JP4253071B2 - リウマチ因子による干渉の低下 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フック（hook, 鉤）効果を減少させる、または回避するための干渉低下試薬としてリウマチ因子またはリウマチ因子様物質を添加する、アナライトの測定方法に関する。さらに、本発明は上記方法を実施するための適切な試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
測定すべきアナライトを含むサンプルと共にアナライトの同一の、または異なるエピトープに対する２つの受容体をインキュベートする、いわゆるサンドイッチアッセイは、サンプル中のアナライトの定量的測定に頻繁に使用されている。この方法においては、第１の可溶性受容体は好ましくはシグナル発生系すなわち標識に直接または間接的に結合されているが、不均一(heterogeneous)検出法では第２の受容体は固相に結合して存在するか、または適切に被覆された固相に結合可能なビオチン等の結合成分と共に提供される。
【０００３】
診断的に重要な多数のパラメーターについて、サンプル中のアナライト濃度はかなり変動しうる。これは、より広い測定範囲が望ましい、または必要であることを意味する。そのようなアナライトを測定する場合、一方では、できるだけ正確な高濃度領域における値を得ることが診断上重要である。他方、質的に正確なイエス／ノーの診断を可能とする、低濃度領域における正確な測定の実施も可能でなければならない。すると、そのような診断は根本的な治療上の重大性を持ちうる。
【０００４】
検査すべきサンプルにおける高いアナライト濃度についての問題は、いわゆる「高用量フック（hook, 鉤）効果」である。これは、非常に高いアナライト濃度における測定されたシグナルの低下と理解される。この場合、特定の測定されたシグナルは、２つの異なるアナライト濃度によって引き起こされうる。この「フック効果」は、サンドイッチアッセイの適用をかなり制限してしまう。
フック効果の出現は一段階(one-step)サンドイッチアッセイにおいて特に深刻である。アナライトが第１の特異的受容体と反応し、形成された複合体が固相上に固定化された後、第２の特異的標識化受容体と反応させる前に固相の洗浄によって非結合アナライトを除去する連続的反応方法とは異なり、測定すべきアナライトを該アナライトに特異的な（すなわち該アナライトとサンドイッチを形成する）少なくとも２つの受容体と同一溶液中で反応させ、そしてこの過程で該アナライトが例えば固相上への固定化によって検出される試験を全て一段階アッセイと呼ぶ。
【０００５】
サンドイッチアッセイは、例えばブリッジテスト(bridge test)として抗体を検出するために実施することもできる。この場合には、検出すべき抗体に特異的な固定化抗原または固定化可能な抗原、および第２の標識化抗原が用いられる。このようなブリッジテストまたは二重抗原サンドイッチ測定は、例えばEP-A-0 280 211に記述されている。
【０００６】
２つのアナライト特異的受容体が可溶性で、かつアナライトとの複合体がさらに別の受容体を用いて固相上に固定化されるＤＳＡＰ（二重抗体固相）サンドイッチ原理を利用したアナライト測定もまた、上記の意味で一段階試験であり、フック効果を示す。
【０００７】
第１反応工程の後で洗浄を行う二段階または多段階法でアッセイを実施する、等によってフック効果を検出または回避するための多数の試みがなされてきた(Hoffmannら，Clin. Chem. 30 (1984), 1499)。しかし、この対処法の不利な点は作業が増大し、合計インキュベーション時間が増大し、そしてさらに感受性の喪失がしばしば起こることである。そして、この方法でフック効果を完全に低下させることは不可能であるかもしれない。
【０００８】
別の提案は、サンプルの１つ１つについて異なる希釈率で数回の測定を行うことであった。しかし、この方法もまた必要とされる時間と作業の量を増大させ、使用者のコストの増大を引き起こす。
Hoffmannら(1984)（前掲）は、アナライトと受容体との反応を速度論的に(kinetically)モニターし、数値をコンピューターに記憶させる一段階サンドイッチテストのための測定法をさらに記載している。これはフック効果によってもたらされた測定結果を他の数値から区別することを可能とする。この方法の不利な点は、測定にフック効果が存在するかどうかを知るために極めて複雑で高価なコンピューター分析を必要とすることである。
【０００９】
フック効果を減少させる、または回避するためになされた他の提案もまた、かなり不利な点を有する。したがって、サンプル容量を減少させることは一般に感受性をかなり喪失させる。受容体（固相結合受容体および／または標識受容体）濃度を増大させることはしばしばコストの相当な増大をもたらし、そして標識受容体の濃度を増大させた場合はブランク値の問題を引き起し、その結果、感受性の喪失をもたらす。さらに、受容体濃度のみを増大させても、フック効果を減少させる可能性は比較的低い。
さらに、試験試薬に非標識抗体または抗原を加えることが US-A-4,595,661、US-A-4,743,542またはEP-A-0 617-285等に提案されている。しかし、これもまた通常は感受性の喪失および試薬コストの相当な増大をもたらす。
【００１０】
EP-A-0 572 845は、第１の特異的結合パートナーを手段とする、サンプル中のアナライトの免疫化学的測定方法を開示している。この方法とは、該特異的結合パートナーを担体に固定化し；そして、直接または間接的に標識を担持しているさらに別の特異的結合パートナーを用いて、アナライトと第１の特異的結合パートナーとの結合の度合いを測定するものである。この方法では、アナライトに結合可能な部位を２つ以上有し、上記の固定化された特異的結合パートナーに対しては全くアフィニティーをもたず、かつ標識されていない結合因子がさらに添加される。このような結合因子の例は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、ならびにそれらのフラグメント；レクチン、または数種類のレクチンのコンジュゲート、またはレクチンとアナライト特異的抗体またはそのフラグメントとのコンジュゲートである。アナライトが抗体である場合、結合因子として用いられる抗体はアナライト抗体と相同ではなく、かつアナライト抗体の特定のイムノグロブリンクラスに対するものである。ヒト抗体を測定するためのリウマチ因子の使用は開示されておらず、また自明ともされていない。
【００１１】
EP-A-0 572 845によれば、免疫複合体の形成は結合因子が存在するかどうかとは無関係である。さらに、当業者に公知の逆反応(back reaction)によって、アナライトと特異的受容体との複合体は再度分解しうるので、感受性を厳しく限定する検出反応には利用不可能でありうることが強調されている。この理由により、固定化受容体と検出すべきアナライトとの逆反応速度が非常に高い場合は、試験のもつ診断性能は制限される。このような逆反応速度は低い測定領域、すなわちアナライトが低濃度の場合、または低アフィニティー抗アナライト抗体の場合に特に重大である。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
したがって本発明は、上述の先行技術の不利な点を少なくとも大幅に回避することを目的とする。この目的は、干渉低下試薬としてポリクローナルまたは／およびモノクローナルリウマチ因子またはリウマチ因子様物質を試験混合物に加えることによって達成される。この方法によれば、付加的な時間や作業を要することなく、また感受性の喪失もなく、フック効果によって引き起こされる誤った測定を減少させる、または完全に回避することが可能になる。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
したがって本発明の主題は、干渉を低下させるためにリウマチ因子またはリウマチ因子様物質を加えることを特徴とする、サンプル中のアナライトの測定方法である。好ましくは、測定はサンドイッチアッセイ、特に一段階サンドイッチアッセイによって実施される。さらに、不均一検出法によって、すなわちアナライトの固相結合によって測定を実施することが好ましい。
【００１４】
本発明の方法では、フック効果による誤った陰性の試験結果の回避が最も重要である。固相結合アナライトと抗アナライト抗体との複合体における考えうる高い逆反応速度は重要ではない。なぜなら、定義上、フック効果には非常に高いアナライト濃度が存在し、したがって逆反応速度は重要ではないからである。
【００１５】
リウマチ因子とは、内因性イムノグロブリン（例えばＩｇＧ）に対する自己抗体である。リウマチ因子は通常ＩｇＭクラスの抗体である。ヒトリウマチ因子は特に好ましい。リウマチ因子は免疫学的検出法にとっての干渉物質であるとしばしば文献に記述されてきた（例えば、EP-A-0 163 312; Henleら, Clin. Exp. Immunol. 36 (1979), 415-422; Hoら，J. Clin. Microbiol. 27 (1989), 952-958; ThorfasonおよびDiderholm, J. Meth. Virol. (1982), 157-170; Espersenら，Scand. J. Rheumatology, 75 (1988), 40-45; EP-A-0 292 810; DE-OS 42 02 923; PCT/EP95/04307 および PCT/EP95/04308 参照）。これらの先行技術を考えると、リウマチ因子の添加がフック効果の減少または完全な消滅さえもたらしうることは極めて驚くべきことであった。
【００１６】
リウマチ因子の他に、リウマチ因子様物質すなわちリウマチ因子と同一またはそれに類似した特性を有する干渉低下試薬もまた用いることができる。特に、リウマチ因子様物質は、単量体形のイムノグロブリンよりもオリゴマー性またはポリマー性または架橋イムノグロブリンまたはアナライトと結合したイムノグロブリンと良く結合することができる。このため、リウマチ因子様物質は検出すべき抗体に対するバイオアフィニティー(bioaffinity)を有する２以上の結合部位をもつ結合因子であると理解される。そのようなリウマチ因子様物質の具体例は、ヒトＩｇＧ結合ペプチド（米国特許第5,759,863号に記述されているＣ１ｑのペプチドフラグメント、等）、またはオリゴマー性ヒトＩｇＧと単量体ヒトＩｇＧを区別できるモノクローナルＩｇＭ抗体である。そのような抗体は、架橋ヒトＩｇＧを用いて実験動物を免疫感作し、オリゴマー性ヒトＩｇＧに対して高いアフィニティーを有し、かつ単量体ヒトＩｇＧに対して低いアフィニティーを有するモノクローナル抗体を単離することによって得ることができる。
【００１７】
測定すべきアナライトが存在するサンプルは、好ましくは例えば血液、血清、血漿、尿、唾液、精液または脳脊髄液、等の体液に由来するサンプル、または組織もしくは細胞培養物サンプル、等の生物学的サンプルである。好ましくは、該サンプルは血液、血清または血漿サンプルで、特にヒトのサンプルが好ましい。
【００１８】
本発明の方法は好ましくは不均一サンドイッチアッセイとして実施され、以下の工程を含む：
（ａ）サンプルを固相、該固相に結合している、または結合可能な第１のアナライト特異的受容体、およびシグナル発生基を担持している、またはシグナル発生基に結合可能な第２のアナライト特異的受容体と接触させる工程；および
（ｂ）該固相上のシグナル発生基を測定することによってアナライトの存在または／および量を検出する工程。
【００１９】
さらに、本発明の方法は好ましくは免疫学的反応、すなわち抗原-抗体相互作用を含む。この反応を直接または間接的に用いてアナライトが測定される。しかし、原則として本発明の方法は、高アフィニティー相互作用に基づく、フック効果が起こる危険のある他の測定反応にも用いることができる。
【００２０】
測定すべきアナライトは生物学的サンプル中に存在する任意の物質であることができる。例えば、体液中に存在する抗体、特に自己抗体、腫瘍抗体または病原体（ＨＩＶまたは肝炎ウイルスとうのウイルス等）に対する抗体、等である。また、アナライトは抗原、すなわち抗体に結合できる物質（例えば、αフェトプロテインもしくは癌胎児性抗原等の腫瘍マーカー、またはヒト絨毛性性腺刺激ホルモン等の妊娠マーカー）であることもできる。
【００２１】
リウマチ因子またはリウマチ因子様物質を用いた本発明による干渉の低下は、好ましくは抗体、特にヒト抗体の測定に用いられる。これに関連して、上述のブリッジテスト法による測定が特に好ましい。
【００２２】
測定すべき抗体に対する特異的抗原が固定化された、または固定化可能な形で用いられ、そしてアナライト抗体の結合が直接または間接的に標識された、アナライト抗体に対する抗体によって検出される、抗体検出のためのいわゆる間接法もまた好ましい。
【００２３】
検出法が比濁分析またはネフェロ分析テストとして実施されない場合は、当分野で公知の標識から選択することができるシグナル発生基がアナライトを検出するために通常用いられる。標識の例としては、放射能標識、酵素、染料、蛍光性基および電気化学発光基が挙げられる。電気化学発光基は特に好ましい。例えば、ルテニウムキレート等の発光金属キレートマーカー基、具体的にはEP-A-0 178 450、EP-A-0 255 534、EP-A-0 580 979およびWO 90/05301 に記述されているルテニウム-(ビピリジル)-3-複合体等である。シグナル発生基はアナライト特異的受容体に直接結合していてもよいし（直接標識）、または該アナライト特異的受容体に結合することができるさらに別の受容体と結合していてもよい（間接標識）。
【００２４】
本発明の方法に用いることができる固相は、粒子媒体、特にラテックス粒子および特に好ましい磁気ビーズ等のマイクロビーズ、または反応器、特にマイクロタイタープレート、キュベット、試験管、チップおよびセンサーの表面である。
【００２５】
不均一検出法に固相を用いる場合、試験試薬は固相アナライト特異的受容体をを含む。この固相受容体は、例えば吸収相互作用または共有相互作用によって試験開始前に固相に結合させることができるが、好ましくは特異的高アフィニティー相互作用（例えば、ストレプトアビジンまたはアビジン／ビオチンまたは抗体／抗原相互作用）によって結合させる。他方、上記固相受容体もまた固相に結合可能な形で存在することができる（すなわち、アッセイ中にのみ、そして好ましくは高アフィニティー相互作用によって固相に結合される）。ストレプトアビジンまたはアビジンで被覆した固相、およびビオチニル化した固相アナライト特異的受容体を用いることが特に好ましい。これに関連して、固相受容体は固相に直接的に、または１または数個の付加的受容体を介して間接的に結合できることに注意すべきである。
【００２６】
本発明の方法において、リウマチ因子またはリウマチ因子様物質は一方では干渉をできるかぎり大幅に減少させる（すなわち、フック効果を減少させる）に十分であり、そして他方では検出反応を実質的に損なわない量で試験混合物に添加される。この目的のため、好ましくはリウマチ因子を試験混合物中に１から1000 IU/ml (WHO 基準64/2による）の最終濃度で存在するような量で使用することができる。非常に低濃度のリウマチ因子またはリウマチ因子様物質でも、干渉低下の程度によって効果的でありうる。使用可能な最大濃度は、リウマチ因子または他の干渉低下物質の溶解性によって決まる。
【００２７】
本発明の方法においては、リウマチ因子はポリクローナルまたは／およびモノクローナル抗体の形態、精製された形態または血清、血漿またはそれらの画分の形態で用いることができる。場合により、抗体フラグメントを用いることも可能である。
【００２８】
【発明の実施の形態】
本発明の第１の実施形態においては、リウマチ因子またはリウマチ因子様物質は溶液の形で試験混合物に直接添加される。さらなる実施形態においては、リウマチ因子またはリウマチ因子様物質は固相に結合した形で、または固相アナライト特異的受容体に対応する固相に結合可能な形で用いられる。したがって、例えばストレプトアビジンまたはアビジンで被覆した固相を用いる場合は、ビオチニル化リウマチ因子を用いることができる。さらに別の実施形態においては、リウマチ因子またはリウマチ因子様物質に対して特異的な固相受容体、すなわち干渉低下試薬と特異的に結合可能で、かつそれ自体が固相に結合しているか、または結合可能な受容体が使用される。リウマチ因子に特異的な受容体として、例えばＩｇＭ抗体（抗ヒトＩｇＭ抗体、等）を用いることができる。この実施形態においても、ストレプトアビジンまたはアビジンで被覆した固相およびビオチニル化リウマチ因子特異的受容体またはビオチニル化リウマチ因子様物質またはビオチニル化したその受容体を用いることが好ましい。
【００２９】
本発明のさらなる主題は、検出方法、特に生物学的サンプル（例えば体液）中のアナライトの測定のための診断的検出法における干渉低下試薬としてのリウマチ因子またはリウマチ因子様物質の使用である。好ましくは、リウマチ因子またはリウマチ因子様物質は特に免疫学的方法におけるフック効果を減少させる、または回避するために使用される。
【００３０】
本発明のさらに別な主題は、他の試薬の他に干渉低下試薬としてリウマチ因子またはリウマチ因子様物質を含む、アナライトを測定するための試薬キットである。この試薬キットは、好ましくは固相、該固相に結合している、または結合可能な第１のアナライト特異的受容体、およびシグナル発生基を担持する、またはシグナル発生基に結合可能な第２のアナライト特異的受容体をさらに含む。
【００３１】
本発明は添付の図面によってさらに詳しく説明される。
【００３２】
【実施例】
〔実施例１〕電気化学発光による抗ＨＢｃ抗体（Ｂ型肝炎コア抗原に対する抗体）の検出
試験は二重抗原サンドイッチアッセイとして実施した。この試験は、ビオチニル化ＨＢｃ抗原および電気化学発光能を有するルテニウム複合体を用いて標識したＨＢｃ抗原の使用に基づいている。
抗原は当業者に公知の方法によってビオチニル化することができる。ルテニウム標識抗原は、例えば WO 96/03651に記載の方法で調製することができる。
【００３３】
約10,000 U/mlの含有量を有する抗ＨＢｃ抗体陽性血清をリウマチ因子、抗ヒトＩｇＭ抗体-ビオチンコンジュゲート、およびストレプトアビジン（ＳＡ）で被覆した磁気粒子を添加して、または添加しないで、異なる希釈段階で測定した。
【００３４】
「テストプロトコール２」プログラムを用いて、操作マニュアルにしたがってElecsysTM 2010計器（製造者：Boehringer Mannheim/日立）を使用した。試験試薬は下記のように使用した。
− 容量：サンプル 10 μl、試薬１ 75μl、試薬２ 75μl、ストレプトア
ビジンビーズ 40μl
− インキュベーション時間：試薬１および試薬２をサンプルと共に９分間、Ｓ
Ａビーズと共にさらに９分間
− 試薬１： 100 mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4、ウシ血清成分、界面活
性剤、防腐剤およびビオチニル化ＨＢｃＡｇ（1400 ng/ml)
− 試薬２： 100 mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4、ウシ血清成分、界面活
性剤、防腐剤およびルテニル化(ruthenylated)ＨＢｃＡｇ（700 ng/ml)
【００３５】
ビオチニル化およびルテニル化ＨＢｃＡｇをサンプルと共に９分間インキュベートする。ストレプトアビジン被覆ビーズを加えた後、さらに９分間インキュベートしてから電気化学発光を測定する。
本実施例では、試薬１は０または200 U/mlのリウマチ因子を付加的に含み、また試薬２は０または700 ng/mlのビオチニル化モノクローナル抗ヒトＩｇＭ抗体を付加的に含んでいる。
試験混合物中のリウマチ因子の最終濃度は74 U/ml である。
実験結果を図１および下記の表１に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
リウマチ因子およびビオチニル化抗ＩｇＭ抗体を添加しない場合、抗ＨＢｃ陽性血清の陽性および陰性の区別はサンプルを前もって1:64またはそれよりさらに希釈した場合にのみ可能となるのに対し、リウマチ因子およびビオチニル化抗ＩｇＭ抗体を添加した場合は陽性の結果（カウント59000以上）が未希釈サンプルにおいてすでに得られる。
【００３８】
〔実施例２〕電気化学発光による抗ＨＢｓ抗体（Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体）の検出
この試験もまた、ビオチニル化ＨＢｓ抗原およびルテニウム標識ＨＢｓ抗原を用いて、また「テストプロトコール２」プログラムによってElecsysTM 2010計器を用いて、二重抗原サンドイッチアッセイとして実施した。
【００３９】
高い力価（約400,000 IU/L)を有するＨＢｓ陽性血清をリウマチ因子、抗ヒトＩｇＭ抗体-ビオチンコンジュゲートを添加して、または添加しないで、種々の希釈段階で測定した。試験試薬は下記のように使用した。
− 容量：サンプル 40 μl、試薬１ 65μl、試薬２ 60μl、ストレプトア
ビジンビーズ 35μl
− インキュベーション時間：試薬１および試薬２をサンプルと共に９分間、Ｓ
Ａビーズと共にさらに９分間
− 試薬１： 80 mM MES緩衝液、pH 6.5、ウシ血清成分、界面活性剤、防腐剤お
よびビオチニル化ＨＢｓＡｇ（800 ng/ml)
− 試薬２： 80 mM MES緩衝液、pH 6.5、ウシ血清成分、界面活性剤、防腐剤お
よびルテニル化ＨＢｓＡｇ（500 ng/ml)
【００４０】
ビオチニル化およびルテニル化ＨＢｓＡｇをサンプルと共に９分間インキュベートする。ストレプトアビジン被覆ビーズを加えた後、さらに９分間インキュベートしてから電気化学発光を測定する。
本実施例では、試薬１は０または200 U/mlのリウマチ因子を付加的に含み、また試薬２は０または700 ng/mlのビオチニル化モノクローナル抗ヒトＩｇＭ抗体を付加的に含んでいる。
試験混合物中のリウマチ因子の最終濃度は65 U/mlであった。
実験結果を表２および図２に示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】
実験結果は、リウマチ因子およびビオチニル化抗ＩｇＭ抗体を添加することによって、試験の感受性を喪失させることなくフック効果の出現をより高い濃度領域にシフトさせうることを示している。未希釈または軽度に希釈したサンプル（1:2または1:4 ）において、リウマチ因子の添加により感受性の重大な増加が達成されている。
【００４３】
〔実施例３〕電気化学発光による抗ＨＩＶ抗体の検出
この試験は、ドイツ国特許出願第 DE 197 27 943.0号に記載のＨＩＶ combiテストにしたがって実施した。これは組み合わせたＨＩＶ抗原／抗体テストである。ビオチニル化モノクローナル抗p24 抗体（Ｒ１）および種々のビオチニル化ＨＩＶ抗原（Ｒ３およびＲ５）を固相結合受容体として用いる。ルテニル化モノクローナル抗p24 抗体（Ｒ２）およびルテニル化ＨＩＶ抗原（Ｒ４およびＲ６）を検出用の標識化ルテニル化受容体として用いる。
【００４４】
− Ｒ１：ビオチニル化モノクローナル抗p24-IgG 抗体
− Ｒ２：ルテニル化モノクローナル抗p24-IgG 抗体
− Ｒ３：ビオチニル化gp36、gp41ペプチドおよびポリハプテン；これらの配列は EnzymunTMテスト抗ＨＩＶ１＋２＋SubO、オーダーNo. 1557319、Boehrin
ger Mannheim, Germanyに使用されるペプチドに対応する。
− Ｒ４：ルテニル化gp36、gp41ペプチドおよびポリハプテン；これらの配列は EnzymunTMテスト抗ＨＩＶ１＋２＋SubO、オーダーNo. 1557319、Boehringer
Mannheim, Germanyに使用されるペプチドに対応する。しかし、これらはル
テニル化されているが、ジゴキシゲニン標識はされていない。
− Ｒ５：ＲＴ（逆転写酵素）から調製されたビオチニル化ＲＴ抗原、オーダー
No. 1465333、Boehringer Mannheim, Germany
− Ｒ６：ＲＴから調製されたルテニル化ＲＴ抗原、オーダーNo. 1465333、Bo
ehringer Mannheim, Germany
【００４５】
ルテニウムで標識したＨＩＶ抗原およびそれらの調製方法は、例えば WO 96/03651に記述されている。抗原のビオチニル化は当業者に公知の方法により行う。ポリハプテンの調製はWO 96/03652に記述されている。
高い力価を有する抗ＨＩＶ陽性サンプルを２つの希釈段階でリウマチ因子（濃度：試薬１ 1 mlあたり20、70、200 U）を添加して、または添加しないで測定した。
【００４６】
実験は、ElecsysTM 2010を操作マニュアルおよび「テストプロトコール２」プログラムにしたがって用いて実施した。試験試薬は下記のように使用した。
− 容量：サンプル 50 μl、試薬１ 50μl、試薬２ 50μl、ストレプトア
ビジンビーズ 50μl
− インキュベーション時間：試薬１および試薬２をサンプルと共に９分間、ビ
ーズと共にさらに９分間
− 試薬１： Tris緩衝液、pH 8.0、ウシ血清成分、界面活性剤、防腐剤および
ビオチニル化抗原または抗体（Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５）
− 試薬２： Tris緩衝液、pH 8.0、ウシ血清成分、界面活性剤、防腐剤および
ルテニル化抗原または抗体（Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６）
【００４７】
試薬１および試薬２中の受容体Ｒ１〜Ｒ６（抗体、ポリハプテンおよびＲＴ：各場合において100-2000 ng/ml、ペプチド1 mlあたり10-100 ng)をサンプルと共に９分間インキュベートする。ストレプトアビジン被覆ビーズを加えた後、さらに９分間インキュベートしてから電気化学発光を測定する。
【００４８】
本実施例では、適切な量のヒト血清（リウマチ血清）を添加することにより、試薬１は０、20、70または200 U/mlのリウマチ因子を付加的に含む（試験混合物中のリウマチ因子の最終濃度：０、５、17.5および50 U/ml)。 実験結果を表３に示す。
【００４９】
【表３】
【００５０】
実験結果は、リウマチ因子の存在がフック効果をかなり減少させることを示している。希釈サンプルにおいては軽度の影響しかみられないか、または影響が全くないが、未希釈サンプルにおいては測定シグナルが大幅に増大しており、したがってフック効果はかなり弱められている。
【００５１】
【図面の簡単な説明】
【図１】異なるサンプル希釈率における抗ＨＢｃ抗体試験結果のリウマチ因子添加への依存を示す。
【図２】異なるサンプル希釈率における抗ＨＢｓ抗体試験結果のリウマチ因子添加への依存を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、フック（hook, 鉤）効果を減少させる、または回避するための干渉低下試薬としてリウマチ因子またはリウマチ因子様物質を添加する、アナライトの測定方法に関する。さらに、本発明は上記方法を実施するための適切な試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
測定すべきアナライトを含むサンプルと共にアナライトの同一の、または異なるエピトープに対する２つの受容体をインキュベートする、いわゆるサンドイッチアッセイは、サンプル中のアナライトの定量的測定に頻繁に使用されている。この方法においては、第１の可溶性受容体は好ましくはシグナル発生系すなわち標識に直接または間接的に結合されているが、不均一(heterogeneous)検出法では第２の受容体は固相に結合して存在するか、または適切に被覆された固相に結合可能なビオチン等の結合成分と共に提供される。
【０００３】
診断的に重要な多数のパラメーターについて、サンプル中のアナライト濃度はかなり変動しうる。これは、より広い測定範囲が望ましい、または必要であることを意味する。そのようなアナライトを測定する場合、一方では、できるだけ正確な高濃度領域における値を得ることが診断上重要である。他方、質的に正確なイエス／ノーの診断を可能とする、低濃度領域における正確な測定の実施も可能でなければならない。すると、そのような診断は根本的な治療上の重大性を持ちうる。
【０００４】
検査すべきサンプルにおける高いアナライト濃度についての問題は、いわゆる「高用量フック（hook, 鉤）効果」である。これは、非常に高いアナライト濃度における測定されたシグナルの低下と理解される。この場合、特定の測定されたシグナルは、２つの異なるアナライト濃度によって引き起こされうる。この「フック効果」は、サンドイッチアッセイの適用をかなり制限してしまう。
フック効果の出現は一段階(one-step)サンドイッチアッセイにおいて特に深刻である。アナライトが第１の特異的受容体と反応し、形成された複合体が固相上に固定化された後、第２の特異的標識化受容体と反応させる前に固相の洗浄によって非結合アナライトを除去する連続的反応方法とは異なり、測定すべきアナライトを該アナライトに特異的な（すなわち該アナライトとサンドイッチを形成する）少なくとも２つの受容体と同一溶液中で反応させ、そしてこの過程で該アナライトが例えば固相上への固定化によって検出される試験を全て一段階アッセイと呼ぶ。
【０００５】
サンドイッチアッセイは、例えばブリッジテスト(bridge test)として抗体を検出するために実施することもできる。この場合には、検出すべき抗体に特異的な固定化抗原または固定化可能な抗原、および第２の標識化抗原が用いられる。このようなブリッジテストまたは二重抗原サンドイッチ測定は、例えばEP-A-0 280 211に記述されている。
【０００６】
２つのアナライト特異的受容体が可溶性で、かつアナライトとの複合体がさらに別の受容体を用いて固相上に固定化されるＤＳＡＰ（二重抗体固相）サンドイッチ原理を利用したアナライト測定もまた、上記の意味で一段階試験であり、フック効果を示す。
【０００７】
第１反応工程の後で洗浄を行う二段階または多段階法でアッセイを実施する、等によってフック効果を検出または回避するための多数の試みがなされてきた(Hoffmannら，Clin. Chem. 30 (1984), 1499)。しかし、この対処法の不利な点は作業が増大し、合計インキュベーション時間が増大し、そしてさらに感受性の喪失がしばしば起こることである。そして、この方法でフック効果を完全に低下させることは不可能であるかもしれない。
【０００８】
別の提案は、サンプルの１つ１つについて異なる希釈率で数回の測定を行うことであった。しかし、この方法もまた必要とされる時間と作業の量を増大させ、使用者のコストの増大を引き起こす。
Hoffmannら(1984)（前掲）は、アナライトと受容体との反応を速度論的に(kinetically)モニターし、数値をコンピューターに記憶させる一段階サンドイッチテストのための測定法をさらに記載している。これはフック効果によってもたらされた測定結果を他の数値から区別することを可能とする。この方法の不利な点は、測定にフック効果が存在するかどうかを知るために極めて複雑で高価なコンピューター分析を必要とすることである。
【０００９】
フック効果を減少させる、または回避するためになされた他の提案もまた、かなり不利な点を有する。したがって、サンプル容量を減少させることは一般に感受性をかなり喪失させる。受容体（固相結合受容体および／または標識受容体）濃度を増大させることはしばしばコストの相当な増大をもたらし、そして標識受容体の濃度を増大させた場合はブランク値の問題を引き起し、その結果、感受性の喪失をもたらす。さらに、受容体濃度のみを増大させても、フック効果を減少させる可能性は比較的低い。
さらに、試験試薬に非標識抗体または抗原を加えることが US-A-4,595,661、US-A-4,743,542またはEP-A-0 617-285等に提案されている。しかし、これもまた通常は感受性の喪失および試薬コストの相当な増大をもたらす。
【００１０】
EP-A-0 572 845は、第１の特異的結合パートナーを手段とする、サンプル中のアナライトの免疫化学的測定方法を開示している。この方法とは、該特異的結合パートナーを担体に固定化し；そして、直接または間接的に標識を担持しているさらに別の特異的結合パートナーを用いて、アナライトと第１の特異的結合パートナーとの結合の度合いを測定するものである。この方法では、アナライトに結合可能な部位を２つ以上有し、上記の固定化された特異的結合パートナーに対しては全くアフィニティーをもたず、かつ標識されていない結合因子がさらに添加される。このような結合因子の例は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、ならびにそれらのフラグメント；レクチン、または数種類のレクチンのコンジュゲート、またはレクチンとアナライト特異的抗体またはそのフラグメントとのコンジュゲートである。アナライトが抗体である場合、結合因子として用いられる抗体はアナライト抗体と相同ではなく、かつアナライト抗体の特定のイムノグロブリンクラスに対するものである。ヒト抗体を測定するためのリウマチ因子の使用は開示されておらず、また自明ともされていない。
【００１１】
EP-A-0 572 845によれば、免疫複合体の形成は結合因子が存在するかどうかとは無関係である。さらに、当業者に公知の逆反応(back reaction)によって、アナライトと特異的受容体との複合体は再度分解しうるので、感受性を厳しく限定する検出反応には利用不可能でありうることが強調されている。この理由により、固定化受容体と検出すべきアナライトとの逆反応速度が非常に高い場合は、試験のもつ診断性能は制限される。このような逆反応速度は低い測定領域、すなわちアナライトが低濃度の場合、または低アフィニティー抗アナライト抗体の場合に特に重大である。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
したがって本発明は、上述の先行技術の不利な点を少なくとも大幅に回避することを目的とする。この目的は、干渉低下試薬としてポリクローナルまたは／およびモノクローナルリウマチ因子またはリウマチ因子様物質を試験混合物に加えることによって達成される。この方法によれば、付加的な時間や作業を要することなく、また感受性の喪失もなく、フック効果によって引き起こされる誤った測定を減少させる、または完全に回避することが可能になる。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
したがって本発明の主題は、干渉を低下させるためにリウマチ因子またはリウマチ因子様物質を加えることを特徴とする、サンプル中のアナライトの測定方法である。好ましくは、測定はサンドイッチアッセイ、特に一段階サンドイッチアッセイによって実施される。さらに、不均一検出法によって、すなわちアナライトの固相結合によって測定を実施することが好ましい。
【００１４】
本発明の方法では、フック効果による誤った陰性の試験結果の回避が最も重要である。固相結合アナライトと抗アナライト抗体との複合体における考えうる高い逆反応速度は重要ではない。なぜなら、定義上、フック効果には非常に高いアナライト濃度が存在し、したがって逆反応速度は重要ではないからである。
【００１５】
リウマチ因子とは、内因性イムノグロブリン（例えばＩｇＧ）に対する自己抗体である。リウマチ因子は通常ＩｇＭクラスの抗体である。ヒトリウマチ因子は特に好ましい。リウマチ因子は免疫学的検出法にとっての干渉物質であるとしばしば文献に記述されてきた（例えば、EP-A-0 163 312; Henleら, Clin. Exp. Immunol. 36 (1979), 415-422; Hoら，J. Clin. Microbiol. 27 (1989), 952-958; ThorfasonおよびDiderholm, J. Meth. Virol. (1982), 157-170; Espersenら，Scand. J. Rheumatology, 75 (1988), 40-45; EP-A-0 292 810; DE-OS 42 02 923; PCT/EP95/04307 および PCT/EP95/04308 参照）。これらの先行技術を考えると、リウマチ因子の添加がフック効果の減少または完全な消滅さえもたらしうることは極めて驚くべきことであった。
【００１６】
リウマチ因子の他に、リウマチ因子様物質すなわちリウマチ因子と同一またはそれに類似した特性を有する干渉低下試薬もまた用いることができる。特に、リウマチ因子様物質は、単量体形のイムノグロブリンよりもオリゴマー性またはポリマー性または架橋イムノグロブリンまたはアナライトと結合したイムノグロブリンと良く結合することができる。このため、リウマチ因子様物質は検出すべき抗体に対するバイオアフィニティー(bioaffinity)を有する２以上の結合部位をもつ結合因子であると理解される。そのようなリウマチ因子様物質の具体例は、ヒトＩｇＧ結合ペプチド（米国特許第5,759,863号に記述されているＣ１ｑのペプチドフラグメント、等）、またはオリゴマー性ヒトＩｇＧと単量体ヒトＩｇＧを区別できるモノクローナルＩｇＭ抗体である。そのような抗体は、架橋ヒトＩｇＧを用いて実験動物を免疫感作し、オリゴマー性ヒトＩｇＧに対して高いアフィニティーを有し、かつ単量体ヒトＩｇＧに対して低いアフィニティーを有するモノクローナル抗体を単離することによって得ることができる。
【００１７】
測定すべきアナライトが存在するサンプルは、好ましくは例えば血液、血清、血漿、尿、唾液、精液または脳脊髄液、等の体液に由来するサンプル、または組織もしくは細胞培養物サンプル、等の生物学的サンプルである。好ましくは、該サンプルは血液、血清または血漿サンプルで、特にヒトのサンプルが好ましい。
【００１８】
本発明の方法は好ましくは不均一サンドイッチアッセイとして実施され、以下の工程を含む：
（ａ）サンプルを固相、該固相に結合している、または結合可能な第１のアナライト特異的受容体、およびシグナル発生基を担持している、またはシグナル発生基に結合可能な第２のアナライト特異的受容体と接触させる工程；および
（ｂ）該固相上のシグナル発生基を測定することによってアナライトの存在または／および量を検出する工程。
【００１９】
さらに、本発明の方法は好ましくは免疫学的反応、すなわち抗原-抗体相互作用を含む。この反応を直接または間接的に用いてアナライトが測定される。しかし、原則として本発明の方法は、高アフィニティー相互作用に基づく、フック効果が起こる危険のある他の測定反応にも用いることができる。
【００２０】
測定すべきアナライトは生物学的サンプル中に存在する任意の物質であることができる。例えば、体液中に存在する抗体、特に自己抗体、腫瘍抗体または病原体（ＨＩＶまたは肝炎ウイルスとうのウイルス等）に対する抗体、等である。また、アナライトは抗原、すなわち抗体に結合できる物質（例えば、αフェトプロテインもしくは癌胎児性抗原等の腫瘍マーカー、またはヒト絨毛性性腺刺激ホルモン等の妊娠マーカー）であることもできる。
【００２１】
リウマチ因子またはリウマチ因子様物質を用いた本発明による干渉の低下は、好ましくは抗体、特にヒト抗体の測定に用いられる。これに関連して、上述のブリッジテスト法による測定が特に好ましい。
【００２２】
測定すべき抗体に対する特異的抗原が固定化された、または固定化可能な形で用いられ、そしてアナライト抗体の結合が直接または間接的に標識された、アナライト抗体に対する抗体によって検出される、抗体検出のためのいわゆる間接法もまた好ましい。
【００２３】
検出法が比濁分析またはネフェロ分析テストとして実施されない場合は、当分野で公知の標識から選択することができるシグナル発生基がアナライトを検出するために通常用いられる。標識の例としては、放射能標識、酵素、染料、蛍光性基および電気化学発光基が挙げられる。電気化学発光基は特に好ましい。例えば、ルテニウムキレート等の発光金属キレートマーカー基、具体的にはEP-A-0 178 450、EP-A-0 255 534、EP-A-0 580 979およびWO 90/05301 に記述されているルテニウム-(ビピリジル)-3-複合体等である。シグナル発生基はアナライト特異的受容体に直接結合していてもよいし（直接標識）、または該アナライト特異的受容体に結合することができるさらに別の受容体と結合していてもよい（間接標識）。
【００２４】
本発明の方法に用いることができる固相は、粒子媒体、特にラテックス粒子および特に好ましい磁気ビーズ等のマイクロビーズ、または反応器、特にマイクロタイタープレート、キュベット、試験管、チップおよびセンサーの表面である。
【００２５】
不均一検出法に固相を用いる場合、試験試薬は固相アナライト特異的受容体をを含む。この固相受容体は、例えば吸収相互作用または共有相互作用によって試験開始前に固相に結合させることができるが、好ましくは特異的高アフィニティー相互作用（例えば、ストレプトアビジンまたはアビジン／ビオチンまたは抗体／抗原相互作用）によって結合させる。他方、上記固相受容体もまた固相に結合可能な形で存在することができる（すなわち、アッセイ中にのみ、そして好ましくは高アフィニティー相互作用によって固相に結合される）。ストレプトアビジンまたはアビジンで被覆した固相、およびビオチニル化した固相アナライト特異的受容体を用いることが特に好ましい。これに関連して、固相受容体は固相に直接的に、または１または数個の付加的受容体を介して間接的に結合できることに注意すべきである。
【００２６】
本発明の方法において、リウマチ因子またはリウマチ因子様物質は一方では干渉をできるかぎり大幅に減少させる（すなわち、フック効果を減少させる）に十分であり、そして他方では検出反応を実質的に損なわない量で試験混合物に添加される。この目的のため、好ましくはリウマチ因子を試験混合物中に１から1000 IU/ml (WHO 基準64/2による）の最終濃度で存在するような量で使用することができる。非常に低濃度のリウマチ因子またはリウマチ因子様物質でも、干渉低下の程度によって効果的でありうる。使用可能な最大濃度は、リウマチ因子または他の干渉低下物質の溶解性によって決まる。
【００２７】
本発明の方法においては、リウマチ因子はポリクローナルまたは／およびモノクローナル抗体の形態、精製された形態または血清、血漿またはそれらの画分の形態で用いることができる。場合により、抗体フラグメントを用いることも可能である。
【００２８】
【発明の実施の形態】
本発明の第１の実施形態においては、リウマチ因子またはリウマチ因子様物質は溶液の形で試験混合物に直接添加される。さらなる実施形態においては、リウマチ因子またはリウマチ因子様物質は固相に結合した形で、または固相アナライト特異的受容体に対応する固相に結合可能な形で用いられる。したがって、例えばストレプトアビジンまたはアビジンで被覆した固相を用いる場合は、ビオチニル化リウマチ因子を用いることができる。さらに別の実施形態においては、リウマチ因子またはリウマチ因子様物質に対して特異的な固相受容体、すなわち干渉低下試薬と特異的に結合可能で、かつそれ自体が固相に結合しているか、または結合可能な受容体が使用される。リウマチ因子に特異的な受容体として、例えばＩｇＭ抗体（抗ヒトＩｇＭ抗体、等）を用いることができる。この実施形態においても、ストレプトアビジンまたはアビジンで被覆した固相およびビオチニル化リウマチ因子特異的受容体またはビオチニル化リウマチ因子様物質またはビオチニル化したその受容体を用いることが好ましい。
【００２９】
本発明のさらなる主題は、検出方法、特に生物学的サンプル（例えば体液）中のアナライトの測定のための診断的検出法における干渉低下試薬としてのリウマチ因子またはリウマチ因子様物質の使用である。好ましくは、リウマチ因子またはリウマチ因子様物質は特に免疫学的方法におけるフック効果を減少させる、または回避するために使用される。
【００３０】
本発明のさらに別な主題は、他の試薬の他に干渉低下試薬としてリウマチ因子またはリウマチ因子様物質を含む、アナライトを測定するための試薬キットである。この試薬キットは、好ましくは固相、該固相に結合している、または結合可能な第１のアナライト特異的受容体、およびシグナル発生基を担持する、またはシグナル発生基に結合可能な第２のアナライト特異的受容体をさらに含む。
【００３１】
本発明は添付の図面によってさらに詳しく説明される。
【００３２】
【実施例】
〔実施例１〕電気化学発光による抗ＨＢｃ抗体（Ｂ型肝炎コア抗原に対する抗体）の検出
試験は二重抗原サンドイッチアッセイとして実施した。この試験は、ビオチニル化ＨＢｃ抗原および電気化学発光能を有するルテニウム複合体を用いて標識したＨＢｃ抗原の使用に基づいている。
抗原は当業者に公知の方法によってビオチニル化することができる。ルテニウム標識抗原は、例えば WO 96/03651に記載の方法で調製することができる。
【００３３】
約10,000 U/mlの含有量を有する抗ＨＢｃ抗体陽性血清をリウマチ因子、抗ヒトＩｇＭ抗体-ビオチンコンジュゲート、およびストレプトアビジン（ＳＡ）で被覆した磁気粒子を添加して、または添加しないで、異なる希釈段階で測定した。
【００３４】
「テストプロトコール２」プログラムを用いて、操作マニュアルにしたがってElecsysTM 2010計器（製造者：Boehringer Mannheim/日立）を使用した。試験試薬は下記のように使用した。
− 容量：サンプル 10 μl、試薬１ 75μl、試薬２ 75μl、ストレプトア
ビジンビーズ 40μl
− インキュベーション時間：試薬１および試薬２をサンプルと共に９分間、Ｓ
Ａビーズと共にさらに９分間
− 試薬１： 100 mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4、ウシ血清成分、界面活
性剤、防腐剤およびビオチニル化ＨＢｃＡｇ（1400 ng/ml)
− 試薬２： 100 mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4、ウシ血清成分、界面活
性剤、防腐剤およびルテニル化(ruthenylated)ＨＢｃＡｇ（700 ng/ml)
【００３５】
ビオチニル化およびルテニル化ＨＢｃＡｇをサンプルと共に９分間インキュベートする。ストレプトアビジン被覆ビーズを加えた後、さらに９分間インキュベートしてから電気化学発光を測定する。
本実施例では、試薬１は０または200 U/mlのリウマチ因子を付加的に含み、また試薬２は０または700 ng/mlのビオチニル化モノクローナル抗ヒトＩｇＭ抗体を付加的に含んでいる。
試験混合物中のリウマチ因子の最終濃度は74 U/ml である。
実験結果を図１および下記の表１に示す。
【００３６】
【表１】
リウマチ因子およびビオチニル化抗ＩｇＭ抗体を添加しない場合、抗ＨＢｃ陽性血清の陽性および陰性の区別はサンプルを前もって1:64またはそれよりさらに希釈した場合にのみ可能となるのに対し、リウマチ因子およびビオチニル化抗ＩｇＭ抗体を添加した場合は陽性の結果（カウント59000以上）が未希釈サンプルにおいてすでに得られる。
【００３８】
〔実施例２〕電気化学発光による抗ＨＢｓ抗体（Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体）の検出
この試験もまた、ビオチニル化ＨＢｓ抗原およびルテニウム標識ＨＢｓ抗原を用いて、また「テストプロトコール２」プログラムによってElecsysTM 2010計器を用いて、二重抗原サンドイッチアッセイとして実施した。
【００３９】
高い力価（約400,000 IU/L)を有するＨＢｓ陽性血清をリウマチ因子、抗ヒトＩｇＭ抗体-ビオチンコンジュゲートを添加して、または添加しないで、種々の希釈段階で測定した。試験試薬は下記のように使用した。
− 容量：サンプル 40 μl、試薬１ 65μl、試薬２ 60μl、ストレプトア
ビジンビーズ 35μl
− インキュベーション時間：試薬１および試薬２をサンプルと共に９分間、Ｓ
Ａビーズと共にさらに９分間
− 試薬１： 80 mM MES緩衝液、pH 6.5、ウシ血清成分、界面活性剤、防腐剤お
よびビオチニル化ＨＢｓＡｇ（800 ng/ml)
− 試薬２： 80 mM MES緩衝液、pH 6.5、ウシ血清成分、界面活性剤、防腐剤お
よびルテニル化ＨＢｓＡｇ（500 ng/ml)
【００４０】
ビオチニル化およびルテニル化ＨＢｓＡｇをサンプルと共に９分間インキュベートする。ストレプトアビジン被覆ビーズを加えた後、さらに９分間インキュベートしてから電気化学発光を測定する。
本実施例では、試薬１は０または200 U/mlのリウマチ因子を付加的に含み、また試薬２は０または700 ng/mlのビオチニル化モノクローナル抗ヒトＩｇＭ抗体を付加的に含んでいる。
試験混合物中のリウマチ因子の最終濃度は65 U/mlであった。
実験結果を表２および図２に示す。
【００４１】
【表２】
実験結果は、リウマチ因子およびビオチニル化抗ＩｇＭ抗体を添加することによって、試験の感受性を喪失させることなくフック効果の出現をより高い濃度領域にシフトさせうることを示している。未希釈または軽度に希釈したサンプル（1:2または1:4 ）において、リウマチ因子の添加により感受性の重大な増加が達成されている。
【００４３】
〔実施例３〕電気化学発光による抗ＨＩＶ抗体の検出
この試験は、ドイツ国特許出願第 DE 197 27 943.0号に記載のＨＩＶ combiテストにしたがって実施した。これは組み合わせたＨＩＶ抗原／抗体テストである。ビオチニル化モノクローナル抗p24 抗体（Ｒ１）および種々のビオチニル化ＨＩＶ抗原（Ｒ３およびＲ５）を固相結合受容体として用いる。ルテニル化モノクローナル抗p24 抗体（Ｒ２）およびルテニル化ＨＩＶ抗原（Ｒ４およびＲ６）を検出用の標識化ルテニル化受容体として用いる。
【００４４】
− Ｒ１：ビオチニル化モノクローナル抗p24-IgG 抗体
− Ｒ２：ルテニル化モノクローナル抗p24-IgG 抗体
− Ｒ３：ビオチニル化gp36、gp41ペプチドおよびポリハプテン；これらの配列は EnzymunTMテスト抗ＨＩＶ１＋２＋SubO、オーダーNo. 1557319、Boehrin
ger Mannheim, Germanyに使用されるペプチドに対応する。
− Ｒ４：ルテニル化gp36、gp41ペプチドおよびポリハプテン；これらの配列は EnzymunTMテスト抗ＨＩＶ１＋２＋SubO、オーダーNo. 1557319、Boehringer
Mannheim, Germanyに使用されるペプチドに対応する。しかし、これらはル
テニル化されているが、ジゴキシゲニン標識はされていない。
− Ｒ５：ＲＴ（逆転写酵素）から調製されたビオチニル化ＲＴ抗原、オーダー
No. 1465333、Boehringer Mannheim, Germany
− Ｒ６：ＲＴから調製されたルテニル化ＲＴ抗原、オーダーNo. 1465333、Bo
ehringer Mannheim, Germany
【００４５】
ルテニウムで標識したＨＩＶ抗原およびそれらの調製方法は、例えば WO 96/03651に記述されている。抗原のビオチニル化は当業者に公知の方法により行う。ポリハプテンの調製はWO 96/03652に記述されている。
高い力価を有する抗ＨＩＶ陽性サンプルを２つの希釈段階でリウマチ因子（濃度：試薬１ 1 mlあたり20、70、200 U）を添加して、または添加しないで測定した。
【００４６】
実験は、ElecsysTM 2010を操作マニュアルおよび「テストプロトコール２」プログラムにしたがって用いて実施した。試験試薬は下記のように使用した。
− 容量：サンプル 50 μl、試薬１ 50μl、試薬２ 50μl、ストレプトア
ビジンビーズ 50μl
− インキュベーション時間：試薬１および試薬２をサンプルと共に９分間、ビ
ーズと共にさらに９分間
− 試薬１： Tris緩衝液、pH 8.0、ウシ血清成分、界面活性剤、防腐剤および
ビオチニル化抗原または抗体（Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５）
− 試薬２： Tris緩衝液、pH 8.0、ウシ血清成分、界面活性剤、防腐剤および
ルテニル化抗原または抗体（Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６）
【００４７】
試薬１および試薬２中の受容体Ｒ１〜Ｒ６（抗体、ポリハプテンおよびＲＴ：各場合において100-2000 ng/ml、ペプチド1 mlあたり10-100 ng)をサンプルと共に９分間インキュベートする。ストレプトアビジン被覆ビーズを加えた後、さらに９分間インキュベートしてから電気化学発光を測定する。
【００４８】
本実施例では、適切な量のヒト血清（リウマチ血清）を添加することにより、試薬１は０、20、70または200 U/mlのリウマチ因子を付加的に含む（試験混合物中のリウマチ因子の最終濃度：０、５、17.5および50 U/ml)。 実験結果を表３に示す。
【００４９】
【表３】
実験結果は、リウマチ因子の存在がフック効果をかなり減少させることを示している。希釈サンプルにおいては軽度の影響しかみられないか、または影響が全くないが、未希釈サンプルにおいては測定シグナルが大幅に増大しており、したがってフック効果はかなり弱められている。
【００５１】
【図面の簡単な説明】
【図１】異なるサンプル希釈率における抗ＨＢｃ抗体試験結果のリウマチ因子添加への依存を示す。
【図２】異なるサンプル希釈率における抗ＨＢｓ抗体試験結果のリウマチ因子添加への依存を示す。
Claims (8)
- サンプル中のアナライトの測定方法であって、干渉を減少させるために、内因性イムノグロブリンに対する自己抗体であるリウマチ因子を添加する該方法。
- （ａ）サンプルを固相、該固相に結合している、または結合可能な第１のアナライト特異的受容体、およびシグナル発生基を担持している、またはシグナル発生基に結合可能な第２のアナライト特異的受容体と接触させる工程；および（ｂ）該固相上のシグナル発生基を測定することによってアナライトの存在または／および量を検出する工程；を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記リウマチ因子が試験混合物 1 mlあたり１から1000 IUの最終濃度で存在する、請求項１または２に記載の方法。
- 固相に結合している、または結合可能な、前記リウマチ因子に対する特異的受容体をさらに用いる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 検出方法における干渉低下試薬としての、内因性イムノグロブリンに対する自己抗体であるリウマチ因子の使用。
- フック効果を減少させる、または回避するための、請求項５に記載の使用。
- 内因性イムノグロブリンに対する自己抗体であるリウマチ因子を添加することによる、イムノアッセイにおける干渉を減少させる方法。
- 干渉低下剤として、内因性イムノグロブリンに対する自己抗体であるリウマチ因子を含む、アナライトを測定するための試薬キット。
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