JP4211901B2 - 4’−メチルヌクレオシド化合物 - Google Patents
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Description
【発明が属する技術分野】
本発明は、4’−メチルヌクレオシド化合物及びその用途に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
抗ウイルス剤、抗腫瘍剤などの医薬品の開発を目的とし、今日まで多くの4’−置換ヌクレオシド化合物が合成されている。その中で、4’位の水素原子をメチル基で置換した4’−メチルヌクレオシド化合物の合成およびその生物活性が種々のグループから報告されている〔シンテックス・リサーチのグループ(Tetrahedron Lett., 33, 41-44 (1992))、東北大学/アサヒビールのグループ(Biosci. Biotech. Biochem., 57, 1433-1438 (1993), Nucleosides & Nucleotides, 15, 287-304 (1996)、特開平6−80688号)及びC.R.ジョンソンら(J. Org. Chem., 59, 5854-5855 (1994))〕。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
このような4’−メチルヌクレオシド化合物のうち、東北大学/アサヒビールのグループにより合成された2’−デオキシ−4’−C−メチルシチジンが顕著な抗HIV活性を有していることが報告された。しかし、当該化合物は同時に強い細胞毒性も有しており、医薬品としての開発は現在積極的には行われていない。
したがって、本発明は、生物活性を示す濃度と細胞毒性を示す濃度の差が大きい、いわゆる選択毒性の優れた4’−メチルヌクレオシド化合物の提供を目的とするものである。
【0004】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、より選択毒性の優れた4’−メチルヌクレオシド化合物を取得すべく、種々の4’−メチルヌクレオシド化合物をドラックデザインし、それらを合成するとともに、生物活性を測定した。その結果、下記式[I]で表されるような5位が置換されたウラシルを有する4’−メチルヌクレオシド化合物が顕著な抗ウイルス活性と優れた選択毒性を示すことを確認し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、下記式[I]で表される4’−メチルヌクレオシド化合物に関するものである。
【0005】
【化2】
【0006】
(式中、R1は、ハロゲン原子、メチルを除くアルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基を示し、R2及びR3は同一でも相違していてもよく、水素原子または水酸基を示し、R4は水素原子またはリン酸残基を示す。)
また、本発明は、上記式[I]で表される4’−メチルヌクレオシド化合物と薬学的に許容される担体とを含有してなる医薬組成物に関するものである。
【0007】
【発明の実施の形態】
(1)化合物
本発明化合物は、前記式[I]で表されるものであり、R1、R2及びR3は前記定義の通りである。置換基としてのハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が例示される。アルキル基としては、エチル、プロピルなどの炭素数2〜7の低級アルキル基が例示される。ハロアルキル基としては、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、ブロモメチル、ブロモエチルなどの炭素数1〜7のアルキルを有するハロアルキル基が例示される。アルケニル基としては、ビニル、アリルなどの炭素数2〜7のアルケニル基が例示される。ハロアルケニル基としては、ブロモビニル、クロロビニルなどの炭素数2〜7のハロアルケニル基が例示される。アルキニル基としては、エチニル、プロピニルなどの炭素数2〜7のアルキニル基が例示される。
【0008】
式[I]で表される4’−メチルヌクレオシド化合物の代表的なものを具体的に例示すれば、以下に示す化合物またはその5’−リン酸エステルが例示される。
1−(4−C−メチル−β−D−リボフラノシル)−5−フルオロウラシル
1−(4−C−メチル−β−D−アラビノフラノシル)−5−フルオロウラシル
1−(2−デオキシ−4−C−メチル−β−D−エリスロ−ペントフラノシル)−5−フルオロウラシル
1−(4−C−メチル−β−D−リボフラノシル)−5−ヨードウラシル
1−(4−C−メチル−β−D−アラビノフラノシル)−5−ヨードウラシル
1−(2−デオキシ−4−C−メチル−β−D−エリスロ−ペントフラノシル)−5−ヨードウラシル
【0009】
1−(4−C−メチル−β−D−リボフラノシル)−5−ブロモウラシル
1−(4−C−メチル−β−D−アラビノフラノシル)−5−ブロモウラシル
1−(2−デオキシ−4−C−メチル−β−D−エリスロ−ペントフラノシル)−5−ブロモウラシル
1−(4−C−メチル−β−D−リボフラノシル)−5−クロロウラシル
1−(4−C−メチル−β−D−アラビノフラノシル)−5−クロロウラシル
1−(2−デオキシ−4−C−メチル−β−D−エリスロ−ペントフラノシル)−5−クロロウラシル
1−(4−C−メチル−β−D−リボフラノシル)−5−エチルウラシル
1−(4−C−メチル−β−D−アラビノフラノシル)−5−エチルウラシル
1−(2−デオキシ−4−C−メチル−β−D−エリスロ−ペントフラノシル)−5−エチルウラシル
1−(4−C−メチル−β−D−リボフラノシル)−5−クロロエチルウラシル
1−(4−C−メチル−β−D−アラビノフラノシル)−5−クロロエチルウラシル
1−(2−デオキシ−4−C−メチル−β−D−エリスロ−ペントフラノシル)−5−クロロエチルウラシル
【0010】
1−(4−C−メチル−β−D−リボフラノシル)−5−ビニルウラシル
1−(4−C−メチル−β−D−アラビノフラノシル)−5−ビニルウラシル
1−(2−デオキシ−4−C−メチル−β−D−エリスロ−ペントフラノシル)−5−ビニルウラシル
1−(4−C−メチル−β−D−リボフラノシル)−5−ブロモビニルウラシル
1−(4−C−メチル−β−D−アラビノフラノシル)−5−ブロモビニルウラシル
1−(2−デオキシ−4−C−メチル−β−D−エリスロ−ペントフラノシル)−5−ブロモビニルウラシル
1−(4−C−メチル−β−D−リボフラノシル)−5−クロロビニルウラシル
1−(4−C−メチル−β−D−アラビノフラノシル)−5−クロロビニルウラシル
1−(2−デオキシ−4−C−メチル−β−D−エリスロ−ペントフラノシル)−5−クロロビニルウラシル
1−(4−C−メチル−β−D−リボフラノシル)−5−ヨードビニルウラシル
1−(4−C−メチル−β−D−アラビノフラノシル)−5−ヨードビニルウラシル
1−(2−デオキシ−4−C−メチル−β−D−エリスロ−ペントフラノシル)−5−ヨードビニルウラシル
【0011】
1−(4−C−メチル−β−D−リボフラノシル)−5−エチニルウラシル
1−(4−C−メチル−β−D−アラビノフラノシル)−5−エチニルウラシル
1−(2−デオキシ−4−C−メチル−β−D−エリスロ−ペントフラノシル)−5−エチニルウラシル
1−(4−C−メチル−β−D−リボフラノシル)−5−プロピニルウラシル
1−(4−C−メチル−β−D−アラビノフラノシル)−5−プロピニルウラシル
1−(2−デオキシ−4−C−メチル−β−D−エリスロ−ペントフラノシル)−5−プロピニルウラシル
【0012】
本発明化合物は、塩、水和物または溶媒和物の形態であってもよい。そのような塩としては、R4が水素原子である場合には塩酸塩または硫酸塩などの酸付加物、R4がリン酸残基である場合にはナトリウム塩、カリウム塩またはリチウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩もしくはアンモニウム塩などの薬学的に許容される任意の塩が例示される。また、水和物または溶媒和物としては、本発明化合物またはその塩1分子に対し、0.1〜3.0分子の水または溶媒が付着したものを例示することができる。さらに、本発明の化合物には、互変異性体などの各種異性体も包含されうる。
【0013】
(2)製造法
本発明化合物は、式[II]で表される化合物と5位が置換されたウラシル(5−置換ウラシル)とを縮合反応に付し、所望により2’位水酸基をデオキシ化してデオキシ体とするか、立体反転してアラビノ体とし、糖部の水酸基の保護基を除去後、必要により5’位水酸基をリン酸化することにより合成される。
【0014】
【化3】
【0015】
(式中、R5はアシルオキシ基またはハロゲン原子であり、R6,R7及びR8は水酸基の保護基を示す。)
原料化合物は、式[II]で表される公知のリボース誘導体である(特開平6−80688号参照)。
このような式[II]で表される化合物と5−置換ウラシルとの縮合は、ルイス酸存在下、式[II]の化合物と5−置換ウラシルとを反応させることによって行うことができる。用いるルイス酸としては、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル、四塩化すず、塩化亜鉛、ヨウ化亜鉛、無水塩化アルミニウムなどが例示される。縮合反応は、ジクロロメタン、ジクロロエタン、アセトニトリル、トルエン等の有機溶媒中、必要によりアルゴン、窒素などの不活性ガス雰囲気下、式[II]の化合物1モルに対し必要によりシリル化した5−置換ウラシル化合物1〜10モル及びルイス酸0.1〜10モルとを用い、−20〜150℃で1〜24時間程度反応させることにより実施することができる。なお、シリル化は常法にしたがって行えばよく、例えばヘキサメチルジシラザンと硫酸アンモニウム中で5−置換ウラシル化合物を加熱還流すればよい。
【0016】
次に、デオキシ体への誘導は、上記縮合体の2’位水酸基をハロゲン体(ヨウ素体、臭素体、塩素体)、フェノキシチオカルボニル体、チオカルボニルイミダゾール体またはメチルジチオカルボネート体に変換した後、ラジカル開始剤存在下、ラジカル還元剤により還元することにより行われる。例えば、フェノキシチオカルボニル体に導いた後にラジカル還元剤により還元してデオキシ化する場合、フェノキシチオカルボニル体の調製は、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジクロロメタン等の有機溶媒中、ジメチルアミノピリジン、ピリジン等の塩基存在下、2’位水酸基の保護基のみ除去した上記縮合体1モルに対し、クロロチオノギ酸フェニル1〜10モル、好ましくは1.1〜2モル用い、0〜50℃で30分〜5時間程度撹拌反応させることにより実施することができる。続けて、トルエン、ベンゼン等の有機溶媒中、必要によりアルゴン、窒素等の不活性ガス雰囲気下、アゾビスイソブチロニトリル等のラジカル開始剤存在下、上記フェノキシチオカルボニル体1モルに対し、水素化トリブチルスズ等のラジカル還元剤1〜10モル、好ましくは2〜5モル用い、50〜150℃で1〜7時間程度撹拌反応させることにより還元反応を実施することがきでる。
【0017】
また、アラビノ体への誘導は、上記縮合体を2,2’−アンヒドロシクロヌクレオシド体に変換後に加水分解するか、上記縮合体の2’位水酸基をスルホニル化後に適当な塩基を触媒とし加水分解すればよい。例えば、上記縮合体の2’位水酸基をメタンスルホニル化後、適当な塩基を触媒とし加水分解してアラビノ体を調製する場合、メタンスルホニル化は、トリエチルアミン、ジメチルアミノピリジン等の塩基共存下、ピリジン、ジクロロメタン等の有機溶媒中(ただし、ピリジンを使用する場合には必ずしもトリエチルアミン等の塩基を共存させなくてもよい)、必要によりアルゴン、窒素等の不活性ガス雰囲気下、2’位水酸基の保護基のみ除去された上記縮合物1モルに対して塩化メタンスルホン酸1.1〜5モル、好ましくは1.5〜3モル用い、0℃〜室温で30分〜5時間程度反応させることにより実施できる。続けて、エタノール等のアルコール系溶媒と水との混合溶媒中、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基存在下、室温〜100℃で30分〜5時間程度反応させることにより加水分解反応を実施することができる。
【0018】
一方、目的化合物のR1がハロアルケニル基である場合、上記の方法とは別にウラシル(R1が水素原子)を有する4’−メチルヌクレオシド化合物、すなわち4’−メチルウリジンから変換することも可能である。具体的には、必要により適当な保護基で糖部の水酸基を保護した4’−メチルウリジンの5位を常法によりヨウ素化し、続けてヘック(Heck)反応により5位のヨウ素をアクリル酸エステルで置換し、エステル基を加水分解後、脱炭酸的ハロゲン化反応を行うことにより目的とする化合物を得ることができる。例えば、R1がブロモビニル基である場合、アセトニトリル、ジオキサン等の有機溶媒中、硝酸、硝酸アンモニウムセリウム(IV)等の酸化剤存在下、アシル基で保護した4’−メチルウリジン1モルに対して、ヨウ素1〜5モル、好ましくは1〜2モル用い、0〜120℃で1〜3時間程度撹拌反応させることによりヨウ素化反応を実施することができる。続けて、ジオキサン等の有機溶媒中、酢酸パラジウム等のパラジウム触媒、トリフェニルフォスフィン等の触媒配位子及びトリエチルアミン等の塩基存在下、得られたヨード体1モルに対し、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル等のアクリル酸エステル1〜10モル、好ましくは2〜5モルを用い、室温〜120℃で1〜3時間撹拌反応させることによってヘック反応を実施できる。
【0019】
エステル基の加水分解反応は、適当な塩基触媒または酸触媒を用いて行うことができる。例えば、塩基触媒を用いた加水分解反応は、メタノール等のアルコール系溶媒と水との混合溶媒中、水酸化ナトリウム等の塩基存在下、0℃〜室温で30分〜4時間程度反応させることにより実施される。続けて、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン等の有機溶媒中、炭酸水素カリウム、酢酸ナトリウム等の弱塩基共存下、アクリル酸体1モルに対しN−ブロモコハク酸イミド1〜1.5モル、好ましくは1〜1.1モル用い、0〜60℃で30分〜5時間程度反応させることにより脱炭酸的ブロム化反応を実施することができる。
【0020】
かくして得られた4’−メチルヌクレオシド化合物の糖部水酸基の保護基を除去してR4が水素である本発明化合物を得る。水酸基の保護基の除去は、使用した保護基に応じて酸性加水分解、アルカリ性加水分解、フッ化テトラブチルアンモニウム処理、接触還元などの通常の処理方法から適宜選択して行えばよい。また、R4がモノリン酸残基、ジリン酸残基などのリン酸残基である化合物を得る場合、R4が水素原子である化合物とオキシ塩化リン、テトラクロロピロリン酸などのヌクレオシドの5’位の選択的なリン酸化に使用されるリン酸化剤とを反応させて、遊離酸型または塩型の目的化合物を得ることができる。
また、本発明化合物及びその中間体の単離精製は、一般のヌクレオシド、ヌクレオチドの単離精製に使用されている方法(例えば、再結晶法、イオン交換カラムクロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィーなど)を適宜組み合せて行えばよく、必要に応じて塩型とすることも可能である。
【0021】
(3)用途
本発明化合物は、後述の試験例に示すように顕著な抗ウイルス作用を有するとともに、従来の4’−メチルヌクレオシド化合物と比較して優れた選択毒性を示すことから、これらを有効成分とする本発明薬剤は、ウイルス感染の治療に有用である。対象のウイルスとしては、例えばヘルペスウイルス科に属する単純ヘルペスウイルス1型(HSV−1)、単純ヘルペスウイルス2型(HSV−2)、水痘帯状庖疹ウイルス(VZV)などを挙げることができる。本発明組成物の有効成分である本発明化合物の投与量は、患者の年齢、体重、患者の重篤度、薬物による忍容性、投与方法などにより異なり、これらの条件を総合した上で適宜決定されるものである。通常1日当り0.0001〜1000mg/kg体重、好ましくは0.001〜100mg/kg体重の範囲内から選ばれ、一回または複数回に分けて投与される。投与方法は、経口、非経口、経腸、局所投与などのいずれの経路によっても投与することができる。
【0022】
本発明の化合物の製剤化に際しては、通常使用される製剤用担体、賦形剤、その他の添加剤を含む組成物として使用するのが普通である。担体としては、乳糖、カオリン、ショ糖、結晶セルロース、コーンスターチ、タルク、寒天、ペクチン、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、レシチン、塩化ナトリウムなどの固体状担体、グリセリン、落花生油、ポリビニルピロリドン、オリーブ油、エタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコール、水などの液状担体を例示することができる。剤型としては任意の形態を採ることができ、例えば固体状担体を使用する場合には錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、座剤、トローチ剤などを、液状担体を使用する場合にはシロップ、乳液、軟ゼラチンカプセル、クリーム、ゲル、ペースト、スプレー、注射などをそれぞれ例示することができる。
【0023】
【発明の効果】
本発明化合物は、顕著な抗ウイルス作用と優れた選択毒性を有し、医薬品としての開発が期待されるものである。
【0024】
【実施例】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、これにより本発明は何等限定されるものではない。
合成例1
1−(2−デオキシ−4−C−メチル−β−D−エリスロ−ペントフラノシル)−5−エチルウラシル(式[I]、R1=CH2CH3、R2=R3=R4=H)の合成
5−エチルウラシル(0.17g,1.21mmol)のヘキサメチルジシラザン(4.8ml)懸濁液に硫酸アンモニウム(4.8mg)を加え、4時間加熱還流した。室温に戻した後、減圧下濃縮し、残留物と1,2,5−トリ−O−アセチル−3−ベンジル−4−C−メチル−D−リボフラノース(0.385g,1.01mmol)を1,2−ジクロロエタン(4.8ml)に溶解した。0℃の温度条件下、この溶液にアルゴン雰囲気撹拌下でトリメチルシリルトリフレート(0.32ml,1.64mmol)を滴下し、室温下で3時間撹拌した後、0℃下で飽和炭酸水素ナトリウム水(5ml)を加え、室温でしばらく撹拌した。セライトで反応液をろ過した後、ろ液をクロロホルムで抽出し、有機層を飽和塩化ナトリウム水で1回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去し、残留物をメタノール(13ml)に溶解し、25%アンモニア水(13ml)を加え、密栓して室温で17.5時間撹拌した。減圧下溶媒を留去し、残留物をエタノールで2回、トルエンで3回共沸し、共沸残留物をピリジン(3.9ml)に溶解し、室温撹拌下、t−ブチルジメチルシリルクロリド(0.23g,1.52mmol)を加え、アルゴン雰囲気下、同温度で一夜撹拌した。t−ブチルジメチルシリルクロリド(0.23g)を添加し、さらに4.5時間撹拌後、水を加え酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を水で1回水洗した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、混合溶媒(n−ヘキサン:酢酸エチル(2:1〜3:2))で溶出し、5’−O−シリル体0.306g(収率62%)を得た。
【0025】
5’−O−シリル体(0.303g,0.618mmol)とN,N−ジメチルアミノピリジン(0.15g,1.23mmol)をアセトニトリル(18ml)に溶解し、室温およびアルゴン雰囲気撹拌下、フェニルクロロチオノカーボネート(0.13ml,0.927mmol)を滴下した。室温にて4時間撹拌後、減圧下濃縮し、水を加えクロロホルムで抽出し、有機層を水で1回、飽和塩化ナトリウム水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、残留物をトルエン(25.7ml)に溶解後、2,2’−アゾビスイソブチロニトリル(0.026g,0.155mmol)および水素化トリブチルスズ(0.49ml,1.85mmol)を加え、80℃、アルゴン雰囲気下、5.5時間撹拌後、室温に戻し、減圧下溶媒を留去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、混合溶媒(n−ヘキサン:酢酸エチル(5:1〜3:1))で溶出し、2’−デオキシ体0.223g(収率76%)を得た。
【0026】
−78℃、アルゴン雰囲気下、2’−デオキシ体(0.223g,0.47mmol)のジクロロメタン(3.2ml)溶液に1.0M三塩化ホウ素(2.35ml,2.35mmol)を滴下し、−78℃で2時間撹拌した。反応溶液にメタノ−ル(2.4ml)−ジクロロメタン(2.4ml)混合液を加え、室温に戻し、減圧下溶媒を留去し、残留物をメタノールで4回共沸した。共沸残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、混合溶媒(クロロホルム:メタノール(20:1〜10:1))で溶出し、目的化合物0.043g(収率34%)得た。
【0027】
1H−NMR(DMSO−d6)δ(ppm:J(Hz)):11.19(1H,br s,NH),7.76(1H,s,6−H),6.11(1H,t,J=6.4Hz,1’−H),5.12(1H,d,J=4.9Hz,OH),5.11(1H,t,J=4.4Hz,OH),4.23(1H,q,3’−H),3.43(1H,dd,J=11.7,5.4Hz,CHH’OH),3.38(1H,dd,J=11.7,4.9Hz,CHH’OH),2.11−2.24(4H,m,2’−H and CH 2 CH3),1.04(3H,s,Me),1.02(3H,t,J=7.3Hz,CH2CH 3 )
【0028】
合成例2
(E)−5−(2−ブロモビニル)−1−(2−デオキシ−4−C−メチル−β−D−エリスロ−ペントフラノシル)ウラシル(式[I]、R1=CH=CHBr−(E),R2=R3=R4=H)の合成
3’−5’−ジ−O−アセチル−2’−デオキシ−4’−C−メチルウリジン(0.081g,0.248mmol)のアセトニトリル(7.4ml)溶液にヨウ素(0.076g,0.298mmol)およびセリウムジアンモニウムニトレート(0.136g,0.248mmol)を加え、2時間加熱還流した。反応液の温度を室温まで戻した後、減圧下濃縮し、10%チオ硫酸ナトリウム水を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和塩化ナトリウム水で1回洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、混合溶媒(n−ヘキサン:酢酸エチル(3:2〜1:1))で溶出し、5−ヨード体0.093g(収率83%)を得た。
【0029】
酢酸パラジウム(0.018g,0.069mmol)、トリフェニルフォスフィン(0.035g,0.131mmol)およびトリエチルアミン(0.34ml,2.42mmol)のジオキサン(1ml)溶液を70℃、アルゴン雰囲気下30分間撹拌し、アクリル酸メチル(0.31ml,3.45mmol)および5−ヨード体(0.312g,0.69mmol)のジオキサン溶液(2ml)を加え、2時間加熱還流した。温度を室温に戻した後、減圧下溶媒を留去し、水と酢酸エチルを加え、セライトでろ過し、ろ液を酢酸エチルで抽出し、飽和塩化ナトリウム水で1回洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、混合溶媒(n−ヘキサン:酢酸エチル(3:2〜1:1))で溶出し、5−アクリル酸メチル体を0.193g(収率68%)を得た。
【0030】
5−アクリル酸メチル体(0.193g,0.471mmol)のメタノール(4.1ml)溶液に、1N水酸化ナトリウム(8.5ml)を加え、室温下3時間撹拌した。減圧下溶媒を留去し、水を少量加えた後、0℃下10%塩酸でpHを1〜2に調整後、析出してきた結晶をろ取し、水およびアセトンでそれぞれ2回ずつ洗浄し、75℃加熱下数時間真空乾燥を行い、5−アクリル酸体を0.03g得た。また、結晶をろ取した後のろ液を7.5N水酸化ナトリウムで中和後、減圧下濃縮し、濃縮物をODS逆相カラムクロマトグラフィーに付し、水および10%アセトニトリル水溶液で溶出し、5−アクリル酸体のナトリウム塩を得た。このナトリウム塩を水(20 ml)に溶解し、PK216カラムクロマトグラフィーに付し、水で溶出し、5−アクリル酸体0.07gを得た(アクリル酸体の合計収率68%)。
【0031】
5−アクリル酸体(0.101g,0.324mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド(0.48ml)溶液に炭酸水素カリウム(0.039g,0.389mmol)を加え、室温およびアルゴン雰囲気下、20分間撹拌した。N−ブロモコハク酸イミド(0.063g,0.356mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド(0.19ml)溶液を滴下し、室温下4.5時間撹拌した。反応中の沈殿物をセライトでろ去し、ジオキサンで2回洗浄した後、ろ液と洗浄液を併せて減圧下濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、混合溶媒(クロロホルム:メタノール(20:1〜10:1))で溶出し、目的化合物0.094g(収率84%)得た。
【0032】
1H−NMR(DMSO−d6)δ(ppm:J(Hz)):11.52(1H,br s,NH),8.19(1H,s,6−H),7.22(1H,d,J=13.7Hz,vinylHH’),6.83(1H,d,J=13.7Hz,vinylHH’),6.05(1H,t,J=6.4Hz,1’−H),5.20(1H,t,J=5.4Hz,OH),5.15(1H,d,J=4.9Hz,OH),4.23(1H,q,J=5.4Hz,3’−H),3.48(1H,dd,J=11.2,5.4Hz,CHH’OH),3.42(1H,dd,J=11.7,4.9Hz,CHH’OH),2.24(2H,t,J=5.9Hz,2’−H),1.06(3H,s,Me)
【0033】
合成例3
(E)−5−(2−ブロモビニル)−1−(4−C−メチル−β−D−アラビノフラノシル)ウラシル(式[I]、R1=CH=CHBr−(E),R2=OH,R3=R4=H)の合成
5−ブロモビニルウラシル(0.271g,1.25mmol)のアセトニトリル(4.3ml)懸濁液にN,O−ビストリメチルシリルアセトアミド(1.24ml,5mmol)を加え、アルゴン雰囲気下2時間加熱還流した。室温に戻した後、0℃、アルゴン雰囲気撹拌下、1,2−ジ−O−アセチル−3,5−O−ベンジル−4−C−メチル−D−リボフラノース(0.445g,1.04mmol)のアセトニトリル(4.3ml)溶液を加え、続いてトリメチリシリルトリフレート(0.31ml,1.66mmol)を滴下し、室温で一夜撹拌した後、0℃下で飽和炭酸水素ナトリウム水を加え室温でしばらく撹拌した。セライトでろ過した後、ろ液を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和塩化ナトリウム水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去した。残留物をメタノール(5.7ml)に溶解し、室温撹拌下、無水炭酸カリウム(0.43g,3.12mmol)を加え、同温度にて2時間撹拌後、酢酸で中和し、減圧下溶媒を留去し、水を加え酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、混合溶媒(n−ヘキサン:酢酸エチル(2:1〜3:2))で溶出し、脱アセチル体0.41g(収率73%)を得た。
【0034】
脱アセチル体(0.206g,0.379mmol)のピリジン(1.2ml)溶液に0℃、アルゴン雰囲気撹拌下、メタンスルホニルクロリド(0.088ml,1.14mmol)を滴下し、室温にて3時間撹拌した後、0℃下水(4ml)を加え、エーテルで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水で2回、飽和塩化ナトリウム水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去し、残留物をトルエンで2回共沸した。共沸残留物をエタノ−ルと水の混合溶媒(8.4ml:2.8ml)に加熱溶解し、1N水酸化ナトリウム(1.1ml)を加え、3時間加熱還流した。温度を室温まで戻した後、酢酸で中和し、減圧下濃縮し、水を加え酢酸エチルで抽出後、飽和炭酸水素ナトリウム水で2回、飽和塩化ナトリウム水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下溶媒を留去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、混合溶媒(n−ヘキサン:酢酸エチル(2:1〜3:2))で溶出し、加水分解体0.119g(収率58%)を得た。
【0035】
加水分解体(0.092g,0.169mmol)のジクロロメタン(3.2ml)溶液に−78℃、アルゴン雰囲気撹拌下、三臭化ホウ素(0.095ml,1.01mmol)を滴下し、−78℃で4時間撹拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水(9ml)加え室温に戻した後、水層を分取し、水層をクロロホルムで1回洗浄した後、減圧下溶媒を留去し、残留物にメタノールを加えた。不溶物をセライトでろ去し、メタノールで不溶物を2回洗浄した後、ろ液及び洗浄液を減圧下濃縮し、エタノールで1回共沸した後、共沸残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、混合溶媒(クロロホルム:メタノール(15:1〜10:1))で溶出し、目的化合物0.037g(収率60%)を得た。
【0036】
1H−NMR(DMSO−d6)δ(ppm:J(Hz)):11.50(1H,br s,NH),8.06(1H,s,6−H),7.20(1H,d,J=13.7Hz,vinylHH’),6.81(1H,d,J=13.7Hz,vinylHH’),5.99(1H,d,J=5.4Hz,1’−H),5.59(1H,d,J=5.4Hz,OH),5.38(1H,d,J=5.4Hz,OH),5.23(1H,t,J=5.4Hz,OH),4.16(1H,q,J=5.9Hz,2’−H),3.95(1H,t,J=5.4Hz,3’−H),3.50(1H,dd,J=11.2,5.4 Hz,CHH’OH),3.46(1H,dd,J=10.8,5.4Hz,CHH’OH),1.07(3H,s,Me)
【0037】
製剤例1:錠剤
本発明化合物 30.0mg
微粉末セルロース 25.0mg
乳糖 39.5mg
スターチ 40.0mg
タルク 5.0mg
ステアリン酸マグネシウム 0.5mg
上記組成から常法によって錠剤を調製する。
【0038】
製剤例2:カプセル剤
本発明化合物 30.0mg
乳糖 40.0mg
スターチ 15.0mg
タルク 5.0mg
上記組成から常法によってカプセル剤を調製する。
【0039】
製剤例3:注射剤
本発明化合物 30.0mg
グルコース 100.0mg
上記組成から常法によって注射剤を調製する。
【0040】
試験例
(方法)
(1)抗HSV−1活性および抗HSV−2活性
1.ヒト胎児肺由来線維芽細胞を準胎児牛血清(三菱化学)を10%添加したイーグルMEM中で4〜5日毎に1:2〜4スプリット継代培養する。
2.親細胞から1:2のスプリットで得た細胞浮遊液を2ml/ウエルの割合で12穴マルチプレートに播き、炭酸ガスインキュベーター内で37℃4日間培養する。
3.培養液を捨て、50〜150PFUのHSV−1 VR−3株またはHSV−2 MS株を含むハンクスMEM(250μl)を接種し、37℃で30分間ウイルスを吸着させた後、ウイルス液を捨てる。
【0041】
4.被検薬を含む2.5%血清添加イーグルMEM、0.8%メチルセルロース含有培地を加え、炭酸ガスインキュベーター内にて37℃で2〜3日間培養する。通常、被検薬は1/2log10段階希釈する。
5.培養液を捨て、0.5%クリスタルバイオレット液で染色し、透過型実体顕微鏡下で各ウエルのプラーク数を数え、下記式1によりプラーク形成阻害率を求める。
6.プラーク形成阻害率を被検薬の濃度(対数表示)に対してグラフ上にプロットし、得られた用量−プラーク形成阻害曲線から50%阻害を示す被検薬の濃度(ED50)を求める。
【0042】
【式1】
阻害率(%)=(1−X)x100
X=被検薬含有ウエルのプラーク数/被検薬非含有(対照)ウエルのプラーク数
【0043】
(2)抗水痘−帯状疱疹ウイルス(VZV)活性
1.ヒト胎児肺由来線維芽細胞を準胎児牛血清(三菱化学)を10%添加したイーグルMEM中で4〜5日毎に1:2〜4スプリット継代培養する。
2.親細胞から1:2のスプリットで得た細胞浮遊液を2ml/ウエルの割合で12穴マルチプレートに播き、炭酸ガスインキュベーター内で37℃4日間培養する。
3.培養液を捨て、50〜100PFUのVZV Oka株を含む750μlの5%血清添加イーグルMEMを接種し、37℃で1時間ウイルスを吸着させた。
【0044】
4.ウイルス液を除くことなく、被検薬を含む等量のMEMを加え、炭酸ガスインキュベーター内にて37℃で培養する。通常、被検薬は1/2log10段階希釈する。
5.4〜5日間培養後、培養液を捨て、0.5%クリスタルバイオレット液で染色し、透過型実体顕微鏡下で各ウエルのプラーク数を数え、上記(1)と同じ式によりプラーク形成阻害率を求める。
6.プラーク形成阻害率を被検薬の濃度(対数表示)に対してグラフ上にプロットし、得られた用量−プラーク形成阻害曲線から50%阻害を示す被検薬の濃度(ED50)を求める。
【0045】
(3)培養細胞の増殖阻害活性
1.96穴プレートにサンプル溶液あるいはMEM−ハンクス培地10μlをあらかじめ入れておき、対数増殖期のヒト白血病細胞CCRF−HSB−2を5000細胞/90μl/ウェルとなるように10%牛胎児血清添加RPMI1640培地で希釈後播種し、37℃で3日間炭酸ガスインキュベ−タ−中で培養する。
2.培養終了後、各ウェルに10μlのMTT溶液(5mg/ml in PBS)を加え、更に37℃で4時間炭酸ガスインキュベ−タ−中で培養する。
3.培養終了後、各ウェルに100μlの0.02N塩酸/50%ジメチルホルムアミド(dimethylformamide)/20%SDSを加え、撹拌して生成したホルマザンを溶解し、マイクロプレートリーダー(東ソーMPR4Ai)により、570nm(試験波長)、690nm(参照波長)における吸光度を測定する。
4.50%阻止率を示すサンプル濃度(IC50)をプロビット法によりコンピューターソフトを用いて算出する。
なお、試験サンプルは10mg/mlとなるようにジメチルスルホキシドに溶解後4℃で保存し、これをMEM−ハンクス培地で希釈して試験に供した。
【0046】
(結果)
試験結果を表1に示す。
【0047】
【表1】
対照化合物: 2 '−デオキシ−4’- C -メチルシチジン
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