JP4213587B2 - 非水性溶媒を含む生物学的材料を殺菌する方法 - Google Patents

Description

本発明は、生物学的材料を殺菌し、その中の、ウイルス、細菌（マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ナノバクテリア、クラミジア、リケッチアのような細胞間−および細胞内細菌を含む）、酵母、カビ、真菌、プリオンもしくはＴＳＥに対して単独もしくは組み合わせて応答しうる同様の作用因および／または単細胞もしくは多細胞の寄生生物のような１以上の活性な生物学的汚染物または病原体のレベルを低下させる方法に関する。本発明は、特に、１以上の非水性溶媒を含む生物学的材料を照射により殺菌する方法に関する。

ヒト、獣医学、診断および／または実験の用途で調製される多くの生物学的材料には、不必要であり、潜在的に危険な生物学的汚染物または病原体、例えば、ウイルス、細菌（マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ナノバクテリア、クラミジア、リケッチアのような細胞外および細胞内の細菌を含む）、酵母、カビ、真菌、プリオン、またはＴＳＥに単独もしくは組み合わせて応答しうる同様の作用因および／または単細胞しくは多細胞寄生生物が含有される。したがって、生物学的材料中の任意の生物学的汚染物または病原体を、その製品を使用する前に不活性化することが最も重要である。例えば輸血、血液因子の置換治療、器官の移植、並びに、静脈内、筋肉内または注射もしくは導入の他の形態によって矯正されるかまたは治療されるヒトの治療の他の形態で、患者にその材料を直接投与することになっている場合、これは特に重大である。さらに、これは、様々な種類の血漿および／または血漿誘導体または他の生物学的材料を含有し、かつマイコプラズマ、プリオン、細菌性、ウイルス性および他の生物学的汚染物もしくは病原体にさらされうる細胞または組み換え細胞の培地で、またはこれらの培養物を介して調製される、様々な生物学的材料にとっても重要なことである。

生物学的材料を製造するほとんどの方法は、この材料から１以上の汚染物または１以上の病原体を除去または不活性化するのではなく、むしろこの生物学的材料を特定の生物学的汚染物または病原体についてスクリーニングまたは試験する方法を含む。生物学的汚染物または病原体について陽性の試験結果が出る製剤は単に使用しない。スクリーニングの手順の例には、血液提供者から得られたヒト血液中の特定のウイルスについて試験することが含まれる。しかしながら、かかる手順には必ずしも信頼性があるとは限らず、特に非常に数が少ない一定のウイルスの存在を検出することはできない。このことは、偽陰性結果に関連する結果を考慮すれば、試験の評価または確実性を下げる。偽陰性の結果は、ある場合、例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の場合には、生命にかかわり得る。さらに、一部の事例では、材料が汚染されているか否かを検出するのに、数か月ではないにしても、数週間かかることがある。更に、今日まで、生物学的材料内のプリオンを特定するための信頼性のある試験またはアッセイであって、潜在的なドナーまたは感染材料を洗い出すのに適したものは存在しない。これは、その材料の所望の活性をそのまま維持しながら生物学的材料内のプリオンを破壊する効果的な手段の必要性を高める役割を果たす。したがって、生物学的材料を製造する間および／またはその製造後に汚染物または病原体を殺すかまたは不活性化する技術を適用することが望まれるであろう。

生物学的材料の起源に関係なく、これらの技術の重要性は明らかである。全ての生きた細胞および多細胞生物はウイルスおよび他の病原体に感染し得る。したがって、単細胞の、天然もしくは組み換えの生物もしくは組織は、病原体による汚染のリスクを抱えている。産生する細胞または細胞培養物が感染し得るというリスクに加えて、これらおよび他の生物学的材料の加工は、周囲の汚染物に機会をもたらす。感染のリスクは、多細胞性の天然および組み換え生物、例えばトランスジェニック動物に対してより明白である。興味のあることに、遺伝子導入植物のようなヒトとは異なる種からの製品でさえも、上述のような汚染物を加工する間、および、環境または所望の植物と共に施設に共生している感染した生物からの病原体によって汚染されている、成長施設中の周囲の汚染物によるリスクを抱えている。屋外で成長された、遺伝子導入されたトウモロコシの収穫物は、成長の季節にネズミのような齧歯動物に曝されると思われる。ネズミは、しばしば致命的なハンタウイルス属のような危険なヒト病原体を宿している。これらの動物は、成長している収穫物では検出できないであろうから、動物によって撒かれたウイルスは、収穫時に遺伝子導入された材料内に持ち込まれうる。実際に、このような齧歯類は、抑制することが困難であることが周知であり、種子を撒く間、成長の間、収穫の間または貯蔵の間に収穫物に接近することができる。同様に、上空を飛ぶ鳥またはスズメ目の鳥からの汚染物は、オウム病を引き起こす作用因のような危険な病原体を伝染させる可能性がある。したがって、その起源に関わりなく、どの生物学的材料も、受容者に材料を投与する前に除去または不活性化しなければならない危険な病原体を宿す可能性がある。

ウイルスを不活性化する技術の能力を決定する実験を行う場合、関係がある実際のウイルスはほとんど利用されない。これは、試験を行う者に対する安全性への配慮と、封じ込めの設備および廃棄物処理に関連する困難性と経費の結果である。それらのかわりに、同一のファミリーおよびクラスのモデルウイルスを使用する。一般に、不活性化するのが最も困難なウイルスは、タンパク質からできている外部シェルをもつものであり、しかも、それらの中で、不活性化するのが最も困難なものは、最小サイズのものであることが認められている。このことは、それらウイルスの小型サイズが、これらの小さなゲノムに関連しているので、γ線照射および他のほとんどの照射の形態において真実であることが明らかとなっている。分子に対する放射線の直接的効果の規模は、分子のサイズに比例し、標的分子が大きくなるほど、効果が大きくなる。推論のとおり、γ線照射は、ウイルスゲノムが小さいほど、ウイルスを不活性化するのに必要な放射線量は高くなることが明らかとなった。

ヒトおよび動物に由来する生物学的材料について懸念すべきウイルスのうち、最小であり、そのため最も不活性化が困難であるものは、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）のファミリーと、わずかに大きいタンパク質で被覆された肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）に属するものである。ヒトにおいては、パルボウイルスＢ１９とＡ型肝炎は重要な作用因である。ブタ由来の材料では、対応する最小のウイルスはブタパルボウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）である。このウイルスはヒトに無害であるので、ヒトＢ１９パルボウイルスとＡ型肝炎のモデルウイルスとして選択されることが多い。このモデルパルボウイルスの不活性化の実証が、用いられている方法がヒトＢ１９ウイルスとＡ型肝炎を死滅させる適切な証拠となり、さらに、拡大解釈すると、ＨＩＶ、ＣＭＶ、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎、その他のものなどの大型で、それほど耐久性がないウイルスを死滅させる適切な証拠となると考えられる。

より最近の取り組みでは、製品中の汚染物を除去または不活性化する方法に的が絞られてきた。かかる方法には、熱処理、濾過、ならびに製品への化学不活性化剤または化学増感剤の添加が含まれる。

米国食品医薬品局の現在の基準によれば、生物学的材料の熱処理は、感受性のある生物学的材料に損傷を与え得る、最小で約１０時間、約６０℃まで製品を加熱することが必要である。実際には、熱不活性化は、ある生物学的材料の５０％以上の生物活性を無効にする可能性がある。

濾過には、物理的に汚染物を除去するために製品を濾過することが含まれる。残念ながら、またこの方法により、高分子量を有する製品も除去されるかもしれない。さらに、ある場合には、小さなウイルスはフィルタによって除去されないかもしれない。

化学増感の方法には、ウイルスのＤＮＡ／ＲＮＡに結合する有害な薬剤、および、ＵＶまたは放射線のいずれかによって活性化される有害な薬剤の添加が含まれる。この放射線は、ウイルスのＤＮＡ／ＲＮＡに結合する、ＤＮＡ／ＲＮＡバックボーン中の化学結合を切断する、および／または、ウイルスがもはや自己複製することができないようにこれを架橋結合もしくは複合体化する、反応性中間体および／または遊離基を生じさせる。この手順では、増感剤が有毒であり、変異原性または発癌性でなくとも、患者に投与することができないので、製品から未結合の増感剤を洗浄する必要がある。

γ線で製品を照射することは、製品を殺菌する別の方法である。γ線は、高い総線量で与えられる場合、ウイルスと細菌を死滅させるのに有効である（非特許文献１および非特許文献２）。しかしながら、この分野の刊行された文献には、γ線が、血液、血液製品、タンパク質およびタンパク質含有製品のような放射線感受性製品に損傷を与え得ることが教示されている。特に、高放射線量が赤血球、血小板および顆粒球にとって有害であることが示されている（非特許文献２）。特許文献１には、タンパク質製品は、タンパク質製品の効力（viability）を保持するためには、照射前に凍結しなければならないことを開示している。この特許は、「もしタンパク質材料が、例えば、周囲温度である間に、γ線が照射された場合、その材料は完全に損なわれ、すなわち、材料の活性が実質的には効果がないほど低くなる」と推断している。残念ながら、もし、照射目的で凍結し、次いで患者への投与前に解凍させたならば、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）のような感受性生物学的材料の多くは効力と活性を失う可能性がある。

米国特許第４，６２０，９０８号 Keathly et al., "Is There Life After Irradiation? Part 2," BioPharm July-August, 1993 Leitman, "Use of Blood Cell Irradiation in the Prevention of Post Transfusion Graft-vs-Host Disease," Transfusion Science 10: 219-239 (1989) Meyer and Boyd, Analytical Chem., 31, 215-219, 1959 May, et al., J. Biol. Standardization, 10, 249-259, 1982 Centers for Biologics Evaluation and Research, FDA, Docket No.89D-0140,. 83-93 ; 1990 Rohwer, Nature, 308, 5960, pp.658-662, 1984

上述の困難性を考慮して、生物学的材料を殺菌する方法であって、該材料に有害な影響なく活性な生物学的汚染物のレベルを低下させるのに効果的な方法に対する必要性がまだ存在する。

上記参考文献は、追加のまたは代替の、詳細な、特徴的な、および/または技術的な背景の適切な教示のために、適切な場合には、参考文献として取り込む。

本発明の目的は、少なくとも上記問題および/または不利益を解決し、少なくとも以下に説明される利点を提供することである。

したがって、生物学的材料を殺菌する方法であって、該材料に悪影響を及ぼすことなく活性な生物学的汚染物または病原体のレベルを低下する方法を提供することが本発明の目的である。本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の好ましい実施形態の詳細な記述に記載されており、一部は、その記載から明白になるか、あるいは本発明の実施により理解することができる。本発明のこれらの目的および利点は、記載した記述において特に指摘した組成物と方法、ならびにこれについての特許請求の範囲によって実現され達成される。

これらの目的および他の目的に従って、本発明の第１の実施形態は、放射線に感受性であり、非水性溶媒を含む生物学的材料を殺菌するための方法であって、生物学的材料を放射線で、該材料を殺菌し、且つ放射線から該材料を保護するのに有効な割合で、該材料を殺菌するのに有効な時間、照射することを含む方法に向けられる。

本発明の他の実施形態は、（ｉ）生物学的材料を、放射線から保護するのに有効な量の少なくとも１種の安定剤を、生物学的材料に添加することと、（ｉｉ）生物学的材料を、放射線により該材料を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含む、放射線感受性であり、非水性溶媒を含む、生物学的材料を殺菌する方法に向けられる。

本発明の他の実施形態は、（ｉ）生物学的材料を放射線から保護するのに有効なレベルまで生物学的材料の残留溶媒含有量を低下させることと、（ｉｉ）生物学的材料を、放射線により生物学的材料を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含む、放射線感受性であり、非水性溶媒を含む、生物学的材料を殺菌する方法に向けられる。

本発明の他の実施形態は、（ｉ）生物学的材料を放射線から保護するのに有効なレベルまで生物学的材料の温度を低下させることと、（ｉｉ）生物学的材料を放射線により、生物学的材料を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含む、放射線感受性であり、非水性溶媒を含む、生物学的材料を殺菌する方法に向けられる。

本発明の他の実施形態は、（ｉ）（ａ）生物学的材料の残留溶媒含有量を低下させること、（ｂ）生物学的材料に少なくとも１種の安定剤を添加すること、および（ｃ）生物学的材料の温度を低下すること、より成る群から選択される安定化の工程を生物学的材料に適用することと、（ｉｉ）生物学的材料を、放射線により生物学的材料を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含み、該安定化の工程および照射の割合が、共に放射線から生物学的材料を保護するのに効果的である、放射線感受性であり非水性溶媒を含有する、生物学的材料を殺菌する方法に向けられる。

本発明の他の実施形態は、（ｉ）（ａ）生物学的材料の残留溶媒含有量を低下させること、（ｂ）生物学的材料に少なくとも１種の安定剤を添加すること、および（ｃ）生物学的材料の温度を低下すること、より成る群から選択される少なくとも２種の安定化の工程を生物学的材料に適用することと、（ｉｉ）生物学的材料を、放射線により生物学的材料を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含み、該安定化の工程が任意の順序で行われ、共に放射線から生物学的材料を保護するのに効果的である、放射線感受性であり、非水性溶媒を含む、生物学的材料を殺菌する方法に向けられる。

本発明はまた、放射線による殺菌後、それの企図する使用のために製剤を保存するのに有効な量で生物学的材料および非水性溶媒を含む組成物を提供する。

本発明はまた、少なくとも１種の生物学的材料と、少なくとも１種の非水性溶媒と、少なくとも１種の安定剤を含む組成物であって、該非水性溶媒および安定剤が、放射線による殺菌後、それの企図する使用のためにこの材料を保存するのに有効な量で存在する組成物を提供する。

本発明の追加の利点、目的、および特徴は以下の記述で部分的に説明され、一部は、以下の実験で当業者に明らかになるか、または本発明の実施により理解することができる。本発明の目的および利点は、添付の特許請求の範囲に特に指摘されたとおりに実現され達成され得る。

本発明は、添付の図面を参照して詳細に説明される。これらの図面では、同じ参照番号は同じ要素を指す。

Ａ．定義
他に特に定めがない限り、本明細書において用いられているすべての技術的および科学用語は、関連技術分野の技術者によって一般に理解されているのと同じ意味を有することを意図している。

本明細書で使用する用語、単数形を示す「１つの（ａ）」「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」には、文脈に他に特段の明らかな指示がない限り、複数の言及を含んでいる。

本明細書で使用される、「殺菌」という用語は、本発明にしたがって処理される生物学的材料中に見出される少なくとも１種の活性な生物学的汚染物または病原体のレベルの低減を意味することを意図している。

本明細書で使用される、「生物学的材料」という用語は、生きた生物に由来するか、またはこれから得られる任意の物質を意味することを意図している。生物学的材料の例示には、以下のものが含まれるがこれらに制限されない：細胞；組織；血液もしくは血液成分；組み換えおよびトランスジェニックタンパク質、並びにタンパク質様材料を含めたタンパク質；消化酵素、例えばトリプシン、キモトリプシン、α−ガラクトシダーゼおよびイズロノデート−２−スルファターゼ（ｉｄｕｒｏｎｏｄａｔｅ−２−ｓｕｌｆａｔａｓｅ）などを含めた酵素；モノおよびポリ免疫グロブリンを含めた免疫グロブリン；植物性薬品；食品など。生物学的材料の好ましい例には、以下のものが含まれるがこれらに限定されない：靱帯；腱；神経；脱塩された骨基質、移植片、関節、大腿骨、大腿骨頭などを含めた骨；歯；皮膚移植片；骨髄細胞懸濁物（全体または加工されたもの）を含めた骨髄；心臓弁；軟骨；角膜；動脈および静脈；心臓、肝臓、肺、腎臓、腸、膵臓、肢および趾のような移植用の器官を含めた器官；脂質；炭水化物；天然、無原線維性、アテロメリック（ａｔｅｌｏｍｅｒｉｃ）、可溶性および不溶性、組み換えおよびトランスジェニック、天然配列および修飾されたものを含めたコラーゲン；ＮＯ−カルボキシキトサン（ＮＯＣＣ）を含めたキチンおよびその誘導体；幹細胞、ランゲルハンス細胞の小島および遺伝子組み換え細胞を含む他の移植用の細胞；赤血球細胞；単球を含めた白血球細胞；並びに血小板。

本明細書で使用される、「非水性溶媒」という用語は、生物学的材料を溶解または懸濁でき、無機溶媒およびより好ましくは有機溶媒の両方を含む、水以外の任意の液体を意味することを意図している。好適な非水性溶媒の例示には以下のものが含まれるがこれに限定されない：ペンタン、２−メチルブタン（イソペンタン）、ヘプタン、ヘキサン、シクロペンタンおよびシクロヘキサンのようなアルカンおよびシクロアルカン；メタノール、エタノール、２−メトキシエタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ブタンジオール、プロパンジオールおよびオクタノールのようなアルコール；酢酸エチル、酢酸２−メトキシエチル、酢酸ブチルおよび安息香酸ベンジルのようなエステル；ベンゼン、トルエン、ピリジン、キシレンのような芳香族化合物；ジエチルエーテル、２−エトキシエチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテルおよびメチルｔ−ブチルエーテルのようなエーテル；ホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドのようなアルデヒド；アセトンおよび３−ペンタノン（ジエチルケトン）のようなケトン；エチレングリコールおよびプロピレングリコールのようなモノマーグリコール、および、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、例えばＰＰＧ４００、ＰＰＧ１２００およびＰＰＧ２０００のようなポリマーグリコールの両方を含めたグリコール；蟻酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、リン酸および無水酢酸のような酸および酸無水物；綿実油、落花生油、培養培地、ポリエチレングリコール、ケシの実の油、べにばな油、ゴマ油、大豆油および植物油のような油；ピペリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドおよびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドのようなアミンおよびアミド；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；ベンゾニトリルおよびアセトニトリルのようなニトリル；ヒドラジン；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）およびモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）、トリトンおよびドデシル硫酸ナトリウムのような洗剤；二硫化炭素；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロベンゼン、１，２−ジクロロエタン、テトラクロロエチレンおよび１−クロロブタンのようなハロゲン化溶媒；テトラヒドロフランのようなフラン；１，４−ジオキサンのようなオキサン；およびグリセリン／グリセロール。他の好ましい非水性溶媒には、ホルムアミド；ソルトール；マンニトール；プロブコールおよびミリスチン酸イソプロピルが含まれる。好適な非水性溶媒の特に好ましい例には、安定剤としても機能する非水性溶媒、例えばエタノールおよびアセトンが含まれる。

本明細書で使用される、「生物学的汚染物または病原体」という用語は、生物学的材料と直接的にまたは間接的に接触した際に、生物学的材料、またはその受容者に悪効果を及ぼし得る汚染物または病原体を意味することを意図する。かかる生物学的汚染物または病原体には、一般に、生物学的材料中で発見されるか、あるいは該材料を感染させることが当業者に知られている、種々のウイルス、細菌（マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ナノバクテリア、クラミジア、リケッチアのような細胞間および細胞内の細菌を含む）、酵母、カビ、真菌、プリオンまたはＴＳＥに単独もしくは組み合わせて応答しうる同様の作用因および／または単細胞しくは多細胞寄生生物が含有される。生物学的汚染物または病原体の例としては、以下のものが含まれるがこれに限定されない：ヒト免疫不全ウイルスおよび他のレトロウイルス、ヘルペスウイルス、フィロウイルス、シルコウイルス、パラミクソウイルス、サイトメガロウイルス、肝炎ウイルス（Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎、およびそれらの変異体を含む）、ポックスウイルス、トーガウイルス、エプスタインバーウイルスおよびパルボウイルスのようなウイルス；エシェリヒア属、バチルス属、カンピロバクター属、ストレプトコッカス属およびスタファロコッカス属のような細菌；トリパノゾーマ属とマラリア原虫（プラズモディウム種を含む）のような寄生生物；酵母；カビ；真菌；マイコプラズマおよびウレアプラズマ；クラミジア；Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｔｉのようなリケッチア；並びに、プリオンおよび動物の伝達性海綿状脳症として知られる１以上の疾患状態、例えば、スクラピー、ミンクの伝染性脳症、慢性消耗病（ミュールジカおよびヘラジカで一般に観測される）、ネコの海綿状脳症、ウシの海綿状脳症（狂牛病）、クロイツフェルト−ヤコブ病（変異型ＣＪＤを含む）、致命的な家族性不眠症、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｅｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群、クールー；およびアルパーズ症候群に対して、単独または組み合わせて応答しうる同様の作用因。本明細書で使用する、「活性な生物学的汚染物または病原体」という用語は、単独でまたは他の因子、例えば第２の生物学的汚染物もしくは病原体または天然のタンパク質（野生型または突然変異体）または抗体と組み合わせて、生物学的材料および／またはその受容者に悪効果を及ぼす可能性がある生物学的汚染物または病原体を意味することを意図する。

本明細書で使用される、「血液成分」という用語は、全血から分離することができる１以上の成分を意味することを意図しており、以下のものを含むがこれらに限定されない：赤血球細胞、白血球細胞および血小板のような細胞性血液成分；血液凝固因子、酵素、アルブミン、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、免疫グロブリンのような血液タンパク質；および血漿、血漿タンパク質画分（ＰＰＦ）、寒冷沈降物、血漿画分および血漿含有組成物のような液体血液成分。

本明細書で使用される、「細胞性血液成分」という用語は、赤血球細胞、白血球細胞、幹細胞および血小板のような細胞を含む全血の１以上の成分を意味することを意図する。

本明細書で使用される、「血液タンパク質」という用語は、全血中に通常見出される１以上のタンパク質を意味することを意図する。ヒトを含めた哺乳動物に見出される血液タンパク質の例示には以下のものが含まれるがこれらに限定されない：凝固因子（ファクターＶＩＩおよびファクターＩＸのようなビタミンＫ−依存性のものおよびファクターＶＩＩＩおよびフォン・ビルブラント因子のようなビタミンＫ−非依存性のものの両方）；アルブミン；高密度リポタンパク質および低密度リポタンパク質を含めたリポタンパク質；相補性タンパク質；免疫グロブリンＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＥのようなグロブリンなど。血液タンパク質の好ましいグループは、ファクターＩ（フィブリノーゲン）、ファクターＩＩ（プロトロンビン）、ファクターＩＩＩ（組織因子）、ファクターＶ（プロアクセレリン）、ファクターＶＩ（アクセレリン）、ファクターＶＩＩ（プロコンベルチン、血清プロトロンビン変換体）、ファクターＶＩＩＩ（抗血友病因子Ａ）、ファクターＩＸ（抗血友病因子Ｂ）、ファクターＸ（スチュアート−プラウアー因子）、ファクターＸＩ（血漿トロンボプラスチン前駆体）、ファクターＸＩＩ（ハーゲマン因子）、ファクターＸＩＩＩ（プロトランスグルタミナーゼ）、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）、ファクターＩａ、ファクターＩＩａ、ファクターＩＩＩａ、ファクターＶａ、ファクターＶＩａ、ファクターＶＩＩａ、ファクターＶＩＩＩａ、ファクターＩＸａ、ファクターＸａ、ファクターＸＩａ、ファクターＸＩＩａおよびファクターＸＩＩＩａ。血液タンパク質の他の好ましいグループには、ヘモグロビンおよび種々の成長因子、並びにこれらのタンパク質の誘導体のような赤血球細胞内に見出されるタンパク質が含まれる。更に別の、血液タンパク質の好ましいグループには、Ｐｌａｓｍａ−Ｐｌｅｘ（登録商標）（Ｃｏｎｔｅｏｎ／Ａｖｅｎｔｉｓ Ｂｅｈｒｉｎｇ）、Ｐｒｏｔｅｎａｔｅ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ（登録商標）（Ｂａｙｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）およびＰｌａｓｍａｔｅｉｎ（登録商標）（Ａｌｐｈａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）のような商業的に利用可能な血漿タンパク質画分製品が含まれる。

本明細書で使用される、「液体血液成分」という用語は、血漿（凝固に先立って見出される、ヒトまたは動物の全血の、液体の非細胞性部分）および血清（凝固の後に見出される、ヒトまたは動物の全血の、液体の非細胞性部分）のような、液体の１以上の非細胞性成分を意味することを意図している。

本明細書で使用される、「生物学的適合溶液」という用語は、生物学的材料が、例えば、懸濁または溶解されることによって暴露され、かつ、生存可能に維持されている溶液、すなわち、それらの本質的な生物学的および生理学的特性を保持する溶液を意味することを意図する。

本明細書で使用される、「生物学的適合緩衝溶液」という用語は、生物学的適合溶液であって、その中の材料の完全性を維持するのに適切なｐＨ特性および浸透圧特性（例えば、張性、オスモル濃度および／またはコロイド浸透圧）を有する生物学的適合溶液を意味することを意図する。好適な生物学的適合緩衝溶液は、一般に、４から８．５のｐＨを有しており、等張性であるか、あるいは、ほんのわずか低張性または高張性である。生物学的適合緩衝溶液は知られており、当業者によって容易に利用され得る。

本明細書で使用される、「安定剤」という用語は、照射される生物学的材料への損傷を、該材料の安全性と有効な利用を妨げるのには不十分なレベルまで低下させる化合物または材料を意味することを意図する。安定剤の例示には、これに限定されるものではないが、以下の物が含まれる：抗酸化剤；ｔｅｒｔ−ブチル−ニトロソブタン（ｔＮＢ）、α−フェニル−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン（ＰＢＮ）、５，５−ジメチルピロリン−Ｎ−オキシド（ＤＭＰＯ）、ｔｅｒｔ−ブチルニトロソベンゼン（ＢＮＢ）、α−（４−ピリジル−１−オキシド）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン（４−ＰＯＢＮ）および３，５−時ブロモ−４−ニトロソ−ベンゼンスルホン酸（ＤＢＮＢＳ）のような、スピントラップ剤を含めた、遊離基補足剤；組み合わせ型安定剤、すなわちタイプＩおよびタイプＩＩの両方の光力学的反応を消光する際に有効な安定剤；および結合している分子を安定化する、ヘパリンのようなリガンド。安定剤の好ましい例には以下のものが含まれるがこれらに限定されない：エタノール；アセトン；６，８−ジメルカプトオクタン酸（リポ酸）およびその誘導体および類似体（アルファ、ベータ、ジヒドロ、ビスノおよびテトラノルリポ酸）、チオクト酸、６，８−ジメルカプトオクタン酸、ジヒドロロポエート（ＤＬ−６，８−ジチオールオクタン酸メチルエステル）、リポアミド、ビソノルメチルエステルおよびテトラノルジヒドロリポ酸、フラン脂肪酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、およびそれらの塩類および誘導体を含めた脂肪酸；ケルセチン、ルチンおよびその誘導体、アピゲニン、アミノフラボン、カテキン、ヘスペリジン、およびナリンギンのような、フラボノイド、フェニルプロパノイドおよびフラベノール；β−カロチンを含めたカロチン；Ｃｏ−Ｑ１０；キサントフィル；グリセロール、マンニトールのような多価アルコール；キシロース、グルコース、リボース、マンノース、フルクトースおよびトレハロースのような糖；ヒスチジン、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、グルタミン酸、トリプトファン、カプリル酸ナトリウム、Ｎ−アセチルトリプトファン、およびメチオニンのようなアミノ酸およびその誘導体；アジ化ナトリウムのようなアジ化物；スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）およびカタラーゼのような酵素；１，３−ジメチル尿酸およびジメチルチオ尿素のような尿酸およびその誘導体；アロプリノール；グルタチオンおよび還元グルタチオンおよびシステインのようなチオール；セレンのような微量元素；ビタミンＡ、ビタミンＣ（アスコルビン酸ナトリウムおよびパルミトイルアスコルビン酸のようなその誘導体および塩類を含む）、ならびにビタミンＥ（および酢酸トコフェロールとα−トコトリエノールのようなその誘導体および塩類）のようなビタミン；クロマノール−アルファ−Ｃ６；６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマ−２ カルボン酸（トロロクス）および誘導体；ゼラチンおよびアルブミンのような外来タンパク質；トリス−３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン（ＭＣＩ−１８６）；シチオロン；プエルセチン；クリシン；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）；イミダゾール；メトキシソラレン（ＭＯＰＳ）；１，２−ジチアン−４，５−ジオール；ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）およびブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）のような還元物質；コレステロール；プロブコール；インドール誘導体；チメロサール；ラザロイドおよびチリラザドメシレート（tirilazad mesylate）；プロアンテノール；プロアントシアニジン；硫酸アンモニウム；ペゴルゴテイン（ＰＥＧ−ＳＯＤ）；Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−アルファ−フェニルニトロン（ＰＥＮ）；４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（Ｔｅｍｐｏｌ）；アスコルビン酸塩、尿酸塩およびトロロクスＣの混合物（Ａｓｃ／ｕｒａｔｅ／Ｔｒｏｌｏｘ Ｃ）；グリシルグリシンおよびカルノシンのようなタンパク質およびペプチドであって、各アミノ酸がそのＤまたはＬ形態であり得るもの；ジオスミン；ププロガリン（ｐｕｐｕｒｏｇａｌｉｎ）；これに限定されるものではないが、没食子酸プロピルを含めた没食子酸とその誘導体；ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウムおよびシリマリン。追加の好ましい安定剤には、プロピレングリコール；ブタンジオール；ホルムアミド；ソルトール；ＤＭＥＭ；没食子酸プロピル；クエン酸塩；プロパンジオール；ミリスチン酸イソプロピル；クマル酸；ＰＶＰおよびこれらの混合物が含まれる。特に好ましい例には、タイプＩおよびタイプＩＩの両方の光力学的反応を消光する際に効果的な単一安定剤または安定剤の組み合わせ、および、気体として適用できおよび／またはエバポレーション、低圧および同様な方法で容易に除去可能である揮発性安定剤が含まれる。

本明細書では、「残留溶媒含有量」という用語は、生物学的材料中の遊離している液体の量または割合を意味することを意図する。遊離している液体（freely available liquid）は、殺菌される生物学的材料中に存在する水または有機溶媒（例えば、エタノール、イソプロパノール、アセトン、ポリエチレングリコールなど）のような液体であって、該材料の１種以上の非液体成分と結合しないかもしくは複合体を形成しないものを意味する。遊離している液体には細胞内の水が含まれる。本明細書で記載されている水のような関連のある残留溶媒含有量は、ＦＤＡ承認の変法カールフィッシャー法（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）によって決定されたレベルを意味する。他の溶媒の残留レベルの定量は、どの溶媒を使用するかに応じて、当技術分野でよく知られている手段によって決定することができる。また、溶質と残留溶媒の比率は、溶媒内の溶質の濃度を反映したものであると考えることができる。そのように表現されている場合、溶質の濃度が高いほど、残留溶媒の量は低い。

本明細書で使用される、「増感剤」という用語は、ウイルス性汚染物、細菌性汚染物、プリオン汚染物、および／または寄生生物汚染物を選択的に標的とし、放射線による不活性化に対してそれらをより感受性にし、その結果、増感剤非含有の場合よりも、放射線の割合もしくは線量を低くして使用する、および／または、照射時間を短くして使用することができる物質を意味することを意図する。好適な増感剤をの例示には、これに限定されるものではないが、以下の物が含まれる：ソラレンおよびその誘導体および類似体（３−カルボエトキシソラレンを含む）；イナクチンおよびその誘導体および類似体；ハロゲン置換基および、第四級アンモニウムイオンまたはホスホニウムイオンのような水可溶化部分を含有するアンゲリシン、ケリンおよびクマリン；核酸結合化合物；臭素化ヘマトポルフィリン；フタロシアニン；プルプリン；ポルホリン；ジヘマトポルフィリンエステルのハロゲン化誘導体または金属原子置換された誘導体、ヘマトポルフィリン誘導体、ベンゾポルフィリン誘導体、ヒドロジベンゾポルフィリンジマレイミド、ヒドロジベンゾポルフィリン、ジシアノジスルホン、テトラカルボエトキシヒドロジベンゾポルフィリン、およびテトラカルボエトキシヒドロジベンゾポルフィリンジプロピオンアミド；ハロゲンまたは金属原子で修飾されていてもよいドキソルビシンおよびダウノマイシン；ネトロプシン；ＢＤペプチド、Ｓ２ペプチド；Ｓ−３０３（ＡＬＥ化合物）；ヒペリシン、メチレンブルー、エオシン、フルオレセイン（およびそれらの誘導体）、フラビン、メロシアニン５４０のような色素；ベルガプテンのような光活性化合物；ならびにＳＥペプチド。加えて、プリオンに結合し、これによって放射線による不活性化に対するこれらの感受性を高める原子も使用することができる。このような原子の例示は銅イオンであろう。このイオンは、先のタンパク質に結合し、タンパク質内の他の原子よりも高いＺ数により、照射、特にガンマ線照射の間にプリオンタンパク質がエネルギーを吸収する確率を高める。

本明細書で使用される、「タンパク質様材料」という用語は、少なくとも１種のタンパク質またはペプチド含む生きた生物から誘導されるかまたはそれから得られる任意の材料を意味することを意図している。タンパク質様材料は、天然に存在する材料（その本来の状態または加工／精製および／または誘導体化の後のもの）、または、化学合成もしくは組み換え／トランスジェニック技術および必要に応じて加工／精製および／または誘導体化することにより製造された、人工的に製造された材料であり得る。タンパク質様材料の例示には以下のものが含まれるがこれに限定されない：細胞培養で製造されるタンパク質およびペプチド；乳および乳製品；腹水；ホルモン；成長因子；動物組織から抽出または単離された医薬品（例えばヘパリンおよびインスリン）、または植物質を含めた材料；新鮮な画分、凍結した画分および凍結乾燥した画分、および血漿タンパク質画分を含めた血漿；フィブリノーゲンおよびこれらの誘導体、フィブリン、フィブリンＩ、フィブリンＩＩ、可溶性フィブリンおよびフィブリンモノマー、および／またはフィブリンシーラント製品；全血；タンパク質Ｃ；タンパク質Ｓ；α−１抗トリプシン（α−１プロテアーゼ阻害剤）；ブチル−コリンエステラーゼ；クマリンの医薬品（ワルファリン）のような抗凝固剤；ストレプトキナーゼ；組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；ウロキナーゼ；ノイポゲン（ｎｅｕｐｏｇｅｎ）；抗トロンビン−３；α−グルコシダーゼ；（胎児）ウシ血清／ウマ血清；獣肉；抗血清、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、遺伝子工学で改良または産生された抗体を含めた免疫グロブリン；アルブミン；α−グロブリン；β−グロブリン；γ−グロブリン；凝固タンパク質；相補性タンパク質；およびインターフェロン。

本明細書で使用される、「放射線」という用語は、照射される生物学的材料の少なくとも幾つかの成分を殺菌するのに十分なエネルギーの放射線を意味することを意図する。放射線の種類は、これに限定されるものではないが、以下のもの、すなわち、（ｉ）微粒子（ニュートロン、電子および／または陽子のような亜原子粒子の流れ）；（ｉｉ）電磁気（電波、可視光線（単色および多色）および不可視光線、紫外線、Ｘ線、γ線、ならびにそれらが混ぜ合わさったもののような種々の電磁界から発生するもの）、および（ｉｉｉ）音波および圧力波が含まれる。かかる放射線は、γ線ようなイオン化（照射された材料中でイオンを生じうる）放射線として、および、可視光線のような非イオン化放射線として記載されていることが多い。かかる放射線源はいろいろであるが、一般に、十分な放射線が、殺菌を行うのに適切な時間かつ適切な割合で与えられる限り、特定の照射源の選択は、重要ではない。実際には、γ線は通常、コバルトまたはセシウムのアイソトープにより発生するが、一方、紫外線およびＸ線は、それぞれ紫外線およびＸ線を放射する装置により発生され、そして、電子は、機械による発生が含まれる「電子ビーム」照射として知られている方法で材料を殺菌するために用いられることが多い。可視光線は、単色および多色の両方とも、機械によって発生され、実際には同じ機械または異なる機械で発生される赤外線および紫外線のような不可視光線と組み合わされうる。

本明細書で使用される、「保護する」という用語は、照射される生物学的材料に対する任意の損傷、さもなければ、その材料の照射によって起こるであろう任意の損傷を、照射後の材料の安全性と有効な使用を妨げるのには不十分なレベルまで、低下させることを意味することを意図する。言い換えれば、物質または実行するプロセスの存在が、その物質またはプロセスが存在しない場合よりも照射による材料の損傷を低下させるのであれば、その物質またはプロセスは、照射から生物学的材料を「保護」する。したがって、生物学的材料は、その材料を「保護する」物質の存在下で照射を行った後、またはその材料を保護するプロセスの実行後に照射を行った後では、安全且つ有効に使用できるが、同一の条件下であるがその物質の非存在下またはそのプロセスを実行しないで照射した後では、安全且つ有効に使用することはできない。

本発明で使用される、損傷の「許容できるレベル」は、使用される本発明の特定の方法の特定の特徴、例えば個々の生物学的材料の性質および特性、および／または使用される非水性溶媒、および／または照射される生物学的材料の意図した使用に依存して変化し得、これは当業者によって経験的に決定することができる。したがって、損傷の「許容できないレベル」は、殺菌される生物学的材料の安全で有効な使用を妨げる損傷のレベルである。所与の生物学的材料の損傷の特定のレベルは、当業者に公知の方法および技術のいずれかを用いて決定することができる。
Ｂ．特に好ましい実施形態
本発明の第１の実施形態は、放射線に感受性である生物学的材料を殺菌する方法であって、該材料を殺菌し、且つ該材料を放射線から保護するのに有効な割合で、該材料を殺菌するのに有効な時間、放射線により生物学的材料を照射することを含む方法に向けられる。

本発明の別の実施形態は、（ｉ）生物学的材料を放射線から保護するのに有効な量で少なくとも１種の安定剤を、生物学的材料に添加することと、（ｉｉ）生物学的材料を、放射線によりこの材料を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含む、放射線に感受性であり、非水性溶媒を含む、生物学的材料を殺菌する方法に向けられる。

本発明の他の好ましい実施形態は、（ｉ）生物学的材料を放射線から保護するのに有効なレベルまで生物学的材料の残留溶媒含有量を低下させることと、（ｉｉ）生物学的材料を、放射線により生物学的材料を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含む、放射線に感受性であり、非水性溶媒を含む、生物学的材料を殺菌する方法に向けられる。

本発明の他の好ましい実施形態は、（ｉ）生物学的材料を放射線から保護するのに有効なレベルまで生物学的材料の温度を低下させることと、（ｉｉ）生物学的材料を、放射線により生物学的材料を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含む、放射線に感受性であり、非水性溶媒を含む、生物学的材料を殺菌する方法に向けられる。

本発明の他の好ましい実施形態は、（ｉ）（ａ）生物学的材料の残留溶媒含有量を低下させること、（ｂ）生物学的材料に少なくとも１種の安定剤を添加すること、および（ｃ）生物学的材料の温度を低下すること、より成る群から選択される安定化の工程を生物学的材料に適用することと、（ｉｉ）生物学的材料を、放射線により生物学的材料を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含み、該安定化の工程および照射の割合が、共に放射線から生物学的材料を保護するのに効果的である、放射線に感受性であり、非水性溶媒を含む、生物学的材料を殺菌する方法に向けられる。

本発明の他の好ましい実施形態は、（ｉ）（ａ）生物学的材料の残留溶媒含有量を低下させること、（ｂ）生物学的材料に少なくとも１種の安定剤を添加すること、および（ｃ）生物学的材料の温度を低下すること、より成る群から選択される安定化の工程を生物学的材料に適用することと、（ｉｉ）生物学的材料を、放射線により生物学的材料を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含み、該安定化の工程が任意の順序で行われ、共に放射線から生物学的材料を保護するのに効果的である、放射線に感受性であり、非水性溶媒を含む、生物学的材料を殺菌する方法に向けられる。

本発明の他の好ましい実施形態は、生物学的材料および放射線による殺菌の間に製剤を保護するのに有効な量で非水性溶媒を含み、これによってその意図した使用に適切且つ有効なままである組成物に向けられる。

本発明の他の好ましい実施形態は、少なくとも１種の生物学的材料、少なくとも１種の非水性溶媒および少なくとも１種の安定剤を含む組成物であって、非水性溶媒および安定剤が、共に、照射による殺菌の後のその意図した使用のために該材料を保護するのに効果的な量で存在する組成物に向けられる。

非水性溶媒は、照射の際に遊離基を形成する傾向のない非水性溶媒あることが好ましく、照射の際に遊離基を形成する傾向がなく、且つ溶解された、酸素または照射の際に遊離基を形成する傾向のある１または複数の他のガスがほとんどないかあるいは全く存在しない非水性溶媒であることがより好ましい。揮発性非水性溶媒が特に好ましく、安定剤である非水性溶媒、例えばエタノールおよびアセトンが特に好ましい。

本発明の特定の実施形態によれば、生物学的材料は水および非水性溶媒、例えばエタノールおよび／またはアセトンの混合物を含有し得る。このような実施形態では、１または複数の非水性溶媒は、照射の際に遊離基を形成する傾向のない非水性溶媒であることが好ましく、照射の際に遊離基を形成する傾向がなく、且つ溶解された、酸素または照射の際に遊離基を形成する傾向のある１または複数の他のガスがほとんどないかあるいは全く存在しない非水性溶媒であることが最も好ましい。揮発性非水性溶媒が特に好ましく、安定剤である非水性溶媒、例えばエタノールおよびアセトンが特に好ましい。

本発明の特定の方法に従えば、安定剤は非水性溶媒を含む生物学的材料を放射線で照射する前に添加される。この安定剤は、放射線から生物学的材料を保護するのに有効な量で非水性溶媒を含む生物学的材料に添加されることが好ましい。代替法として、安定化剤は、非水性溶媒と共に、放射線から生物学的材料を保護するのに有効な量で非水性溶媒を含む生物学的材料に添加されることが好ましい。安定剤の適切な量は、使用される本発明の特定の方法の特定の特徴、例えば使用される特定の安定剤および／または照射される非水性溶媒を含む特定の生物学的材料の性質および特性および／またはその意図した使用に依存して変動し得、その量は当業者によって経験的に決定することができる。

本発明の特定の方法によれば、非水性溶媒を含む生物学的材料の残留溶媒含有量は、放射線による生物学的材料の照射前に低下される。残留溶媒含有量は、生物学的材料を放射線から保護するのに有効レベルまで低下されることが好ましい。好適なレベルの残留溶媒含有量は、使用されている本発明の特定の方法の特定の特徴、例えば照射されている非水性溶媒を含む特定の生物学的材料の性質および特性および／またはその意図した使用に依存して変動し得、その含有量は、当業者によって経験的に決定することができる。具体的な値よりも、特定の範囲内に残留溶媒含有量を維持することが望ましい、生物学的材料が存在しうる。

本発明の特定の実施形態によれば、非水性溶媒を含む生物学的材料が水も含む場合、生物学的材料の残留溶媒（水）含有量は、水を溶解することができる非水性溶媒に、非水性溶媒を含む生物学的材料を溶解するかまたは懸濁することによって低下させることができる。生物学的材料が液相中にある場合、液体の非水性溶媒の添加による残留溶媒（水）の希釈によって同様の結果を達成することもできる。好ましくは、このような第二の非水性溶媒は、照射の際に遊離基を形成する傾向がなく、且つ、溶解された、酸素または照射の際に遊離基を形成する傾向のある１または複数の他のガスがほとんどないかあるいは全く存在しない。

非水性溶媒を含む生物学的材料が液相中にある場合、残留溶媒含有量の低下は、溶質の濃度を高めることによるなどの、多くの手段のいずれかによって達成することができる。この手段では、溶媒内に溶解された、非水性溶媒を含む生物学的材料内のタンパク質の濃度を、一般には少なくとも約０．５％、典型的には少なくとも約１％、通常は少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１５％、更に好ましくは少なくとも約２０％、更により好ましくは少なくとも約２５％、最も好ましくは少なくとも約５０％に増加することができる。

本発明の特定の実施形態では、非水性溶媒を含む生物学的材料の残留溶媒含有量は、具体的な値よりも、特定の範囲内にあることが見出され得る。非水性溶媒を含む特定の生物学的材料の好ましい残留溶媒含有量に対するこのような範囲は、当業者によって経験的に決定することができる。

いかなる操作性の理論に拘束されるものではないが、残留溶媒含有量の低下は、非水性溶媒を含む生物学的材料の自由度を下げること、遊離基を生成する標的数を減少すること、およびこれらの遊離基の溶解性を制限し得ることが考えられる。したがって、同様の結果は、その共融点未満またはその凝固点未満に、非水性溶媒を含む生物学的材料の温度を下げることによって、または、該生物学的材料の自由度を同じように下げるためにガラス化することによって達成することができるであろう。これらの結果は、他の場合で許容されるものよりも高い割合および／または線量の放射線の使用を可能にし得る。したがって、本明細書に開示された方法は、非水性溶媒を含む生物学的材料に許容できない損傷、すなわち生物学的材料の安全で有効な使用を妨げるであろう損傷、を生じない任意の温度で実施することができる。好ましくは、本明細書に開示された方法は、周囲温度または周囲温度未満、例えば照射される非水性溶媒を含む生物学的材料の共融点もしくは凝固点未満で行われる。

非水性溶媒を含む生物学的材料の残留溶媒含有量は、生物学的材料に許容できないレベルの損傷を生じさせることなく、非水性溶媒を含む生物学的材料から溶媒を減少させるための、当業者に公知の方法および技術のいずれかによって低下させることができる。このような方法には、溶質の添加、エバポレーション、濃縮、遠心による濃縮、ガラス化および噴霧乾燥が含まれるがこれらに限定されない。

非水性溶媒を含む生物学的材料の残留溶媒含有量を低下させるための特に好ましい方法は、凍結乾燥である。

非水性溶媒を含む生物学的材料の残留溶媒含有量を低下させるための他の好ましい方法は、溶質の添加である。

非水性溶媒を含む生物学的材料の残留溶媒含有量を低下させるための他の好ましい方法は、噴霧乾燥である。

非水性溶媒を含む生物学的材料の残留溶媒含有量を低下させるための他の好ましい方法は、ガラス化である。この方法は、当業者に公知に方法および技術のいずれかで実現することができ、これには例えば、非水性溶媒を含む生物学的材料の共融点を上げるために溶質および追加の溶質（例えば蔗糖）を添加し、これに続いて残留溶媒を除去するために非水性溶媒を含む生物学的材料に減圧を徐々に適用することが含まれる。得られたガラス状材料は、残留溶媒含量が低下されている。

本発明の特定の方法によれば、殺菌される非水性溶媒を含む生物学的材料は、当業者によく知られておりその者に利用可能な手段によって、固体表面上に固定化することができる。例えば、殺菌される非水性溶媒を含む生物学的材料は、生物学的または非生物学的基材上のコーティングとしてまたはその上の表面として存在し得る。

本発明の方法で使用される放射線は、処理される非水性溶媒を含む生物学的材料の殺菌に有効な任意の放射線であり得る。放射線は電子ビームを含めた微粒子であり得る。好ましくは、放射線は、ｘ−線、赤外線、可視光線、紫外線、および様々な波長の電磁放射線の混合したものを含めた電磁放射線である。特に好ましい放射線の形態はγ線である。

本発明の方法によれば、非水性溶媒を含む生物学的材料は、該生物学的材料の殺菌に有効であるが、その材料に許容できないレベルの損傷をもたらさない割合で、放射線により照射される。照射の適切な割合は、使用される本発明の方法の特定の特徴、例えば照射される非水性溶媒を含む生物学的材料の性質および特性、関係のある放射線の特定の形態、および／または不活性化される特定の生物学的汚染物または病原体、に依存して変化し得る。照射の適切な割合は、当業者によって経験的に決定され得る。照射の割合は殺菌手順の継続期間中一定であることが好ましい。これが実行できないか、さもなければ望まれない場合、可変または断続的な照射を用いてもよい。

本発明の方法によれば、照射の割合は、生成物回収と操作を完了するのに必要な時間との最も有利な組み合わせをもたらすために最適化することができる。低い割合（＜３ｋＧｙ／時間）および高い割合（＞３ｋＧｙ／時間）の両方が、そのような結果を達成するために、本明細書に記載した方法に利用することができる。照射の割合は非水性溶媒を含む生物学的材料を引き続き殺菌しつつ、非水性溶媒を含む生物学的材料の回収を最適化するように選択されることが好ましい。照射の割合を低下することは、非水性溶媒を含む生物学的材料の損傷を減少させることになるが、特定の所望の総線量を達成するのに必要な照射時間も長くなる。したがって、より高い線量の割合は、例えば戦略的問題およびコストを最小化するための、ある環境では好ましく、そして、照射から非水性溶媒を含む生物学的材料を保護するための本発明に記載の方法に従って使用される場合には、そのような線量の割合が可能である。

本発明の特に好ましい実施形態によれば、照射率は、約３．０ｋＧｙ／時間以下、さらに好ましくは約０．１ｋＧｙ／時間から３．０ｋＧｙ／時間の間、よりさらに好ましくは約０．２５ｋＧｙ／時間から２．０ｋＧｙ／時間の間、より一層好ましくは、約０．５ｋＧｙ／時間から１．５ｋＧｙ／時間の間、最も好ましくは、約０．５ｋＧｙ／時間から１．０ｋＧｙ／時間の間である。

本発明の別の特に好ましい実施形態によれば、照射率は、少なくとも約３．０ｋＧｙ／時間、さらに好ましくは、少なくとも約６ｋＧｙ／時間、さらにより好ましくは、少なくとも約１６ｋＧｙ／時間、より一層好ましくは、少なくとも３０ｋＧｙ／時間、最も好ましくは、少なくとも４５ｋＧｙ／時間以上である。

本発明の方法によれば、殺菌される非水性溶媒を含む生物学的材料は、生物学的材料の殺菌に有効な時間、放射線により照射される。照射率と組み合わせた適当な照射時間により、非水性溶媒を含む生物学的材料に適用される適切な照射の線量が得られる。好適な照射時間は、関連する放射線の特定の形態および照射率、および／または照射されている非水性溶媒を含む特定の生物学的材料の性質および特性に依存して変動し得る。好適な照射時間は、当業者によって経験的に決定することができる。

本発明の方法によれば、殺菌される非水性溶媒を含む生物学的材料は、その材料に許容できないレベルの損傷ををもたらさないが、生物学的材料の殺菌に有効な総線量まで放射線で照射される。放射線の好適な総線量は、使用される本発明の方法の特定の特徴、例えば照射される非水性溶媒を含む生物学的材料の性質および特性、関係のある放射線の特定の形態、および／または不活性化される特定の生物学的汚染物または病原体、に依存して変化し得る。照射の適切な総線量は、当業者によって経験的に決定され得る。放射線の総線量は、好ましくは少なくとも２５ｋＧｙ、より好ましくは少なくとも４５ｋＧｙ、よりさらに好ましくは少なくとも７５ｋＧｙ、より一層好ましくは、少なくとも１００ｋＧｙ以上、例えば１５０ｋＧｙまたは２００ｋＧｙ以上である。

厚さおよび放射線源からの距離のような、照射される非水性溶媒を含む生物学的材料の特定の寸法は、当業者によって経験的に決定されうる。好ましい実施形態は、製剤全体に一様な割合の照射を提供する寸法である。特に好ましい実施形態は、製剤を通過する放射線に対して距離が短くなり、したがって製剤の前側と後ろ側の間の放射線量の差が最小になる寸法である。これは、幾つかの好ましい実施形態、特に製剤が放射線源に垂直な軸に関して一定の角度を有する実施形態では、前記軸に関して製剤を回転させる手段を用いることにより更に最小化することができる。

同様に、本発明の特定の方法によれば、照射の間に製剤を収容するのに有効な容器は、照射の影響下で安定性を兼備し、容器と放射線の間の相互作用を最小にするものである。好ましい容器は、照射の前、照射中および照射後に外部環境に対して密封性を維持し、容器がその内で製剤と反応せず、且つ容器がその内で製剤と相互作用し得る化学物質を生じることがない。特に好ましい例には、照射の間かなり安定であるガラスを含む容器であって、内部から最小量の化合物しか放出されないゴム製のストッパーで栓をされ、アルミニウムまたはかなり低いＺ値を有する他の適切な材料の金属圧着シールで密封されたものが含まれるがこれに限定されない。適切な材料は、それらの物理的性能を測定することによって、および、照射後の反応性の浸出しうる化合物の量およびタイプ、および当業者によって経験的に生物学的材料の封じ込めに重要であることが知られている他の特性を試験することによって決定することができる。

本発明の特定の方法によれば、生物学的材料への照射の有害な影響を最小にするために本明細書に記載された方法を使用すると共に、例えば非水性溶媒を含む生物学的材料中の１以上の生物学的汚染物または１以上の病原体に関する照射の効率を高めるために、有効量の少なくとも１つの増感剤化合物を照射の前に非水性溶媒を含む生物学的材料に、任意に添加することができる。好適な増感剤は、当業者に公知であり、それにはソラレンおよびその誘導体並びにイナクチンおよびその誘導体が含まれる。

本発明の方法によれば、非水性溶媒を含む生物学的材料の照射は、殺菌される生物学的材料に対して有害ではない任意の温度で行うことができる。好ましい一実施形態によれば、非水性溶媒を含む生物学的材料は周囲温度で照射される。代替の好ましい実施形態によれば、非水性溶媒を含む生物学的材料は、低い温度、すなわち０℃、−２０℃、−４０℃、−６０℃、−７８℃または−１９６℃のような周囲温度未満の温度で照射される。本発明この実施形態によれば、非水性溶媒を含む生物学的材料の凝固点または共融点で、またはそれ未満で照射されることが好ましい。別の代替の好ましい実施形態によれば、非水性溶媒を含む生物学的材料は高い温度、すなわち３７℃、６０℃、７２℃または８０℃のような周囲温度を超える温度で照射される。何れの理論にも拘束されることを望むものではないが、高温の使用は、１以上の生物学的汚染物または１以上の病原体への照射の効果を高め、したがってより低い総線量の放射線を用いることを可能にする。

最も好ましくは、非水性溶媒を含む生物学的材料の照射は、照射からこの製剤を保護する温度で行う。好適な温度は当業者により経験的に決定されうる。

本発明の特定の実施形態では、照射が行われる温度は、具体的な点ではなく所定の範囲内にあることが見出され得る。非水性溶媒を含む特定の生物学的材料の照射のための好ましいこのような温度範囲は、当業者により経験的に決定され得る。

本発明の方法によれば、非水性溶媒を含む生物学的材料は、殺菌される非水性溶媒を含む生物学的材料に有害でない任意の圧力で行われ得る。好ましい一実施形態によれば、非水性溶媒を含む生物学的材料は、高い圧力で照射される。より好ましくは、非水性溶媒を含む生物学的材料は、音波の適用または揮発性物質の使用により高い圧力で照射される。何れの理論に拘束されることを望むものではないが、高い圧力の使用は、１以上の生物学的汚染物または１以上の病原体への照射の効率を高め、および／または１以上の安定剤によってもたらされる保護を増強し、これによってより低い総線量の放射線の使用を可能にする。適切な圧力は、当業者によって経験的に決定され得る。

一般に本発明の方法によれば、殺菌を受ける非水性溶媒を含む生物学的材料のｐＨは約７である。しかし、本発明の幾つかの実施形態では、非水性溶媒を含む生物学的材料は７未満のｐＨ、好ましくは６以下のｐＨ、より好ましくは５以下のｐＨ、より一層好ましくは、４以下のｐＨ、最も好ましくは３以下のｐＨを有し得る。本発明の代替の実施形態では、非水性溶媒を含む生物学的材料は、７を超えるｐＨ、好ましくは８以上のｐＨ、より好ましくは９以上のｐＨ、より一層好ましくは１０以上のｐＨ、最も好ましくは１１以上のｐＨを有し得る。本発明の特定の実施形態によれば、殺菌を受ける製剤のｐＨは、この生物学的材料の１つの成分の等電点またはその近傍である。好適なｐＨレベルは、当業者によって経験的に決定され得る。

同様に、本発明の方法によれば、非水性溶媒を含む生物学的材料の照射は、処理される生物学的材料に有害でない任意の雰囲気下で行うことができる。１つの好ましい実施形態によれば、非水性溶媒を含む生物学的材料は、低酸素雰囲気下または不活性雰囲気に保たれる。不活性雰囲気が使用される場合、その雰囲気は、ヘリウムまたはアルゴンのような希ガス、より好ましくは、より高分子量の希ガス、最も好ましくはアルゴンである。他の好ましい実施形態によれば、非水性溶媒を含む生物学的材料は照射されている間真空下に保たれる。本発明の特に好ましい実施形態によれば、非水性溶媒を含む生物学的材料（凍結乾燥されたもの、液体または凍結されたもの）は照射前には、真空下または不活性雰囲気下（好ましくはヘリウムもしくはアルゴンのような希ガス、より好ましくはより高分子の希ガス、最も好ましくはアルゴン）で貯蔵される。本発明の代替の好ましい実施形態によれば、液体の、非水性溶媒を含む生物学的材料は、凍結乾燥のような溶媒を減少させる事前のステップを用いても、または用いなくても、照射の前には、この液体に溶解されている気体、特に酸素の量を低下させるために低圧下に保持される。このような脱気処理は当業者に公知のいずれかの方法を用いて行われ得る。

他の好ましい実施形態では、非水性溶媒を含む生物学的材料が酸素を含有するか、または、その中に溶解されているかもしくはそれに付随した他の気体を含有する場合、製剤内または製剤に付随したこれらのガスの量は、当業者に公知であるかまたは当業者に利用可能な方法および技術のいずれか、例えば処理される製剤を保持する容器（硬いかもしくは軟らかいもの）内を制御された減圧にすること、または製剤をほぼ同じ容積の容器に収容することによって低下させることができる。

本発明の特定の実施形態では、処理される非水性溶媒を含む生物学的材料が組織である場合、少なくとも１種の安定剤を、当業者に公知であり、利用できる方法および技術のいずれかに従って導入することができる。その導入方法には、好ましくは減圧下、高温および／またはジメチルスルホキシドのような浸透増強剤の存在下で、安定剤を含有する溶液に組織を浸漬しすることが含まれる。組織に少なくとも１種の安定剤を導入する他の方法には、好ましくは圧力下および／または高温で１種以上の安定剤を含有する気体を適用すること、１種以上の安定剤または１種以上の安定剤を含有する溶液を組織に直接注入すること、組織を減圧下に置き次いで安定剤を含有する気体または溶液を導入すること、およびこれらの方法の２以上の組み合わせが含まれるがそれらに限定されない。１種以上の安定剤をこのような方法によって組織に導入することもできる。

本明細書に記載されている１以上の特徴を組み合わせて用いることによって、１以上の生物学的汚染物または１以上の病原体に対する照射プロセスの適切な有効性を保持しながら、照射によって引き起こされる非水性溶媒を含む生物学的材料に対する望まない効果をさらに最小限にすることができることが理解されよう。例えば、安定剤の使用に加えて、非水性溶媒を含む特定の生物学的材料はまた、照射前に凍結乾燥され、低い温度に保持され、真空下に保持されて、望まない効果を更に最小にすることができる。

放射線に対する特定の生物学的汚染物または病原体の放射線に対する感受性は、Ｄ_３７値として知られる、試料中の３７％のその作用因を除く全てを不活化または死滅させるのに必要な線量を決定することにより一般に計算される。生物学的材料の所望の成分も、３７％のこれらの所望の生物学的および生理学的特性を除く全てを排除するのに必要な照射線量に等しいＤ_３７値を有すると考えることができる。

本発明の特定の好ましい実施形態によれば、非水性溶媒を含む生物学的材料の殺菌は、生物学的材料のＤ_３７値を同時に低下させることなく、生物学的汚染物または病原体のＤ_３７値を低下させる条件下で行われる。本発明の他の好ましい実施形態によれば、非水性溶媒を含む生物学的材料の殺菌は、材料のＤ_３７値の増加をもたらす条件下で行われる。本発明の最も好ましい実施形態によれば、非水性溶媒を含む生物学的材料の殺菌は、生物学的汚染物および病原体のＤ_３７値の低下をもたらし、同時に生物学的材料のＤ_３７値を高める条件下で行われる。
（実施例）
以下の例は本発明を例示するものであるが、それを限定するものではない。他の適当な修正や適応も当業者が通常直面する種類のものであり、完全に本発明の精神および範囲内に入る。なお、特に断らない限り、照射はすべて^６０Ｃｏ源を使用して行った。

この実験では、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）４００またはリン酸塩バッファー食塩水（ＰＢＳ）中に懸濁させた乾燥ウロキナーゼに対するγ線放射の影響を決定した。

方法
ウロキナーゼとＰＰＧ４００（管２および５）、ＰＢＳ（管３および６）または乾燥ウロキナーゼのみ（管１および４）を含む６本の１．５ｍｌポリプロピレン微小遠心管を、下表に示すように調製した。管４〜６を４℃、４５ｋＧｙ（１．９ｋＧｙ／時間）でγ線照射した。管１〜３は対照である（４℃）。

照射後に、試料を室温で５分間１４ｋＲＰＭで遠心分離した。ＰＰＧ４００溶媒を管２および５から除き、それらの２本の管に１２０μｌＰＢＳを添加した。管１および４にはそれぞれ１２８μｌと１３５μｌのＰＢＳを添加した（ウロキナーゼ濃度：４０，０００ＩＵ／ｍｌ）。次いで、すべての試料をＰＢＳで５０倍に希釈し、２８０ｎｍでの吸光度を測定した。次いで、各希釈試料５０μｌを９６穴マイクロタイタープレートに加え、次いで２×アッセイバッファー中３ｍＭの基質５０μｌを加えた。振盪させながらプレートを３７℃でインキュベートし、基質添加後５分から始めて２０分ごとに４０５ｎｍおよび６２０ｎｍの両方の吸収を読み取った。４０５ｎｍの値から６３０ｎｍ（バックグラウンド）の吸収値を差し引いて補正吸収値を得た。ウロキナーゼの最終濃度は１０００ＩＵ／ｍｌであった。

材料
ウロキナーゼ−Ｓｉｇｍａ社カタログ番号Ｕ−５００４（ロット２９Ｈ１０５４）；２．５ｍｇ＝４０００ＩＵウロキナーゼ。

ＰＰＧ４００−Ｆｌｕｋａカタログ番号８１３５０。

基質−ウロキナーゼ基質１、比色（ｃｏｌｏｒｍｅｔｒｉｃ）−（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ．）カタログ番号６７２１５７、ロットＢ２３９０１、５ｍｇバイアル、最終濃度１．５ｍＭ。

２×アッセイバッファー−１００ｍＭトリス（ｐＨ８．８）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ＰＥＧ８０００。

結果
ＰＰＧ４００中に懸濁させ、次いで総線量４５ｋＧｙでγ線照射したウロキナーゼは、乾燥粉状ウロキナーゼをγ線照射したのと同じパーセント活性（８０％）を維持した。これに対し、同じγ線照射に曝露したＰＢＳ中に懸濁させたウロキナーゼでは６％しか活性を維持しなかった。この実験の結果を図１に示す。

この実験では、固定化した抗インシュリンモノクローナル抗体の活性（抗原を結合する能力によって示されるもの）を、種々の形態のポリプロピレングリコール（分子量４００、１２００および２０００）存在下で照射した後に測定した。

方法
２枚の９６穴マイクロタイタープレート（ファルコンプレートＰｒｏＢｉｎｄポリスチレンカタログ番号３５３９１５）について、ウェルを十分な容積のＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４回洗浄した。一旦上記のように、２枚のプレートを調製してから、それらを新たに調製した２μｇ／ｍｌ抗インシュリンのコーティングバッファー溶液１００μｌ／ウェルでコーティングし、４℃で一夜置いた。次いで、プレートを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で手早く３回洗浄し、１００μｌのＰＰＧ４００、ＰＰＧ１２００またはＰＰＧ２０００を特定のウェルに添加した。各溶液は、ＰＢＳで１ｌに、つまり２倍段階希釈で調製した。プレートは両者とも、キャップマット（Ｇｒｅｉｎｅｒキャップマット、カタログ番号３８１０７０（ＵＳＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））でしっかりとカバーし、両者とも４℃で０ｋＧｙ／時間または４５ｋＧｙ（１．９２ｋＧｙ／時間）のいずれかで照射した。

次いで、照射後に、十分な容積のブロッキングバッファー（約３８０μｌ）をすべてのウェルに添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで４回洗浄し、５０ｎｇ／ｍｌのビオチン標識化インシュリンの結合バッファー溶液１００μｌを各ウェルに添加した。プレートをプレートシーラー（Ｄｙｎａｔｅｃｈアセテートプレートシーラー）でカバーし、１．５時間振盪しながら（３にセットされたＬａｂＬｉｎｅタイタープレートシェーカー）、３７℃でインキュベートした。次いで、ＴＢＳＴでプレートを４回洗浄し、０．５μｇ／ｍｌのホスファターゼ標識化ストレプトアビジンの結合バッファー溶液１００μｌを各ウェルに添加した。プレートをプレートシーラーでカバーし、振盪しながら１時間、３７℃でインキュベートした。次いで、ＴＢＳＴでプレートを４回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌのホスファターゼ基質のＤＥＡバッファー溶液１００μｌを各ウェルに添加し、振盪しながら、３７℃でプレートをインキュベートした。吸収を必要に応じ５分間隔で４０５ｎｍと６２０ｎｍの両方で測定した。４０５ｎｍの値から６３０ｎｍ（バックグラウンド）の吸収値を差し引いて補正吸収値を得た。

材料
ブロッキングバッファー−２％ＢＳＡ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）。

ＴＢＳＴ−０．０５％のトゥイーン２０を含むトリス食塩水（ｐＨ７．４）バッファー。

ビオチン標識化インシュリン−ウシ膵臓由来−ＳｉｇｍａＩ−２２５８ロット１１０Ｈ８０６５、５ｍｇインシュリン。インシュリン１ｍｏｌ当たりＦＩＴＣ１．２ｍｏｌを５ｍｌ滅菌水で１．０ｍｇ／ｍｌで再構成し、４℃で保存した。

結合バッファー−０．２５％ＢＳＡ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）。

ホスファターゼ標識化ストレプトアビジン−ＫＰＬカタログ番号１５−３０−００；５０％グリセロール／Ｈ_２Ｏ（ストックを１：１０００希釈）中０．５ｍｇ／ｍｌ。

ＤＥＡバッファー−１Ｌ当たり−９７ｍｌジエタノールアミン（ＳｉｇｍａＤ−８８８５）、０．１ｇ ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．０２％アジ化ナトリウム、４℃にて保存。

ホスファターゼ基質−ｐ−ニトロフェニルホスフェート−Ｓｉｇｍａ１０４−１０５、５ｍｇ／タブレット。

ホスファターゼ基質は、ホスファターゼ基質バッファー、すなわち、ＤＥＡバッファー中の１ｍｇ／ｍｌ溶液として新たに調製した。溶液は光感受性なので、分注の準備ができるまでそれを暗所に保存しなければならなかった。

モノクローナルＩｇＧ１抗ヒトインシュリン−Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔ．カタログ番号Ｅ８６１０２Ｍ、ロット８Ｊ２８７７。

コーティングバッファー−炭酸塩／重炭酸塩（ｐＨ９．４）。

ポリプロピレングリコールＰ４００−Ｆｌｕｋａカタログ番号８１３５０。

ポリプロピレングリコールＰ１２００−Ｆｌｕｋａカタログ番号８１３７０。

ポリプロピレングリコールＰ２０００−Ｆｌｕｋａカタログ番号８１３８０。

結果
ＰＰＧを含む照射試料は、照射していない対照のおよそ５０〜６３％の結合活性を示した。対照的に、ＰＢＳを含む照射試料は結合活性を示さなかった。結果を図２に示す。

この実験では、５０％のグリセロールを含み、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）でスパイクした液体トロンビンを、総線量を様々に変えて照射した。

方法
１．１００μｌの１００％グリセロール、５０μｌＰＰＶでスパイクした、２０μｌトロンビン（１００Ｕ／ｍｌトロンビン）、および任意に安定剤として２０μｌ（２００ｍＭ）アスコルビン酸ナトリウム（水で全量１ｍｌに調整）を、３ｍｌホイートン管（２通り）に添加し、４℃、１．８ｋＧｙ／時間で１０、３０または４５ｋＧｙの総線量で照射する。

２．９６−穴細胞培養プレートを標識し播種し、１希釈当たり少なくとも４つのウェルを割り当てる（播種は接種の１日前に行う）。ウェル当たり２００μｌの細胞懸濁液を４×１０^４／ｍｌの濃度で加える。同じ細胞培養培地をウイルス接種後に細胞成長および維持のために用いる。

３．細胞シートが７０〜９０％コンフルエントになった時点で、ウイルス接種を行う。この実験では、ＰＫ−１３増殖培地８００ｕｌを最初に２００ｕｌ試料に添加した。

４．試料をＰＫ−１３増殖培地で適切に希釈（１：５）し、次いで、タンパク質への結合力の低いディスクフィルタを使用して、各試料を濾過滅菌する。

５．予め希釈した試料５０μｌを９６穴プレートのカラム１に添加する。カラム１で、ピペットによる吸い上げと注入を４〜５回行って培地と試料を互いに混合する。チップを新しくして、必要量（５０μｌ）を次のカラムに移し、混合プロセスを繰り返す。チップ内の液体をすべて空にし、同じチップセットを使用して、次のカラムに試料を移す。カラム１２に達するまで、各カラムでこのプロセスを繰り返す。カラム１２の試料を混合する場合、チップ内の液体をすべて空にし、試料量を引き込んで廃液ボトル中にこの余分な液体を捨てる。これにより１２の試料希釈液が得られる。

６．３７℃のインキュベーターにプレートを戻す。

７．４〜５日目および７日目に顕微鏡で観察して、接種した培養物における細胞変性の結果を記録する。ケルバーの方法によってＣＰＥの読みからＴＣＩＤ_５０を計算する。

８．ポジティブコントロールは５０μｌＰＰＶ感染ストックを加えることにより行い、ネガティブコントロールは５０μｌＰＫ−１３増殖培地を加えた後、１：５連続希釈することで行った。

材料
ホイートン管−ガラス血清バイアル、Ｗｈｅａｔｏｎ＃２２３６８４（ロット＃１１５４１３２−０２）。

トロンビン−ウシ起源、５０００ＵＳ単位（５０００Ｕ／ｍｌストック）。

アスコルビン酸ナトリウム−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ．社カタログ番号２６，８５５−０（Ｍｉｌｗ，ＷＩ ５３２０１）。

ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）−ＡＴＣＣ＃ＶＲ−７４２；ＰＰＶ感染ストックを、ＰＥＧ８０００（２．５Ｍ ＮａＣｌ中２０％）の１／５容積をＰＰＶに加えたＰＥＧ８０００調製物によって調製した。２４時間、冷蔵温度でインキュベートした後、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ−２８ローター中で４５分間１５，０００ｒｐｍでＰＰＶをペレット化し、１／１０容積のＰＥＧバッファーに再懸濁した。ブタパルボウイルスのＰＰＶ滴定濃度をＴＣＩＤ_５０によって決定し、これは約９．０ｌｏｇ／ｍｌ（０３２３０１ストック）であった。ＰＰＶスパイク比は液体トロンビン中１：４であった（１５０μｌタンパク質溶液と混合された５０μｌ ＰＰＶストック）。

ＰＥＧバッファー−０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ。

Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｔｅｍｌｉ（プリンストン（Ｎ．Ｊ．））から得られたシリコーン化栓、６７２０ＧＣゴム処方、ロット＃Ｇ００９／７２０２を実験で使用した。

細胞−ＰＫ−１３（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−６４８９）、継代＃１４。細胞は、ＰＫ−１３増殖培地（１０％ＦＢＳおよび１×ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミンを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓの修正イーグル培地）中で維持する。

結果

総線量１０ｋＧｙでは、アスコルビン酸ナトリウム存在下および非存在下においてＰＰＶレベルで、それぞれ１．３２ｌｏｇおよび３．４０５ｌｏｇの減少があった。同様に、総線量３０ｋＧｙでは、アスコルビン酸ナトリウム存在下および非存在下においてＰＰＶレベルで、それぞれ３．２４ｌｏｇおよび４．０２５ｌｏｇの減少があった。総線量４５ｋＧｙでは、アスコルビン酸ナトリウム存在下および非存在下においてＰＰＶレベルで、それぞれ３．２４ｌｏｇおよび３．３２５ｌｏｇの減少があった。この実験は、小さなノンエンベロープ（ｎｏｎ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ）ウイルスであっても、その不活性化に非水溶媒（有効な安定剤を加えたものおよびその安定剤のないもの）の存在が有効であることを実証する。

この実験では、ポリプロピレングリコール４００中に懸濁させたトリプシンを、残留溶媒（水）含有量を変えてγ線照射に付した。

方法
トリプシンを約２０，０００Ｕ／ｍｌの濃度でポリプロピレングリコール４００中に懸濁させ複数の試料に分割した。固定量の水（０％、１％、２．４％、４．８％、７％、９％、１０％、２０％、３３％）を各試料に添加した。ＰＰＧ４００を含まない１００％水試料も調製した。

試料を１．９ｋＧｙ／時間の割合および４℃の温度で、総線量４５ｋＧｙで照射した。照射後、各試料を遠心分離し、溶解しないトリプシンをペレットとした。ＰＰＧ／水可溶性画分を除去し、ペレットは活性試験のために水のみに再懸濁した。

アッセイ条件：ウェル当たり５Ｕ／トリプシン（５０Ｕ／ｍｌ）＋ＢＡＰＮＡ基質（０．５ｍｇ／ｍｌ）を、９６穴プレート上で３倍ずつ連続希釈した。アッセイは、２枚の９６穴プレートにセットアップし、４０５ｎｍおよび６２０ｎｍで５分および２０分後に吸収を測定した。４０５ｎｍの値から６３０ｎｍ（バックグラウンド）の吸収値を差し引いて補正吸収値を得た。５分と１５分の間の反応時間にわたってこの値の経時変化をプロットし、双曲線矩形方程式（ｈｙｐｅｒｂｏｌｉｃ ｒｅｃｔａｎｇｕｌａｒ ｅｑｕａｔｉｏｎ）を使用しＳｉｇｍａプロット（Ｓｉｇｍａ Ｐｌｏｔ）においてＶｍａｘおよびＫｍを決定した。

結果
ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ４００）および水（３３％以内の水）の混合物を含む、照射試料は、非照射トリプシン対照の活性の約８０％を保持し、同じ条件下で照射された乾燥（凍結乾燥）トリプシン対照と等しい活性を保持した。４５ｋＧｙで照射した１００％水試料では活性は検知されなかった。この実験の結果を図３にグラフとして示す。

この実験では、ブタ心臓弁を、総線量３０ｋＧｙ（１．５８４ｋＧｙ／時間、−２０℃）まで、ポリプロピレングリコール４００（ＰＰＧ４００）および任意に捕捉剤存在下にγ線照射した。

材料：
組織−ブタ肺動脈弁（ＰＶ）。心臓弁は使用に先立って採取し保存した。

組織調製試薬−
ポリプロピレングリコール４００。Ｆｌｕｋａ、カタログ番号８１３５０ ロット＃３８６７１６／１
Ｔｒｏｌｏｘ Ｃ。Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号２３，８８１−３ ロット＃０２５０７ＴＳ
クマル酸。Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ−９００８ ロット＃４９Ｈ３６００
没食子酸ｎ−プロピル。Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ−３１３０ロット＃１１７Ｈ０５２６
α−リポ酸。ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号４３７６９２ ロット＃Ｂ３４４８４
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰＢＳ。Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬカタログ番号１４１９０−１４４ ロット＃１０９５０２７
２．０ｍｌねじ蓋管。ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号２０１７０−２２１ロット＃０３５９
組織加水分解試薬−
ＮｅｒｌＨ_２Ｏ。ＮＥＲＬ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓカタログ番号９８００−５ ロット＃０３０５５１５１
アセトン。ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号ＡＸ０１２５−５、ロット＃３７０５９７１１
６Ｎ定沸点ＨＣ１。Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号２４３０９、ロット＃ＢＡ４２１８４
Ｉｎｔ−Ｐｙｄ（アセチル化ピリジノリン）ＨＰＬＣ内部標準。Ｍｅｔｒａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社カタログ番号８００６、ロット＃９Ｈ１４２ 期限２／２００２。≦−２０℃で保管。

塩酸。ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社カタログ番号ＶＷ３１１０−３、ロット＃不明
ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ−７１３３、ロット＃２０Ｋ３４８２
ＦＷ２１４．０を２〜８℃で保存。

ＳＰ−セファデックスＣ−２５樹脂を保存する。Ｐｈａｒｍａｃｉａカタログ番号１７−０２３０−０１、ロット＃２４７２４９（メーカー指示通りＮａＣｌと共にチャージされた）。

加水分解バイアル−１０ｍｍ×１００ｍｍの真空加水分解管。Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号２９５６０、ロット＃ＢＢ６２７２８１
加熱モジュール−Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｅａｃｔｉ−ｔｈｅｒｍ。モデル＃１８８７０、Ｓ／Ｎ１１２５０００３２０１７６
Ｓａｖａｎｔ−Ｓａｖａｎｔ Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃシステム：
１．Ｓｐｅｅｄ ＶａｃモデルＳＣ１１０、モデル＃ＳＣ１１０−１２０およびシリアル＃ＳＣ１１０−ＳＤ１７１００２−１Ｈ
ａ．冷却した蒸気トラップモデルＲＶＴ１００、モデル＃ＲＶＴ１００−１２０Ｖ（シリアル＃ＲＶＴ１００−５８０１０５３８−１Ｂ
ｂ．真空ポンプ、ＶＰ１００ ２段階ポンプモデルＶＰ１００、シリアル＃９３０２４
カラム−Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｌｕｎａ５μＣ１８（２）１００Å（４．６×２５０ｍｍ）。パート＃００Ｇ−４２５２−Ｅ０、Ｓ／Ｎ＃６８７４０−２５、Ｂ／Ｎ＃５２９１−２９
ＨＰＬＣシステム：ＳｈｉｍａｄｚｕシステムコントローラーＳＣＬ−１０Ａ
Ｓｈｉｍａｄｚｕ自動試料注入器ＳＩＬ−１０Ａ（５０μｌループ）
Ｓｈｉｍａｄｚｕ分光蛍光検出器ＲＦ−１０Ａ
ＳｈｉｍａｄｚｕポンプＬＣ−１０ＡＤ
ソフトウェア−クラス−ＶＰバージョン４．１
低結合管−ＭｉｎｉＳｏｒｐ １００×ｌ５ Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ。バッチ＃０４２９５０、カタログ番号４６８６０８
方法：
Ａ．安定剤溶液の調製：
Ｔｒｏｌｏｘ Ｃ：
ＭＷ＝２５０；したがって、１Ｍに対して２５０ｍｇ／ｍｌ、０．５Ｍに対して１２５ｍｇ／ｍｌ必要。

実重量＝２５０．９ｍｇ
２５０÷１２５ｍｇ／ｍｌ＝２．０ｍｌ
不溶；したがって、ＰＰＧをさらに２ｍｌ添加した。水浴超音波処理および時間の後に、Ｔｒｏｌｏｘ Ｃは１２５ｍＭで可溶。

クマル酸：
ＭＷ＝１６４；したがって、１Ｍに対して１６４ｍｇ／ｍｌ
実重量＝１６４．８ｍｇ
１６４．８ｍｇ÷１６４ｍｇ／ｍｌ＝１．０ｍｌ
およそ１５分間超音波処理した水浴−１００％可溶でない。ＰＰＧをさらに１ｍｌ添加し、さらに水浴超音波処理した。

没食子酸ｎ−プロピル：
ＭＷ＝２１２．２；したがって、１Ｍのために２１２ｍｇ／ｍｌまたは０．５Ｍに対して１０６ｍｇ／ｍｌ
実重量＝２１１．９ｍｇ
２１１．９ｍｇ÷１０６ｍｇ／ｍｌ＝２．０ｍｌ
２０〜３０分の水浴超音波処理後に可溶。

１Ｍα−リポ酸：
ＭＷ＝２０６；したがって２０６ｍｇ／ｍｌ、
実重量＝４１２ｍｇ
４１２ｍｇ÷２０６ｍｇ／ｍｌ＝２．０ｍｌ
１０分の水浴超音波処理後に非常に可溶。

捕捉剤の最終ストック：
１２５ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘ Ｃ−４ｍｌ
１Ｍリポ酸−２ｍｌ
０．５Ｍクマル酸−２ｍｌ
０．５Ｍ没食子酸ｎ−プロピル−２ｍｌ
Ｂ．γ線照射に先立つ弁の処理。

１．ＰＶ心臓弁を濡れた氷の上で解凍した。

２．弁膜尖を各弁から切除し、冷Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰＢＳを含む５０ｍｌコニカル管中にプールした。

３．弁膜尖をおよそ１．５時間、４℃ＰＢＳ中で洗浄した；その時間の間ＰＢＳを合計６回代えた。

４．２個の弁膜尖を各２ｍｌのねじ蓋管内に装入した。

５．２本の管（０および３０ｋＧｙ用）に下記の１．２ｍｌを加えた：
ＰＰＧ
ＰＰＧ中の１２５ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘ Ｃ
ＳＣｂ安定剤混合物−１．５ｍｌの１２５ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘ Ｃ、３００μｌの１Ｍリポ酸、６００μｌの０．５Ｍクマル酸および６００μｌの０．５Ｍ没食子酸ｎ−プロピルを含む。（最終濃度：それぞれ６２．５ｍＭ、１００ｍＭ、１００ｍＭおよび１００ｍＭ）
６．管を揺動させながら４℃でインキュベートした。

７．安定剤溶液および弁膜尖をγ線照射のための２ｍｌガラスバイアルに移した。

８．ガラスバイアルはすべてドライアイス上で凍らせた。

９．対照試料は−２０℃で庫内に保持した。

Ｃ．組織のγ線照射。

試料を−２０℃で１．５８４ｋＧｙ／時間の割合で３０ｋＧｙの総線量で照射した。

Ｄ．加水分解／抽出のための組織の処理。

１．ＰＰＧに粘性があるので、材料を移しやすくするためにＰＢＳを添加した。

２．各弁膜尖対（１条件当たり２個）を、冷ＰＢＳを満たした５０ｍｌファルコン管に入れ、氷上でインキュベートし周期的に管を逆さにした。

３．１時間後、ＰＰＧ／０および３０中に弁膜尖を含む管からＰＢＳをデカンテーションし、新たな冷ＰＢＳを補充した。Ｔｒｏｌｏｘ Ｃまたは安定剤カクテルを含むＰＰＧ試料については、冷ＰＢＳを満たした新鮮な５０ｍｌのファルコン管を用意し、弁膜尖を移した。

４．さらに３回の洗浄を行った。

５．１つの弁膜尖を抽出のために冷ＰＢＳを満たした２ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に移した。他の弁膜尖は加水分解用に準備した。

Ｅ．組織の加水分解。

組織の加水分解：
１．各弁膜尖はＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中アセトンで６回（およそ１．５ｍｌ／洗浄）洗浄した。

２．各弁膜尖を、およそ１５分間または乾燥するまでＳｐｅｅｄＶａｃ（加熱なし）にかけた。

３．試料を秤量し、加水分解バイアルに移し、２０ｍｇ組織／ｍｌＨＣｌの量で６ＮＨＣｌを加えた：
試料ＩＤ 乾燥重量（ｍｇ） ６ＮＨＣｌ（μｌ）
１．ＰＰＧ／０ ６．４９ ３２５
２．ＰＰＧ／３０ ７．２６ ３６３
３．ＰＰＧ Ｔ／０ ５．８０ ２９０
４．ＰＰＧ Ｔ／３０ ８．２０ ４１０
５．ＰＰＧ ＳＣｂ／０ ６．４１ ３２１
６．ＰＰＧ ＳＣｂ／３０ ８．６０ ４３０
４．試料を１１０℃でおよそ２３時間加水分解した。

５．加水分解物をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に移し、１２，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。

６．次いで、上清を清浄なＥｐｐｅｎｄｏｒｆに移した。

７．加水分解物５０μｌを８ｍｌＮｅｒｌＨ_２Ｏで希釈した（ＨＣｌをおよそ３８ｍＭに希釈する）。

８．２×ｉｎｔ−ｐｙｄの２００μｌでスパイク処理した。反転させることにより混合した。（１６００μｌのために２×ｉｎｔ−ｐｙｄ：１６０μｌのために２０×ｉｎｔ−ｐｙｄ＋１４４０μｌＮｅｒｌＨ_２Ｏ）
９．試料を水で平衡に維持したＳＰ−セファデックスＣ２５カラム（およそ１×１ｃｍ充填ベッド体積）上に装入した。（カラムは、ＮａＣｌで予めチャージしておいた）
１０．カラム上にフローをもう一度装入した。

１１．２０ｍｌの１５０ｍＭＨＣｌで洗浄した。

１２．低結合性管中に５ｍｌの２ＮＨＣｌで溶出物を架橋。

１３．Ｓａｖａｎｔ中で試料全体を乾燥。

Ｆ．加水分解物の分析。

下記を準備する：
試料 μｌ μｌＨ_２Ｏ μｌＨＦＢＡ
１．ＰＰＧ／０ｋＧｙ １８ １８０ ２
２．ＰＰＧ／３０ｋＧｙ ５９ １３９ ２
３．ＰＰＧ Ｔ／０ｋＧｙ ６７ １７１ ２
４．ＰＰＧ Ｔ／３０ｋＧｙ ６４ １３４ ２
５．ＰＰＧ ＳＣｂ／０ｋＧｙ １０ １８８ ２
６．ＰＰＧ ＳＣｂ／３０ｋＧｙ ３２ １６６ ２
結果：
ＨＰＬＣの結果を図４Ａ〜４Ｃに示す。ＰＰＧ４００存在下、心臓弁は照射しても照射しなくても結果はほとんど同一であった。単一の安定剤（ｔｒｏｌｏｘ Ｃ）または安定剤混合物の添加は、より一層有効な結果をもたらした。図４Ｄに示すゲル分析は、これらの条件によってもたらされる保護の有効性を裏付けた。

この実験では、５０％ＤＭＳＯおよび任意に安定剤の存在下、およびポリプロピレングリコール４００（ＰＰＧ４００）存在下でのブタ心臓弁膜尖に対するγ線照射の影響を測定した。

照射用組織の準備：
１．ＰＶの５個バイアル、および心房弁（ＡＶ）の３個のバイアルを氷上で解凍した。

２．解凍した培地を除去し、ＰＢＳで満たしたビーカー中で弁をすすいだ。

３．各弁をＰＢＳを含む５０ｍｌコニカル管に移した。反転させることによって洗浄し、取り出した。

４．洗浄を３回繰り返した。

５．３つの弁膜尖（弁）を切除する。

６．２ｍｌのねじ蓋Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆガラスバイアル（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｓ）中ＰＢＳで保存し、氷上に保持した。

安定剤の調製：
安定剤はすべてＤＭＳＯの最終濃度が５０％であるように調製した。

５０％ＤＭＳＯ中の１Ｍアスコルビン酸塩：
Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２６，８５５−０ロット＃１０８０１ＨＵ
２００ｍｇを３００μｌのＨ_２Ｏに溶解した。５００μｌのＤＭＳＯを添加する。容積をＨ_２Ｏで１ｍｌに調節した。最終ｐＨ約８．０
１Ｍクマル酸：
Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｃ−９００８ ロット＃４９Ｈ３６００。ＭＷ １６４．２
１０６μｌのＤＭＳＯに３４．７ｍｇを溶解する。ｐＨ＝約３．０
１３８μｌのＨ_２Ｏを添加した。試料をつぶした。

一旦ｐＨを１ＮＮａＯＨで７．５に調節した後、クマル酸を溶液に戻した。

１Ｍ没食子酸ｎ−プロピル：
Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ−３１３０ ロット＃１１７Ｈ０５２６。ＭＷ ２１２．２
１３８μｌのＤＭＳＯに５８．２ｍｇを溶解する。

１３８μｌのＨ_２Ｏを添加する。最終ｐＨ６．５またはこれよりわずかに低い。

安定剤混合物：
１．０ｍｌの５００ｍＭアスコルビン酸塩
５００μｌの１Ｍクマル酸
３００μｌの１Ｍ没食子酸ｎ−プロピル
１．２ｍｌの５０％ＤＭＳＯ
３．０ｍｌ
方法：
溶液（安定剤混合物またはＰＰＧ４００）１．６ｍｌを各試料に添加し、次に、試料を４℃で２．５日間インキュベートした。次いで、弁およびそれらをインキュベートした溶液１ｍｌを２ｍｌの照射バイアルに移した。各試料を３．６℃、１．７２３ｋＧｙ／時間の割合で総線量２５ｋＧｙでγ線照射した。

組織の加水分解：
１．２ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆガラスバイアル中、各弁膜尖をアセトンで６回洗浄した。

２．最終のアセトン洗浄後に、およそ１０〜１５分または乾燥するまで、Ｓａｖａｎｔ（加熱なし）中で試料を乾燥した。

３．試料を秤量し、それらを加水分解バイアルに移し、２０ｍｇ組織／ｍｌＨＣｌの量で６ＮＨＣｌを加えた：
試料ＩＤ 乾燥重量（ｍｇ） ６ＮＨＣｌ（μｌ）
１．ＰＢＳ／０ｋＧｙ １１．４ ５７０
２．ＰＢＳ／２５ｋＧｙ ６．０ ３００
３．ＤＭＳＯ／０ｋＧｙ ６．４２ ３２１
４．ＤＭＳＯ／２５ｋＧｙ ８．１４ ４０７
５．ＤＭＳＯ／ＳＣ−ａ／０ｋＧｙ ８．７ ４３５
６．ＤＭＳＯ／ＳＣ−ａ／２５ｋＧｙ ８．１５ ４０８
７．ＰＰＧ／０ｋＧｙ １３．０９ ６５５
８．ＰＰＧ／２５ｋＧｙ １０．８８ ５４４
５．試料を１１０℃でおよそ２３時間加水分解した。

６．加水分解物をＥｐｐｅｎｄｏｒｆバイアルに移し、１２，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。

７．上清を清浄なＥｐｐｅｎｄｏｒｆバイアルに移した。

８．加水分解物５０μｌを８ｍｌＮｅｒｌＨ_２Ｏに希釈した（ＨＣｌをおよそ３７ｍＭに希釈する）。

９．２×ｉｎｔ−ｐｙｄの２００μｌ中でスパイク処理した。反転することにより混合した。（２０００μｌのために２×ｉｎｔ−ｐｙｄ：２００μｌのために２０×ｉｎｔ−ｐｙｄ＋１．８ｍｌＮｅｒｌＨ_２Ｏ）
１０．試料を、水中で平衡にしたＳＰ−セファデックスＣ２５カラム（およそ１×１ｃｍ充填ベッド体積）上に装入した。（カラムは、ＮａＣｌで予めチャージしておいた）
１１．カラム上にフローをもう一度装入した。

１２．２０ｍｌの１５０ｍＭＨＣｌで洗浄した。

１３．低結合性管５ｍｌ中に２ＮＨＣｌで溶出物を架橋した。５０ｍｌの２ＮＨＣｌ：８．６ｍｌの濃ＨＣｌをＮｅｒｌＨ_２Ｏで５０ｍｌの容積に調節した。

１４．Ｓａｖａｎｔ中で試料全体を乾燥。

プロテオグリカンのグアニジンＨＣｌ抽出およびＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製：
４ＭグアニジンＨＣｌ抽出：
１．γ線照射バイアルから３つの弁膜尖をすべて取り出し、別々の５０ｍｌコニカル管に移した。

２．弁膜尖を５０ｍｌｄＰＢＳで（４℃、およそ５時間かけて）５回洗浄し、Ｋｉｍｗｉｐｅ上で湿らせた後、１つの弁膜尖の湿潤重量を測定した。

３．各グループから１個の弁膜尖を１．５ｍｌ微小遠心管に移し、２μｇ／ｍｌプロチアーゼ抑制剤（アプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチンＡ）を含むｐＨ５．８の４ＭグアニジンＨＣｌ／１５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーを、組織に対する体積比が１５になるように適量加えた（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１４４ ｐ．３２１を参照−最適なものでは、１５〜２０の使用比を与える）。

４．はさみで弁膜尖をさいの目に切断して細片にした。

５．４℃で４８時間転頭した。

６．Ｈｅｒｍｌｅ Ｚ−２５２Ｍで、４℃×１０分間、１６，５００ＲＰＭで遠心分離した。

７．グアニジン可溶性画分を回収し、グアニジンを除去するために５ＬのＰＢＳに対して、１０Ｋ ＭＷＣＯＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ中でＰＢＳに対して（５Ｌで３ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒｓ、そして別の５Ｌで５ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒｓ）一夜透析した。

８．ＰＢＳを変え、撹拌しながら４℃でさらに９時間透析した。

９．透析物を回収して４℃で保存する。

１０．Ｈｅｒｍｌｅ Ｚ−２５２Ｍ、４℃×５分間、１６，５００ＲＰＭで遠心分離した。

１１．ＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーでＰＢＳ可溶性画分を取り出した。

ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー
１．ＰＢＳ可溶のグアニジン抽出物５００μｌのＮａＣｌ濃度を３００ｍＭ ＮａＣｌ（ＰＢＳ可溶性画分が既に約１５０ｍＭ ＮａＣｌであったと仮定すると各５００ｕｌ試料に１５μｌの５Ｍ ＮａＣｌストックを添加する）に増加させる。

２．約１ｍｌの、充填したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（事前に１Ｍ ＮａＣｌ／ＰＢ ｐＨ７．２で洗浄）を、３００ｍＭ ＮａＣｌ／ＰＢ ｐＨ７．２中に平衡にした（注：３００ｍＭ ＮａＣｌ／ＰＢ ｐＨ７．２を調製するために１００ｍｌのＰＢＳに５Ｍ ＮａＣｌストック３ｍｌを添加）。

３．１：μｌの樹脂スラリー２００ｕｌを５１５μｌのＧｕＨＣｌ抽出物（両方とも３００ｍＭ ＮａＣｌ）を添加した。

４．約１時間、室温で転頭した。

５．ペレット樹脂を穏やかに遠心分離した。

６．「非接着」試料を取り出し−２０℃で保存した。

７．約１．５ｍｌの３００ｍＭ ＮａＣｌ／ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で樹脂を５回洗浄した。

８．最後の洗浄後、１００ｕｌハミルトン注射器を使用して、余分なバッファーをすべて除去した。

９．周囲温度において１Ｍ ＮａＣｌ／ＰＢ（ｐＨ７．２）１００μｌで３回溶出した。−２０℃で保存した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：
ＰＢＳ可溶のグアニジンＨＣｌ抽出物およびＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー分析用の５〜２０％の勾配ゲル。

１．ゲル＃１：ＧｕＨＣｌ抽出物／ＰＢＳ可溶性画分−トルイジンブルー、次いでクマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブルーで染色した。

２．ゲル＃２：ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出画分＃１−トルイジンブルー、次いでクマシーブルーで染色した。

ＨＰＬＣによるコラーゲン架橋の定量：
１．１％ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）中で１００〜２００ｕｌの１倍溶液を調製する。

２．移動相で平衡にしたＣ１８ＨＰＬＣカラムに５０ｕｌを注入する。

３．分光蛍光計は、２９５ｎｍでの励起および３９５ｎｍでの放出に調整する。

４．内部ピリジノリン（Ｉｎｔ−Ｐｙｄ）の積分蛍光値を、Ｉｎｔ−Ｐｙｄの１倍溶液１ｕｌについて計算する。

結果：
ＨＰＬＣの結果を図５Ａ〜Ｄに示す。主ピークは内部ピリジノリン（ｉｎｔ−Ｐｙｄ）ピークを表わす。水性環境（ＰＢＳ）中での照射は、より小さなピーク（図５Ａ）の明白な減少をもたらした。非水性溶媒（ＰＰＧ４００）の添加による含水量の減少は、ほとんど重ねられる曲線（図５Ｂ）をもたらした。ＤＭＳＯはそれほど有効ではなく（図５Ｃ）、一方、ＤＭＳＯと安定剤の混合物を合わせたものは、いくつかの小さなピークが多少増加したが、主ピークを保存するにはより有効であった。下表に示すように、各試料に対するｐｙｄピークの下の面積を計算した。これらの結果は上記の結論を確認し、捕捉剤混合物を加えたＰＰＧおよびＤＭＳＯを含む試料では成熟コラーゲン中で見られるアミノ酸架橋（ｐｙｄ）が有効に保存されることを示す。ゲル分析が図５Ｅに示されており、これはＰＢＳ中に見られるバンドが著しく失なわれ、非水性溶媒存在下に見られる主バンドが保持されており、ＨＰＬＣ分析からの主な結論を反映している。

この実験では、様々な溶媒に漬けた冷凍ブタＡＶ心臓弁を−２０℃、１．５８４ｋＧｙ／時間で総線量３０ｋＧｙでγ線照射した。

材料：
１．ブタ心臓弁膜尖を得て、冷凍保存溶液（ウシ胎児血清、ペニシリン−ストレプトマイシン、Ｍ１９９培地およびおよそ２０％ＤＭＳＯを含む）中−８０℃で保存した。

２．Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓリン酸塩バッファー食塩水：Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬカタログ番号１４１９０−１４４ロット１０９５０２７
３．２ｍｌねじ蓋バイアル：ＶＷＲカタログ番号２０１７０−２２１ ロット＃０３５９
４．２ｍｌガラスバイアル：Ｗｈｅａｔｏｎカタログ番号２２３５８３ ロット＃３７００００−０１
５．１３ｍｍ栓：Ｓｔｅｌｍｉ６７２０ＧＣ ロット＃Ｇ００６／５５１１
６．ＤＭＳＯ：ＪＴ Ｂａｋｅｒカタログ番号９２２４−０１ ロット＃Ｈ４０６３０
７．アスコルビン酸ナトリウム：Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２６，８５５−０ ロット１０８０１ＨＵ；Ｎｅｒｌ水中２Ｍストックとして調製した。

８．ウシ胎児血清
９．ペニシリン−ストレプトマイシン
１０．Ｍ１９９の培地
１１．ＤＭＳＯ
方法：
冷凍保存操作：
溶液の調製：
凍結培地：
ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（１０％）＝５０ｍｌ
ペニシリン−ストレプトマイシン＝２．５ｍｌ
Ｍ１９９＝ＱＳ５００ｍｌ
２Ｍ ＤＭＳＯ
ＤＭＳＯ＝１５．６２ｇ
凍結培地＝ＱＳ１００ｍｌ
３Ｍ ＤＭＳＯ
ＤＭＳＯ＝２３．４４ｇ
凍結培地＝ＱＳ１００ｍｌ
１．心臓弁（少量の導管／筋肉が付着）を切除しガラス凍結管（鉛筆でラベル）に入れる。

２．凍結培地２ｍｌを添加する。

３．２１℃で２Ｍ ＤＭＳＯ溶液１ｍｌを添加する。

４．５分の時点で、２Ｍ ＤＭＳＯ溶液１ｍｌを添加する。

５．３０分の時点で、３Ｍ ＤＭＳＯ溶液４ｍｌを添加する。

６．４５分の時点および４℃で凍結管を氷上に置く。

７．５０分の時点および−７．２℃で、浴に種を入れる。

８．５５分の時点および−７．２℃で核形成する。

９．７０分の時点で、１℃／分で−４０℃に冷却する。浴から取り出しＬＮ_２小缶中に入れ、低温保存容器中に保存する。

心臓弁照射操作：
１．濡れた氷上でＡＶ心臓弁膜尖を解凍した。

２．弁膜尖を５０ｍｌ管中にプールした。

３．弁膜尖を約５０ｍｌｄＰＢＳで、４℃において転頭しながら洗浄した。５時間のこの経過の間にＰＢＳを５回交換した。

４．２ｍｌねじ蓋管（２弁膜尖／管）中に弁膜尖を移した。

５．各２本の管のうちの２本に下記の１．０ｍｌを添加した：ｄＰＢＳ、５０％ＤＭＳＯおよび２００ｍＭアスコルビン酸ナトリウム（２Ｍアスコルビン酸ナトリウムストックを以下のように希釈した：４００μｌ（２Ｍ）＋１．６ｍｌ水＋２ｍｌの１００％ＤＭＳＯ）を加えた５０％ＤＭＳＯ。

６．約４６時間、転頭しながら４℃で管をインキュベートした。

７．２ｍｌガラスバイアルに溶液および弁膜尖を移し、栓をし、キャップをした。

８．バイアルをすべてドライアイス上で冷凍した。

１０．次いで、冷凍試料を−２０℃で１．５８４ｋＧｙ／時間の割合で総線量３０ｋＧｙで照射した。

結果：
ＨＰＬＣ分析の結果を図６Ａ〜６Ｄに示す。水性環境（ＰＢＳ）での照射は、より小さなピークの減少をもたらした（図６Ａ）。非水性溶媒（２０％ＤＭＳＯ）の添加による含水量の低下は、これらのピークをより忠実に再現した（図６Ｂ）。ＤＭＳＯ濃度を５０％に増加させると、わずかにより有効であった（図６Ｃ）が、安定剤混合物とＤＭＳＯを合わせたものは、主ピークと小さなピークの両方（追加の新しいピークは安定剤それ自身による）の保存に非常に有効だった（図６Ｄ）。ゲル分析結果が、図６Ｅに示され、ＰＢＳで見られたバンドが著しく消失され、安定剤を含む非水性溶媒存在下および安定剤を含まない非水性溶媒存在下で主バンドが保持されており、ＨＰＬＣ分析からの主な結論を反映している。

この実験では、様々な溶媒に漬けた冷凍ブタＡＶ心臓弁を−７０℃において、およそ６ｋＧｙ／時間で総線量４５ｋＧｙでγ線照射した。

材料：
１．ブタ心臓弁膜尖を得て、冷凍保存溶液（実施例７と同一の溶液）中−８０℃で保存した。

２．２．Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓリン酸塩バッファー食塩水：Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬカタログ番号１４１９０−１４４ ロット１０９５０２７
３．２ｍｌねじ蓋バイアル：ＶＷＲカタログ番号２０１７０−２２１ ロット＃０３５９
４．２ｍｌガラスバイアル：Ｗｈｅａｔｏｎカタログ番号２２３５８３ ロット＃３７００００−０１
５．１３ｍｍ栓：Ｓｔｅｌｍｉ６７２０ＧＣ ロット＃Ｇ００６／５５１１
６．ＤＭＳＯ：ＪＴ Ｂａｋｅｒカタログ番号９２２４−０１ ロット＃Ｈ４０６３０
７．アスコルビン酸ナトリウム：Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２６，８５５−０ ロット１０８０１ＨＵ；Ｎｅｒｌ水中２Ｍストックとして調製した。

８．ポリプロピレングリコール４００（ＰＰＧ４００）：Ｆｌｕｋａカタログ番号８１３５０ ロット＃３８６７１６／１
方法：
凍結保存操作は実施例７に示されたものと同じである。

１．濡れた氷上でＡＶ心臓弁膜尖を解凍した。弁膜尖を切除しプールした弁膜尖を冷ＰＢＳ中６回洗浄した。

２．各弁膜尖を乾燥し２ｍｌねじ蓋管（２弁膜尖／管）中に弁膜尖を移した。

３．各２本の管のうちの２本に下記の１．２ｍｌを添加した：ｄＰＢＳ、２００ｍＭアスコルビン酸ナトリウムを含むｄＰＢＳ、ＰＰＧ４００、再水和用ＰＰＧ４００、５０％ＤＭＳＯおよび２００ｍＭアスコルビン酸ナトリウム（２Ｍアスコルビン酸ナトリウムストックを以下のように希釈した：４００μｌ（２Ｍ）＋１．６ｍｌ水＋２ｍｌの１００％ＤＭＳＯ）を含む５０％ＤＭＳＯ。

４．約４６時間、転頭しながら４℃で管をインキュベートした。

５．溶液をすべて新鮮なものに交換した（以下の例外あり：１つのＰＰＧ４００のセットについては、ＰＰＧ４００を除去し、弁膜尖をＰＢＳ＋２００ｍＭアスコルビン酸塩で洗浄し、次いで、それを除いて新鮮なＰＢＳ＋２００ｍＭアスコルビン酸塩と取り替えた）。

６．約４６時間、転頭しながら４℃で管をインキュベートした。

７．ステップ５で調製したＰＰＧ４００脱水／ＰＢＳ＋アスコルビン酸塩再水和弁膜尖）に関して溶液を交換した。

８．約６時間、転頭しながら４℃で管をインキュベートした。

９．２ｍｌガラスバイアルに溶液および弁膜尖を移し、栓をし、キャップをした。

１０．バイアルをすべてドライアイス上で冷凍した。

１１．次いで、冷凍試料を−７０℃で６ｋＧｙ／時間の割合で総線量４５ｋＧｙで照射した。

結果：
ＨＰＬＣ分析の結果を図７Ａ〜７Ｆに示す。水性環境（ＰＢＳ）での照射は、小さなピークの変化および主ピークの右シフトをもたらした。様々な非水性溶媒を含有させた場合、残留水を減少させた場合および安定剤を追加した場合には、対応する対照とより近く一致したプロフィールを生じた。ゲル分析の結果が図７Ｇ〜７Ｈに示され、ＰＢＳのバンドの著しい喪失を示す。一方、この例に示す他の群では、これら喪失されたバンドは顕著に保持されていた。

実施例８からの結果を実施例５、６および７からの結果と比較すると、γ線照射温度を低下させることでコラーゲンの架橋の修飾または損害の量の減少が通常もたらされることが明白になる。この温度依存性の１つの例示は５０％ＤＭＳＯおよびアスコルビン酸塩を含む試料であり、温度を−２０℃から−８０℃に低下するにつれて追加ピークは著しく減少している。

この実験では、安定剤混合物（１００ｍＭトレハロース、１５０ｍＭマンニトール、３．１Ｍ ＤＭＳＯ、２．２Ｍブタンジオールおよび３．１Ｍホルムアミド）の存在下または非存在下において２５ｋＧｙまたは５０ｋＧｙの総線量で照射したヒト大腿骨の機械的完全性に対するγ線照射の影響を調べた。

材料：
ホルムアミド（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ＃４６５０、ロット３６３１Ｂ３３）；密度＝１．１３ｇ／ｍＬ
２，３ブタンジオール（Ａｌｄｒｉｃｈ＃Ｂ８，４９０−４、ロットＫ０２３１１９ＢＯ）；密度＝０．９９５ｇ／ｍＬ
トレハロース（ＳｉｇｍａＴ−９５３１、ロット６１Ｋ７０２６）；０．５Ｍストック水溶液
マンニトール（ＳｉｇｍａＭ−８４２９、ロット１０６Ｈ００８４２）；０．５Ｍストック水溶液
ジメチルスルホキシド（ＪＴ Ｂａｋｅｒ＃９２２４−０１）
ホイートン５ｍＬ血清バイアル（Ｗｈｅａｔｏｎ＃２２３６８５、ロット１１６５１２２−０１）
栓（Ｓｔｅｌｍｉ、Ｃ１４０４６７２０ＧＣ ６ＴＰ、ロットＧ００５／３７６８）
ＲａｄＴａｇを介してＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅセンターから得たヒト大腿骨
Ｈｅａｖｙ Ｄｕｔｙダイヤモンドブレード（Ｍａｒｍｅｄ、＃７５Ｈ）を備えたダイヤモンド帯鋸モデル＃８０（Ｍａｒｍｅｄ社、クリーヴランド、ＯＨ）
３％の過酸化水素；地元のドラッグストアで購入。

ニュートロン製品照射器。

手順：
１．残存する軟組織と骨膜はカミソリ刀を使用して、骨からこすり落とした。

２．大腿骨は約２ｃｍのセグメントに切断した。

３．セグメントは撹拌させながら温脱イオン水中で２時間すすいだ。

４．撹拌させながらセグメントを３％過酸化水素で０．５時間処理した。

５．水を数回交換しながらセグメントをすすいだ。

６．撹拌させながらセグメントを４℃の水中で一夜すすいだ。

７．大腿骨セグメントを、５ｍｍ×５ｍｍ×１ｃｍのブロックに切断した。

８．大腿骨ブロックを、捕捉剤溶液に入れるまで水中に維持した。

９．大腿骨ブロックを無作為に取り出し、次のグループのうちの１つに入れた：
ａ．安定剤混合物なし／照射なし。

ｂ．安定剤混合物なし／２５ｋＧｙで照射。

ｃ．安定剤混合物なし／５０ｋＧｙで照射。

ｄ．安定剤混合物あり／照射なし。

ｅ．安定剤混合物あり／２５ｋＧｙで照射。

ｆ．安定剤混合物あり／５０ｋＧｙで照射。

試料は、−７２℃、約２．５ｋＧｙ／時間の線量率で約２５ｋＧｙまたは５０ｋＧｙの総線量で照射した。

１０．安定剤混合物を含むグループは、安定剤混合物５ｍＬ中に入れ、未処理群は３．１Ｍ ＤＭＳＯ５ｍＬ中に入れた。

１１．４℃で２４時間、試料を激しく攪拌した。

１２．試料を照射用バイアルに入れ、ドライアイス−エタノール浴中で急速冷凍した。

１３．照射するまで、試料を−８０℃に維持した。

１４．照射後、機械的試験を行うまで、試料を−８０℃で保存した。

試料は３点曲げ試験でテストした。

結果：
安定剤混合物で前処理した骨は曲げ応力の顕著な回復をもたらした。低温だけの照射だけが、他のすべての試験処理と比較して曲げ応力を回復することにおける著しい改良を示した。下に示す結果は対照と比較した平均曲げ応力に基づいて計算した：
ａ．安定剤混合物なし／２５ｋＧｙで照射：９％減少。

ｃ．安定剤混合物なし／５０ｋＧｙで照射：２６％減少。

ｅ．安定剤混合物あり／２５ｋＧｙで照射：５％減少。

ｆ．安定剤混合物あり／５０ｋＧｙで照射：１４％減少。

目的：
ポリプロピレングリコール、次いで、安定剤混合物（２００μＭ ＴｒｏｌｏｘＣ、１００ｍＭクマル酸、１００ｍＭリポ酸、１００ｍＭ没食子酸プロピル）、引き続いて凍結乾燥、そして最後に２５ｋＧｙまたは５０ｋＧｙのいずれかの照射からなる処理をするか、または未処理のままおかれた骨の機械的完全性を決定する。

材料：
・クマル酸（ＳｉｇｍａＣ−４４００、ロット５１Ｋ３６６０）エタノール中０．５Ｍのストック
・没食子酸プロピル（ＳｉｇｍａＰ−３１３０、ロット６０Ｋ０８７７）エタノール中０．５Ｍのストック
・α−リポ酸（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ４３７６９２、ロットＢ３４４８４）エタノール中０．５Ｍのストック
・ＴｒｏｌｏｘＣ（Ａｌｄｒｉｃｈ２３，８８１−３、ロット０２５０７ＴＳ）ＤＰＢＳ中２ｍＭのストック
・ＤＰＢＳ（ＳｉｇｍａＤ−８６６２、ロット７０Ｋ２３４３）
・ポリプロピレングリコールＰ４００（Ｆｌｕｋａ＃８１３５０、ロット３８６７１６）
・ホイートン５ｍＬ血清バイアル（Ｗｈｅａｔｏｎ＃２２３６８５、ロット１１６５１２２−０１）
・栓（Ｓｔｅｌｍｉ、Ｃ１４０４６７２０ＧＣ ６ＴＰ、ロットＧ００５／３７６８）
・ＶｉｒＴｉｓ Ｇｅｎｅｓｉｓ ２５ＥＬ凍結乾燥機；Ｍａｅｓｔｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅによる分析付き
・ＲａｄＴａｇを介してＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅセンターから得たヒト大腿骨
・Ｈｅａｖｙ Ｄｕｔｙダイヤモンドブレード（Ｍａｒｍｅｄ、＃７５Ｈ）を備えたダイヤモンド帯鋸モデル＃８０（Ｍａｒｍｅｄ社、クリーヴランド、ＯＨ）
・３％過酸化水素；地元のドラッグストアで購入したもの
・ニュートロン製品照射器。

手順：
１．残存する軟繊維と骨膜はカミソリ刀を使用して、骨からこすり落とした。

２．大腿骨は約２ｃｍのセグメントに切断した。

３．セグメントは撹拌しながら温脱イオン水中で２時間すすいだ。

４．撹拌させながらセグメントを３％過酸化水素で０．５時間処理した。

５．水を数回交換しながらセグメントをすすいだ。

６．撹拌させながらセグメントを４℃の水中で一夜すすいだ。

７．大腿骨セグメントを、５ｍｍ×５ｍｍ×１ｃｍのブロックに切断した。

８．ブロックを、安定剤混合物中に入れるまで水中に維持した。

９．骨ブロックを無作為に取り出し、次の６グループのうちの１つに入れた（−ＣＫは試料を安定剤混合物で処理していないことを示し、＋ＣＫは試料を安定剤混合物で処理したことを示し、放射線の線量は記載する通りである）：
ａ．−ＣＫ／０ｋＧｙ
ｂ．−ＣＫ／２５ｋＧｙ
ｃ．−ＣＫ／５０ｋＧｙ
ｄ．＋ＣＫ／０ｋＧｙ
ｅ．＋ＣＫ／２５ｋＧｙ
ｆ．＋ＣＫ／５０ｋＧｙ
１０．すべての試料はＰＰＧ中、４℃で一夜インキュベートした。

１１．試料を取り出し、Ｋｉｍｗｉｐｅで軽く叩いて過剰なＰＰＧを除いた。

１２．＋ＣＫとした試料には４ｍＬの安定剤混合物を加え、一方、未処理−ＣＫは未処理のままとした。

１３．＋ＣＫ試料を４℃で一夜激しく撹拌し、−ＣＫ試料は同じ時間４℃で放置した。

１４．試料を照射用バイアルに入れ、凍結乾燥に付した。

１５．照射するまで、凍結乾燥試料を４℃に維持した。

１６．照射後、機械的試験を行うまで試料を４℃で保存した。

試料は３点曲げ試験でテストした。

結果：
３点曲げ試験は、安定剤混合物の添加が、前処理しない試料と比べ照射後の曲げ応力をより良好に回復することを示した。下に示す結果は対照と比較した平均曲げ応力に基づいて計算した：
＋ＣＫ／２５＝曲げ応力１０％減少。

＋ＣＫ／５０＝曲げ応力３０％減少。

−ＣＫ／２５＝曲げ応力４２％減少。

−ＣＫ／５０＝曲げ応力２２％減少。

この実験では、アスコルビン酸塩（２００ｍＭ）または安定剤混合物（２．２Ｍブタンジオール、３．１Ｍ ＤＭＳＯ、３．１Ｍホルムアミド、１５０ｍＭマンニトールおよび１００ｍＭトレハロース）存在下でのヒト骨試料に対するγ線照射の影響を調べた。処理試料または未処理試料を、総線量約５０ｋＧｙで照射するかまたは照射しなかった。グアニジンとペプシン抽出物を調べた。

方法：
１．ヒト骨片を４℃で、２００ｍＭアスコルビン酸塩または安定剤混合物（２．２Ｍブタンジオール、３．１Ｍ ＤＭＳＯ、３．１Ｍホルムアミド、１５０ｍＭマンニトールおよび１００ｍＭトレハロース）のいずれかで一夜処理した。

２．骨片を液体窒素に沈め、ハンマーで粉砕した。

３．粉砕した試料をｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に入れた（１０〜４０ｍｇ／管）。

４．グアニジンとペプシンの抽出を行った。結果はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。

結果：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によれば、安定剤混合物で処理した試料は、アスコルビン酸塩で処理した試料を超える改善された結果を示した。

目的：５０ｋＧｙに照射したヒト骨に関して様々な安定剤混合物の保護効果を調べた。

材料：
１．５ｍｍ×５ｍｍ×３０ｍｍの皮層の骨のビーム（ｃｏｒｔｉｃａｌ ｂｏｎｅ ｂｅａｍｓ）（ＲａｄＴａｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを介してＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅセンターから得たヒト大腿骨）。

２．安定剤混合物：
ａ．ＣＫ２−ｆ：
・１５０ｍＭマンニトール（ＳｉｇｍａＭ−８４２９、ロット１０６Ｈ００８４２）
・１００ｍＭトレハロース（ＳｉｇｍａＴ＝９５３１、ロット６１Ｋ７０２６）
・２．２Ｍブタンジオール（Ａｌｄｒｉｃｈ＃Ｂ８，４９０−４、ロットＫ０２３１１９ＢＯ）
・３．１Ｍ ＤＭＳＯ（ＪＴＢａｋｅｒ＃９２２４−０１）
ｂ．ＣＫ１−ｆｄ：
・１００ｍＭクマル酸（ＳｉｇｍａＣ−４４００、ロット５１Ｋ３６６０）；０．５Ｍエタノール中のストック
・１００ｍＭリポ酸（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ＃４３７６９２、ロットＢ３４４８４）；０．５Ｍエタノール中のストック
・１００ｍＭ没食子酸プロピル（ＳｉｇｍａＰ−３１３０、ロット６０Ｋ０８７７）；０．５Ｍエタノール中のストック
・２００μＭＴｒｏｌｏｘＣ（Ａｌｄｒｉｃｈ＃２３，８８１−３、ロット０２５０７ＴＳ）；ＰＢＳ中の２ｍＭのストック
３．ポリプロピレングリコールＰ４００（Ｆｌｕｋａ＃８１３５０、ロット３８６７１６）
４．３０ｍＬ血清バイアル（Ｗｈｅａｔｏｎ）
５．栓（Ｓｔｅｌｍｉ＃Ｃ１４０４ ６７２０ＧＣ ６ＴＰ；ロットＧ００５／３７６８）
手順：
１．１０本の皮層の骨のビームを、振盪しながら５０ｍＬポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）Ｐ４００に３７℃で２時間浸漬した。

２．ビームをＰＰＧから取り出し、Ｋｉｍｗｉｐｅで軽く吸い取って過剰のＰＰＧを除き、次いで、５０ｍＬのＣＫ１−ｆｄに激しく撹拌しながら４℃で一夜（約１６時間）浸漬した。

３．１２本の骨のビームを５０ｍＬのＣＫ２−ｆに入れ、激しく撹拌しながら４℃で一夜（約１６時間）浸漬した。さらに１０本の骨のビームを脱イオン水に入れ、他の骨片について記載したように一夜浸漬した。

４．翌朝、骨片を取り出し照射用３０ｍＬバイアルに入れた。

５．バイアルは照射まで−８０℃で維持した。

６．試料をドライアイス上で、約４．７ｋＧｙ／時間の線量率で総線量約５０ｋＧｙで照射した。

７．骨は３点曲げ試験を使用して、機械的強度を評価した。

結果：
曲げ試験分析結果は、ＣＫ２−ｆおよびＣＫ１−ｆｄで処理した照射試料は、安定剤混合物で処理しない照射試料（対応する対照の７３％）と比較して改善された結果（それぞれ対応する対照の８６％および８５％）を示した。

目的：約５０ｋＧｙで照射した骨について様々な安定剤混合物の保護効果を調べた。

材料：
１．３ｍｍ×３ｍｍ×２５ｍｍ皮層の骨のビーム（ＲａｄＴａｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを介してＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅセンターから得たヒト大腿骨）。

２．安定剤混合物：
ａ．ＣＫ２−ｆ：
・１５０ｍＭマンニトール（ＳｉｇｍａＭ−８４２９、ロット１０６Ｈ００８４２）
・１００ｍＭトレハロース（ＳｉｇｍａＴ＝９５３１、ロット６１Ｋ７０２６）
・２．２Ｍブタンジオール（Ａｌｄｒｉｃｈ＃Ｂ８，４９０−４、ロットＫ０２３１１９ＢＯ）
・３．１Ｍ ＤＭＳＯ（ＪＴＢａｋｅｒ＃９２２４−０１）
ｂ．１０−ＤＭ：
・１０％ＤＭＳＯ、ＵＳＰ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ＃Ｄ１２５８、ロットＲＰ０９１５）
・１５０ｍＭマンニトール、ＵＳＰ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ＃ＭＡ１６５、ロットＲＭ０４１８）
３．ポリプロピレングリコールＰ４００（Ｆｌｕｋａ＃８１３５０、ロット３８６７１６）
４．３０ｍＬ血清バイアル（Ｗｈｅａｔｏｎ）
５．栓（Ｓｔｅｌｍｉ＃Ｃ１４０４ ６７２０ＧＣ ６ＴＰ；ロットＧ００５／３７６８）
手順：
１．１２本の皮層の骨のビームを各処理に用いた−６本は照射用、６本は非照射用。

２．骨のビームを５ｍｌコニカルバイアルに入れ、次の液体のうちの１つで処理した：
ａ．３ｍｌ水；
ｂ．３ｍｌのＣＫ２−ｆまたは
ｃ．３ｍｌの１０−ＤＭ。

３．試料を４℃で約２０分間超音波で処理した。

４．超音波処理後、骨を約２時間４０分激しく撹拌しながら室温で浸漬した。

５．浸漬後、骨を液体から取り出し、照射用バイアルに入れ、約−８０℃で保存した。

６．試料を約２．６ｋＧｙ／時間の線量率でドライアイス上で総線量約５５ｋＧｙ〜６０ｋＧｙで照射した。

７．３点曲げ試験を使用して、試料を機械的強度について評価した。

結果：
曲げ試験分析は、ＣＫ２−ｆで処理した照射試料は対応する対照の強度の８２％を示し、１０−ＤＭで処理した照射試料は対応する対照の強度の７３％を示すことを示した。

目的：５０ｋＧｙで照射したブタＡＣＬ試料について安定剤混合物の保護効果を調べた。材料：
１．ブタＡＣＬ：ＲａｄＴａｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、
２．安定剤混合物：
３．１Ｍ ＤＭＳＯ；
２．２Ｍ ２，３−ブタンジオール；
１５０ｍＭマンニトール；および
１００ｍＭトレハロース。

手順：
１．ブタＡＣＬ（１０）を−８０℃で保存し、３７℃の水浴中で約３０分間で解凍した。

２．各ＡＣＬを個別の５０ｍｌコニカル管に入れた。

３．試料は、振盪しながら、１洗浄当たり約５分間５０ｍｌのＰＢＳで４回洗浄した。

４．試料は、振盪しながら５分間水（各５０ｍｌ）で１回洗浄した。

５．各靭帯を約４〜５個のより小さな片（直径約３ｍｍ）に切断した。

６．試料を２ｍｌバイアル（１／バイアル）に入れた。

７．１ｍｌの安定剤混合物または水を各バイアルに加えた。

８．バイアルにゴム栓およびキャップを配した。

９．試料を４℃で一夜振盪した。

１０．試料を約５０ｋＧｙの総線量で照射した。

１１．試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。

結果：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば、安定剤混合物で処理した試料は、処理していない対照を超える、改善された特性を示した。

目的：５０ｋＧｙで照射したウシ脛骨に対する様々な安定剤混合物の保護効果を調べた。

材料：
・屠殺場（Ｍｔ．Ａｉｒｙ Ｍｅａｔ Ｌｏｃｋｅｒ）から得たウシ脛骨を砕いて３ｍｍ×３ｍｍ×４２ｍｍセクションとしたもの
・ブタンジオール（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｂ８，４９０−４、ロットＫ０２３１１９Ｂ０）
・プロピレングリコール（Ｓｉｇｍａ、Ｐ−４３４７、ロット１１１Ｋ１６５８）
・ＤＭＳＯ、ＵＳＰ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｄ１２５８、ロットＲＥ０７５４）
・マンニトール、ＵＳＰ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、ＭＡ１６５、ロットＲＥ１０２０）
・トレハロース（Ｓｉｇｍａ、Ｔ−９５３１、ロット０６２Ｋ７３０２）
・没食子酸（ＳｉｇｍａＧ−７３８４、ロット１１１Ｋ０１０３）
・アスコルビン酸ナトリウム、ＵＳＰ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｓ１３４９、ロットＲＭ０３９８）
・ブランソン２７１０水浴超音波処理装置
・３０ｍＬ血清バイアル（Ｋｉｍｂｌｅ Ｇｌａｓｓ６２１２１Ｄ−３０）
・２０ｍｍ栓（Ｓｔｅｌｍｉ Ｃ１４０４ ６７２ＧＣ ６ＴＰ、ロットＧ００５／３７５８）
・安定剤混合物：
Ｆ１（ＢＤＧＴ）：
２．２Ｍブタンジオール
３．１Ｍ ＤＭＳＯ
１００ｍＭ没食子酸
５０ｍＭトレハロース
Ｆ２（ＡＢＭＴ）：
２００ｍＭアスコルビン酸塩
２．２Ｍブタンジオール
１５０ｍＭマンニトール
５０ｍＭトレハロース
Ｆ３（ＡＢＤＭ）：
２００ｍＭアスコルビン酸塩
１．６６Ｍブタンジオール
０．３３Ｍ ＤＭＳＯ
１２５ｍＭマンニトール
Ｆ４（ＢＧＭＴ）：
２．２Ｍブタンジオール
５０ｍＭ没食子酸
１５０ｍＭマンニトール
５０ｍＭトレハロース
Ｆ５（ＢＤＧ）：
２．２Ｍブタンジオール
３．１Ｍ ＤＭＳＯ
１００ｍＭ没食子酸
Ｆ６（ＡＭＰＴ）：
２００ｍＭアスコルビン酸塩
１５０ｍＭマンニトール
２．２Ｍプロピレングリコール
５０ｍＭトレハロース
手順：
１．砕いた皮層骨片を大きなビーカーに入れて混合した。

２．１０個の骨片を無作為に選択し、５０ｍＬコニカル管に入れた。

３．上記の安定剤混合物をコニカル管の４０ｍＬの目盛りまで加えた。

４．コニカル管をフロートに入れ、次いで、水浴超音波処理装置に入れた。

・浴中の水は、４℃に予め冷却した。

・浴中の水は、ほぼ１５分ごとに４時間氷冷水と交換した。

５．超音波処理後、コニカル管を網棚に置き、４℃で２４時間穏やかに撹拌した。

６．骨片をコニカル管から取り出し、過剰の安定剤混合物を除去し、試料を照射用の２５ｍＬ血清バイアルに入れた。

７．バイアルに栓をし、キャップをし、照射するまで−８０℃で保存した。

８．試料をドライアイス上で総線量５０ｋＧｙで照射した。

９．機械的強度を３点曲げ試験によって試験した。

結果：
３点曲げ試験分析は照射試料の機械的強度として以下の結果（照射していない対照平均に対する相対値）を与えた：
ＢＤＧＴ：７５％
ＡＢＭＴ：６６％
ＡＢＤＭ：６０％
ＢＧＭＴ：６８％
ＢＤＧ：５９％
ＡＭＰＴ：６１％
安定剤なし：５６％

目的：ブタＡＣＬコラーゲンに関する様々な安定剤混合物の、ドライアイス温度で５０ｋＧｙでγ線照射した後の保護効果を調べた。

材料：
・ＲａｄＴａｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得らブタＡＣＬ（０２年６月２５日採取）。

・食塩水［０．９％ＮａＣｌ（ＶＷＲ＃ＶＷ６４３０−５、ロット４１２４０２０２）］
・プロピレングリコール（Ｓｉｇｍａ Ｐ−４３４７、ロット１１１Ｋ１６５８）
・ジメチルスルホキシド、ＵＳＰ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｄ１２５８、ロットＲＥ０７５４）
・マンニトール、ＵＳＰ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＭＡ１６５、ロットＲＥ１０２０）
・トレハロース（Ｓｉｇｍａ Ｔ−９５３１、ロット０６２Ｋ７３０２）
・ＤＭＥＭ（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ １１２−１０３−１０１、ロット７１０８５０）
・プロブコール（Ｓｉｇｍａ Ｐ−９６７２、ロット１２８Ｈ０６９５）
・Ｔｒｏｌｏｘ（Ａｌｄｒｉｃｈ ２３，８８１−３、ロット０２５０７ＴＳ）
・２００プルーフ（１００度）エタノール（ＡｌｄｒｉｃｈＥ７０２−３、ロット０１２Ｉ３７４０）で調製した没食子酸プロピル（ＳｉｇｍａＰ−３１３０、ロット６０Ｋ０８７７）１Ｍストック；
・３ｍＬ血清バイアル（Ｗｈｅａｔｏｎ＃２２３６８４）
・Ｓｔｅｌｍｉ栓（＃Ｃ１５０３ ６７２０ＧＣ ６ ＤＴ）
手順：
１．７個のブタＡＣＬを解凍しＰＢＳで５回すすいだ。

２．全ＡＣＬを４０℃で４時間、次いで４℃で一夜（約１５時間）、次の溶液のうちの１つに浸漬した：
ａ．食塩水；
ｂ．２．２Ｍプロピレングリコール、３．１Ｍ ＤＭＳＯ、１５０ｍＭマンニトールおよび１００ｍＭトレハロース；食塩水で定量としたもの；
ｃ．２．２Ｍプロピレングリコール、３．１Ｍ ＤＭＳＯ、１５０ｍＭマンニトール、１００ｍＭトレハロース、１％ｓｏｌｕｔｏｌ：食塩水で定量としたもの；
ｄ．ＤＭＥＭ；
ｅ．ＤＭＥＭ、２．２Ｍプロピレングリコール、１５０ｍＭマンニトール；
ｆ．ＤＭＥＭ、５０μＭプロブコール、２％ＤＭＳＯ；または
ｇ．ＤＭＥＭ、５０ｍＭ ｔｒｏｌｏｘ、１００ｍＭ没食子酸プロピル；
３．ＡＣＬを溶液から取り出した。腱の特性変化を観察し下記に記す（このセクション中の文字は上記２と同じ文字で示す溶液に対応する）。

４．ＡＣＬを半分で２分して、３ｍＬバイアルに合うように端を切り取った（半分は０ｋＧｙ対照とし、また、他方の半分は５０ｋＧｙとした）。照射用包装をするまで、試料は−８０°で保存した。

５．試料をドライアイス上で総線量約５０ｋＧｙで照射した。

結果：
安定剤混合物ｄ、ｅおよびｆで処理した照射試料は、他の安定剤混合物に対して改善された結果を示した。

目的：約５０ｋＧｙで照射したウシ脛骨に関する様々な安定剤混合物の保護効果を調べた。

材料：
・屠殺場（Ｍｔ．Ａｉｒｙ Ｍｅａｔ Ｌｏｃｋｅｒ）から得たウシ脛骨を洗浄後砕いて３ｍｍ×３ｍｍ×４２ｍｍセクションとしたもの
・ブタンジオール（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｂ８，４９０−４、ロットＫ０２３１１９Ｂ０）
・プロピレングリコール（Ｓｉｇｍａ、Ｐ−４３４７、ロット１１１Ｋ１６５８）
・ＤＭＳＯ、ＵＳＰ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｄ１２５８、ロットＲＥ０７５４）
・マンニトール、ＵＳＰ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、ＭＡ１６５、ロットＲＥ１０２０）
・トレハロース（Ｓｉｇｍａ、Ｔ−９５３１、ロット０６２Ｋ７３０２）
・没食子酸（Ｓｉｇｍａ Ｇ−７３８４、ロット１１１Ｋ０１０３）
・アスコルビン酸ナトリウム、ＵＳＰ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｓ１３４９、ロットＲＭ０３９８）
・ブランソン２７１０水浴超音波処理装置
・３０ｍＬ血清バイアル（Ｋｉｍｂｌｅ Ｇｌａｓｓ ６２１２１Ｄ−３０）
・２０ｍｍ栓（Ｓｔｅｌｍｉ Ｃ１４０４ ６７２ＧＣ ６ＴＰ、ロットＧ００５／３７５８）
・クエン酸ナトリウム二水和物（Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ＃０７５４、ロット０７５４Ｔ５１Ｈ２８）水溶液
・安定剤混合物：
ａ．Ｆ１（ＢＤＧＴ）：
２．２Ｍブタンジオール
３．１Ｍ ＤＭＳＯ
１００ｍＭ没食子酸
５０ｍＭトレハロース
ｂ．Ｆ４（ＢＧＭＴ）：
２．２Ｍブタンジオール
５０ｍＭ没食子酸
１５０ｍＭマンニトール
５０ｍＭトレハロース
ｃ．Ｆ４−ｐｒｏｐ（ＧＭＰＴ）：
５０ｍＭ没食子酸
１５０ｍＭマンニトール
２．２Ｍプロピレングリコール
５０ｍＭトレハロース
ｄ．Ｆ４＋ｐＨ（ＢＧＭＴｃ）：
２．２Ｍブタンジオール
５０ｍＭ没食子酸
１５０ｍＭマンニトール
５０ｍＭトレハロース
２００ｍＭクエン酸ナトリウム
ｅ．ＣＫ２（ＢＤＭＴ）：
２．２Ｍブタンジオール
３．１Ｍ ＤＭＳＯ
１５０ｍＭマンニトール
１００ｍＭトレハロース
手順：
１．砕いた皮層骨片を大きなビーカーに入れて混合した。

２．６個の骨片を無作為に選択し、前記安定剤混合物の１つで処理するため５０ｍＬコニカルに入れた。

３．安定剤混合物をコニカルの４０ｍＬの目盛りまで加えた。

４．コニカルをフロートに入れ、次いで、水浴超音波処理装置に入れた。

・浴中の水は、４℃に予め冷やした。

・浴中の水は、ほぼ１５分ごとに４時間氷冷水と交換した。

５．超音波処理後、コニカルを網棚に置き、４℃で２４時間穏やかに撹拌した。

６．骨片をコニカルから取り出し、過剰の安定剤カクテルを除去し、６つの骨片を照射用の２５ｍＬ血清バイアルに入れた。

７．バイアルに栓をし、キャップをし、照射するまでバイアルを−８０℃で保存した。

８．試料をドライアイス上で総線量約５０ｋＧｙで照射した。

９．機械的強度を３点曲げ試験によって試験した。

結果：
３点曲げ試験分析は照射試料の機械的強度として以下の結果（照射していない対照平均に対する相対値）を与えた：
安定剤混合物なし：６２％
ＣＫ２：７８％
Ｆ１：７７％
Ｆ４：６７％
Ｆ４＋ｐＨ：７１％
Ｆ４−ｐｒｏｐ：６２％

目的：５０ｋＧｙで照射したウシ脛骨に対する様々な安定剤混合物の保護効果を調べた。

材料：
・屠殺場（Ｍｔ．Ａｉｒｙ Ｍｅａｔ Ｌｏｃｋｅｒ）から得たウシ脛骨を洗浄し、砕いて３ｍｍ×３ｍｍ×４２ｍｍセクションとしたもの
・ＤＭＳＯ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｄ１２５８、ロットＲＥ０７５４）
・トレハロース（Ｓｉｇｍａ Ｔ−９５３１、ロット０６２Ｋ７３０２）；０．５Ｍストック水溶液
・没食子酸（ＳｉｇｍａＧ−７３８４、ロット１１１Ｋ０１０３）
・ブタンジオール（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｂ８，４９０−４、ロットＫ０２３１１９Ｂ０）
・プロピレングリコール（Ｓｉｇｍａ Ｐ−４３４７、ロット１１１Ｋ１６５８）
・クエン酸ナトリウム二水和物（Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ ０７５４、ロット０７５４Ｔ５１Ｈ２８）；２Ｍストック水溶液
・ＶｉｒＴｉｓ Ｇｅｎｅｓｉｓ ２５ＥＬ 凍結乾燥機、Ｍａｅｓｔｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ付き
０２年８月１６日〜０２年８月１９日 凍結乾燥１−Ｔｅｒｉ Ｂｏｎｅサイクル
・安定剤混合物：
ａ．ＢＤＧＴ：
２．２Ｍブタンジオール
３．１Ｍ ＤＭＳＯ
１００ｍＭ没食子酸
５０ｍＭトレハロース
ｂ．ＢＤＧＴ＋Ｃ：
２．２Ｍブタンジオール
３．１Ｍ ＤＭＳＯ
１００ｍＭ没食子酸
５０ｍＭトレハロース
２００ｍＭクエン酸塩
ｃ．ＰＤＧＴ：
２．２Ｍプロピレングリコール
３．１Ｍ ＤＭＳＯ
１００ｍＭ没食子酸
５０ｍＭトレハロース
ｄ．ＰＤＧＴ＋Ｃ：
２．２Ｍプロピレングリコール
３．１Ｍ ＤＭＳＯ
１００ｍＭ没食子酸
５０ｍＭトレハロース
２００ｍＭクエン酸塩
没食子酸は、有機成分を加えるに先立ち穏やかに加熱した。

手順：
１．６個の無作為に選択した骨片を５０ｍＬコニカルに入れた。骨を秤量し、次いで、安定剤混合物または水を４０ｍＬの目盛りまで加え、重量を記録した。各条件に対し２種類の試料（１セットは冷凍用、他の１セットは凍結乾燥用）を以下のように作成した：

２．骨を含む５０ｍＬコニカルを超音波処理装置に入れ、合計４時間の超音波処理時間の間、１５分ごとに氷冷水で超音波処理浴の水を交換した。

３．超音波処理後、試料を４℃で２４時間、発泡スチロール箱に入れた。次いで、試料を３０ｍＬ血清バイアルに入れて−８０℃で冷凍するか、ガラス板上に置いて凍結乾燥機中に入れた。

４．真空凍結乾燥後、骨を３０ｍＬ血清バイアルに入れ、キャップをして−８０℃で保存した。

５．試料を総線量約５０ｋＧｙで照射した。

６．試料は３点曲げ試験によって分析した。

結果：
５０ｋＧｙで照射した凍結乾燥試料については、ＢＤＧＴで処理した試料およびＢＧＤＴ＋Ｃで処理した試料は、安定剤混合物で処理しない試料と比較して、平均の機械的強度が約１．６倍の増加を示した。クエン酸塩の追加は機械的強度に悪い影響を与えなかった。

本発明を十分に説明してきたが、本発明の範囲またはその任意の実施形態から外れることなく、広範囲で等価な条件、処方および他のパラメーターで本発明の方法が実施できることが、当業者には理解されるであろう。

ここに引用した特許および刊行物はすべて、参照によってその全体が本願に完全に組み込まれる。任意の刊行物の引用は出願日に先立つその開示のためにあり、そのような刊行物が先行技術であること、または、本発明が先行発明のためにそのような刊行物に先立つ資格がないことを承認するものと解釈すべきではない。

以上の実施形態および利点は単に例示であり、本発明を限定するものと解釈すべきではない。本発明の教示は容易に他のタイプの装置に適用することができる。本発明の記載は、特許請求の範囲の欄の範囲を限定するものではなく例示的なものであることを意図されている。多くの代替、修正および変形が当業者には明らかであろう。

ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）４００またはリン酸塩バッファー食塩水（ＰＢＳ）に懸濁された乾燥ウロキナーゼに対するγ線の効果を示すグラフである。 種々の形態のポリプロピレングリコールの存在下で照射した後の、固定化された非インスリンモノクローナル抗体の活性を示すグラフである。 種々のレベルの残留溶媒（水）含有量で、プロピレングリコールに懸濁されたトリプシンに対するγ線の効果を示すグラフである。 プロピレングリコール４００（ＰＰＧ４００）および任意に捕捉剤の存在下でγ線照射されたブタ心臓弁膜の効果を示す。 プロピレングリコール４００（ＰＰＧ４００）および任意に捕捉剤の存在下でγ線照射されたブタ心臓弁膜の効果を示す。 プロピレングリコール４００（ＰＰＧ４００）および任意に捕捉剤の存在下でγ線照射されたブタ心臓弁膜の効果を示す。 プロピレングリコール４００（ＰＰＧ４００）および任意に捕捉剤の存在下でγ線照射されたブタ心臓弁膜の効果を示す。 ５０％ＤＭＳＯおよび任意に安定剤の存在下、および、プロピレングリコール４００（ＰＰＧ４００）の存在下におけるブタ心臓弁膜尖に対するγ線照射の効果を示す。 ５０％ＤＭＳＯおよび任意に安定剤の存在下、および、プロピレングリコール４００（ＰＰＧ４００）の存在下におけるブタ心臓弁膜尖に対するγ線照射の効果を示す。 ５０％ＤＭＳＯおよび任意に安定剤の存在下、および、プロピレングリコール４００（ＰＰＧ４００）の存在下におけるブタ心臓弁膜尖に対するγ線照射の効果を示す。 ５０％ＤＭＳＯおよび任意に安定剤の存在下、および、プロピレングリコール４００（ＰＰＧ４００）の存在下におけるブタ心臓弁膜尖に対するγ線照射の効果を示す。 ５０％ＤＭＳＯおよび任意に安定剤の存在下、および、プロピレングリコール４００（ＰＰＧ４００）の存在下におけるブタ心臓弁膜尖に対するγ線照射の効果を示す。 種々の溶媒に浸漬され、−２０℃において１．５８４ｋＧｙ／ｈｒで総線量３０ｋＧｙに照射された、凍結されたブタＡＶ心臓弁膜に対するγ線照射の効果を示す。 種々の溶媒に浸漬され、−２０℃において１．５８４ｋＧｙ／ｈｒで総線量３０ｋＧｙに照射された、凍結されたブタＡＶ心臓弁膜に対するγ線照射の効果を示す。 種々の溶媒に浸漬され、−２０℃において１．５８４ｋＧｙ／ｈｒで総線量３０ｋＧｙに照射された、凍結されたブタＡＶ心臓弁膜に対するγ線照射の効果を示す。 種々の溶媒に浸漬され、−２０℃において１．５８４ｋＧｙ／ｈｒで総線量３０ｋＧｙに照射された、凍結されたブタＡＶ心臓弁膜に対するγ線照射の効果を示す。 種々の溶媒に浸漬され、−２０℃において１．５８４ｋＧｙ／ｈｒで総線量３０ｋＧｙに照射された、凍結されたブタＡＶ心臓弁膜に対するγ線照射の効果を示す。 種々の溶媒に浸漬され、−７０℃において約６ｋＧｙ／ｈｒで総線量４５ｋＧｙに照射された、凍結されたブタＡＶ心臓弁膜に対するγ線照射の効果を示す。 種々の溶媒に浸漬され、−７０℃において約６ｋＧｙ／ｈｒで総線量４５ｋＧｙに照射された、凍結されたブタＡＶ心臓弁膜に対するγ線照射の効果を示す。 種々の溶媒に浸漬され、−７０℃において約６ｋＧｙ／ｈｒで総線量４５ｋＧｙに照射された、凍結されたブタＡＶ心臓弁膜に対するγ線照射の効果を示す。 種々の溶媒に浸漬され、−７０℃において約６ｋＧｙ／ｈｒで総線量４５ｋＧｙに照射された、凍結されたブタＡＶ心臓弁膜に対するγ線照射の効果を示す。 種々の溶媒に浸漬され、−７０℃において約６ｋＧｙ／ｈｒで総線量４５ｋＧｙに照射された、凍結されたブタＡＶ心臓弁膜に対するγ線照射の効果を示す。 種々の溶媒に浸漬され、−７０℃において約６ｋＧｙ／ｈｒで総線量４５ｋＧｙに照射された、凍結されたブタＡＶ心臓弁膜に対するγ線照射の効果を示す。 種々の溶媒に浸漬され、−７０℃において約６ｋＧｙ／ｈｒで総線量４５ｋＧｙに照射された、凍結されたブタＡＶ心臓弁膜に対するγ線照射の効果を示す。 種々の溶媒に浸漬され、−７０℃において約６ｋＧｙ／ｈｒで総線量４５ｋＧｙに照射された、凍結されたブタＡＶ心臓弁膜に対するγ線照射の効果を示す。

Claims (41)

1. 組織、血清、血漿またはタンパク質サンプル内の活性な生物学的汚染物または病原体のレベルを低下する方法であって、前記方法が、
   （ｉ）前記組織、血清、血漿またはタンパク質サンプルに少なくとも１種の安定化剤を添加する工程であって、１種の安定化剤が、ｔｅｒｔ−ブチル−ニトロソブタン（ｔＮＢ）、α−フェニル−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン（ＰＢＮ）、５，５’−ジメチルピロリン−Ｎ−オキシド（ＤＭＰＯ）、ｔｅｒｔ−ブチルニトロソベンゼン（ＢＮＢ）、α−（４−ピリジル−１−オキシド）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン（４−ＰＯＢＮ）、３，５−ジブロモ−４−ニトロソ−ベンゼンスルホン酸（ＤＢＮＢＳ）、ヘパリン、アセトン、還元グルタチオン、グリシルグリシン、ＤＭＥＭ、ジオスミン、ププロガリン、没食子酸、シリマリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、ブタンジオール、ホルムアミド、ソルトール、没食子酸プロピル、クエン酸塩、プロパンジオール、ミリスチン酸イソプロピル、クマル酸、およびトロロクスＣよりなる群から選択される工程と、
   （ｉｉ）前記組織、血清、血漿またはタンパク質サンプルを、前記組織、血清、血漿またはタンパク質サンプル内の活性な生物学的汚染物または病原体のレベルを低下させるのに効果的な有効線量の放射線で照射する工程
   を含むことを特徴とする方法。
2. 前記組織が硬組織であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記硬組織が、骨、脱塩された骨基質、関節、大腿骨、大腿骨頭または歯よりなる群から選択されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. 前記組織が軟組織であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 前記軟組織が、骨髄、靱帯、腱、神経、皮膚移植片、心臓弁、軟骨、角膜、動脈および静脈よりなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. 前記組織が硬組織および軟組織の組合せであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 前記組織、血清、血漿またはタンパク質サンプルが、照射の間、周囲温度よりも低い温度にあることを特徴とする請求項１に記載の方法。
8. 前記温度が、照射の間、−２０℃よりも低いことを特徴とする請求項７に記載の方法。
9. 前記温度が、照射の間、−４０℃よりも低いことを特徴とする請求項７に記載の方法。
10. 前記温度が、照射の間、−６０℃よりも低いことを特徴とする請求項７に記載の方法。
11. 前記温度が、照射の間、−７８℃よりも低いことを特徴とする請求項７に記載の方法。
12. 前記温度が、照射の間、−１９６℃よりも低いことを特徴とする請求項７に記載の方法。
13. 前記組織、血清、血漿またはタンパク質サンプルが、照射の間、不活性雰囲気に維持されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
14. 前記組織、血清、血漿またはタンパク質サンプルが、照射の間、真空下に維持されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
15. 前記タンパク質サンプルが、抗体、免疫グロブリン、ホルモン、成長因子、抗凝固剤、凝固因子、補体、またはリポタンパク質を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
16. 前記凝固因子が、ファクターＩ（フィブリノーゲン）、ファクターＩＩ（プロトロンビン）、ファクターＩＩＩ（組織因子）、ファクターＶ（プロアクセレリン）、ファクターＶＩ（アクセレリン）、ファクターＶＩＩ（プロコンベルチン、血清プロトロンビン変換体）、ファクターＶＩＩＩ（抗血友病因子Ａ）、ファクターＩＸ（抗血友病因子Ｂ）、ファクターＸ（スチュアート−プラウアー因子）、ファクターＸＩ（血漿トロンボプラスチン前駆体）、ファクターＸＩＩ（ハーゲマン因子）、ファクターＸＩＩＩ（プロトランスグルタミナーゼ）、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）、ファクターＩａ、ファクターＩＩａ、ファクターＩＩＩａ、ファクターＶａ、ファクターＶＩａ、ファクターＶＩＩａ、ファクターＶＩＩＩａ、ファクターＩＸａ、ファクターＸａ、ファクターＸＩａ、ファクターＸＩＩａおよびファクターＸＩＩＩａよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
17. 前記免疫グロブリンがポリクローナル免疫グロブリンまたはモノクローナル免疫グロブリンまたはこれらの混合物であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
18. 前記免疫グロブリンが、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＥまたはこれらの混合物であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
19. 前記タンパク質サンプルが、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、α−１抗トリプシン（α−１プロテアーゼ阻害剤）、ヘパリン、インスリン、ブチル−コリンエステラーゼ、ワルファリン、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ウロキナーゼ、ノイポゲン（ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、抗トロンビン−３、α−グルコシダーゼ、ヘモグロビンおよびアルブミンよりなる群から選択される１以上のタンパク質を含有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
20. 前記タンパク質サンプルが、組み換え法によって産生される１以上のタンパク質を含有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
21. 前記タンパク質サンプルが、血漿タンパク質画分を含有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
22. 前記血漿タンパク質画分が、Ｐｌａｓｍａ−Ｐｌｅｘ（登録商標）、Ｐｒｏｔｅｎａｔｅ（登録商標）、Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ（登録商標）およびＰｌａｓｍａｔｅｉｎ（登録商標）よりなる群から選択されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
23. 前記血清サンプルが、胎仔ウシ血清を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
24. 前記放射線が、少なくとも約３ｋＧｙ／時間から少なくとも約４５ｋＧｙ／時間で適用されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
25. 前記１以上の安定化剤がプロピレングリコールであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
26. プロピレングリコールの濃度が約１．０から約２．２Ｍであることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
27. ２以上の安定化剤の組合せが前記組織、血漿、血清またはタンパク質サンプルに加えられることを特徴とする請求項１に記載の方法。
28. ２以上の安定化剤が、ＤＭＳＯ、マンニトール、プロピレングリコールおよびトレハロースよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
29. ＤＭＳＯの濃度が約１．０から約３．１Ｍであることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
30. マンニトールの濃度が約１３５から約１５０ｍＭであることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
31. トレハロースの濃度が約１から約１００ｍＭであることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
32. 前記組織、タンパク質サンプル、血漿または血清を１以上の増感剤と接触させる工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
33. 前記サンプルが１以上の残留溶媒を含有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
34. 前記残留溶媒が水であることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
35. 前記残留溶媒が非水性溶媒であることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
36. 前記残留溶媒の含量が照射の前に減少されていることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
37. 残留溶媒の含量が約６から約８パーセントまで減少されていることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
38. 残留溶媒の含量が、凍結乾燥、乾燥、濃縮、蒸発、化学抽出、噴霧乾燥およびガラス化よりなる群から選択される方法によって減少されることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
39. γ線照射の全線量が少なくとも約２５ｋＧｙであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
40. γ線照射の全線量が少なくとも約４５ｋＧｙであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
41. γ線照射の全線量が少なくとも約７５ｋＧｙであることを特徴とする請求項１に記載の方法。

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