０のアミノ酸配列は、配列番号：９に示すアミノ酸中、１７４番目のアミノ酸から３４９番目のアミノ酸までのアミノ酸配列に相当する部分配列である。配列番号：１１に記載のアミノ酸配列は、配列番号：１０に記載の塩基配列によってコードされている。配列番号：１０に記載の塩基配列は、配列番号：８に示す塩基配列の１０２７位〜１５６４位の塩基に相当する部分塩基配列である。このアミノ酸配列を含む蛋白質の断片は、ヒトＣｄｃ７と複合体を形成しキナーゼ活性の発現に必要な領域である。ここで、部分ＡＳＫは部分ＡＳＫ蛋白質をコードする限りその配列は限定されず、コドンの縮重を考慮した任意の塩基配列を有するＤＮＡが含有される。また、その形態も限定されず、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡが含有される。
本発明において、モノシストロニックに発現可能な状態とは、Ｃｄｃ７サブユニットをコードするＤＮＡとＡＳＫサブユニットをコードするＤＮＡとが、１つのｍＲＮＡ分子として転写され、２つの蛋白質分子に翻訳されることを言う。モノシストロニックに発現させるためには、これらのＤＮＡを共通の転写制御領域の制御下に発現できるように配置する。また、２つの遺伝子の間にターミネータなどの転写を終結させる塩基配列が介在しないようにデザインする。更に、２つの遺伝子は接近して配置することが望ましい。ただし、両者の翻訳フレームが連続すると、１つの融合蛋白質として翻訳されてしまうので、両者の間には終止コドンを配置する。
またｍＲＮＡ上の２つの蛋白質コード領域に対してそれぞれの翻訳を効率的に行わせるために、２つの遺伝子の間にＲＢＳ（リボソーム結合配列−Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｎｏ配列）を配置することは有効である。実施例において、ヒトＣｄｃ７と、配列番号：１０にアミノ酸配列からなるヒト部分ＡＳＫ蛋白質とを、大腸菌においてモノシストロニックに発現させるためのコンストラクトを示した。コンストラクトの構築に用いるベクターは、制限されない。具体的には、たとえば、実施例に示したようなｐＧＥＸ−２Ｔなどの市販のベクターのクローニングサイトに、Ｃｄｃ７サブユニットと、ＡＳＫサブユニットをコードするＤＮＡを順次クローニングすることによって、これらをモノシストロニックに発現可能なベクターとすることができる。
このようなベクターコンストラクトを、定法により大腸菌に形質転換し、その培養物から発現産物を回収することにより、目的とするＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質を得ることができる。
発現産物は、塩析、ゲルろ過、あるいはイオン交換クロマトグラフィー等の手法を利用して精製することができる。これらの遺伝子工学的手法による複合体の製造方法においては、複合体を構成するサブユニットのいずれか、あるいは両方に、タグを融合させることができる。サブユニットに結合親和性を有するタグを融合させておき、このタグに対する結合親和性物質を利用したアフィニティクロマトグラフィーによる精製を利用することもできる。結合性のタグとしては、数個のヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、チオレドキシン、マルトース結合タンパク、Ｍｙｃ、Ｘｐｒｅｓｓ、ＦＬＡＧ等を用いることができる。例えば、ＧＳＴを用いれば、発現した蛋白質をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂカラムなどで容易に精製することができる。
本発明の測定方法に用いる基質蛋白質としては、先に述べた本発明によるキナーゼ活性測定用の基質蛋白質を用いることができる。本発明において、被験化合物は、前記のｉ）−ｉｉｉ）に記載のいずれかの順序で、基質蛋白質、およびＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質と接触させられる。
ｉ）被験化合物と基質蛋白質とを接触後にＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質を接触させることによって、被験化合物の基質蛋白質に作用してキナーゼ活性を修飾する作用を見出すことができる。ｉｉ）被験化合物の共存下で、基質蛋白質とＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質を接触させる場合には、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質のキナーゼ活性に対する競合阻害活性を評価することができる。更に、ｉｉｉ）基質蛋白質、およびＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質とを接触後に、被験化合物を接触させることにより、リン酸化された基質蛋白質に対する被験化合物の脱リン酸化作用を検出することができる。
本発明において、基質蛋白質のリン酸化のレベルは、先に述べた本発明のキナーゼ活性の測定方法と同様の方法にしたがって測定することができる。たとえば、基質蛋白質の被リン酸化部位におけるリン酸化の状態を識別する抗体によって、リン酸化のレベルが測定される。
リン酸化のレベルの測定の結果は、被験化合物のＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質のキナーゼ活性に与える影響と関連付けられる。たとえば、被験化合物を接触させない対照と比較してリン酸化のレベルが低下した場合、被験化合物はリン酸化に対して阻害的に作用する活性を有すると結論付けられる。また被験化合物によってリン酸化のレベルが上昇する場合には、当該化合物がＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質のキナーゼ活性を促進する作用を有すると結論付けられる。
リン酸化レベルは、被験化合物を接触させない対照のみならず、キナーゼ活性に対する作用が明らかな化合物の測定結果と比較することもできる。たとえば、キナーゼ活性に対する阻害作用を見出すことを目的とする場合、一定の阻害作用を有することが予め確認されている化合物との比較によって、被験化合物の阻害作用の大きさを評価することもできる。更に、予めキナーゼ活性に対する阻害作用が明らかな物質について上記測定方法を実施しておき、その結果を被験化合物の測定結果と対比させることによって、その作用を定量的に評価することもできる。
本発明による被験化合物のＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体のキナーゼ活性に与える影響の測定方法に基づいて、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体のキナーゼ活性を調節する作用を有する化合物のスクリーニング方法を実施することができる。すなわち本発明は、次の工程を含む、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体のキナーゼ活性を調節する作用を有する化合物のスクリーニング方法に関する。
ａ）前記方法によって、被験化合物のＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体のキナーゼ活性に与える影響を測定する工程、および
ｂ）対照と比較して、リン酸化レベルが高い、または低い被験化合物を選択する工程
本発明のスクリーニング方法において、リン酸化レベルは、被験化合物を接触させない対照のみならず、キナーゼ活性に対する作用が明らかな化合物の測定結果と比較することもできる。たとえば、キナーゼ活性に対する阻害作用を見出すことを目的とする場合、一定の阻害作用を有することが予め確認されている化合物との比較によって、被験化合物の阻害作用の大きさを評価することもできる。比較の結果、より阻害作用の大きな化合物を選択することによって、一定の水準以上の阻害作用を有する化合物をスクリーニングすることができる。
本発明のスクリーニング方法において、被験化合物としては、たとえば天然または合成された蛋白質、ペプチド、抗体、動植物や細菌の細胞抽出物、培養上清、あるいは低分子化合物などを用いることができる。これらの被験化合物は、化合物ライブラリーや、遺伝子ライブラリーから得ることもできる。
天然成分を被験化合物に用いる場合には、当業者に公知の方法（例えば、各種クロマトグラフィー）によりこれらを分画して、それぞれ検出を行うことにより、キナーゼ活性を阻害する単一の化合物を最終的に特定することが可能である。これらスクリーニングにより単離されたキナーゼ活性を阻害もしくは促進する化合物は、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体のキナーゼ活性の活性調整剤として利用することができる。
Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体は、生体内においては細胞増殖におけるキーポイントとなっている。したがって、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体のキナーゼ活性の調節によって、細胞増殖を制御することができる。たとえば、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体のキナーゼ活性を阻害する化合物は、細胞増殖の抑制剤として有用である。より具体的には、本発明のスクリーニング方法によって選択されたＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体に対する阻害作用を有する化合物は、がんのような増殖を抑制すべき細胞の制御に有用である。
本発明のスクリーニング方法では、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体による基質蛋白質のリン酸化を特異的に検出している。その結果、本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物のＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体に対する作用は、より特異的であると言うことができる。このような化合物は、たとえば癌の制御に用いる場合も、増殖段階にある細胞に対して特異的に作用することから、増殖性の細胞に対する選択性の高い薬剤として期待できる。
これらの化合物は、特にがん治療薬の候補化合物として有用である。本発明のスクリーニング法により単離される化合物を、キナーゼ活性の活性調整剤として用いる場合には、公知の製剤学的製造法により製剤化して用いることも可能である。例えば、薬理学上許容される担体または媒体（生理食塩水、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤など）とともに患者に投与される。投与は、化合物の性質に応じて、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、静脈内、または経口的に行われる。投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適宜適当な投与量を選択することが可能である。
加えて本発明は、上記測定方法、またはスクリーニングに用いる、質基質のリン酸化状態を識別することができる抗体を含むキットに関する。本発明のキットは、キナーゼ活性の検出に用いる場合には、前記抗体以外に、例えば基質蛋白質および緩衝液等で構成される。またキナーゼ活性を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニングに用いる場合には、さらにＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質を組み合わせる。基質蛋白質、あるいは前記抗体のいずれかは、上記のような標識を付与することができ、他方を固相化しておくことができる。
キットには、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質の活性や、測定系そのものの検定のために、酵素標品や基質蛋白質標品を組み合わせることができる。これらの標品や、前記抗体には、安定化などのための他の成分を加えることができる。例えば、１％程度のＢＳＡ、および終濃度０．２〜１０％（好ましくは１％）のシュークローズ、フルクトースなどのポリオール類を、標品中に凍結乾燥後の蛋白質変性防止剤として添加することができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。
実施例を構成する汎用されている手法は、全て下記の成書に従って行った。実施例で用いられている実験方法は、様々な成書に紹介されている方法を用いれば良く、何ら制限は無い。
Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
大海忍、辻村邦夫、稲垣昌樹（１９９４）細胞工学別冊 実験プロトコールシリーズ抗ペプチド抗体実験プロトコール 株式会社 秀潤社
右田俊介、紺田進、本庶佑、濱岡利之（１９９５）免疫実験操作法Ｉ・ＩＩ，株式会社 南江堂
（１）ＡＳＫ活性ドメインの特定
本発明者らは、分裂酵母のＨｓｋ１−Ｈｉｍ１／Ｄｆｐ１を材料として、詳細な変異体解析を行った結果、Ｄｂｆ４−ｍｏｔｉｆ−ｍとＤｂｆ４−ｍｏｔｉｆ−Ｃのみあれば、キナーゼ活性化に十分であることを報告している（Ｏｇｉｎｏ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３１３７６−３１３８７，２００１）。分裂酵母のＨｓｋ１−Ｈｉｍ１／Ｄｆｐ１は、ヒトＣｄｃ７−Ｄｂｆ４に相当する複合体である。この事実に基づいて、ヒトＡＳＫにおいてもｍｏｔｉｆ−Ｍとｍｏｔｉｆ−Ｃのみを含む最小ドメインでキナーゼ活性化に十分であろうと予想した。ヒトＡＳＫ、出芽酵母Ｄｂｆ４、および分裂酵母Ｈｉｍ１／Ｃｆｐ１における、ｍｏｔｉｆ−Ｍとｍｏｔｉｆ−Ｃの配置を比較した結果を図１に示す。
具体的には、配列番号：９に示すヒトＡＳＫのアミノ酸配列から、１７３から３４９番目に相当するアミノ酸配列（配列番号：１０）を選択した。この領域をコードするＤＮＡは、ちょうどｉｎｔｒｏｎで分断されている。イントロンの存在箇所は、機能的ドメインあるいは機能的モジュールの切れ目であることが多いと提唱されているため、この領域を選択した。
（２）Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質発現用のベクター
大腸菌において、ヒトＣｄｃ７とＡＳＫの活性ドメインを発現させるために、ＧＳＴ−ＴＡＴ−ＡＳＫ（ｍｉｎｉｍｕｍ）−ＨＡ−ｈｕＣｄｃ７というプラスミドを作製した。まずＧＳＴ−ＴＡＴ−ＡＳＫ融合蛋白質発現ベクターＧＳＴ−ＴＡＴ１１を作製した。その後、ＡＳＫの下流に制限酵素サイト（ＮｏｔＩ）を導入し、このサイトにＨＡ−Ｃｄｃ７を挿入した。そのさい、ＨＡ−Ｃｄｃ７の直前にＲＢＳ（リボソーム結合配列−Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｎｏ配列）を付加した。強力なＲＢＳの付加により、ＧＳＴ−ＴＡＴ−ＡＳＫからＨＡ−Ｃｄｃ７まで一続きで転写され、ひとつの転写産物から２つの蛋白質をともに効率良く翻訳することができた。具体的な操作は次に示すとおりである。
以下の２つのプライマーを用いて、ヒトＡＳＫのｃＤＮＡから１７３から３４９番目のアミノ酸をコードする領域をＰＣＲ法によって増幅した。

得られた増幅生成物を精製し、ＧＳＴ−ＴＡＴ１１ベクターにクローニングした。このベクターには、ＧＳＴ−ＴＡＴ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＡＳＫ−ＥｃｏＲＩの順に各領域が配置されている。ＧＳＴ−ＴＡＴ１１ベクターとしては、ｐＧＥＸ−２Ｔ−Ｔａｔ１１−ＴＫベクターを用いた。このベクターは、１１アミノ酸からなるＴＡＴ配列（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ／配列番号：１３）がＧＳＴベクターに挿入された構造を有している。ＴＫのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩサイトを消化して、別にＰＣＲで増幅しておいたｍｉｎｉｍｕｍ ＡＳＫを挿入することができる。ＨｉｎｄＩＩＩのフレームはＡＡＧ ＣＴＴとなることから、このベクターではＥｃｏＲＩサイトのすぐ下流に３ＦＲＡＭＥで停止コドンに達するため、翻訳はすぐに終了する。
次にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩアダプター（ＡＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣ／配列番号：１４）を用いて、ＧＳＴ−ＴＡＴ−ＨｉｍｄＩＩＩ−ＡＳＫ−ＥｃｏＲＩのＥｃｏＲＩをＮｏｔＩに置換した。続いて、次のプライマーを用いてヒトＣｄｃ７のｃＤＮＡからコード領域の全長を増幅した。

ｈｕＣｄｃ７−ＲＢＳ−Ｎ（ＮｏｔＩ）の塩基配列中、ＲＢＳとＡＴＧに相当する領域を小文字で示した。ＡＴＧ以下の塩基配列でコードされるアミノ酸配列は、ＭＹＰＹＤＶＰＤＹＡＦＳＰＱＲＤ（配列番号：１７）となり、このうちＭＹＰＹＤＶＰＤがＨＡエピトープに相当する。このベクターでは、ＨＡタグに続いてヒトＣｄｃ７の１４番目以降のアミノ酸配列を連結したアミノ酸配列からなる蛋白質が発現される。先に述べたように強力なＲＢＳを付加したため、２つの遺伝子はともに翻訳される。
なお、Ｃｄｃ７については野生型とキナーゼ失活型を作製した。キナーゼ失活型はＫ９０Ｅと呼ばれる、９０番目のアミノ酸リジン（Ｋ）をグルタミン酸（Ｅ）に変異させたアミノ酸配列をからなる。
（３）細菌におけるＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質の発現と精製
（２）で構築したベクターＧＳＴ−ＴＡＴ−ＡＳＫ（ｍｉｎｉｍｕｍ）−ＨＡ−ｈｕＣｄｃ７を、大腸菌Ｃ６００ｌｏｎ−に常法により形質転換した。Ｃ６００ｌｏｎ−は、大腸菌の主要なプロテアーゼであるｌｏｎを欠損した大腸菌株である。
形質転換した大腸菌は、４０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地２００ｍｌに接種し、３７℃で培養した。培養液のＯＤ６００が０．５になったところで、ＩＰＴＧを１ｍＭになるように添加し、さらに３時間培養した。菌を遠心で回収し、洗浄後、２０ｍｌのｂｕｆｆｅｒＡ（４０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ［ｐＨ７．６］１ｍＭ ＥＤＴＡ，４０ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｇｌｕｔａｍａｔｅ，１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１ｍＭ ＤＴＴ）に懸濁した。超音波処理で細胞を破壊した後、遠心で可溶性画分と沈澱（不溶性画分）に分画した。可溶性画分に１ｍｌのｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂを添加した。４℃で１時間かくはんした後、遠心によってｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂを回収し、簡易カラムに詰めてｂｕｆｆｅｒＡでよく洗浄した。カラムボルームの２０倍量以上のｂｕｆｆｅｒＡを用い、溶出液のＯＤ２８０が０．０１以下になるまで洗浄した。その後、２０ｍＭ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅを含有するｂｕｆｆｅｒＡ、引き続いて５０ｍＭ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅを含有するｂｕｆｆｅｒ Ａで溶出した。
最終的に溶出された画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後に銀染色したところ、ＧＳＴ−ＡＳＫ（約５０ｋＤａ）および、ＨＡ−Ｃｄｃ７（約６５ｋＤａ）が精製されていることが確認された。
（４）細菌によるＭＣＭ２（１−１３０）の発現と精製
Ｊｕｒｋａｔ ｃｅｌｌから、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーンＣａｔ Ｎｏ．３１１−０２５０１）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、Ｙｏｕ−Ｐｒｉｍｅ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｂｅａｄｓ（アマシャムファルマシア社Ｃａｔ Ｎｏ．２７−９２６４−０１）を用いてｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡを鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ベーリンガーマンハイム社Ｃａ Ｎｏ．１７３２−６５０）と下記のプライマーを用いてヒトＭｃｍ２（１−１３０）のｃＤＮＡを増幅した。得られた３９０ｂｐのＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化後、大腸菌の発現ベクターであるｐＧＥＸ−４Ｔ−１（アマシャムファルマシア社）のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩサイトにクローニングした。塩基配列を決定し、得られたｃＤＮＡの配列がヒトＭＣＭ２（１−１３０）であることを確認した。ＰＣＲに使用したプライマーを以下に示す。

ＭＣＭ２（１−１３０）／ｐＧＥＸ−４Ｔ−１を大腸菌ＤＨ５ａに、形質転換した。その大腸菌を３０℃で約５時間培養した後、吸光度（６００ｎｍ）が０．８になったところで培養温度を２０℃に下げ、終濃度が０．２ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、２０℃、１６時間培養後、集菌した。集めた大腸菌は、氷冷の可溶化緩衝液（ＰＢＳ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００，１ｍＭ ＰＭＳＦ）でけん濁し、氷中で超音波破砕機を用いて溶解した。溶解した粗抽出液を高速遠心機で１５０００回転３０分間遠心して、可溶性画分と不溶性画分とを分離した。それぞれをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行ってＧＳＴ−ｆｕｓｉｏｎ Ｍｃｍ２（１−１３０）が可溶性画分にあることを確認した。２ｍｌのＧＳＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（アマシャムファルマシア）充填したカラムに可溶性画分を添加した後、洗浄液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．９，０．５Ｍ ＮａＣｌ，５ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）５０ｍｌで洗浄し、溶出液（１０ｍＭ Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，５０ｍｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．６）で２ｍｌずつ１０本溶出した。吸光度（Ａ２８０ｎｍ）を測定し０．１以上を集めて氷冷のＰＢＳに一晩透析した。透析した蛋白は、抗ＭＣＭ２特異抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇにより、ＧＳＴ−ｆｕｓｉｏｎ ＭＣＭ２（１−１３０）であることを確認した。
（５）ＭＣＭ２の被リン酸化部位の特定
まずヒト、マウス、カエル、ショウジョウバエ、分裂酵母、出芽酵母などの、ＭＣＭ２の一次構造をアラインし、保存されているセリン、スレオニン残基を同定した。機能的に重要なリン酸化部位は種を越えて保存されているだろうという仮定に基づいている。これらの保存セリン、スレオニン残基が比較的クラスターを形成して数多く存在する部を８ケ所（Ｆ１，Ｆ２，Ｆ３，Ｆ４，Ｆ５，Ｆ６ ＮＦ１，ＮＦ２）選定した。
各領域について、それぞれの部位で４−７残基のセリン、スレオニン残基をアラニンあるいは、グルタミン酸に置換した変異ＭＣＭ２を作製した。変異体の作製は、オリゴヌクレオチドを用いた方法によった。これを、昆虫細胞発現ベクターＵＷ３１上にクローン化した。ＵＷ３１は２種類の遺伝子産物を同時に発現することが可能なベクターであり、ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇのついたＭＣＭ７とともに、各種変異ＭＣＭ２を共発現する組み換えウィルス溶液を得た。Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇのＭＣＭ４とＭＣＭ６を共発現する組み換えウィルス溶液とともに、昆虫細胞Ｓｆ９に共感染し、細胞抽出液を作製した。これから、ニッケルカラムによりＭＣＭ２−４−６−７複合体のａｆｆｉｎｉｔｙ精製をおこなった。
目的のＭＣＭ２−４−６−７複合体が溶出している画分をプールした。次にｍｏｎｏＱカラム（ＰｈａｒｍａｃｉａのＳＭＡＲＴシステムを使用）によりさらに、ＭＣＭ２−４−６−７複合体を精製した。０．３−０．３５Ｍ ＮａＣｌに溶出されるピーク画分をプールし、透析し塩濃度を低下させてから、ｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化反応の基質として使用した。
また、同時に、これらの保存部位の一部を含むポリペプチドをｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇあるいはＧＳＴ−ｔａｇ付きで作製し、大腸菌で発現し、精製した。これらの作製は、制限酵素サイトを付加したプライマーオリゴヌクレオチドで目的のコード領域を増幅し、ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇ発現ベクター（ｐＴ７−７／ｐＱＥ３０）あるいは、ＧＳＴ−ｆｕｓｉｏｎ発現ベクター（ｐＧＥＸ−５Ｘ−３）にクローン化した。野生型およびアラニン置換変異体を発現した。これらの発現ベクターをＤＥ３あるいは、Ｃ６００ｌｏｎ−株にそれぞれ導入し、発現誘導し、ニッケルカラムあるいはｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓカラムでａｆｆｉｎｉｔｙ精製をおこなった。これらの蛋白質もｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化反応の基質として使用した。
変異体ＭＣＭ２を含むＭＣＭ２−４−６−７蛋白質複合体を基質として用いた場合には、どの変異体においても、リン酸化が完全に消失することはなかった。そこで、リン酸化された野生型および変異体ＭＣＭ２をトリプシン消化の後、２次元クロマトグラフィーにより展開し、スポットが消失するかどうかを解析し、リン酸化部位を限定した。
また、ＭＣＭ２はｉｎ ｖｉｖｏにおいてもｉｎ ｖｉｔｒｏにおいても、Ｃｄｃ７によりリン酸化される結果ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で移動度が下方にシフトする。この現象を指標として、シフトが消失する変異体の同定を試みた。
これらの結果から、ＭＣＭ２のＮ端のＣｄｋおよびＣｄｃ７によるリン酸化部位（Ｓ２７／Ｓ４１およびＳ２６／Ｓ４０）があることを同定した。さらにこのリン酸化が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でシフトの原因となっていることを明らかにした。マウスＭＣＭ２の２６位のセリン残基（Ｓ２６）に相当するヒトＭＣＭ２の１７位のセリン残基（Ｓ１７）は、Ｎ末端１３０アミノ酸ポリペプチドを基質にした場合に効率よくＣｄｃ７によりリン酸化されることが明らかとなった。この結果に基づいて、ヒトＭＣＭ２のＮ末端１３０アミノ酸（配列番号：１）からなる蛋白質を、後述のＥＬＩＳＡ測定法のための基質蛋白質として使用することにした。
（６）抗リン酸化ペプチド抗体の作製
Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体はヒトＭｃｍ２の１７番目のセリン残基を特異的にリン酸化することが明らかになったので、次に１７番目のセリン残基のリン酸化を検出するための道具として、リン酸化された１７番目のセリン残基を特異的に認識する抗リン酸化特異抗体を作製した。
被リン酸化部位として確定したヒトＭＣＭ２タンパク質の１７番目のセリン残基を含む、１０番目から２０番目までのアミノ酸配列に相当する以下の２本のペプチドをペプチド合成機を用いて作製した。
リン酸化ペプチド（Ｍｃｍ２−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ１７と記す）：ＣＲＧＮＤＰＬＴＳ（ｐ）Ｓ（配列番号：２０）
非リン酸化ペプチド（Ｍｃｍ２−Ｓ１７と記す）：ＣＲＧＮＤＰＬＴＳＳ（配列番号：２１）
上記のペプチド配列は、一文字表記で、アミノ末端からカルボキシル末端方向に記されている。Ｓ（ｐ）は、リン酸化セリン残基を示す。アミノ末端のシステイン（Ｃ）残基は、ペプチドをキャリアータンパク質に共有結合させるために導入したものである。これらのペプチドは、ＨＰＬＣにより、９５％以上の純度であることを確認した。リン酸化ペプチドは免疫原に用い、抗体力価の測定及び抗体精製にリン酸化ペプチドと非リン酸化ペプチドを用いた。
合成した短いペプチド単独では抗原性が低いので、通常ペプチドをキャリアータンパク質に結合させて動物に免疫する。キャリアータンパク質としては、アルブミン、ミオグロビン、ヘモシアニン等が用いられるが、今回はヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ，以下ＫＬＨ、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）を用いた。成書に従いｐｈｏｓｐｈｏ−Ｈｓ−Ｓ８３とＫＬＨを架橋剤であるＭＢＳ（ｍ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ，ＳＩＧＭＡ社製）を用いて共有結合させ、ＫＬＨ−Ｍｃｍ２−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ１７を合成した。
ＫＬＨ−Ｍｃｍ２−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ１７ ２０μｇ／１００μｌおよび１０μｇ／１００μｌをそれぞれウサギおよびマウスの１回あたりの免疫に用いた。これに１００μｌのフロイト完全アジュバント（ヤトロン社製）を加え、エマルジョン化し免疫原とした。ウサギの背部への皮下注射にて免疫を行った。免疫は２週間ごと３回から５回行い、耳朶静脈から採血後その血清を回収した。抗体力価は、Ｍｃｍ２−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ１７とＭｃｍ２−Ｓ１７を固相化したマイクロタイタープレートを用いたＥＬＩＳＡ法で測定した。
十分な抗体力価の確認の後、翌週より、採血（最初の１週間）、休息（次の１週間）、免疫（最後の１週間）を１サイクルとし、これを４回繰り返した。採血は、抗体力価の確認の際と同様に、耳朶静脈より行った。１回の採血あたり、およそ６０〜７０ｍｌの血液を採取した。最後の採血では、カテーテルを用いて心臓より直接血液を回収した。
採取した血液は、４℃で一晩静置し、血清と血餅に分離させ、上澄み部分の血清を回収した。分離回収した血清に、終濃度５０％となるように、硫酸アンモニウムを添加し攪拌後、遠心分離を行い、ＩｇＧ分画を含む沈澱物に最小限のＰＢＳを加え完全に溶解した後、ＰＢＳに対して透析を行った。完全にＰＢＳに平衡化した後、この粗精製抗体分画をカラムにかけて、抗体を精製した。
特異化カラム作製には、Ｍｃｍ２−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ１７合成ペプチドを用い、吸収用カラム作製には、Ｍｃｍ２−Ｓ１７合成ペプチドを用いた。合成ペプチド１ｍｇを５ｍｌの０．１Ｍ炭酸緩衝液に溶解し、１ｍＭ塩酸で平衡化したＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）を加えた。４℃で一晩穏やかに混和し、これをカラムに充填した。５〜１０倍量のＰＢＳでカラムを洗浄後、セファロース４Ｂ表面に残っている活性基をブロッキングするために１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した。ブロッキング後、ＰＢＳで洗浄および平衡化し、抗体精製に使用した。
抗リン酸化ペプチド抗体を精製するため、前述の粗精製抗体分画を特異化カラムに通した。ＰＢＳ／０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００で洗浄した後、カラムに吸着している抗リン酸化ペプチド抗体を、０．１７Ｍ ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）で溶出した。溶出した抗体は直ちに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を適量加えて中和し、ＰＢＳに対して透析し、抗Ｍｃｍ２−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ１７抗体分画とした。完全にＰＢＳに平衡化させた後、これを吸収用カラムであるＭｃｍ２−Ｓ１７セファロース４Ｂカラムに通した。吸収用カラムに通すことにより、抗Ｍｃｍ２−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ１７抗体画分中に存在する非リン酸化ペプチドとも反応する抗体を取り除くことができる。一方、抗リン酸化ペプチド特異抗体は、カラムに吸着せずに、カラムを素通りする。吸収カラムをＰＢＳ／０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００で洗浄し、吸収用カラムに結合した抗体は、０．１７Ｍ ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）で溶出した。溶出後、カラムは、再びＰＢＳ／０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００で平衡化し、非リン酸化ペプチド抗体がほぼ完全に吸収されるまで、抗Ｍｃｍ２−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ１７抗体分画を吸収用カラムに、繰り返して通した。非リン酸化ペプチド感作プレートを用いたＥＬＩＳＡによって、非リン酸化ペプチドとも反応する抗体が除去できている事を確認した。リン酸化ペプチド感作プレートを用いたＥＬＩＳＡによって、そのリン酸化ペプチドに対する特異性を最終的に確認した。
ペプチドを１μｇ／ｍｌになるように０．１Ｍ炭酸緩衝液に溶かした。これをＥＬＩＳＡ用の９６穴マイクロタイタープレートに、１穴あたり５０μｌずつ分注した。これを４℃で一晩放置し感作した。感作後、ペプチド溶液を除き、ブロッキング溶液（１％ ＢＳＡ，５％ Ｓｕｃｒｏｓｅ，０．１％ ＮａＮ_３／ＰＢＳ）を、１穴あたり２００μｌずつ分注して、室温で１時間程度放置した。ブロッキング液を完全に除去し、ドラフト内で風乾させた（固相化）。
リン酸化ペプチド（Ｍｃｍ２−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ１７）固相化プレートは、それぞれ抗体力価の測定、抗リン酸化セリン残基特異抗体の吸収確認、抗リン酸化ペプチド抗体の特異性の確認に用いた。また、非リン酸化ペプチド（Ｍｃｍ２−Ｓ１７）固相化プレートは、カラムによる非特異抗体の吸収の確認に用いた。
力価検定用の血清は、ＰＢＳを用いて２００倍希釈から、精製抗体は１μｇ／ｍｌから、４倍ずつ段階的に希釈し、希釈したサンプルは、感作プレート１穴あたり５０μｌ添加した。添加後、室温に１時間静置した（１次抗体反応）。反応液を捨て、各穴を、ＰＢＳで４回以上洗浄した。Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）で標識された抗ウサギ免疫グロブリン抗体（２次抗体）をＰＢＳで適当に希釈し、これを各ウェルに５０μｌずつ添加し、室温で３０〜６０分間反応させた（２次抗体反応）。２次抗体はａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ−ｃｈａｉｎ）ｃｏｎｊ．Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＭＢＬ社製）を用いた。２次抗体反応液を捨て、各穴を、ＰＢＳで４回以上洗浄した。発色基質（７５０μＭ ＴＭＢ，Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）溶液を１穴あたり５０μｌ添加し、３０℃で５〜２０分間発色させた（発色反応）。反応停止液（１．５Ｎ Ｈ_３ＰＯ_４）を５０μｌずつ加えて、発色反応を停止させた。最後に、マイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
抗Ｍｃｍ２−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ１７抗体を、それぞれ４μｇ／ｍｌ（抗体）から４倍ずつ段階的に希釈し、リン酸化ペプチド（Ｍｃｍ２−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ１７）固相化プレートと非リン酸化ペプチド（Ｍｃｍ２−Ｓ１７）固相化プレートを用いて、ＥＬＩＳＡ法にて特異性を確認した。
図２は抗Ｍｃｍ２−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ１７ポリクローナル抗体の特異性を確認した結果である。この結果、抗体濃度が高くなるに従い、Ｍｃｍ２−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ１７リン酸化ペプチド固相化プレートでは吸光度が高くなる一方で、Ｍｃｍ２−Ｓ１７非リン酸化ペプチド固相化プレートでは吸光度がほぼゼロを維持していることがわかる。したがって、当抗体はヒトの１７番目のセリン残基のリン酸化を特異的に認識する抗体であることが証明された。
（７）Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体リン酸化酵素活性測定用ＥＬＩＳＡ系の構築
９６穴マイクロタイータープレート内でＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体リン酸化酵素活性を測定するために、用いる基質となるヒトの１７番目のセリン残基を含む領域の選択を行った。具体的には放射性同位元素を用いたリン酸化アッセイにおいてＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体の良い基質となることが分かったヒトＭＣＭ２の１−１３０番目までおよび１−８０番目のアミノ酸領域のＧＳＴ融合タンパク質と、１０番目から２０番目までのアミノ酸配列に相当する非リン酸化ペプチド（Ｍｃｍ２−Ｓ１７）を基質として検討した。
０．１Ｍ炭酸緩衝液を用いてＧＳＴ−Ｍｃｍ２（１−１３０ａａ）およびＧＳＴ−Ｍｃｍ２（１−８０ａａ）を５μｇ／ｍｌに希釈し、ＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレートに、１穴あたり５０μｌずつ分注して、４℃にて一晩感作した。感作溶液を除き、ブロッキング溶液（１％ ＢＳＡ，５％ Ｓｕｃｒｏｓｅ，０．１％ ＮａＮ_３／ＰＢＳ）を、１穴あたり２００μｌずつ分注して、室温で１時間程度放置した。ブロッキング溶液を完全に除去し、ドラフト内で風乾させ、使用まで４℃で保存した。この操作によりマイクロタイタープレートの内壁にＧＳＴ−Ｍｃｍ２（１−１３０ａａ）およびＧＳＴ−Ｍｃｍ２（１−８０ａａ）を固相化した。
リコンビナントタンパク質ＧＳＴ−Ｍｃｍ２（１−１３０ａａ）、ＧＳＴ−Ｍｃｍ２（１−８０ａａ）あるいは非リン酸化ペプチド（Ｍｃｍ２−Ｓ１７）を固相化したウェル中において、タンパク質リン酸化反応を行う。その後、同じウェル中で、連続してＥＬＩＳＡを行う。
１倍（ｘ１）から２倍ずつ６４倍まで希釈したリコンビナントＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体希釈系列をリン酸化緩衝液を用いて調整した。これを５０μｌずつ固相化プレートのウェル中に添加した（タンパク質リン酸化反応）。３０℃で一定時間保温した後、リン酸化反応液を捨て、各ウェルをＰＢＳで４回以上十分に洗浄した。１μｇ／ｍｌとなるように、抗体希釈液（１％ ＢＳＡ，０．１％ ＮａＮ_３／ＰＢＳ）で希釈した一次抗体、すなわち抗Ｍｃｍ２−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ１７ポリクローナル抗体を、各ウェルに５０μｌずつ添加して、室温で３０〜６０分間反応させた（１次抗体反応）。１次抗体反応液を捨て、各ウェルをＰＢＳで４回以上十分に洗浄した。Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）で標識された抗ウサギ免疫グロブリン抗体（２次抗体、ＭＢＬ社）をＰＢＳで１０００倍に希釈し、これを各ウェルに５０μｌずつ添加し、室温で３０〜６０分間反応させた（２次抗体反応）。２次抗体反応液を捨て、各ウェルを、ＰＢＳで４回以上洗浄した。発色基質溶液を１ウェルあたり５０μｌ添加し５〜２０分間発色させた（発色反応）。反応停止液を５０μｌずつ加えて、発色反応を停止させ、マイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果を図３に示した。この結果より、本発明で提供される、抗リン酸化ペプチド抗体を用いたＥＬＩＳＡ法によって、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質のタンパク質リン酸化酵素活性を測定できることが明らかになった。このリン酸化酵素活性測定系に用いる基質は、リコンビナントタンパク質ＧＳＴ−Ｍｃｍ２（１−１３０ａａ）が最も好ましいことが明らかになった。非リン酸化ペプチド（Ｍｃｍ２−Ｓ１７）がこの活性測定系に利用できない原因としてはリン酸化部位を含む領域が短く、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体が標的とする１７番目のセリン残基を認識することが難しい事が予想される。また同様な考察を行うことによって、ＧＳＴ−Ｍｃｍ２（１０−２０ａａ）も本測定系における基質の１つとして提供することも可能と考えられる。
上記のＧＳＴ−Ｍｃｍ２（１−１３０ａａ）と抗Ｍｃｍ２−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ１７ポリクローナル抗体を用いるＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体の活性測定方法において、リン酸化反応液中に添加するＡＴＰの終濃度を１μＭから２ｍＭまで変化させたときの反応性の変化を調べた結果を図４に示す。酵素活性は２ｍＭにおける反応性を１００とする相対的活性値（％）で示した。０．１ｍＭでは９０％の活性を示し、１ｍＭにおいてほぼ反応はプラトーに達している。低濃度のＡＴＰ存在下においても、最大活性値の３０％以上の活性を示すものの、明らかに、ＡＴＰ依存的な反応性を示した。
Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体の活性測定方法において、リン酸化反応時間を０から１５０分間まで変化させたときの反応性の変化を調べた結果を図５に示す。反応時間依存的な吸光度の上昇が見られ、９０分間においてほぼ反応はプラトーに達している。
本測定系において、他のリン酸化酵素を用いた場合の検討を行った。ＧＳＴ−Ｍｃｍ２（１−１３０ａａ）感作プレートと抗Ｍｃｍ２−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ１７ポリクローナル抗体を用いた。酵素には前述のＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体（野生型、ＷＴ）、非活性型Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体（ＫＤ）を用い、それぞれの希釈系列にて活性測定を行った。
結果を図６に示す。Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体ＷＴは酵素を４倍まで希釈するに従い、吸光度すなわち１７番目のセリン残基のリン酸化が低下することが観察された。これはリン酸化酵素活性が存在しないＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体ＫＤでは観察されなかった。以上の事より、本測定系においてＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体特異的なリン酸化活性の測定が可能であることが証明された。
ラジオフィルターアッセイは、酸不溶性画分への放射性同位元素［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰの取り込みを利用して、基質に対するリン酸化を検出する方法であり、リン酸化活性を測定する場合に頻用される。この方法と本発明で提供されるＥＬＩＳＡ測定系における感度を比較した。
１μｇのリコンビナントタンパク質ＧＳＴ−Ｍｃｍ２（１−１３０ａａ）に、１倍（ｘ１）から２倍ずつ６４倍まで希釈したリコンビナントＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体希釈系列をリン酸化緩衝液を用いて調整し、全量を５０μｌにした。３０℃で一定時間保温した後、１ｍｌの１０％トリクロロ酢酸、０．２％ Ｎａ_４Ｐ_２Ｏ_７を加え反応を停止させた。この酸不溶性画分をＧＦＣフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ社製）にトラップし、２％トリクロロ酢酸、０．０２％ Ｎａ_４Ｐ_２Ｏ_７を用いて３回洗浄した。基質に取りこまれた［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰのカウントを液体シンチレーションカウンターで測定した。
結果を図７に示す。それぞれ１倍のＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体酵素濃度における、ラジオフィルターアッセイではカウント（ｃｐｍ）をＥＬＩＳＡでは吸光度を１００％として相対値（％）にて示した結果である。ＥＬＩＳＡ法による測定においては、ｘ８まで１００％であることより、放射性同位元素［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰを用いた測定系と比較して、約１／８の酵素量で測定できることが示された。またＥＬＩＳＡ法で用いる基質の量は１ウェルに計算上０．２５μｇであるのに対し、ラジオフィルターアッセイでは約４倍量の１μｇ必要とする点、また酵素量ゼロにおけるバックグランドがＥＬＩＳＡ法ではほとんど存在しない事からも、放射性同位元素を使用せずに測定できる利点以上に、感度も高く、かつ用いる基質と酵素も少なくでき、本発明で提供されるＥＬＩＳＡ測定系がいかに優れているかが証明された。
リン酸化酵素の阻害剤として知られるＫ−２５２ａ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）およびｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅは、ＣａＭキナーゼＩＩやプロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、プロテインキナーゼＧなど、様々なリン酸化酵素の阻害剤として知られている。Ｋ−２５２ａとｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅをを用いて、本発明で提供されるＥＬＩＳＡ系にて検討した。それぞれの希釈系列を調製し、これとリン酸化アッセイ緩衝液で調製したＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体とを混合し、全量を５０μｌにした。これをＧＳＴ−Ｍｃｍ２（１−１３０ａａ）を固相化したウェルに添加し、前述の方法でＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体リン酸化活性をＥＬＩＳＡ法にて検討した。
結果を図８に示す。図８は、阻害剤を加えない場合の活性値を１００とする相対的阻害値（％）で示した。各阻害剤のＫ−２５２ａとｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅは特異性の低いキナーゼの阻害剤であることから、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体によるリン酸化活性を濃度依存的に抑制する結果が得られた。ＩＣ５０は両者とも２μＭであった。一方、Ｒｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅ、Ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ、およびＵ０１２６では、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体に対する濃度依存的な阻害作用が観察されなかった。Ｒｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅ、およびＯｌｏｍｏｕｃｉｎｅは、ｃｄｋ２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒである。またＵ０１２６はＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒである。これらのキナーゼ阻害剤はＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体の活性を阻害しないことを示している。このことから、実際にＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体のリン酸化活性阻害剤の薬剤スクリーニングにも有効であることが示された。
産業上の利用の可能性
本発明によって、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体による基質蛋白質であるＭＣＭ２のリン酸化機構が明らかにされた。この知見に基づいて、基質蛋白質のＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体によるリン酸化を、より特異的に評価することが可能となった。つまり、本発明のリン酸化作用の測定方法は、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体のリン酸化作用を、特異的に評価しうる方法として有用である。たとえば増殖の盛んな癌細胞におけるＣｄｃ７−ＡＳＫのキナーゼ活性が亢進していることが明らかにされている（Ｇｅｎｅ １９９８ Ａｐｒ ２８；２１１（１）：１３３−４０ Ａ ｈｕｍａｎ ｈｏｍｏｌｏｇ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ＣＤＣ７ ｇｅｎｅ ｉｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｓｏｍｅ ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｈｅｓｓ ＧＦ，Ｄｒｏｎｇ ＲＦ，Ｗｅｉｌａｎｄ ＫＬ，Ｓｌｉｇｈｔｏｍ ＪＬ，Ｓｃｌａｆａｎｉ ＲＡ，Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ ＲＥ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｊｏｈｎ，Ｉｎｃ．，３０１ Ｈｅｎｒｉｅｔｔａ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩ ４９００１，ＵＳＡ．）。したがって、ある癌細胞の増殖能を、Ｃｄｃ７−ＡＳＫのキナーゼ活性に基づいて予測することができる。また本発明者らも多くのヒト癌細胞パネルでＣｄｃ７の発現量を正常細胞と比較し、ほとんどの培養癌細胞（繊維芽細胞系もリンホイド系も）でＣｄｃ７がきわめて強く発現されていることを確認した。したがって、本発明の方法によって評価することができるＣｄｃ７−ＡＳＫのキナーゼ活性は、癌化のマーカーとして有用である。本発明によれば、Ｃｄｃ７−ＡＳＫのキナーゼ活性を特異的に評価することができる。したがって、癌細胞の増殖能をより特異的に評価することができる。
更に本発明は、上記測定方法を応用した、被験化合物のＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体のリン酸化作用に与える影響を評価する方法と、この評価方法に基づくスクリーニング方法を実現した。
本発明のＣｄｃ７−ＡＳＫキナーゼ活性の測定方法、あるいはその活性を調節する化合物のスクリーニング方法は、Ｃｄｃ７−ＡＳＫを標的とした癌に対する創薬の開発や治療方法の開発に有用である。Ｃｄｃ７−ＡＳＫを標的とすることは、公知の細胞内キナーゼ（Ｃｄｋ−Ｃｙｃｌｉｎなど）や蛋白質を標的とすることに比べて次のような利点を有する。
第一に、Ｃｄｃ７−ＡＳＫを標的とすることにより、より確実な活性の制御を期待することができる。Ｃｄｋ−Ｃｙｃｌｉｎが多くの類似遺伝子によってファミリーを構成していることに比べて、Ｃｄｃ７−ＡＳＫはより限られた構造の分子で構成されている。したがって、Ｃｄｃ７−ＡＳＫを標的とすることで、その活性を確実に制御することができる。
第二に、Ｃｄｃ７−ＡＳＫを標的とすることにより、細胞増殖を特異的に制御することができる。Ｃｄｃ７−ＡＳＫはＳ期の開始と進行に必要な因子である。その活性の喪失は直ちにＳ期進行の停止に至り、細胞の増殖が停止する。さらに遺伝子操作を施したマウスを用いた実験から、Ｓ期、すなわちＤＮＡの複製の停止はＤＮＡ上に異常な構造を蓄積し、それはＤＮＡ損傷として感知されてｐ５３の誘導、さらには細胞死が誘導される可能性が示唆されている。つまり、Ｃｄｃ７−ＡＳＫの活性阻害により、癌細胞のＳ期進行を効果的にブロックし、さらに細胞死を誘導することにより効率よく癌細胞を除去できる可能性がある。
第三に、Ｃｄｃ７−ＡＳＫを標的とすることにより、まったく新しい細胞増殖の阻害剤の発見が期待される。Ｃｄｃ７−ＡＳＫのキナーゼとしての構造は、キナーゼファミリーのなかでもユニークである。またＡＳＫの構造もこれまで多くの研究がされてきたＣｙｃｌｉｎ分子とは異なっており、キナーゼ活性化についてもこれまで知られていない新規の機構によるものと予測される。したがって、Ｃｄｃ７−ＡＳＫを標的とした活性阻害物質の探索により、これまでの種々のキナーゼに対するスクリーニングでは見出されなかった全く新規な物質が見出される可能性が高い。このことは、たとえば制がん剤の研究開発において、新たなリード化合物の発見につながる可能性があることを意味している。
そして第四に、Ｃｄｃ７−ＡＳＫを標的とすることにより、細胞死への誘導が期待できる。予期しないＤＮＡ複製の停止に対して細胞はＡＴＭ、Ｃｈｋ１、Ｃｄｓ１などのいわゆるチェックポイントキナーゼを活性化し、細胞周期進行の遅延などを引き起こして対処する。Ｃｄｃ７−ＡＳＫの阻害物質と共に、これらのチェックポイントキナーゼに対する阻害物質も併用すれば、Ｃｄｃ７−ＡＳＫの活性阻害によって引き起こされる、Ｓ期進行阻害による細胞死への誘導を増強できることが期待される。
このように、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体は、細胞周期において細胞増殖の初期の段階において重要な役割を果たしている。しかも、そのリン酸化活性は、がん細胞の増殖能と比例している。つまり、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体の活性の制御によって、がん細胞の増殖をより特異的に制御することができる。したがって、本発明のスクリーニング方法は、がん細胞の増殖を特異的に制御しうる化合物を得る方法として有用である。
更に本発明のスクリーニング方法は、被験化合物のＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体のリン酸化作用に与える影響を、より特異的に評価することができる。その結果、がんに対してより特異的に作用する化合物を選択することができる。
本発明はまた、上記の各種の方法に必要な、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質の調製方法を提供した。本発明の方法によれば、原核細胞を利用して、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体と同様の活性を有する複合体を、容易に、かつ多量に調製することができる。
また発明は、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体によってリン酸化される基質蛋白質を提供する。本発明の基質蛋白質は、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体（あるいはＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質）による被リン酸化に必要な構造を有する蛋白質である。このような基質蛋白質の利用により、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体のリン酸化作用をより特異的に評価することができる。本発明に基づいて調製されたＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質や基質蛋白質は、上記方法に有用である。
加えて本発明は、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体あるいはＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質によってリン酸化された基質蛋白質の、リン酸化レベルを識別する抗体を提供した。本発明の抗体は、基質蛋白質の特定の部位におけるリン酸化のレベルを識別する。この抗体によって、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体あるいはＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質のリン酸化作用を、より特異的に評価することが可能となる。また、本発明の抗体の利用によって、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体あるいはＣｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質のリン酸化作用を、イムノアッセイの原理に基づいて容易に評価することができる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、ヒトＡＳＫ、出芽酵母Ｄｂｆ４、および分裂酵母Ｈｉｍ１／Ｃｆｐ１における、ｍｏｔｉｆ−Ｍとｍｏｔｉｆ−Ｃの配置を示した。
図２は、抗Ｍｃｍ２−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ１７ポリクローナル抗体の特異性を確認した結果を示す。図中、縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度を、横軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
図３は、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体活性物質の蛋白質リン酸化酵素活性を測定した結果を示す。図中、縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度を、横軸は酵素量（μＬ）を示す。
図４は、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体の活性測定方法において、リン酸化反応液中に添加するＡＴＰの濃度を変化させたときの反応性の変化を調べた結果を示す。図中、縦軸は２ｍＭにおける反応性を１００とする相対的活性値（％）を、横軸は反応液中のＡＴＰの終濃度（ｍＭ）を示す。
図５は、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体の活性測定方法において、リン酸化反応時間を変化させたときの反応性の変化を調べた結果を示す。図中、縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度を、横軸は反応時間（分）を示す。
図６は、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体（野生型、ＷＴ）、および非活性型Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体（ＫＤ）を用いた、ＥＬＩＳＡによるリン酸化酵素活性の測定方法の評価結果を示す図。図中、縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度を、横軸は酵素量（μＬ）を示す。
図７は、ラジオフィルターアッセイとＥＬＩＳＡ法による、リン酸化酵素活性の測定結果を示す図。図中、縦軸／左はＥＬＩＳＡにおける測定結果（４５０ｎｍにおける吸光度）を、縦軸／右はラジオフィルターアッセイにおける測定結果（放射活性；ｃｐｍ）を、また横軸は酵素量（μＬ）を示す。
図８は、既知のタンパク質リン酸化阻害剤の、Ｃｄｃ７−ＡＳＫ複合体リン酸化活性への影響の測定結果を示す図。図中、縦軸は相対的阻害値（％）、横軸は阻害剤の濃度（μＭ）を示す。

Claims (13)

1. 次の工程を含む、Cdc7-ASK複合体のキナーゼ活性の測定方法。
   a)基質蛋白質を、基質蛋白質のリン酸化が可能な条件下でCdc7-ASK複合体と接触させる工程、；ただし基質蛋白質は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質であり、 ASK は、配列番号：１０に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質または該配列と９０％以上の配列同一性を有し Cdc7 と複合体を構成してキナーゼ活性を発現する蛋白質であり、該複合体はタグと融合していてもよい、
   b)基質蛋白質の、配列番号：１に示すアミノ酸配列において１７位のセリン残基におけるリン酸化のレベルを測定する工程、および
   c)前記リン酸化のレベルを指標としてCdc7-ASK複合体のキナーゼ活性を測定する工程
2. リン酸化のレベルを、前記セリン残基におけるリン酸化のレベルを識別する抗体の結合のレベルに基づいて測定する請求項１に記載の方法。
3. Cdc7-ASK複合体が、生体試料に由来する請求項１に記載の方法。
4. 次の工程を含む、被験化合物のCdc7-ASK複合体のキナーゼ活性に与える影響の測定方法。
   a)被験化合物、基質蛋白質、およびCdc7-ASK複合体を、次のi)〜iii)のいずれかに記載の順序で接触させる工程、；ただし基質蛋白質は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質であり、 ASK は、配列番号：１０に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質または該配列と９０％以上の配列同一性を有し Cdc7 と複合体を構成してキナーゼ活性を発現する蛋白質であり、該複合体はタグと融合していてもよい、
   i)被験化合物と基質蛋白質とを接触後にCdc7-ASK複合体を接触させる
   ii)被験化合物の共存下で、基質蛋白質とCdc7-ASK複合体を接触させる、
   iii) 基質蛋白質、およびCdc7-ASK複合体を接触後に、被験化合物を接触させる
   b)基質蛋白質の、配列番号：１に示すアミノ酸配列において１７位のセリン残基におけるリン酸化のレベルを測定する工程、および
   c)前記リン酸化のレベルを指標として、被験化合物のCdc7-ASK複合体のキナーゼ活性に与える影響を測定する工程
5. 次の工程を含む、Cdc7-ASK複合体のキナーゼ活性を調節する作用を有する化合物のスクリーニング方法。
   a)請求項４に記載の方法によって、被験化合物のCdc7-ASK複合体のキナーゼ活性に与える影響を測定する工程、および
   b)被験化合物を接触させない対照と比較して、リン酸化レベルが高い、または低い被験化合物を選択する工程
6. 請求項５のb)において、リン酸化レベルが低い化合物を選択する、請求項５に記載のスクリーニング方法。
7. Cdc7-ASK 複合体が、原核細胞において
   ヒト Cdc7 蛋白質をコードする DNA と、配列番号：１０に記載のアミノ酸配列からなる 蛋白質をコードする DNA とを、
   共発現させ製造されたものである、請求項４または５に記載の方法。
8. Cdc7-ASK 複合体が、次の工程を含み、製造されたものである、請求項７に記載の方法。
   ａ）ヒト Cdc7 蛋白質をコードする DNA と、配列番号：１０ に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする DNA とを
   モノシストロニックに発現可能な状態で原核細胞に導入する工程、
   ｂ）前記２つの DNA を発現させる工程、および
   ｃ）発現された蛋白質を回収する工程
9. 次の要素を含む、Cdc7-ASK複合体のキナーゼ活性測定用キット。
   a) 配列番号：１に記載のアミノ酸配列の１７位のセリン残基を含み、かつ当該アミノ酸配列から選択された連続するアミノ酸配列を有する基質蛋白質、および
   b) 基質蛋白質の、配列番号：１に示すアミノ酸配列において１７位のセリン残基におけるリン酸化のレベルを識別する抗体
10. 次の要素を含む、被験化合物のCdc7-ASK複合体のキナーゼ活性に与える影響を評価するためのキット。
    a) Cdc7-ASK複合体、および
    b) 配列番号：１に記載のアミノ酸配列の１７位のセリン残基を含み、かつ当該アミノ酸配列から選択された連続するアミノ酸配列を有する基質蛋白質
11. Cdc7-ASK 複合体が、原核細胞において
    ヒト Cdc7 蛋白質をコードする DNA と、配列番号：１０に記載のアミノ酸配列からなる 蛋白質をコードする DNA とを、
    共発現させ製造されたものである、請求項１０に記載のキット。
12. Cdc7-ASK 複合体が、次の工程を含み、製造されたものである、請求項１１に記載のキット。
    ａ）ヒトＣｄｃ７蛋白質をコードするＤＮＡと、配列番号：１０ に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡとを、
    モノシストロニックに発現可能な状態で原核細胞に導入する工程、
    ｂ）前記２つのＤＮＡを発現させる工程、および
    ｃ）発現された蛋白質を回収する工程
13. 配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する蛋白質の１７位セリン残基におけるリン酸化のレベルを識別する抗体。

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