JP4189873B2 - 穀粒中の混合品種の有無および混合された品種の判別方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、穀粒中の混合品種の有無および混合された品種の判別方法に関するものである。たとえば、良食味米への混米の有無およびその品種の判定を行うためのＤＮＡ品種判別方法に関し、より詳しくは米、小麦、トウモロコシ、大麦等の穀粒あるいはそれらの加工品から抽出したＤＮＡを鋳型とし、適当な対合プライマー群の存在下にマルチプレックスＰＣＲを行うことによって、増幅したＤＮＡのバンドパターンから混入されている品種を判別する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、穀粒の価格は、穀粒の加工適性や食味に応じて決定され、良質の穀粒ほど高価格で取り引きされている。たとえば米において、平成１２年度におけるわが国の作付け上位４品種である「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「ヒノヒカリ」および「あきたこまち」に代表される良食味米は、消費者の良食味米志向を受けて高値で取り引きされている。
しかし、一部では、これらの良食味品種以外の米を混米しながら、表示を偽って販売されている不正混米が行われ、問題となっている。平成１３年４月から施行される改正ＪＡＳ法のもとでは、米の包装での品種、産地、産年の表示が義務づけられており、内容と表示が一致しているかどうかを科学的に検査する技術の開発が必要とされている。
【０００３】
従来、米等の穀物の品種については、植物体の草型、穀粒の粒型、葉や米の酵素多型などによって識別されてきた。しかし、現在のように、わが国の米における「コシヒカリ」とその類縁系統が全体の７割を越えるような近縁系統の多い状況下では、前述の方法によって品種混合の有無を識別することは不可能である。
本発明者らは、これまでに、ＲＡＰＤ法やＳＴＳ化プライマー法等のＤＮＡによって品種を判別する技術を開発し、日本食品科学工学会誌４６巻３号（p.117-122)、特許第３０４８１４９号明細書および特開２００１−９５５８９号公報に開示してきた。
しかし、これらの技術では、単一品種同士の米の品種識別は明瞭に行うことができるものの、たとえば「コシヒカリ」にその識別バンドが重なる場合、「コシヒカリ」よりも発現する識別バンド数の少ない異品種の米を１〜３割程度混米した場合や複数の品種を混米した場合に、これらを検出することが困難であった。
【０００４】
また、３〜４種類のプライマーセットによる混米の有無の判定では、たとえ混米特有のＤＮＡバンドが現れなかったとしても、その品種が良食味米のような対象品種である確率は８８〜９４％（＝１−（０．５）3 〜 4 ）に過ぎず、十分に高い確率とは言えないのが現状である。
さらに、混米特有のバンドが現れたとしても、実際には混米の品種の同定が必要とされる場合が多い。このため、対象品種に現れる筈のない識別バンドが現れたのみでは混米品種の同定のためには情報が不十分であり、混米品種の同定のためにはさらなるＰＣＲを行う必要がある。
したがって、これまでの公知の技術では、穀粒の品種混合の有無および混合された品種を簡易迅速、かつ正確に判定することは不可能であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、「コシヒカリ」等の良質穀粒に対する他の品種の混合の有無および混合された品種を簡易迅速、かつ正確に判定する方法を提供することを目的としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、穀粒試料から抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ増幅を行うに際し、対象の良質品種には現れずに他の品種のみに特有に現れるネガティブバンド識別用対合プライマー群を用いて第１次のマルチプレックスＰＣＲを行い、発現したバンドパターンによっては対合プライマーを選択的に用いた第２次のマルチプレックスＰＣＲを行うことにより増幅したＤＮＡの多型を検出することによって、穀類試料が対象品種であることを確認し、さらには品種混合の有無および混合された品種の同定を簡易迅速、かつ正確に行うことができることを見出し、かかる知見に基づいて本発明に到達したものである。
【０００７】
請求項１記載の本発明は、穀粒にイネ品種「コシヒカリ」以外の品種の穀粒が混合しているか否かを、当該穀粒もしくはその加工品から抽出したＤＮＡを鋳型とするマルチプレックスＰＣＲ法を用いて判別するに際し、イネ品種「コシヒカリ」では識別バンドを発現せず、混合品種のみに選択的に発現する以下の１）〜４）に示す４種の対合プライマーからなるネガティブバンド識別用対合プライマー群を用いることを特徴とするイネ品種「コシヒカリ」のＤＮＡ品種判別方法である。
１）Ａ６Ｆ２１（配列番号３）およびＡ６Ｒ２２（配列番号４）
２）Ｂ７Ｆ２２（配列番号１９）およびＢ７Ｒ１７（配列番号２０）
３）Ｆ６Ｆ２５（配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列番号４４）
４）ＷＫ９Ｆ２０（配列番号９５）およびＷＫ９Ｒ２０（配列番号９６）
【０００８】
請求項２記載の本発明は、さらに、以下の５）〜８）に示す４種の対合プライマーからなる対合プライマー群を用いて第２次のマルチプレックスＰＣＲ法を行い、発現したＤＮＡバンドパターンによってイネ品種「コシヒカリ」であることを確認することを特徴とする請求項１記載のイネ品種「コシヒカリ」のＤＮＡ品種判別方法である。
５）Ｂ４３Ｆ１７（配列番号２７）およびＢ４３Ｒ１８（配列番号２８）
６）Ｇ２２Ｆ２７（配列番号５１）およびＧ２２Ｒ２３（配列番号５２）
７）Ｍ１１Ｆ２０（配列番号６７）およびＭ１１Ｒ２０（配列番号６８）
８）ＷＫ９Ｆ２０（配列番号９５）およびＷＫ９Ｒ２０（配列番号９６）
請求項３記載の本発明は、第２次のマルチプレックスＰＣＲ法において、さらに以下の９）に示す対合プライマーを用いることを特徴とする請求項１または２記載のイネ品種「コシヒカリ」のＤＮＡ品種判別方法である。
９）Ｐ３Ｆ２０（配列番号７１）およびＰ３Ｒ１５（配列番号７２）
【０００９】
請求項４記載の本発明は、穀粒にイネ品種「ひとめぼれ」以外の品種の穀粒が混合しているか否かを、当該穀粒もしくはその加工品から抽出したＤＮＡを鋳型とするマルチプレックスＰＣＲ法を用いて判別するに際し、イネ品種「ひとめぼれ」では識別バンドを発現せず、混合品種のみに選択的に発現する以下の１）〜４）に示す４種の対合プライマーからなるネガティブバンド識別用対合プライマー群を用いることを特徴とするイネ品種「ひとめぼれ」のＤＮＡ品種判別方法である。
１）Ａ６Ｆ２１（配列番号３）およびＡ６Ｒ２２（配列番号４）
２）Ｆ６Ｆ２５（配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列番号４４）
３）Ｐ３Ｆ２０（配列番号７１）およびＰ３Ｒ１５（配列番号７２）
４）Ｓ１３Ｆ２５（配列番号８３）およびＳ１３Ｒ２４（配列番号８４）
【００１０】
請求項５記載の本発明は、さらに、以下の５）〜９）に示す５種の対合プライマーからなる対合プライマー群を用いて第２次のマルチプレックスＰＣＲ法を行い、発現したＤＮＡバンドパターンによってイネ品種「ひとめぼれ」であることを確認することを特徴とする請求項４記載のイネ品種「ひとめぼれ」のＤＮＡ品種判別方法である。
５）Ｂ４３Ｆ１７（配列番号２７）およびＢ４３Ｒ１８（配列番号２８）
６）Ｅ３０Ｆ２８（配列番号３９）およびＥ３０Ｒ２４（配列番号４０）
７）Ｇ２２Ｆ２７（配列番号５１）およびＧ２２Ｒ２３（配列番号５２）
８）Ｐ５Ｆ２０（配列番号７５）およびＰ５Ｒ２５（配列番号７６）
９）ＷＫ９Ｆ２０（配列番号９５）およびＷＫ９Ｒ２０（配列番号９６）
【００１１】
請求項６記載の本発明は、穀粒にイネ品種「ヒノヒカリ」以外の品種の穀粒が混合しているか否かを、当該穀粒もしくはその加工品から抽出したＤＮＡを鋳型とするマルチプレックスＰＣＲ法を用いて判別するに際し、イネ品種「ヒノヒカリ」では識別バンドを発現せず、混合品種のみに選択的に発現する以下の１）〜４）に示す４種の対合プライマーからなるネガティブバンド識別用対合プライマー群を用いることを特徴とするイネ品種「ヒノヒカリ」のＤＮＡ品種判別方法である。
１）Ｂ４３Ｆ１７（配列番号２７）およびＢ４３Ｒ１８（配列番号２８）
２）Ｆ６Ｆ２５（配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列番号４４）
３）Ｇ２８Ｆ１７（配列番号５５）およびＧ２８Ｒ２８（配列番号５６）
４）Ｔ１６Ｆ３０（配列番号８９）およびＴ１６Ｒ３０（配列番号９０）
【００１２】
請求項７記載の本発明は、穀粒にイネ品種「あきたこまち」以外の品種の穀粒が混合しているか否かを、当該穀粒もしくはその加工品から抽出したＤＮＡを鋳型とするマルチプレックスＰＣＲ法を用いて判別するに際し、イネ品種「あきたこまち」では識別バンドを発現せず、混合品種のみに選択的に発現する以下の１）〜５）に示す５種の対合プライマーからなるネガティブバンド識別用対合プライマー群を用いることを特徴とするイネ品種「あきたこまち」のＤＮＡ品種判別方法である。
１）Ａ６Ｆ２１（配列番号３）およびＡ６Ｒ２２（配列番号４）
２）Ｅ３０Ｆ２８（配列番号３９）およびＥ３０Ｒ２４（配列番号４０）
３）Ｆ６Ｆ２５（配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列番号４４）
４）Ｇ２２Ｆ２７（配列番号５１）およびＧ２２Ｒ２３（配列番号５２）
５）Ｐ３Ｆ２０（配列番号７１）およびＰ３Ｒ１５（配列番号７２）
【００１３】
請求項８記載の本発明は、試料米が米飯である請求項１〜７のいずれかに記載のＤＮＡ品種判別方法である。
請求項９記載の本発明は、混入した試料米を各１粒ずつ検定することを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のＤＮＡ品種判別方法である。
【００１４】
請求項１０記載の本発明は、以下の１）〜４）に示す４種の対合プライマーを含むことを特徴とするイネ品種「コシヒカリ」のＤＮＡ品種判別用キットである。
１）Ａ６Ｆ２１（配列番号３）およびＡ６Ｒ２２（配列番号４）
２）Ｂ７Ｆ２２（配列番号１９）およびＢ７Ｒ１７（配列番号２０）
３）Ｆ６Ｆ２５（配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列番号４４）
４）ＷＫ９Ｆ２０（配列番号９５）およびＷＫ９Ｒ２０（配列番号９６）
【００１５】
請求項１１記載の本発明は、以下の１）〜４）に示す４種の対合プライマーを含むことを特徴とするイネ品種「コシヒカリ」のＤＮＡ品種判別用キットである。
１）Ｂ４３Ｆ１７（配列番号２７）およびＢ４３Ｒ１８（配列番号２８）
２）Ｇ２２Ｆ２７（配列番号５１）およびＧ２２Ｒ２３（配列番号５２）
３）Ｍ１１Ｆ２０（配列番号６７）およびＭ１１Ｒ２０（配列番号６８）
４）ＷＫ９Ｆ２０（配列番号９５）およびＷＫ９Ｒ２０（配列番号９６）
請求項１２記載の本発明は、さらに以下の５）に示す対合プライマーを含むことを特徴とする請求項１１記載のイネ品種「コシヒカリ」のＤＮＡ品種判別方法である。
５）Ｐ３Ｆ２０（配列番号７１）およびＰ３Ｒ１５（配列番号７２）
【００１６】
請求項１３記載の本発明は、以下の１）〜４）に示す４種の対合プライマーを含むことを特徴とするイネ品種「ひとめぼれ」のＤＮＡ品種判別用キットである。
１）Ａ６Ｆ２１（配列番号３）およびＡ６Ｒ２２（配列番号４）
２）Ｆ６Ｆ２５（配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列番号４４）
３）Ｐ３Ｆ２０（配列番号７１）およびＰ３Ｒ１５（配列番号７２）
４）Ｓ１３Ｆ２５（配列番号８３）およびＳ１３Ｒ２４（配列番号８４）
請求項１４記載の本発明は、以下の１）〜５）に示す５種の対合プライマーを含むことを特徴とするイネ品種「ひとめぼれ」のＤＮＡ品種判別用キットである。
１）Ｂ４３Ｆ１７（配列番号２７）およびＢ４３Ｒ１８（配列番号２８）
２）Ｅ３０Ｆ２８（配列番号３９）およびＥ３０Ｒ２４（配列番号４０）
３）Ｇ２２Ｆ２７（配列番号５１）およびＧ２２Ｒ２３（配列番号５２）
４）Ｐ５Ｆ２０（配列番号７５）およびＰ５Ｒ２５（配列番号７６）
５）ＷＫ９Ｆ２０（配列番号９５）およびＷＫ９Ｒ２０（配列番号９６）
【００１７】
請求項１５記載の本発明は、以下の１）〜４）に示す４種の対合プライマーを含むことを特徴とするイネ品種「ヒノヒカリ」のＤＮＡ品種判別用キットである。
１）Ｂ４３Ｆ１７（配列番号２７）およびＢ４３Ｒ１８（配列番号２８）
２）Ｆ６Ｆ２５（配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列番号４４）
３）Ｇ２８Ｆ１７（配列番号５５）およびＧ２８Ｒ２８（配列番号５６）
４）Ｔ１６Ｆ３０（配列番号８９）およびＴ１６Ｒ３０（配列番号９０）
【００１８】
請求項１６記載の本発明は、以下の１）〜５）に示す５種の対合プライマーを含むことを特徴とするイネ品種「あきたこまち」のＤＮＡ品種判別用キットである。
１）Ａ６Ｆ２１（配列番号３）およびＡ６Ｒ２２（配列番号４）
２）Ｅ３０Ｆ２８（配列番号３９）およびＥ３０Ｒ２４（配列番号４０）
３）Ｆ６Ｆ２５（配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列番号４４）
４）Ｇ２２Ｆ２７（配列番号５１）およびＧ２２Ｒ２３（配列番号５２）
５）Ｐ３Ｆ２０（配列番号７１）およびＰ３Ｒ１５（配列番号７２）
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下において、本発明を詳細に説明する。
本発明における穀類とは、稲科植物の種子を指し、たとえば米、小麦、トウモロコシ、大麦、ソルガム等があり、これらの加工品も含まれる。また、試料米とは、精米、玄米、精米粉、玄米粉、米飯、餅等を意味する。
【００２０】
また、本発明において対象品種とは、穀類中の主流をなす品種、たとえば米では「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「あきたこまち」、「ササニシキ」等の良食味米を意味し、大麦の場合は、「イチバンボシ」、「サンシュウ」、「大系ＨＫ６４」等、トウモロコシの場合は、「ハニーバンダム」、「ピーターコーン」、「ワキシーコーン」等を意味する。
これらの穀類は、穀粒自体を試料とする他、必要に応じて適当な粉砕機器、たとえば超遠心粉砕機（レッチェ社製）、サイクロンミル（ユーディ社製）、ミルサー（イワタニ製）、乳鉢等によって粉砕し、粉末として用いる。
【００２１】
穀類試料からのゲノムＤＮＡの抽出には、公知のＤＮＡ抽出法を適用することができ、たとえばフェノール抽出法、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）法、アルカリＳＤＳ法などが挙げられる。本発明においては、後記の実施例で示すように、ＣＴＡＢ法を用いるのが好ましい。
たとえば、試料にＣＴＡＢ溶液（０．１Ｍ トリス塩酸、２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム、１．４Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））を加えて攪拌し、恒温槽に入れた後、再びＣＴＡＢ溶液を加え、所定時間静置して抽出することにより、ゲノムＤＮＡを得ることができる。
【００２２】
また、試料が米飯や餅等の場合には、特許第３０４８１４９号明細書に記載されているように、粉末試料を耐熱性アミラーゼによって処理した後にゲノム遺伝子を抽出する酵素法によって抽出することもできる。
ＤＮＡの抽出後、必要に応じてクロロホルム／イソアミルアルコール処理、イソプロパノール沈殿、フェノール／クロロホルムによる除蛋白、エタノール沈殿等の精製工程を加えてもよい。これらの工程の中では、クロロホルム／イソアミルアルコール処理が好ましい。この処理は、たとえばＤＮＡ抽出液にクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を加えて攪拌、遠心分離して得られる上清に、ＤＮＡ沈殿液を加えてさらにＤＮＡを沈殿させた後、遠心分離を行って得られたＤＮＡ沈殿物を１Ｍ ＮａＣｌで抽出し、イソプロピルアルコール、エタノールによる洗浄、沈殿の後、ＴＥ緩衝液に溶解するもので、これによりＤＮＡ試料液を得ることができる。
【００２３】
続いて、ランダムプライマーの共存下に、上記の操作により得られるゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法を行う。これは、ゲノムＤＮＡのうち、次のＰＣＲ用の対合プライマー設計の基となる品種間の識別性を有する塩基配列を増幅させるために行うものである。
ここで、本発明におけるＰＣＲ法とは、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ複製の連鎖反応を指す。すなわち、鋳型となるＤＮＡに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーの共存下で約９０〜９６℃の高温処理過程（変性）、約３０〜７５℃のプライマー・ＤＮＡ結合過程（アニーリング）、約７０〜７５℃のＤＮＡ複製過程（伸長）の３過程を２０〜６０サイクル繰り返すことにより、約１００万倍〜１０億倍に増加させる（増幅）反応をいう。
また、マルチプレックスＰＣＲ法とは、複数の対合プライマーを組み合わせて行うＰＣＲ法を意味し、この方法には互いにプライマーダイマーを生成したり、識別バンドが互いに干渉したり、重複したりすることがない、融解温度の近い複数の対合プライマー（８〜３０量体）を選定して用いる。その結果、ＰＣＲ回数および電気泳動・染色回数を減らすことができる。
【００２４】
対合プライマーとは、品種間の識別性の現れる塩基配列を増幅させることができる１対のプライマーであり、前記したように、ＲＡＰＤ法に基づき、上記穀類試料より得られるＤＮＡからＰＣＲ法を行って得られる品種間に識別性のあるバンド部分の塩基配列を基に設計されるものである。すなわち、対象とする穀類のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ランダムプライマー存在下で行うＰＣＲ法によって識別バンドとして得られたＤＮＡの塩基配列を決定し、そのうちランダムプライマー部分のフォワード側およびリバース側の１５〜２９残基を１対のプライマーとして、対象穀類の鋳型ＤＮＡと共に品種識別のために行うＰＣＲ法に使用するものを指す。
対合プライマーを選定することにより、ランダムプライマーが鋳型ＤＮＡに結合する複数個所のうち、品種識別のために行うＰＣＲ法においては、識別に有用な識別バンドとなる塩基配列部分のみに選択的に結合することになる。
【００２５】
本発明におけるランダムプライマーとは、穀類試料から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲ法で増幅する際に、変性して一本鎖に分かれたゲノムＤＮＡに相補的に結合して二本鎖構造を形成し、鋳型ＤＮＡ複製の開始点となるプライマーを指す。通常は８〜５０量体のヌクレオチドであり、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）を無作為の配列に結合させた合成プライマーのことであり、たとえば市販されている１０量体ランダムプライマー（オペロン社製）やＤＮＡオリゴマーセット（１２量体）（和光純薬社製）等が挙げられる。
【００２６】
続いて、ＰＣＲで得られる増幅ＤＮＡの電気泳動を行う。これは、増幅産物のうち、目的とする対合プライマーを設計するための基となる、品種間の識別性の現れる塩基配列であることを示すバンドを検出するためである。
ここで電気泳動とは、ＰＣＲ法によって増幅されたＤＮＡが、アガロースやポリアクリルアミドのゲル中を直流電荷に引かれて移動する際に、ＤＮＡの分子量の差によって分離され、臭化エチジウムによって帯状に染色されてバンドとして増幅ＤＮＡの相違が検出される操作をいう。
【００２７】
このようにして検出された品種間の識別性の現れたバンドから、次のようにして１対の対合プライマーを作製する。
すなわち、当該識別性の現れたバンドを前記ゲルから切り出してＤＮＡを抽出、回収し、これを大腸菌に組み込んで増殖させる。次いで、アルカリミニプレップ法等でプラスミドを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとするＰＣＲ法で増幅し、ＤＮＡ自動シークエンサーにより塩基配列を決定する。
決定された塩基配列から、対合プライマーの設計を行う。先のランダムプライマーによるＰＣＲ法において、鋳型ＤＮＡである穀類試料由来のＤＮＡのうちランダムプライマーが結合した部位は、当該ランダムプライマーと同一あるいは相補的な（相同な）配列を有している筈である。つまり、この鋳型ＤＮＡから切り出して抽出した品種識別性の高いＤＮＡ塩基配列（これがＰＣＲ法における対合プライマーの母体となる）は、両端にランダムプライマーと同一あるいは相同な配列を有していることになる。
したがって、この識別性の高いＤＮＡ塩基配列のフォワード側およびリバース側のそれぞれから、適当な配列と長さを有する穀類の品種判定に有用な対合プライマーを設計することができる。
【００２８】
本発明における対合プライマーは、互いに同一配列あるいは相同配列を有していることが望ましい。
また、対合プライマーのサイズは、好ましくは１０〜４０塩基、より好ましくは１３〜２９塩基の範囲内であることが必要である。プライマーがこの範囲を超える場合は、鋳型ＤＮＡとの結合性および結合後の解離が悪くなり、ＰＣＲ後にも識別バンドが検出されず、品種識別が困難になるため好ましくない。また、この範囲を下回る場合は、非特異的な結合によるミスマッチ等が起こり、識別バンド以外のバンドの発現頻度が高くなるため、品種識別が困難になる他、複数のプライマーの併用によるＰＣＲの簡易迅速化が困難になるため好ましくない。
【００２９】
本発明者らは、上記のＰＣＲを行った結果、各種品種間に識別性の現れる数種のバンドを得た。米における識別バンドと品種識別性の関係を表１に示す。
【００３０】
【表１】
＋：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現することを示す。
−：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現しないことを示す。
【００３１】
【表２】
＋：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現することを示す。
−：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現しないことを示す。
【００３２】
【表３】
＋：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現することを示す。
−：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現しないことを示す。
【００３３】
【表４】
＋：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現することを示す。
−：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現しないことを示す。
【００３４】
トウモロコシおよび大麦における識別バンドと品種識別性の関係を、表２に示す。
【００３５】
【表５】
＋：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現することを示す。
−：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現しないことを示す。
【００３６】
【表６】
＋：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現することを示す。
−：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現しないことを示す。
【００３７】
各バンドに由来して、種々の対合プライマーを得た。
（１）識別バンドＡ７（０．７ｋｂｐ）
このバンドは、「コシヒカリ」や「あきたこまち」等の品種から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「日本晴」や「朝の光」では特異的に見られない。このＡ７から、１対のプライマーＡ７Ｆ３０（配列表の配列番号５）およびＡ７Ｒ３０（配列表の配列番号６）を設計した。
続いて、上記のプライマーの３’側から所定数の塩基を切除し、本発明の対合プライマーであるＡ７Ｆ１９（配列表の配列番号７）およびＡ７Ｒ１６（配列表の配列番号８）を得た。
【００３８】
（２）識別バンドＢ４３（０．９ｋｂｐ）
このバンドは、「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」や「ササニシキ」から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「きらら３９７」や「朝の光」では見られない。このＢ４３から、１対のプライマーＢ４３Ｆ３０（配列表の配列番号２５）およびＢ４３Ｒ３０（配列表の配列番号２６）を設計した。
続いて、上記のプライマーの３’側から所定数の塩基を切除し、本発明の対合プライマーであるＢ４３Ｆ１７（配列表の配列番号２７）およびＢ４３Ｒ１８（配列表の配列番号２８）を得た。
【００３９】
（３）識別バンドＥ３０（０．８５ｋｂｐ）
このバンドは、「ひとめぼれ」や「むつほまれ」等の品種から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「コシヒカリ」や「あきたこまち」では見られない。このＥ３０から、１対のプライマーＥ３０Ｆ３０（配列表の配列番号３７）およびＥ３０Ｒ３０（配列表の配列番号３８）を設計した。
続いて、上記のプライマーから塩基を切除し、本発明の対合プライマーであるＥ３０Ｆ２８（配列表の配列番号３９）およびＥ３０Ｒ２４（配列表の配列番号４０）を得た。
【００４０】
（４）識別バンドＪ６（０．９ｋｂｐ）
このバンドは、「コシヒカリ」や「きらら３９７」から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「ササニシキ」では見られない。このＪ６から、１対のプライマーＪ６Ｆ３０（配列表の配列番号５７）およびＪ６Ｒ３０（配列表の配列番号５８）を設計した。
続いて、上記のプライマーから塩基を切除し、本発明の対合プライマーであるＪ６Ｆ１８（配列表の配列番号５９）およびＪ６Ｒ２０（配列表の配列番号６０）を得た。
【００４１】
（５）識別バンドＭ２ＣＧ（１．２ｋｂｐ）
このバンドは、１０量体ランダムプライマーに２残基添加したもので、「ひとめぼれ」や「日本晴」から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「コシヒカリ」や「キヌヒカリ」では見られない。このＭ２ＣＧから、１対のプライマーＭ２ＣＧＦ３０（配列表の配列番号６１）およびＭ２ＣＧＲ３０（配列表の配列番号６２）を設計した。
続いて、上記のプライマーから塩基を切除し、本発明の対合プライマーであるＭ２ＣＧＦ１６（配列表の配列番号６３）およびＭ２ＣＧＲ１５（配列表の配列番号６４）を得た。
【００４２】
（６）識別バンドＳ１３（１．８ｋｂｐ）
このバンドは、「きらら３９７」や「ほしのゆめ」から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「日本晴」や「朝の光」では特異的に見られない。このＳ１３から、１対のプライマーＳ１３Ｆ３０（配列表の配列番号８１）およびＳ１３Ｒ３０（配列表の配列番号８２）を設計した。
続いて、上記のプライマーから塩基を切除し、本発明の対合プライマーであるＳ１３Ｆ２５（配列表の配列番号８３）およびＳ１３Ｒ２４（配列表の配列番号８４）を得た。
【００４３】
（７）識別バンドＷＫ９（１．６ｋｂｐ）
このバンドは、「ひとめぼれ」や「あきたこまち」から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「こしひかり」や「ササニシキ」では見られない。このＷＫ９から、１対のプライマーＷＫ９Ｆ３０（配列表の配列番号９３）およびＷＫ９Ｒ３０（配列表の配列番号９４）を設計した。
続いて、上記のプライマーから塩基を切除し、本発明の対合プライマーであるＷＫ９Ｆ２０（配列表の配列番号９５）およびＷＫ９Ｒ２０（配列表の配列番号９６）を得た。
【００４４】
上記のプライマーは米を基にして設計したものであるが、その多くは同じイネ科に属するトウモロコシや大麦等の識別にも利用できる。
本発明の対合プライマーを得るために行う塩基の切除とは、穀類試料より抽出した鋳型ＤＮＡを増幅し、これを基に設計された１対のプライマーの３’側の１〜１７個の塩基を切除し、１３〜２９個の塩基とすることをいう。
塩基を切除する方法としては、好適な制限酵素を用いて行う常法によって実施すればよい。
【００４５】
具体的には、１対のプライマーであるＡ６Ｆ３０（配列表の配列番号１）およびＡ６Ｒ３０（配列表の配列番号２）、Ａ７Ｆ３０（配列表の配列番号５）およびＡ７Ｒ３０（配列表の配列番号６）、Ａ５２Ｆ３０（配列表の配列番号９）およびＡ５２Ｒ３０（配列表の配列番号１０）、Ｂ１Ｆ３０（配列表の配列番号１３）およびＢ１Ｒ３０（配列表の配列番号１４）、Ｂ７Ｆ３０（配列表の配列番号１７）およびＢ７Ｒ３０（配列表の配列番号１８）、Ｂ１８Ｆ３０（配列表の配列番号２１）およびＢ１８Ｒ３０（配列表の配列番号２２）、Ｂ４３Ｆ３０（配列表の配列番号２５）およびＢ４３Ｒ３０（配列表の配列番号２６）、Ｄ４Ｆ３０（配列表の配列番号２９）およびＤ４Ｒ３０（配列表の配列番号３０）、Ｅ２２Ｆ３０（配列表の配列番号３３）およびＥ２２Ｒ３０（配列表の配列番号３４）、Ｅ３０Ｆ３０（配列表の配列番号３７）およびＥ３０Ｒ３０（配列表の配列番号３８）、Ｆ６Ｆ３０（配列表の配列番号４１）およびＦ６Ｒ３０（配列表の配列番号４２）、Ｇ４Ｆ３０（配列表の配列番号４５）およびＧ４Ｒ３０（配列表の配列番号４６）、Ｇ２２Ｆ３０（配列表の配列番号４９）およびＧ２２Ｒ３０（配列表の配列番号５０）、Ｇ２８Ｆ３０（配列表の配列番号５３）およびＧ２８Ｒ３０（配列表の配列番号５４）、Ｊ６Ｆ３０（配列表の配列番号５７）およびＪ６Ｒ３０（配列表の配列番号５８）、Ｍ２ＣＧＦ３０（配列表の配列番号６１）およびＭ２ＣＧＲ３０（配列表の配列番号６２）、Ｍ１１Ｆ３０（配列表の配列番号６５）およびＭ１１Ｒ３０（配列表の配列番号６６）、Ｐ３Ｆ３０（配列表の配列番号６９）およびＰ３Ｒ３０（配列表の配列番号７０）、Ｐ５Ｆ３０（配列表の配列番号７３）およびＰ５Ｒ３０（配列表の配列番号７４）、Ｑ１６Ｆ３０（配列表の配列番号７７）およびＱ１６Ｒ３０（配列表の配列番号７８）、Ｓ１３Ｆ３０（配列表の配列番号８１）およびＳ１３Ｒ３０（配列表の配列番号８２）、Ｔ８Ｆ３０（配列表の配列番号８５）およびＴ８Ｒ３０（配列表の配列番号８６）、Ｔ１６Ｆ３０（配列表の配列番号８９）およびＴ１６Ｒ３０（配列表の配列番号９０）、ＷＫ９Ｆ３０（配列表の配列番号９３）およびＷＫ９Ｒ３０（配列表の配列番号９４）から、上記の方法によって、３’側の１〜１７個の塩基を切除した１３〜２９個の塩基からなる対合プライマーからなる群より選ばれた２種以上の対合プライマーを用いることができる。
【００４６】
すなわち、対合プライマーとしては、Ａ６Ｆ２１（配列表の配列番号３）およびＡ６Ｒ２２（配列表の配列番号４）、Ａ７Ｆ１９（配列表の配列番号７）およびＡ７Ｒ１６（配列表の配列番号８）、Ａ５２Ｆ２９（配列表の配列番号１１）およびＡ５２Ｒ２１（配列表の配列番号１２）、Ｂ１Ｆ２５（配列表の配列番号１５）およびＢ１Ｒ２０（配列表の配列番号１６）、Ｂ７Ｆ２２（配列表の配列番号１９）およびＢ７Ｒ１７（配列表の配列番号２０）、Ｂ１８Ｆ１５（配列表の配列番号２３）およびＢ１８Ｒ２１（配列表の配列番号２４）、Ｂ４３Ｆ１７（配列表の配列番号２７）およびＢ４３Ｒ１８（配列表の配列番号２８）、Ｄ４Ｆ２３（配列表の配列番号３１）およびＤ４Ｒ２１（配列表の配列番号３２）、Ｅ２２Ｆ２０（配列表の配列番号３５）およびＥ２２Ｒ２１（配列表の配列番号３６）、Ｅ３０Ｆ２８（配列表の配列番号３９）およびＥ３０Ｒ２４（配列表の配列番号４０）、Ｆ６Ｆ２５（配列表の配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列表の配列番号４４）、Ｇ４Ｆ１８（配列表の配列番号４７）およびＧ４Ｒ２４（配列表の配列番号４８）、Ｇ２２Ｆ２７（配列表の配列番号５１）およびＧ２２Ｒ２３（配列表の配列番号５２）、Ｇ２８Ｆ１７（配列表の配列番号５５）およびＧ２８Ｒ２８（配列表の配列番号５６）、Ｊ６Ｆ１８（配列表の配列番号５９）およびＪ６Ｒ２０（配列表の配列番号６０）、Ｍ２ＣＧＦ１６（配列表の配列番号６３）およびＭ２ＣＧＲ１５（配列表の配列番号６４）、Ｍ１１Ｆ２０（配列表の配列番号６７）およびＭ１１Ｒ２０（配列表の配列番号６８）、Ｐ３Ｆ２０（配列表の配列番号７１）およびＰ３Ｒ１５（配列表の配列番号７２）、Ｐ５Ｆ２０（配列表の配列番号７５）およびＰ５Ｒ２５（配列表の配列番号７６）、Ｑ１６Ｆ２５（配列表の配列番号７９）およびＱ１６Ｒ２０（配列表の配列番号８０）、Ｓ１３Ｆ２５（配列表の配列番号８３）およびＳ１３Ｒ２４（配列表の配列番号８４）、Ｔ８Ｆ２２（配列表の配列番号８７）およびＴ８Ｒ２５（配列表の配列番号８８）、Ｔ１６Ｆ２４（配列表の配列番号９１）およびＴ１６Ｒ２６（配列表の配列番号９２）、ＷＫ９Ｆ２０（配列表の配列番号９５）およびＷＫ９Ｒ２0 （配列表の配列番号９６）からなる群より選ばれた２種あるいはそれ以上の組み合わせからなるオリゴヌクレオチドを用いることができる。
【００４７】
本発明で用いる対合プライマーについては、上記した対合プライマーのみに限定されるものではなく、識別性や融解温度（Ｔｍ）等の点で使用可能な対合プライマーを新たに設計して使用することもできる。
ここで、Ｔｍとは、ＤＮＡの２本鎖がそれぞれの１本鎖に分離する温度のことであり、ＰＣＲのアニーリング温度は、通常、使用するプライマーのＴｍ付近が適している。本発明においては、対合プライマーの併用に際し、Ｔｍの類似した対合プライマー同士を選択して使用し、Ｔｍに近い適正なアニーリング温度を選定することによって、各対合プライマーを単独で使用した場合に得られる識別バンドを１回あるいは数回のＰＣＲで得ることができる。
【００４８】
具体的には、使用する対合プライマーのＴｍの平均値と、各対合プライマーのＴｍとの差が１５℃（±１５℃）以内で、かつＰＣＲのアニーリング温度もその範囲内とすることが好ましい。
アニーリング温度を対合プライマーのＴｍの平均値よりも１５℃以上低い温度としてＰＣＲを行う場合には、本来識別バンドが現れない品種にも識別バンドが現れる恐れがあるため、好ましくない。一方、Ｔｍの平均値よりも１５℃以上高い温度としてＰＣＲを行う場合には、本来発現していた識別バンドが消えてしまうことがあり、好ましくない。
【００４９】
本発明では、対合プライマーを用いて、先に抽出した鋳型ＤＮＡと共にマルチプレックスＰＣＲを行う。
対合プライマーを適切に選定することにより、ＰＣＲにおいて、品種の識別に有用な識別バンドとなる塩基配列部位のみに選択的に結合する。その結果、本発明の目的とする穀類の判別が可能となるのである。
本発明において、対合プライマーのうちの１種類あるいは２種類以上の組み合わせを混合使用することが可能である。
本発明における対合プライマーの混合使用とは、選択した複数の対合プライマーを、品種の識別を行うためのＰＣＲにおいて、同一反応に併用することを意味する。従来のＲＡＰＤ法では、識別バンド以外に多数の共通バンドが発現するため、複数のプライマーを同時に使用することが困難であった。本発明では、適切な対合プライマーの組み合わせ（プライマーセット）を用いることにより、それぞれのプライマーに対応する識別バンドのみが電気泳動で発現することになるため、混合使用が可能である。
【００５０】
調製した対合プライマーは、全てが混合使用できるものではなく、各プライマー間で相互のプライマーダイマー生成が起こらないこと、識別バンドが重ならないこと等に注意しながら好適な組み合わせおよび配合割合を選定することが必要である。各種の好適な対合プライマーを混合使用することにより、プライマー毎にＰＣＲを行う必要がなくなり、１回のＰＣＲで多くの品種を正確、かつ簡便に識別することができるため、品種判別に要する労力、時間や費用を大幅に減少させることができる。
【００５１】
本発明において、対象品種のみに特異的に発現するポジティブバンドとは、対象品種のみに発現する特異的なバンドパターンであり、対象品種独自のパターンを示すものである。
たとえば、対象品種として「コシヒカリ」、対合プライマーとしてＷＫ９、Ｍ１１、Ｂ４３およびＧ２２の４種からなる対合プライマーセットを用いた場合、穀類試料が「コシヒカリ」であればＷＫ９の識別バンドは発現しないが、Ｍ１１、Ｂ４３およびＧ２２の３本の識別バンドは発現する。この識別バンドパターンは、他の品種では示すものはなく、対象品種である「コシヒカリ」に独自のバンドパターンを示すものである。
また、対象品種のみに特異的に発現するポジティブバンド識別用対合プライマーセットまたは対象品種のみに発現しないネガティブバンド識別用対合プライマーセットとは、上記のような対象品種独特のバンドパターンとなるプライマーセットのことである。
【００５２】
上記の場合、穀類試料が対象品種である「コシヒカリ」であると推定できる各率について検討してみる。すなわち、各識別バンドの発現確率を発現／非発現の０．５と仮定すると、「コシヒカリ」以外のある品種が偶然に４種類の識別バンドの全てにおいて対象品種である「コシヒカリ」と一致する確率は（０．５）4 であることから、０．０６２５となる。
このことから、未知の穀類試料の４種類のバンドパターンが、全て対象品種と一致した場合には、９０％以上の確率で対象品種と同じ品種であると推定することができる。
【００５３】
また、対象品種では識別バンドの発現しないネガティブバンドとは、他の品種には識別バンドが発現するが、対象品種には特異的に発現しないバンドパターンを示すものである。
たとえば、対象品種として「コシヒカリ」、対合プライマーとしてＷＫ９Ｆ２０（配列表の配列番号９５）およびＷＫ９Ｒ２０（配列表の配列番号９６）、Ｆ６Ｆ２５（配列表の配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列表の配列番号４４）、Ｂ７Ｆ２２（配列表の配列番号１９）およびＢ７Ｒ１７（配列表の配列番号２０）、Ａ６Ｆ２１（配列表の配列番号３）およびＡ６Ｒ２２（配列表の配列番号４）の４種類からなる対合プライマーセットを用いた場合、穀類試料が「コシヒカリ」であればＰＣＲ後の増幅ＤＮＡバンドが全く発現しない。
一方、穀類試料が他の品種である場合には、いずれかの識別バンドが発現する、すなわち他の品種が「きらら３９７」である場合は、識別バンドＷＫ９、「キヌヒカリ」の場合は、識別バンドＷＫ９およびＢ７、「むつほまれ」である場合は、識別バンドＢ７が発現するというバンドパターンを示すものである。
【００５４】
上記において、ネガティブバンド識別用対合プライマーを用いて第１次ＰＣＲを行ったとき識別バンドが発現せず、さらに第１表〜第２表に記載の他の対合プライマーを用いて第２次のＰＣＲを行ったとき発現した識別バンドパターンについても、対象品種である「コシヒカリ」と一致した場合、穀物試料は「コシヒカリ」である確率が非常に高いと判定される。
たとえば、対象品種では識別バンドの発現しないネガティブバンド識別用対合プライマー群および対象品種に特異的に発現するポジティブバンドまたは対象品種のみに発現しないネガティブバンド識別用対合プライマー群が、それぞれ４種類であって、前者で識別バンドが全く発現せずに、後者で識別バンドパターンが一致した場合には、穀類試料が「コシヒカリ」ではない確率Ｐは、（１／２）4 ×（１／２）4 ＝０．００３９であり、０．０１以下である。
【００５５】
したがって、対象品種では識別バンドが発現しないネガティブバンド識別用対合プライマー群によるＰＣＲで識別バンドが全く発現せず、かつ対象品種に特異的に発現するポジティブバンドまたは対象品種のみに発現しないネガティブバンド識別用対合プライマー群による識別バンドパターンも一致する場合には、当該穀物試料は９９．９％以上の確率で「コシヒカリ」であると推定することができる。
【００５６】
次に、穀類試料が対象品種に他の品種が混入されたものである場合、その混合品種を同定する方法について説明する。
たとえば、米の品種である「むつほまれ」と「コシヒカリ」の混米の場合、対象品種に特異的に発現するポジティブバンド識別用対合プライマー群として、ＷＫ９、Ｍ１１、Ｇ２２およびＢ４３の４種類の対合プライマーセットを用いることにより、単一品種同士の比較では、「コシヒカリ」では識別バンドの発現するＭ１１およびＧ２２において、「むつほまれ」では識別バンドが発現しないことから、両者の識別が可能である。
【００５７】
しかし、「むつほまれ」を「コシヒカリ」に少量混米した場合には、識別バンドＭ１１およびＧ２２では識別バンドが発現しないという「むつほまれ」のネガティブ性が、「コシヒカリ」の多量に発現するポジティブバンドに隠れてしまうために、混米の検知が不可能である。
したがって、混米中の混入品種の同定においては、単一品種同士の識別を目的とした特開２００１−９５５８９号公報に記載されている対合プライマー群のみでは不十分であり、新たに対象品種では識別バンドが現れないが他の品種では識別バンドの現れるネガティブバンド識別用対合プライマー群が必要となる。
【００５８】
前記したように、本発明は穀類のＤＮＡ品種判別方法を提供すると共に、当該方法に使用されるキットを提供する。当該キットは、対象品種では識別バンドを発現せず、混合品種のみに選択的に発現するネガティブバンド識別用対合プライマー群を含有することを特徴とする。好適には、さらに対象品種のみに特異的に発現するポジティブバンド識別用対合プライマー群および／または対象品種のみに特異的に発現しないネガティブバンド識別用対合プライマー群を含有するキットが挙げられる。
本発明のキットに含有される対合プライマー群としては、前記の各種プライマー群を使用することができる。さらに、本発明のキットは、ＰＣＲ法に使用される試薬類、例えばＤＮＡポリメラーゼや反応用緩衝液等を含んでいてもよい。
【００５９】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１（識別用ネガティブバンドＤＮＡ群による「コシヒカリ」への混米の検出例）
わが国の平成１１年度における作付け上位２０品種である「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「ヒノヒカリ」、「あきたこまち」、「きらら３９７」、「キヌヒカリ」、「ほしのゆめ」、「はえぬき」、「むつほまれ」、「日本晴」、「ササニシキ」、「つがるロマン」、「ハナエチゼン」、「夢つくし」、「ハツシモ」、「朝の光」、「月の光」、「あいちのかおり」、「祭り晴」、「アキホ」の玄米を試料とし、試験用精米機（山本製作所製、ライスパルVP31T ）を用いて歩留まり９０％に精白した。
精米試料をレッチェ社製超遠心粉砕機を用いて粉砕し、その６ｇからＣＴＡＢ法によってゲノムＤＮＡを抽出した。すなわち、７０℃の２％ＣＴＡＢ溶液（０．１Ｍ トリス塩酸、２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム、１．４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）６ｍｌを加えて撹拌し、５５℃の恒温槽に入れ、次いで上記ＣＴＡＢ溶液（１％溶液）６ｍｌを加えて３０分間ＤＮＡを抽出した。
【００６０】
その後、ＤＮＡ抽出液にクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を加えて撹拌した後、遠心分離して上清をとり、ＤＮＡ沈殿液（１％ＣＴＡＢ、２０ｍＭ トリス塩酸、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加えて4 ℃で一晩静置してＤＮＡを沈殿させた。次に、遠心分離して得られたＤＮＡ沈殿物から１ＭＮａＣｌによって抽出し、イソプロピルアルコール、エタノールによる洗浄、沈殿の後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）２００μｌに溶解してＤＮＡ試料液とした。
ＰＣＲの反応液組成は、滅菌水１１．７４μｌ、ポリメラーゼ（宝酒造（株）製、Taq polymerase（５Ｕ／μｌ）０．２μｌ、反応用緩衝液（１２ｍＭ トリス塩酸、６０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．３）２．５μｌ、ＭｇＣｌ2 ２．０μｌ、鋳型ＤＮＡ ２００ｎｇ／１μｌ、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）１μｌを混合して調製し、ＰＣＲに用いる対合プライマーとして、配列番号９５および９６のＷＫ９Ｆ２０およびＷＫ９Ｒ２０各０．６μｌ、配列番号４３および４４のＦ６Ｆ２５およびＦ６Ｒ２２各０．５μｌ、配列番号１９および２０のＢ７Ｆ２２およびＢ７Ｒ１７各０．５μｌおよび配列番号３および４のＡ６Ｆ２１およびＡ６Ｒ２２各０．４μｌを使用して合計２２．４４μｌとした。
【００６１】
反応装置は宝酒造（株）製ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（６２℃、１分）、伸長（７２℃、２分）を３５サイクル反応させた。増幅ＤＮＡの電気泳動はコスモバイオ（株）製ミューピッドIIを使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後の紫外線照射によりバンドパターンを検出した。検出結果を表３および図１に示す。
【００６２】
この結果、「コシヒカリ」以外の１９品種の場合には、全て何らかのポジティブバンドが発現し、混米を検出できることが明らかになった。
一方、特開２００１−９５５８９号公報の実施例１０において、Ｍ２ＣＧ、ＷＫ９およびＢ７の３種類のプライマー併用の場合は、「コシヒカリ」と「ハツシモ」の両者が識別バンドが発現しないので、「ハツシモ」を「コシヒカリ」に混米しても検出できない。このことから、本発明の方法が優れていることが明らかである。
【００６３】
【表７】
（＋：識別バンドが発現する −：識別バンドが発現しない）
【００６４】
実施例２（識別用ネガティブ／ポジティブバンドＤＮＡ群による識別例）
平成１１年度のわが国の作付け上位２０品種、すなわち、「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「ヒノヒカリ」、「あきたこまち」、「きらら３９７」、「キヌヒカリ」、「ほしのゆめ」、「はえぬき」、「むつほまれ」、「日本晴」、「ササニシキ」、「つがるロマン」、「ハナエチゼン」、「夢つくし」、「ハツシモ」、「朝の光」、「月の光」、「あいちのかおり」、「祭り晴」、「アキホ」の玄米を試験用精米機（山本製作所製、ライスパルVP31T ）を用いて歩留まり９０％に精白した。これらの精米各１粒を乳鉢で粉砕して試料とし、ＤＮＡ抽出キットであるISOPLANT II によってゲノムＤＮＡを抽出した。
【００６５】
ＰＣＲの反応液組成は、滅菌水１０．４μｌ、ポリメラーゼ（宝酒造（株）製、Taq polymerase（５Ｕ／μｌ）０．２μｌ、反応用緩衝液（１２ｍＭ トリス塩酸、６０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．３）２．５μｌ、ＭｇＣｌ2 ２．０μｌ、鋳型ＤＮＡ ２００ｎｇ／μｌを１μｌ、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）１μｌを混合して調製し、ＰＣＲに用いる対合プライマーとして、配列番号９５および９６のプライマーＷＫ９Ｆ２０およびＷＫ９Ｒ２０各０．６μｌ、配列番号６７および６８のプライマーＭ１１Ｆ２０およびＭ１１Ｒ２０各０．３μｌ、配列番号５１および５２のプライマーＧ２２Ｆ２７およびＧ２２Ｒ２３各０．３μｌ、配列番号２７および２８のプライマーＢ４３Ｆ１７およびＢ４３Ｒ１８各０．１μｌ、配列番号７１および７２のプライマーＰ３Ｆ２０およびＰ３Ｒ１５各０．３μｌの合計２０．３μｌとした。
【００６６】
反応装置は宝酒造（株）製、ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（６２℃、１分）、伸長（７２℃、２分）を３５サイクル反応させた。
増幅ＤＮＡの電気泳動は、コスモバイオ（株）製ミューピッドIIを使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後の紫外線照射によりバンドパターンを検出した。検出結果を表４および図２に示す。
【００６７】
【表８】
（＋：識別バンドが発現する −：識別バンドが発現しない）
【００６８】
この結果、実施例１で用いた４種類のプライマーであるＷＫ９、Ｆ６、Ａ６およびＢ７に、本実施例で用いたＭ１１、Ｇ２２、Ｂ４３およびＰ３の４種類の対合プライマーセットを併用することにより、作付け上位２０品種のうち、「ほしのゆめ」と「アキホ」の識別を除く全てを互いに識別することが可能である。
従って、実施例１と実施例２の組み合わせにより、「コシヒカリ」に対する混米の有無の判定に加えて、混米された品種の同定もほとんどが可能であることが示された。
【００６９】
実施例３（３種類の識別用ネガティブバンドＤＮＡ群による混米の検出例）
わが国の平成１１年度における作付け上位２０品種である「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「ヒノヒカリ」、「あきたこまち」、「きらら３９７」、「キヌヒカリ」、「ほしのゆめ」、「はえぬき」、「むつほまれ」、「日本晴」、「ササニシキ」、「つがるロマン」、「ハナエチゼン」、「夢つくし」、「ハツシモ」、「朝の光」、「月の光」、「あいちのかおり」、「祭り晴」、「アキホ」の玄米を試料とし、実施例１と同様にして精米粉末から鋳型ＤＮＡを調製した。
「コシヒカリ」に他品種を少量混米した場合を想定して、「コシヒカリ」のＤＮＡを８０％、他の品種のＤＮＡを２０％混合して鋳型ＤＮＡとし、配列番号８３および８４のプライマーＳ１３Ｆ２５およびＳ１３Ｒ２４各０．０８μｌ、配列番号３９および４０のプライマーＥ３０Ｆ２８およびＥ３０Ｒ２４各０．０５μｌ、配列番号６３および６４のプライマーＭ２ＣＧＦ１６およびＭ２ＣＧＲ２２各１．０μｌを加えてＰＣＲを行った。結果を表５および図３に示す。
【００７０】
【表９】
（＋：識別バンドが発現する −：識別バンドが発現しない）
【００７１】
表5から明らかなように、「コシヒカリ」への混米判別用プライマーセットの場合、上位２０品種のうち、「あきたこまち」、「キヌヒカリ」、「つがるロマン」、「夢つくし」、「朝の光」、「祭り晴」、「月の光」以外の全てがポジティブバンドを有しており、「コシヒカリ」に対する混米の検出に有用である。
これら３種類のプライマーを、実施例１および２で示した９種類のプライマーセットと併用すると、実施例２では識別できなかった「ほしのゆめ」と「アキホ」の識別も可能となり、混米の同定に有効である。
なお、特開２００１−９５５８９号公報の実施例１のＭ２ＣＧとＳ１３のみのＰＣＲの場合は、表３から明らかなように、「コシヒカリ」と「日本晴」、「きらら３９７」の識別は可能であるが、「あきたこまち」、「キヌヒカリ」、「ササニシキ」、「つがるロマン」、「夢つくし」、「朝の光」、「月の光」、「祭り晴」の８品種は「コシヒカリ」と同様に識別バンドを全く生じないので混米されても検出が不可能であり、混米検出の点で明らかに劣っている。
【００７２】
実施例４（ネガティブバンド群およびネガティブ／ポジティブバンド群の併用による米飯試料の混米の検出および混米品種の同定例）
「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「ヒノヒカリ」、「あきたこまち」、「きらら３９７」、「キヌヒカリ」、「ほしのゆめ」、「はえぬき」、「むつほまれ」、「日本晴」の作付け上位１０品種を含む２０品種の玄米を試料とし、試験用精米機（山本製作所製、ライスパル VP31T）を用いて歩留まり９０％に精白した。
精米試料を１粒ずつプラスチックチューブ（アシスト、１．５ｍｌ容）に取り、脱イオン水３５μｌを加え、スタンドに立てて１時間浸漬した後、開封状態で電気炊飯器（東芝製、RC-183、外釜に脱イオン水７５ｍｌ添加）にて１５分間炊飯し、１５分間蒸らし、米飯試料とした。この試料からのＤＮＡの抽出は下記のように行った。
【００７３】
試料米飯各１粒をマイクロチューブに取り、トリス／塩酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ含有）３００μｌを加え、ペレットミキサーで粉砕した。次いで、耐熱性アミラーゼ（シグマ製、α−アミラーゼ、７９０Ｕ／ｍｇ ｓｏｌｉｄ，１ｍｇ／ｍｌ）を５μｌ添加し、６０℃で１時間反応させた。次いで、トリチラチウム・アルブム（Tritirachium album）由来のプロテアーゼＫ（オンコー製、２０ｍｇ／ｍｌ）を５μｌ添加し、３７℃で２時間反応させた。
酵素反応終了後、−２０℃に冷却したエタノール１ｍｌを添加し、−２０℃で１５分間静置した後、微量遠心機で遠心分離（１５０００Ｇ、４℃、１５分間、以下同様）を行って沈殿を得た。この沈殿を３００μｌのＴＥ（１０ｍＭ トリス／塩酸、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、フェノール４００μｌを加え、回転撹拌機で３０分間ＤＮＡを抽出した。
次いで、遠心分離を行って上清を採取し、等量のＰＣＩ（フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール：２５／２４／１）を加え、３０分間抽出したのち、遠心分離を行って上清を得た。この上清に５Ｍ ＮａＣｌを６ｍｌ添加し、冷却したエタノール４００μｌを加え、遠心分離して得た沈殿を７０％エタノールで２回洗浄し、最後の沈殿を４０μｌの１０倍希釈ＴＥに溶解してＤＮＡ試料液とした。ＰＣＲは以下のように行った。
【００７４】
前述の方法で米飯から調製したＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行った。ＤＮＡポリメラーゼとして東洋紡績（株）製Taq polymeraseを使用し、ＰＣＲの反応液組成は、滅菌水１０μｌ、ポリメラーゼ０．２μl 、反応用緩衝液２．５μｌ、ＭｇＣｌ2 ２．０μｌ、鋳型ＤＮＡ３μｌ、ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ）１μｌを混合し、配列番号８３および８４のプライマーＳ１３Ｆ２５およびＳ１３Ｒ２４各０．１μｌ、配列番号４３および４４のプライマーＦ６Ｆ２５およびＦ６Ｒ２２各０．２μｌ、配列番号３および４のプライマーＡ６Ｆ２１およびＡ６Ｒ２２各０．１μｌ、配列番号７１および７２のプライマーＰ３Ｆ２０およびＰ３Ｒ１５各０．２５μｌ合計２０．０μｌとした。
反応装置は宝酒造（株）製ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（６０℃、１分）、伸長（７２℃、２分）の条件で４５サイクル反応させた。ＰＣＲで増幅したＤＮＡの電気泳動および染色は、実施例１と同様にして行った。ＰＣＲを行った結果を表６に示す。
【００７５】
【表１０】
（＋：識別バンドが発現する −：識別バンドが発現しない）
【００７６】
表６に示すように、４つの識別バンドが全てネガティブとなるのは、「ひとめぼれ」、「あきたこまち」、「ササニシキ」の３品種のみであるので、これらの３品種に、他の１７品種のいずれかを混米した場合、第１次ＰＣＲにより識別バンドがポジティブに発現するので、混米されていることを確実に検出できることが示された。
【００７７】
対象品種（この場合は「ひとめぼれ」と「あきたこまち」）の識別バンドが全てネガティブになる前述の第１次ＰＣＲに続いて、第２次のＰＣＲを行った。第２次ＰＣＲでは、配列番号９５および９６のプライマーＷＫ９Ｆ２０およびＷＫ９Ｒ２０各０．５μｌ、配列番号３９および４０のプライマーＥ３０Ｆ２８およびＥ３０Ｒ２４各０．０５μｌ、配列番号５１および５２のプライマーＧ２２Ｆ２７およびＧ２２Ｒ２３各０．２μｌ、配列番号７５および７６のプライマーＰ５Ｆ２０およびＰ５Ｒ２５各０．３μｌ、配列番号２７および２８のプライマーＢ４３Ｆ１７およびＢ４３Ｒ１８各０．２５μｌを用いたこと以外は全て本実施例の第１次ＰＣＲと同様に行った。
第２次ＰＣＲで増幅したＤＮＡを電気泳動して染色した結果を表７および図４に示す。
【００７８】
【表１１】
（＋：識別バンドが発現する −：識別バンドが発現しない）
【００７９】
第２次ＰＣＲの結果から、第１次ＰＣＲで全てネガティブであった「ひとめぼれ」、「あきたこまち」および「ササニシキ」の３品種を互いに識別することが可能であることが示された。
また、第１次ＰＣＲでポジティブバンドが発現する１７品種も加えて、表６と表７を合わせて比較することにより、作付け上位２０品種を全て識別することが可能であることが示された。
したがって、対象品種である「ひとめぼれ」あるいは「あきたこまち」に対する混米の有無は、これらがネガティブバンドとなる第１次ＰＣＲによってこれら３品種以外の１７品種で可能であり、ネガティブな３品種同士も第２次ＰＣＲで識別が可能であった。さらに、第１次ＰＣＲでポジティブバンドの現れる１７品種の場合も、１粒の米飯試料による第２次ＰＣＲの結果を加えることによって全て識別できることが示された。
【００８０】
実施例５（ネガティブバンドＤＮＡ群の併用による混米の検出および混米品種の同定例）
平成１２年度のわが国の作付け上位２０品種、すなわち「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「ヒノヒカリ」、「あきたこまち」、「きらら３９７」、「キヌヒカリ」、「ほしのゆめ」、「はえぬき」、「むつほまれ」、「日本晴」、「ササニシキ」、「つがるロマン」、「ハナエチゼン」、「夢つくし」、「ハツシモ」、「朝の光」、「月の光」、「あいちのかおり」、「祭り晴」、「アキホ」の２０品種の玄米を試料とし、実施例１と同様にして精白、粉砕、ゲノムＤＮＡ抽出およびＰＣＲを行った。
【００８１】
ＰＣＲの反応液組成は、滅菌水１０μｌ、ポリメラーゼ（宝酒造（株）製、Taq polymerase（５Ｕ／μｌ））０．２μｌ、反応用緩衝液（１２ｍＭ トリス塩酸、６０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．３）２．５μｌ、ＭｇＣｌ2 ２．０μｌ、鋳型ＤＮＡ ２５ｎｇ（１μｌ）、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）１μｌを混合し、ＰＣＲに用いるオリゴヌクレオチドプライマーとして、「ヒノヒカリ」に対する混米を検出するために、Ｂ４３、Ｇ２８、Ｆ６、Ｔ１６のプライマーセット、「あきたこまち」に対する混米を検出するために、Ａ６、Ｅ３０、Ｆ６、Ｇ２２、Ｐ３のプライマーセットを調製し、配列番号２７および２８のプライマーＢ４３Ｆ１７およびＢ４３Ｒ１８各０．０５μｌ、配列番号５５および５６のプライマーＧ２８Ｆ１７およびＧ２８Ｒ２８各０．４μｌ、配列番号４３および４４のプライマーＦ６Ｆ２５およびＦ６Ｒ２２各０．３μｌ、配列番号８９および９０のプライマーＴ１６Ｆ３０およびＴ１６Ｒ３０各０．４μｌの合計１９．０μｌとした。また、配列番号３および４のプライマーＡ６Ｆ２１およびＡ６Ｒ２２各０．５μｌ、配列番号７１および７２のプライマーＰ３Ｆ２０およびＰ３Ｒ１５各２μｌ、配列番号３９および４０のプライマーＥ３０Ｆ２８およびＥ３０Ｒ２４各０．３μｌ、配列番号４３および４４のプライマーＦ６Ｆ２５およびＦ６Ｒ２２各０．３μｌ、配列番号５１および５２のプライマーＧ２２Ｆ２７およびＧ２２Ｒ２３各０．３μｌの合計２３．５μｌとした。
【００８２】
反応装置は宝酒造（株）製、ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（６１℃、１分）、伸長（７２℃、２分）を３５サイクル反応させた。
増幅ＤＮＡの電気泳動および染色は実施例１と同様に行った。検出結果を表８に示す。
【００８３】
【表１２】
（＋：識別バンドが発現する −：識別バンドが発現しない）
【００８４】
表８の結果から、「ヒノヒカリ」、「あきたこまち」ともに、それぞれのネガティブプライマーセットによる「対象品種には現れずに他の品種のみに特有に現れる識別用ＤＮＡの群」を用いて、上位２０品種の全ての他品種の混米を検出できることが明らかとなった。
さらに、表８の９種類のプライマーによるＰＣＲ結果を総合すると、作付け上位２０品種を全て互いに識別することが可能であり、ネガティブプライマーセットでポジティブバンドの発現した混米の場合に、一粒ずつＤＮＡを抽出して鋳型ＤＮＡとし、上記９種類のプライマーで検定することによって混米された品種を同定することが可能であることが示された。
【００８５】
実施例６（大麦における品種混合の検出および混合品種の判別例）
３品種の大麦、すなわち「サンシュウ」、「イチバンボシ」および「大系ＨＫ６４」の種子を、研削式精麦機により、歩留まり６０％に搗精した。これらの精麦をレッチェ社製超遠心粉砕機によって粉砕して粉末試料を得た。
これらの粉末試料６ｇを秤り取り、実施例１と同様にＣＴＡＢ法によってＤＮＡを抽出・精製し、鋳型ＤＮＡとした。
【００８６】
ＰＣＲの反応液組成は、ポリメラーゼ（宝酒造（株）製、Taq polymerase（５Ｕ／μｌ））０．２μｌ、反応用緩衝液（１２ｍＭ トリス塩酸、６０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．３）２．５μｌ、ＭｇＣｌ2 ２．０μｌ、鋳型ＤＮＡ２００ｎｇ／１μｌ、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）１μｌを混合し、ＰＣＲに用いる対合プライマーとして、第１次ＰＣＲでは配列番号５９および６０のＪ６Ｆ１８およびＪ６Ｒ２０各０．６μｌ、配列番号７および８のＡ７Ｆ１９およびＡ７Ｒ１６各０．５μｌ、配列番号１９および２０のＢ７Ｆ２２およびＢ７Ｒ１７各０．５μｌおよび配列番号３９および４０のＥ３０Ｆ２８およびＥ３０Ｒ２４各０．４μｌの４種類の対合プライマーを使用し、滅菌水を加えて合計２０．７μｌとした。また、第２次のＰＣＲでは配列番号４７および４８のＧ４Ｆ１８およびＧ４Ｒ２４各０．５μｌ、配列番号４３および４４のＦ６Ｆ２５およびＦ６Ｒ２２各０．５μｌ、配列番号６３および６４のＭ２ＣＧＦ１６およびＭ２ＣＧＲ１５各０．５μｌ、配列番号９５および９６のＷＫ９Ｆ２０およびＷＫ９Ｒ２０各０．４μｌの４種類の対合プライマーを使用して反応液総量を合計２０．７μｌとした。
【００８７】
反応装置は宝酒造（株）製、ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（６２℃、１分）、伸長（７２℃、２分）を３５サイクル反応させた。増幅ＤＮＡの電気泳動はコスモバイオ（株）製、ミューピッドIIを使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後の紫外線照射によりバンドパターンを検出した。検出結果を表９に示す。
この結果、品種混合検出のための第１次ＰＣＲにおいて、「イチバンボシ」のみが４種類の対合プライマー全てにおいて識別バンドが発現しないのに対し、「サンシュウ」および「大系ＨＫ６４」ではＪ６の場合に識別バンドが発現するので、これらの品種を「イチバンボシ」に混合した場合に検出が可能である。
さらに、混合された品種の判定のための第２次ＰＣＲの結果、「サンシュウ」の場合には全てマイナスであるのに対し、「イチバンボシ」の場合はＭ２ＣＧ、「大系ＨＫ６４」の場合にはＧ４およびＭ２ＣＧの場合に識別バンドが発現するので、第１次ＰＣＲの結果とも総合して、これら「サンシュウ」と「大系ＨＫ６４」の判別が可能であった。
【００８８】
【表１３】
（＋：識別バンドが発現する −：識別バンドが発現しない）
【００８９】
実施例７（トウモロコシにおける品種混合の検出および混合品種の判別例）
３品種のトウモロコシ、すなわち「ピーターコーン」、「ハニーバンタム」および「ワキシーコーン」の種子をアイラ製凍結乾燥機ＦＤ２００によって凍結乾燥した後、イワタニ製コーヒーミルサーによって粉砕して粉末試料を得た。これらの粉末試料６ｇを秤り取り、実施例１と同様にＣＴＡＢ法によってＤＮＡを抽出・精製し、鋳型ＤＮＡとした。
【００９０】
ＰＣＲの反応液組成は、滅菌水１１．７４μｌ、ポリメラーゼ（宝酒造（株）製、Taq polymerase（５Ｕ／μｌ））０．２μｌ、反応用緩衝液（１２ｍＭ トリス塩酸、６０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．３）２．５μｌ、ＭｇＣｌ2 ２．０μｌ、鋳型ＤＮＡ ２００ｎｇ／１μｌ、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）１μｌを混合し、ＰＣＲに用いる対合プライマーとして、第１次ＰＣＲでは配列番号７および８のＡ７Ｆ１９およびＡ７Ｒ１６各０．６μｌ、配列番号３９および４０のＥ３０Ｆ２８およびＥ３０Ｒ２４各０．５μｌ、配列番号４３および４４のＦ６Ｆ２５およびＦ６Ｒ２２各０．５μｌおよび配列番号８３および８４のＳ１３Ｆ２５およびＳ１３Ｒ２４各０．４μｌの４種類の対合プライマーを使用して合計２２．４４μｌとした。
【００９１】
また、第２次のＰＣＲでは配列番号３および４のＡ６Ｆ２１およびＡ６Ｒ２２各０．５μｌ、配列番号４７および４８のＧ４Ｆ１８およびＧ４Ｒ２４各０．５μｌおよび配列番号５９および６０のＪ６Ｆ１８およびＪ６Ｒ２０各０．４μｌ、配列番号６３および６４のＭ２ＣＧＦ１６およびＭ２ＣＧＲ１５各０．３μｌの４種類の対合プライマーを使用して合計２０．７μｌとした。
反応装置はアステック（株）製温度コントロールシステムＰＣ７００を使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（６２℃、１分）、伸長（７２℃、２分）を３５サイクル反応させた。増幅ＤＮＡの電気泳動はコスモバイオ（株）製ミューピッドIIを使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後の紫外線照射によりバンドパターンを検出した。検出結果を表１０に示す。
【００９２】
【表１４】
（＋：識別バンドが発現する −：識別バンドが発現しない）
【００９３】
この結果、品種混合検出のための第１次ＰＣＲにおいて、「ハニーバンタム」および「ピーターコンーン」が４種類の対合プライマー全てにおいて識別バンドが発現しないのに対し、「ワキシーコーン」ではＡ７、Ｅ３０、Ｆ６、Ｓ１３の場合に識別バンドが発現するので、「ワキシーコーン」を「ハニーバンタム」あるいは「ピーターコーン」に混合した場合に検出が可能である。
さらに、混合品種判定のための第２次ＰＣＲの結果、「ハニーバンタム」の場合にはＡ６およびＭ２ＣＧ、「ピーターコーン」の場合にはＪ６、「ワキシーコーン」の場合にはＡ６、Ｇ４、Ｊ６、Ｍ２ＣＧの場合に識別バンドが発現するので、第１次ＰＣＲの結果とも総合してこれら３品種の判別が可能であった。
【００９４】
実施例８（プライマーの長さの範囲規定）
「コシヒカリ」および「ほしのゆめ」の２品種の試料玄米を用いた。
試験用精米機（山本製作所製、ライスパル VP31T）を用いて歩留まり９０％に精白した。各精米試料をレッチェ社製超遠心粉砕機を用いて粉砕し、その６ｇからＣＴＡＢ法によってゲノムＤＮＡを抽出した。紫外吸収法（２６０ｎｍ）によって測定したＤＮＡ濃度が約４００μｇ／ｍｌとなるように各試料ＤＮＡの濃度を調整してＰＣＲに供した。
【００９５】
ＰＣＲに用いるオリゴヌクレオチドプライマーとして、配列表の配列番号９７および９８の４０残基の配列を有する長い対合プライマー、配列番号８３（２５量体）および配列番号８４（２４量体）からなる対合プライマー、配列番号９９（１２量体）および配列番号１００（１２量体) からなる対合プライマーの３種類の対合プライマーをそれぞれ単独で使用した。
【００９６】
ＤＮＡポリメラーゼは東洋紡（株）製、Taq polymerase（５Ｕ／μｌ）を使用した。ＰＣＲの反応液組成は、滅菌水１０μｌ、ポリメラーゼ０．２μｌ、反応用緩衝液２．５μｌ、ＭｇＣｌ2 ２．０μｌ、鋳型ＤＮＡ３μｌ、ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ）１．０μｌを混合し、対合プライマー各１．０μｌ（合計２．０μｌ）の合計２０．７μｌとした。
反応装置は宝酒造（株）製、ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（３８℃、１分）、伸長（７２℃、２分）の条件で４５サイクル反応させた。
【００９７】
増幅ＤＮＡの電気泳動はコスモバイオ（株）製ミューピッドIIを使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後の紫外線照射によりバンドパターンを検出した。その結果、４０残基の長い対合プライマーの場合はバンドが現れず、１２残基の短い対合プライマーの場合は多数のバンドが発現し、いずれの場合も本発明の目的とする正確な識別のためには不適当であった。
これに対して、２５量体と２４量体からなる対合プライマーの場合は、１．８ｋｂｐの識別バンドが「ほしのゆめ」で現れ、「コシヒカリ」で現れず、品種の識別が可能であった。
【００９８】
実施例９( 外国産米の米飯試料による識別例)
「コシヒカリ」（日本）、「一品」（韓国）、「バンニシキ」（中国）、「アマルー」（オーストラリア）、「タマキ」（米国）、「カオドークマリ１０５」（タイ）、「モトボイ」（ベトナム）の７種類の玄米各１０ｇをケット科学研究所製のパーレストによって歩留まり９０％に精白し、精米試料を１粒ずつプラスチックチューブ（アシスト、１．５ｍｌ容）に取り、脱イオン水３５μｌを加え、スタンドに立てて１時間浸漬した後、開封状態で電気炊飯器（東芝製、RC-183、外釜に脱イオン水７５ｍｌ添加）にて１５分間炊飯し、１５分間蒸らし、米飯試料とした。ＤＮＡの抽出は下記のように行った。
【００９９】
試料米飯各１粒をマイクロチューブに取り、トリス／塩酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ含有）３００μｌを加え、ペレットミキサーで粉砕した。次いで、耐熱性アミラーゼ（シグマ製、α−アミラーゼ、７９０Ｕ／ｍｇ ｓｏｌｉｄ，１ｍｇ／ｍｌ）を５μｌ添加し、６０℃で１時間反応させた。次いでトリチラチウム・アルバム（Tritirachium album）由来のプロテアーゼＫ（オンコー製、２０ｍｇ／ｍｌ）を５μｌ添加し、３７℃で２時間反応させた。
酵素反応終了後、−２０℃に冷却したエタノール１ｍｌを添加し、−２０℃で１５分間静置した後、微量遠心機で遠心分離（１５０００Ｇ、４℃、１５分間、以下同様）を行って沈殿を得た。この沈殿を３００μｌのＴＥ（１０ｍＭ トリス／塩酸、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、フェノール４００μｌを加え、回転撹拌機で３０分間ＤＮＡを抽出した。
次いで、遠心分離を行って上清を採取し、等量のＰＣＩ（フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール：２５／２４／１）を加え、３０分間抽出し、遠心分離して得た上清に５Ｍ ＮａＣｌを６ｍｌ添加し、冷却したエタノール４００μｌを加え、遠心分離して得た沈殿を７０％エタノールで２回洗浄し、最後の沈殿を４０μｌの１０倍希釈ＴＥに溶解してＤＮＡ試料溶液とした。
ＰＣＲは以下のようにして行った。
【０１００】
前述の方法で精米から調製したＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡの増幅を行った。ＤＮＡポリメラーゼとして東洋紡績（株）製、Taq polymeraseを使用し、ＰＣＲの反応液組成は、滅菌水１０μｌ、ポリメラーゼ０．２μｌ、反応用緩衝液２．５μｌ、ＭｇＣｌ2 ２．０μｌ、鋳型ＤＮＡ３μｌ、ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ）１．０μｌを混合し、配列番号９５および９６のプライマーＷＫ９Ｆ２０およびＷＫ９Ｒ２０各０．２５μｌ、配列番号７および８のプライマーＡ７Ｆ１９およびＡ７Ｒ１６各０．２５μｌ、配列番号８３および８４のプライマーＳ１３Ｆ２５およびＳ１３Ｒ２４各０．２５μｌ、配列番号５９および６０のプライマーＪ６Ｆ１８およびＪ６Ｒ２０各０．２５μｌ合計２０．７μｌとした。
反応装置は宝酒造（株）製ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（６０℃、１分）、伸長（７２℃、２分）の条件で４５サイクル反応させた。
ＰＣＲで増幅したＤＮＡの電気泳動は実施例１と同様にして行った。作付け上位７品種の米飯から抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った結果を表１１に示す。
【０１０１】
表から明らかなように、本発明方法は外国産米から調製した米飯試料の場合にも適用が可能であることが示された。対合プライマーＷＫＡ９およびＳ１３のみの使用の場合には、「バンニシキ」と「モトボイ」の２品種、「アマルー」、「タマキ」、「カオドークマリ１０５」の３品種の識別が不可能であった。これに対し、Ａ７およびＪ６の２種類の対合プライマーを加えることにより、上記２品種および上記３品種の識別も可能となり、使用した７品種すべての識別が可能となった。
【０１０２】
【表１５】
【０１０３】
実施例１０（その他のプライマー群の有用性）
試料玄米として「コシヒカリ」、「ヒノヒカリ」、「あきたこまち」、「キヌヒカリ」、「はえぬき」、「日本晴」、「ササニシキ」を用い、対合プライマーとして、配列番号１５および１６のＢ１Ｆ２５およびＢ１Ｒ２０、配列番号３５および３６のＥ２２Ｆ２０およびＥ２２Ｒ２１、配列番号７９および８０のＱ１６Ｆ２５およびＱ１６Ｒ２０、配列番号８７および８８のＴ８Ｆ２２およびＴ８Ｒ２５、配列番号２３および２４のＢ１８Ｆ１５およびＢ１８Ｒ２１を用いたこと以外は実施例１と同じ方法でＰＣＲおよび電気泳動を行った。試験結果を表１２に示す。
表から明らかなように、これらの対合プライマーにより、７品種間の識別が全て可能となった。
【０１０４】
【表１６】
【０１０５】
【発明の効果】
本発明によれば、米、小麦、トウモロコシ、大麦等の穀粒に他の品種の穀粒が混合していることを、穀粒から抽出したＤＮＡを鋳型とするマルチプレックスＰＣＲを用いて判別することができ、かつ混入している穀粒の品種を識別することができる。すなわち、第１次ＰＣＲによって、簡易迅速に品種混合の有無を判定することができ、少量でも他の品種が混合していれば、判別できる。さらに、第２次ＰＣＲによって、当該混合品種を同定することができる。
【０１０６】
特に、本発明では識別性の高い対合プライマーによるＰＣＲを行うために、目的とする識別バンド以外のバンドが消失し、たとえば対象が「コシヒカリ」系統のような近縁種の場合にも、正確な品種判別が可能である。
しかも、本発明においては、ＰＣＲを、対合プライマーを混合して併用するマルチプレックス法で行うために、ＰＣＲの回数や電気泳動・染色回数を減らすことができ、品種判別を短時間、かつ低コストで実施することができる。
【０１０７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 識別用ネガティブバンドＤＮＡ群による「コシヒカリ」への混米の検出のためのＰＣＲの結果を示す泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍは分子量マーカー、１は「コシヒカリ」、２は「ひとめぼれ」、３は「ヒノヒカリ」、４は「あきたこまち」、５は「きらら３９７」、６は「キヌヒカリ」、７は「ほしのゆめ」、８は「はえぬき」、９は「むつほまれ」、１０は「日本晴」、１１は「ササニシキ」、１２は「つがるロマン」、１３は「ハナエチゼン」、１４は「夢つくし」、１５は「ハツシモ」、１６は「朝の光」、１７は「月の光」、１８は「あいちのかおり」、１９は「祭り晴」、２０は「アキホ」をそれぞれ示す。
【図２】 識別用ネガティブバンド／ポジティブバンドＤＮＡ群による「コシヒカリ」への混米の検出のためのＰＣＲの結果を示す泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍは分子量マーカー、１は「コシヒカリ」、２は「ひとめぼれ」、３は「ヒノヒカリ」、４は「あきたこまち」、５は「きらら３９７」、６は「キヌヒカリ」、７は「ほしのゆめ」、８は「はえぬき」、９は「むつほまれ」、１０は「日本晴」、１１は「ササニシキ」、１２は「つがるロマン」、１３は「ハナエチゼン」、１４は「夢つくし」、１５は「ハツシモ」、１６は「朝の光」、１７は「月の光」、１８は「あいちのかおり」、１９は「祭り晴」、２０は「アキホ」をそれぞれ示す。
【図３】 識別用ネガティブバンドＤＮＡ群による「コシヒカリ」への混米の検出のためのＰＣＲの結果を示す泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍは分子量マーカー、１は「コシヒカリ」、２は「ひとめぼれ」、３は「ヒノヒカリ」、４は「あきたこまち」、５は「きらら３９７」、６は「キヌヒカリ」、７は「ほしのゆめ」、８は「はえぬき」、９は「むつほまれ」、１０は「日本晴」、１１は「ササニシキ」、１２は「つがるロマン」、１３は「ハナエチゼン」、１４は「夢つくし」、１５は「ハツシモ」、１６は「朝の光」、１７は「月の光」、１８は「あいちのかおり」、１９は「祭り晴」、２０は「アキホ」をそれぞれ示す。
【図４】 ５種類のプライマーによる第２次ＰＣＲの結果を示す泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍは分子量マーカー、１は「コシヒカリ」、２は「ひとめぼれ」、３は「ヒノヒカリ」、４は「あきたこまち」、５は「きらら３９７」、６は「キヌヒカリ」、７は「ほしのゆめ」、８は「はえぬき」、９は「むつほまれ」、１０は「日本晴」、１１は「ササニシキ」、１２は「つがるロマン」、１３は「ハナエチゼン」、１４は「夢つくし」、１５は「ハツシモ」、１６は「朝の光」、１７は「月の光」、１８は「あいちのかおり」、１９は「祭り晴」、２０は「アキホ」をそれぞれ示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、穀粒中の混合品種の有無および混合された品種の判別方法に関するものである。たとえば、良食味米への混米の有無およびその品種の判定を行うためのＤＮＡ品種判別方法に関し、より詳しくは米、小麦、トウモロコシ、大麦等の穀粒あるいはそれらの加工品から抽出したＤＮＡを鋳型とし、適当な対合プライマー群の存在下にマルチプレックスＰＣＲを行うことによって、増幅したＤＮＡのバンドパターンから混入されている品種を判別する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、穀粒の価格は、穀粒の加工適性や食味に応じて決定され、良質の穀粒ほど高価格で取り引きされている。たとえば米において、平成１２年度におけるわが国の作付け上位４品種である「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「ヒノヒカリ」および「あきたこまち」に代表される良食味米は、消費者の良食味米志向を受けて高値で取り引きされている。
しかし、一部では、これらの良食味品種以外の米を混米しながら、表示を偽って販売されている不正混米が行われ、問題となっている。平成１３年４月から施行される改正ＪＡＳ法のもとでは、米の包装での品種、産地、産年の表示が義務づけられており、内容と表示が一致しているかどうかを科学的に検査する技術の開発が必要とされている。
【０００３】
従来、米等の穀物の品種については、植物体の草型、穀粒の粒型、葉や米の酵素多型などによって識別されてきた。しかし、現在のように、わが国の米における「コシヒカリ」とその類縁系統が全体の７割を越えるような近縁系統の多い状況下では、前述の方法によって品種混合の有無を識別することは不可能である。
本発明者らは、これまでに、ＲＡＰＤ法やＳＴＳ化プライマー法等のＤＮＡによって品種を判別する技術を開発し、日本食品科学工学会誌４６巻３号（p.117-122)、特許第３０４８１４９号明細書および特開２００１−９５５８９号公報に開示してきた。
しかし、これらの技術では、単一品種同士の米の品種識別は明瞭に行うことができるものの、たとえば「コシヒカリ」にその識別バンドが重なる場合、「コシヒカリ」よりも発現する識別バンド数の少ない異品種の米を１〜３割程度混米した場合や複数の品種を混米した場合に、これらを検出することが困難であった。
【０００４】
また、３〜４種類のプライマーセットによる混米の有無の判定では、たとえ混米特有のＤＮＡバンドが現れなかったとしても、その品種が良食味米のような対象品種である確率は８８〜９４％（＝１−（０．５）3 〜 4 ）に過ぎず、十分に高い確率とは言えないのが現状である。
さらに、混米特有のバンドが現れたとしても、実際には混米の品種の同定が必要とされる場合が多い。このため、対象品種に現れる筈のない識別バンドが現れたのみでは混米品種の同定のためには情報が不十分であり、混米品種の同定のためにはさらなるＰＣＲを行う必要がある。
したがって、これまでの公知の技術では、穀粒の品種混合の有無および混合された品種を簡易迅速、かつ正確に判定することは不可能であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、「コシヒカリ」等の良質穀粒に対する他の品種の混合の有無および混合された品種を簡易迅速、かつ正確に判定する方法を提供することを目的としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、穀粒試料から抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ増幅を行うに際し、対象の良質品種には現れずに他の品種のみに特有に現れるネガティブバンド識別用対合プライマー群を用いて第１次のマルチプレックスＰＣＲを行い、発現したバンドパターンによっては対合プライマーを選択的に用いた第２次のマルチプレックスＰＣＲを行うことにより増幅したＤＮＡの多型を検出することによって、穀類試料が対象品種であることを確認し、さらには品種混合の有無および混合された品種の同定を簡易迅速、かつ正確に行うことができることを見出し、かかる知見に基づいて本発明に到達したものである。
【０００７】
請求項１記載の本発明は、穀粒にイネ品種「コシヒカリ」以外の品種の穀粒が混合しているか否かを、当該穀粒もしくはその加工品から抽出したＤＮＡを鋳型とするマルチプレックスＰＣＲ法を用いて判別するに際し、イネ品種「コシヒカリ」では識別バンドを発現せず、混合品種のみに選択的に発現する以下の１）〜４）に示す４種の対合プライマーからなるネガティブバンド識別用対合プライマー群を用いることを特徴とするイネ品種「コシヒカリ」のＤＮＡ品種判別方法である。
１）Ａ６Ｆ２１（配列番号３）およびＡ６Ｒ２２（配列番号４）
２）Ｂ７Ｆ２２（配列番号１９）およびＢ７Ｒ１７（配列番号２０）
３）Ｆ６Ｆ２５（配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列番号４４）
４）ＷＫ９Ｆ２０（配列番号９５）およびＷＫ９Ｒ２０（配列番号９６）
【０００８】
請求項２記載の本発明は、さらに、以下の５）〜８）に示す４種の対合プライマーからなる対合プライマー群を用いて第２次のマルチプレックスＰＣＲ法を行い、発現したＤＮＡバンドパターンによってイネ品種「コシヒカリ」であることを確認することを特徴とする請求項１記載のイネ品種「コシヒカリ」のＤＮＡ品種判別方法である。
５）Ｂ４３Ｆ１７（配列番号２７）およびＢ４３Ｒ１８（配列番号２８）
６）Ｇ２２Ｆ２７（配列番号５１）およびＧ２２Ｒ２３（配列番号５２）
７）Ｍ１１Ｆ２０（配列番号６７）およびＭ１１Ｒ２０（配列番号６８）
８）ＷＫ９Ｆ２０（配列番号９５）およびＷＫ９Ｒ２０（配列番号９６）
請求項３記載の本発明は、第２次のマルチプレックスＰＣＲ法において、さらに以下の９）に示す対合プライマーを用いることを特徴とする請求項１または２記載のイネ品種「コシヒカリ」のＤＮＡ品種判別方法である。
９）Ｐ３Ｆ２０（配列番号７１）およびＰ３Ｒ１５（配列番号７２）
【０００９】
請求項４記載の本発明は、穀粒にイネ品種「ひとめぼれ」以外の品種の穀粒が混合しているか否かを、当該穀粒もしくはその加工品から抽出したＤＮＡを鋳型とするマルチプレックスＰＣＲ法を用いて判別するに際し、イネ品種「ひとめぼれ」では識別バンドを発現せず、混合品種のみに選択的に発現する以下の１）〜４）に示す４種の対合プライマーからなるネガティブバンド識別用対合プライマー群を用いることを特徴とするイネ品種「ひとめぼれ」のＤＮＡ品種判別方法である。
１）Ａ６Ｆ２１（配列番号３）およびＡ６Ｒ２２（配列番号４）
２）Ｆ６Ｆ２５（配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列番号４４）
３）Ｐ３Ｆ２０（配列番号７１）およびＰ３Ｒ１５（配列番号７２）
４）Ｓ１３Ｆ２５（配列番号８３）およびＳ１３Ｒ２４（配列番号８４）
【００１０】
請求項５記載の本発明は、さらに、以下の５）〜９）に示す５種の対合プライマーからなる対合プライマー群を用いて第２次のマルチプレックスＰＣＲ法を行い、発現したＤＮＡバンドパターンによってイネ品種「ひとめぼれ」であることを確認することを特徴とする請求項４記載のイネ品種「ひとめぼれ」のＤＮＡ品種判別方法である。
５）Ｂ４３Ｆ１７（配列番号２７）およびＢ４３Ｒ１８（配列番号２８）
６）Ｅ３０Ｆ２８（配列番号３９）およびＥ３０Ｒ２４（配列番号４０）
７）Ｇ２２Ｆ２７（配列番号５１）およびＧ２２Ｒ２３（配列番号５２）
８）Ｐ５Ｆ２０（配列番号７５）およびＰ５Ｒ２５（配列番号７６）
９）ＷＫ９Ｆ２０（配列番号９５）およびＷＫ９Ｒ２０（配列番号９６）
【００１１】
請求項６記載の本発明は、穀粒にイネ品種「ヒノヒカリ」以外の品種の穀粒が混合しているか否かを、当該穀粒もしくはその加工品から抽出したＤＮＡを鋳型とするマルチプレックスＰＣＲ法を用いて判別するに際し、イネ品種「ヒノヒカリ」では識別バンドを発現せず、混合品種のみに選択的に発現する以下の１）〜４）に示す４種の対合プライマーからなるネガティブバンド識別用対合プライマー群を用いることを特徴とするイネ品種「ヒノヒカリ」のＤＮＡ品種判別方法である。
１）Ｂ４３Ｆ１７（配列番号２７）およびＢ４３Ｒ１８（配列番号２８）
２）Ｆ６Ｆ２５（配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列番号４４）
３）Ｇ２８Ｆ１７（配列番号５５）およびＧ２８Ｒ２８（配列番号５６）
４）Ｔ１６Ｆ３０（配列番号８９）およびＴ１６Ｒ３０（配列番号９０）
【００１２】
請求項７記載の本発明は、穀粒にイネ品種「あきたこまち」以外の品種の穀粒が混合しているか否かを、当該穀粒もしくはその加工品から抽出したＤＮＡを鋳型とするマルチプレックスＰＣＲ法を用いて判別するに際し、イネ品種「あきたこまち」では識別バンドを発現せず、混合品種のみに選択的に発現する以下の１）〜５）に示す５種の対合プライマーからなるネガティブバンド識別用対合プライマー群を用いることを特徴とするイネ品種「あきたこまち」のＤＮＡ品種判別方法である。
１）Ａ６Ｆ２１（配列番号３）およびＡ６Ｒ２２（配列番号４）
２）Ｅ３０Ｆ２８（配列番号３９）およびＥ３０Ｒ２４（配列番号４０）
３）Ｆ６Ｆ２５（配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列番号４４）
４）Ｇ２２Ｆ２７（配列番号５１）およびＧ２２Ｒ２３（配列番号５２）
５）Ｐ３Ｆ２０（配列番号７１）およびＰ３Ｒ１５（配列番号７２）
【００１３】
請求項８記載の本発明は、試料米が米飯である請求項１〜７のいずれかに記載のＤＮＡ品種判別方法である。
請求項９記載の本発明は、混入した試料米を各１粒ずつ検定することを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のＤＮＡ品種判別方法である。
【００１４】
請求項１０記載の本発明は、以下の１）〜４）に示す４種の対合プライマーを含むことを特徴とするイネ品種「コシヒカリ」のＤＮＡ品種判別用キットである。
１）Ａ６Ｆ２１（配列番号３）およびＡ６Ｒ２２（配列番号４）
２）Ｂ７Ｆ２２（配列番号１９）およびＢ７Ｒ１７（配列番号２０）
３）Ｆ６Ｆ２５（配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列番号４４）
４）ＷＫ９Ｆ２０（配列番号９５）およびＷＫ９Ｒ２０（配列番号９６）
【００１５】
請求項１１記載の本発明は、以下の１）〜４）に示す４種の対合プライマーを含むことを特徴とするイネ品種「コシヒカリ」のＤＮＡ品種判別用キットである。
１）Ｂ４３Ｆ１７（配列番号２７）およびＢ４３Ｒ１８（配列番号２８）
２）Ｇ２２Ｆ２７（配列番号５１）およびＧ２２Ｒ２３（配列番号５２）
３）Ｍ１１Ｆ２０（配列番号６７）およびＭ１１Ｒ２０（配列番号６８）
４）ＷＫ９Ｆ２０（配列番号９５）およびＷＫ９Ｒ２０（配列番号９６）
請求項１２記載の本発明は、さらに以下の５）に示す対合プライマーを含むことを特徴とする請求項１１記載のイネ品種「コシヒカリ」のＤＮＡ品種判別方法である。
５）Ｐ３Ｆ２０（配列番号７１）およびＰ３Ｒ１５（配列番号７２）
【００１６】
請求項１３記載の本発明は、以下の１）〜４）に示す４種の対合プライマーを含むことを特徴とするイネ品種「ひとめぼれ」のＤＮＡ品種判別用キットである。
１）Ａ６Ｆ２１（配列番号３）およびＡ６Ｒ２２（配列番号４）
２）Ｆ６Ｆ２５（配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列番号４４）
３）Ｐ３Ｆ２０（配列番号７１）およびＰ３Ｒ１５（配列番号７２）
４）Ｓ１３Ｆ２５（配列番号８３）およびＳ１３Ｒ２４（配列番号８４）
請求項１４記載の本発明は、以下の１）〜５）に示す５種の対合プライマーを含むことを特徴とするイネ品種「ひとめぼれ」のＤＮＡ品種判別用キットである。
１）Ｂ４３Ｆ１７（配列番号２７）およびＢ４３Ｒ１８（配列番号２８）
２）Ｅ３０Ｆ２８（配列番号３９）およびＥ３０Ｒ２４（配列番号４０）
３）Ｇ２２Ｆ２７（配列番号５１）およびＧ２２Ｒ２３（配列番号５２）
４）Ｐ５Ｆ２０（配列番号７５）およびＰ５Ｒ２５（配列番号７６）
５）ＷＫ９Ｆ２０（配列番号９５）およびＷＫ９Ｒ２０（配列番号９６）
【００１７】
請求項１５記載の本発明は、以下の１）〜４）に示す４種の対合プライマーを含むことを特徴とするイネ品種「ヒノヒカリ」のＤＮＡ品種判別用キットである。
１）Ｂ４３Ｆ１７（配列番号２７）およびＢ４３Ｒ１８（配列番号２８）
２）Ｆ６Ｆ２５（配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列番号４４）
３）Ｇ２８Ｆ１７（配列番号５５）およびＧ２８Ｒ２８（配列番号５６）
４）Ｔ１６Ｆ３０（配列番号８９）およびＴ１６Ｒ３０（配列番号９０）
【００１８】
請求項１６記載の本発明は、以下の１）〜５）に示す５種の対合プライマーを含むことを特徴とするイネ品種「あきたこまち」のＤＮＡ品種判別用キットである。
１）Ａ６Ｆ２１（配列番号３）およびＡ６Ｒ２２（配列番号４）
２）Ｅ３０Ｆ２８（配列番号３９）およびＥ３０Ｒ２４（配列番号４０）
３）Ｆ６Ｆ２５（配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列番号４４）
４）Ｇ２２Ｆ２７（配列番号５１）およびＧ２２Ｒ２３（配列番号５２）
５）Ｐ３Ｆ２０（配列番号７１）およびＰ３Ｒ１５（配列番号７２）
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下において、本発明を詳細に説明する。
本発明における穀類とは、稲科植物の種子を指し、たとえば米、小麦、トウモロコシ、大麦、ソルガム等があり、これらの加工品も含まれる。また、試料米とは、精米、玄米、精米粉、玄米粉、米飯、餅等を意味する。
【００２０】
また、本発明において対象品種とは、穀類中の主流をなす品種、たとえば米では「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「あきたこまち」、「ササニシキ」等の良食味米を意味し、大麦の場合は、「イチバンボシ」、「サンシュウ」、「大系ＨＫ６４」等、トウモロコシの場合は、「ハニーバンダム」、「ピーターコーン」、「ワキシーコーン」等を意味する。
これらの穀類は、穀粒自体を試料とする他、必要に応じて適当な粉砕機器、たとえば超遠心粉砕機（レッチェ社製）、サイクロンミル（ユーディ社製）、ミルサー（イワタニ製）、乳鉢等によって粉砕し、粉末として用いる。
【００２１】
穀類試料からのゲノムＤＮＡの抽出には、公知のＤＮＡ抽出法を適用することができ、たとえばフェノール抽出法、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）法、アルカリＳＤＳ法などが挙げられる。本発明においては、後記の実施例で示すように、ＣＴＡＢ法を用いるのが好ましい。
たとえば、試料にＣＴＡＢ溶液（０．１Ｍ トリス塩酸、２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム、１．４Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））を加えて攪拌し、恒温槽に入れた後、再びＣＴＡＢ溶液を加え、所定時間静置して抽出することにより、ゲノムＤＮＡを得ることができる。
【００２２】
また、試料が米飯や餅等の場合には、特許第３０４８１４９号明細書に記載されているように、粉末試料を耐熱性アミラーゼによって処理した後にゲノム遺伝子を抽出する酵素法によって抽出することもできる。
ＤＮＡの抽出後、必要に応じてクロロホルム／イソアミルアルコール処理、イソプロパノール沈殿、フェノール／クロロホルムによる除蛋白、エタノール沈殿等の精製工程を加えてもよい。これらの工程の中では、クロロホルム／イソアミルアルコール処理が好ましい。この処理は、たとえばＤＮＡ抽出液にクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を加えて攪拌、遠心分離して得られる上清に、ＤＮＡ沈殿液を加えてさらにＤＮＡを沈殿させた後、遠心分離を行って得られたＤＮＡ沈殿物を１Ｍ ＮａＣｌで抽出し、イソプロピルアルコール、エタノールによる洗浄、沈殿の後、ＴＥ緩衝液に溶解するもので、これによりＤＮＡ試料液を得ることができる。
【００２３】
続いて、ランダムプライマーの共存下に、上記の操作により得られるゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法を行う。これは、ゲノムＤＮＡのうち、次のＰＣＲ用の対合プライマー設計の基となる品種間の識別性を有する塩基配列を増幅させるために行うものである。
ここで、本発明におけるＰＣＲ法とは、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ複製の連鎖反応を指す。すなわち、鋳型となるＤＮＡに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーの共存下で約９０〜９６℃の高温処理過程（変性）、約３０〜７５℃のプライマー・ＤＮＡ結合過程（アニーリング）、約７０〜７５℃のＤＮＡ複製過程（伸長）の３過程を２０〜６０サイクル繰り返すことにより、約１００万倍〜１０億倍に増加させる（増幅）反応をいう。
また、マルチプレックスＰＣＲ法とは、複数の対合プライマーを組み合わせて行うＰＣＲ法を意味し、この方法には互いにプライマーダイマーを生成したり、識別バンドが互いに干渉したり、重複したりすることがない、融解温度の近い複数の対合プライマー（８〜３０量体）を選定して用いる。その結果、ＰＣＲ回数および電気泳動・染色回数を減らすことができる。
【００２４】
対合プライマーとは、品種間の識別性の現れる塩基配列を増幅させることができる１対のプライマーであり、前記したように、ＲＡＰＤ法に基づき、上記穀類試料より得られるＤＮＡからＰＣＲ法を行って得られる品種間に識別性のあるバンド部分の塩基配列を基に設計されるものである。すなわち、対象とする穀類のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ランダムプライマー存在下で行うＰＣＲ法によって識別バンドとして得られたＤＮＡの塩基配列を決定し、そのうちランダムプライマー部分のフォワード側およびリバース側の１５〜２９残基を１対のプライマーとして、対象穀類の鋳型ＤＮＡと共に品種識別のために行うＰＣＲ法に使用するものを指す。
対合プライマーを選定することにより、ランダムプライマーが鋳型ＤＮＡに結合する複数個所のうち、品種識別のために行うＰＣＲ法においては、識別に有用な識別バンドとなる塩基配列部分のみに選択的に結合することになる。
【００２５】
本発明におけるランダムプライマーとは、穀類試料から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲ法で増幅する際に、変性して一本鎖に分かれたゲノムＤＮＡに相補的に結合して二本鎖構造を形成し、鋳型ＤＮＡ複製の開始点となるプライマーを指す。通常は８〜５０量体のヌクレオチドであり、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）を無作為の配列に結合させた合成プライマーのことであり、たとえば市販されている１０量体ランダムプライマー（オペロン社製）やＤＮＡオリゴマーセット（１２量体）（和光純薬社製）等が挙げられる。
【００２６】
続いて、ＰＣＲで得られる増幅ＤＮＡの電気泳動を行う。これは、増幅産物のうち、目的とする対合プライマーを設計するための基となる、品種間の識別性の現れる塩基配列であることを示すバンドを検出するためである。
ここで電気泳動とは、ＰＣＲ法によって増幅されたＤＮＡが、アガロースやポリアクリルアミドのゲル中を直流電荷に引かれて移動する際に、ＤＮＡの分子量の差によって分離され、臭化エチジウムによって帯状に染色されてバンドとして増幅ＤＮＡの相違が検出される操作をいう。
【００２７】
このようにして検出された品種間の識別性の現れたバンドから、次のようにして１対の対合プライマーを作製する。
すなわち、当該識別性の現れたバンドを前記ゲルから切り出してＤＮＡを抽出、回収し、これを大腸菌に組み込んで増殖させる。次いで、アルカリミニプレップ法等でプラスミドを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとするＰＣＲ法で増幅し、ＤＮＡ自動シークエンサーにより塩基配列を決定する。
決定された塩基配列から、対合プライマーの設計を行う。先のランダムプライマーによるＰＣＲ法において、鋳型ＤＮＡである穀類試料由来のＤＮＡのうちランダムプライマーが結合した部位は、当該ランダムプライマーと同一あるいは相補的な（相同な）配列を有している筈である。つまり、この鋳型ＤＮＡから切り出して抽出した品種識別性の高いＤＮＡ塩基配列（これがＰＣＲ法における対合プライマーの母体となる）は、両端にランダムプライマーと同一あるいは相同な配列を有していることになる。
したがって、この識別性の高いＤＮＡ塩基配列のフォワード側およびリバース側のそれぞれから、適当な配列と長さを有する穀類の品種判定に有用な対合プライマーを設計することができる。
【００２８】
本発明における対合プライマーは、互いに同一配列あるいは相同配列を有していることが望ましい。
また、対合プライマーのサイズは、好ましくは１０〜４０塩基、より好ましくは１３〜２９塩基の範囲内であることが必要である。プライマーがこの範囲を超える場合は、鋳型ＤＮＡとの結合性および結合後の解離が悪くなり、ＰＣＲ後にも識別バンドが検出されず、品種識別が困難になるため好ましくない。また、この範囲を下回る場合は、非特異的な結合によるミスマッチ等が起こり、識別バンド以外のバンドの発現頻度が高くなるため、品種識別が困難になる他、複数のプライマーの併用によるＰＣＲの簡易迅速化が困難になるため好ましくない。
【００２９】
本発明者らは、上記のＰＣＲを行った結果、各種品種間に識別性の現れる数種のバンドを得た。米における識別バンドと品種識別性の関係を表１に示す。
【００３０】
【表１】
−：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現しないことを示す。
【００３１】
【表２】
−：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現しないことを示す。
【００３２】
【表３】
−：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現しないことを示す。
【００３３】
【表４】
−：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現しないことを示す。
【００３４】
トウモロコシおよび大麦における識別バンドと品種識別性の関係を、表２に示す。
【００３５】
【表５】
−：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現しないことを示す。
【００３６】
【表６】
−：ＰＣＲ後の電気泳動において、識別バンドが発現しないことを示す。
【００３７】
各バンドに由来して、種々の対合プライマーを得た。
（１）識別バンドＡ７（０．７ｋｂｐ）
このバンドは、「コシヒカリ」や「あきたこまち」等の品種から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「日本晴」や「朝の光」では特異的に見られない。このＡ７から、１対のプライマーＡ７Ｆ３０（配列表の配列番号５）およびＡ７Ｒ３０（配列表の配列番号６）を設計した。
続いて、上記のプライマーの３’側から所定数の塩基を切除し、本発明の対合プライマーであるＡ７Ｆ１９（配列表の配列番号７）およびＡ７Ｒ１６（配列表の配列番号８）を得た。
【００３８】
（２）識別バンドＢ４３（０．９ｋｂｐ）
このバンドは、「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」や「ササニシキ」から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「きらら３９７」や「朝の光」では見られない。このＢ４３から、１対のプライマーＢ４３Ｆ３０（配列表の配列番号２５）およびＢ４３Ｒ３０（配列表の配列番号２６）を設計した。
続いて、上記のプライマーの３’側から所定数の塩基を切除し、本発明の対合プライマーであるＢ４３Ｆ１７（配列表の配列番号２７）およびＢ４３Ｒ１８（配列表の配列番号２８）を得た。
【００３９】
（３）識別バンドＥ３０（０．８５ｋｂｐ）
このバンドは、「ひとめぼれ」や「むつほまれ」等の品種から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「コシヒカリ」や「あきたこまち」では見られない。このＥ３０から、１対のプライマーＥ３０Ｆ３０（配列表の配列番号３７）およびＥ３０Ｒ３０（配列表の配列番号３８）を設計した。
続いて、上記のプライマーから塩基を切除し、本発明の対合プライマーであるＥ３０Ｆ２８（配列表の配列番号３９）およびＥ３０Ｒ２４（配列表の配列番号４０）を得た。
【００４０】
（４）識別バンドＪ６（０．９ｋｂｐ）
このバンドは、「コシヒカリ」や「きらら３９７」から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「ササニシキ」では見られない。このＪ６から、１対のプライマーＪ６Ｆ３０（配列表の配列番号５７）およびＪ６Ｒ３０（配列表の配列番号５８）を設計した。
続いて、上記のプライマーから塩基を切除し、本発明の対合プライマーであるＪ６Ｆ１８（配列表の配列番号５９）およびＪ６Ｒ２０（配列表の配列番号６０）を得た。
【００４１】
（５）識別バンドＭ２ＣＧ（１．２ｋｂｐ）
このバンドは、１０量体ランダムプライマーに２残基添加したもので、「ひとめぼれ」や「日本晴」から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「コシヒカリ」や「キヌヒカリ」では見られない。このＭ２ＣＧから、１対のプライマーＭ２ＣＧＦ３０（配列表の配列番号６１）およびＭ２ＣＧＲ３０（配列表の配列番号６２）を設計した。
続いて、上記のプライマーから塩基を切除し、本発明の対合プライマーであるＭ２ＣＧＦ１６（配列表の配列番号６３）およびＭ２ＣＧＲ１５（配列表の配列番号６４）を得た。
【００４２】
（６）識別バンドＳ１３（１．８ｋｂｐ）
このバンドは、「きらら３９７」や「ほしのゆめ」から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「日本晴」や「朝の光」では特異的に見られない。このＳ１３から、１対のプライマーＳ１３Ｆ３０（配列表の配列番号８１）およびＳ１３Ｒ３０（配列表の配列番号８２）を設計した。
続いて、上記のプライマーから塩基を切除し、本発明の対合プライマーであるＳ１３Ｆ２５（配列表の配列番号８３）およびＳ１３Ｒ２４（配列表の配列番号８４）を得た。
【００４３】
（７）識別バンドＷＫ９（１．６ｋｂｐ）
このバンドは、「ひとめぼれ」や「あきたこまち」から抽出したＤＮＡを増幅することにより得られるが、「こしひかり」や「ササニシキ」では見られない。このＷＫ９から、１対のプライマーＷＫ９Ｆ３０（配列表の配列番号９３）およびＷＫ９Ｒ３０（配列表の配列番号９４）を設計した。
続いて、上記のプライマーから塩基を切除し、本発明の対合プライマーであるＷＫ９Ｆ２０（配列表の配列番号９５）およびＷＫ９Ｒ２０（配列表の配列番号９６）を得た。
【００４４】
上記のプライマーは米を基にして設計したものであるが、その多くは同じイネ科に属するトウモロコシや大麦等の識別にも利用できる。
本発明の対合プライマーを得るために行う塩基の切除とは、穀類試料より抽出した鋳型ＤＮＡを増幅し、これを基に設計された１対のプライマーの３’側の１〜１７個の塩基を切除し、１３〜２９個の塩基とすることをいう。
塩基を切除する方法としては、好適な制限酵素を用いて行う常法によって実施すればよい。
【００４５】
具体的には、１対のプライマーであるＡ６Ｆ３０（配列表の配列番号１）およびＡ６Ｒ３０（配列表の配列番号２）、Ａ７Ｆ３０（配列表の配列番号５）およびＡ７Ｒ３０（配列表の配列番号６）、Ａ５２Ｆ３０（配列表の配列番号９）およびＡ５２Ｒ３０（配列表の配列番号１０）、Ｂ１Ｆ３０（配列表の配列番号１３）およびＢ１Ｒ３０（配列表の配列番号１４）、Ｂ７Ｆ３０（配列表の配列番号１７）およびＢ７Ｒ３０（配列表の配列番号１８）、Ｂ１８Ｆ３０（配列表の配列番号２１）およびＢ１８Ｒ３０（配列表の配列番号２２）、Ｂ４３Ｆ３０（配列表の配列番号２５）およびＢ４３Ｒ３０（配列表の配列番号２６）、Ｄ４Ｆ３０（配列表の配列番号２９）およびＤ４Ｒ３０（配列表の配列番号３０）、Ｅ２２Ｆ３０（配列表の配列番号３３）およびＥ２２Ｒ３０（配列表の配列番号３４）、Ｅ３０Ｆ３０（配列表の配列番号３７）およびＥ３０Ｒ３０（配列表の配列番号３８）、Ｆ６Ｆ３０（配列表の配列番号４１）およびＦ６Ｒ３０（配列表の配列番号４２）、Ｇ４Ｆ３０（配列表の配列番号４５）およびＧ４Ｒ３０（配列表の配列番号４６）、Ｇ２２Ｆ３０（配列表の配列番号４９）およびＧ２２Ｒ３０（配列表の配列番号５０）、Ｇ２８Ｆ３０（配列表の配列番号５３）およびＧ２８Ｒ３０（配列表の配列番号５４）、Ｊ６Ｆ３０（配列表の配列番号５７）およびＪ６Ｒ３０（配列表の配列番号５８）、Ｍ２ＣＧＦ３０（配列表の配列番号６１）およびＭ２ＣＧＲ３０（配列表の配列番号６２）、Ｍ１１Ｆ３０（配列表の配列番号６５）およびＭ１１Ｒ３０（配列表の配列番号６６）、Ｐ３Ｆ３０（配列表の配列番号６９）およびＰ３Ｒ３０（配列表の配列番号７０）、Ｐ５Ｆ３０（配列表の配列番号７３）およびＰ５Ｒ３０（配列表の配列番号７４）、Ｑ１６Ｆ３０（配列表の配列番号７７）およびＱ１６Ｒ３０（配列表の配列番号７８）、Ｓ１３Ｆ３０（配列表の配列番号８１）およびＳ１３Ｒ３０（配列表の配列番号８２）、Ｔ８Ｆ３０（配列表の配列番号８５）およびＴ８Ｒ３０（配列表の配列番号８６）、Ｔ１６Ｆ３０（配列表の配列番号８９）およびＴ１６Ｒ３０（配列表の配列番号９０）、ＷＫ９Ｆ３０（配列表の配列番号９３）およびＷＫ９Ｒ３０（配列表の配列番号９４）から、上記の方法によって、３’側の１〜１７個の塩基を切除した１３〜２９個の塩基からなる対合プライマーからなる群より選ばれた２種以上の対合プライマーを用いることができる。
【００４６】
すなわち、対合プライマーとしては、Ａ６Ｆ２１（配列表の配列番号３）およびＡ６Ｒ２２（配列表の配列番号４）、Ａ７Ｆ１９（配列表の配列番号７）およびＡ７Ｒ１６（配列表の配列番号８）、Ａ５２Ｆ２９（配列表の配列番号１１）およびＡ５２Ｒ２１（配列表の配列番号１２）、Ｂ１Ｆ２５（配列表の配列番号１５）およびＢ１Ｒ２０（配列表の配列番号１６）、Ｂ７Ｆ２２（配列表の配列番号１９）およびＢ７Ｒ１７（配列表の配列番号２０）、Ｂ１８Ｆ１５（配列表の配列番号２３）およびＢ１８Ｒ２１（配列表の配列番号２４）、Ｂ４３Ｆ１７（配列表の配列番号２７）およびＢ４３Ｒ１８（配列表の配列番号２８）、Ｄ４Ｆ２３（配列表の配列番号３１）およびＤ４Ｒ２１（配列表の配列番号３２）、Ｅ２２Ｆ２０（配列表の配列番号３５）およびＥ２２Ｒ２１（配列表の配列番号３６）、Ｅ３０Ｆ２８（配列表の配列番号３９）およびＥ３０Ｒ２４（配列表の配列番号４０）、Ｆ６Ｆ２５（配列表の配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列表の配列番号４４）、Ｇ４Ｆ１８（配列表の配列番号４７）およびＧ４Ｒ２４（配列表の配列番号４８）、Ｇ２２Ｆ２７（配列表の配列番号５１）およびＧ２２Ｒ２３（配列表の配列番号５２）、Ｇ２８Ｆ１７（配列表の配列番号５５）およびＧ２８Ｒ２８（配列表の配列番号５６）、Ｊ６Ｆ１８（配列表の配列番号５９）およびＪ６Ｒ２０（配列表の配列番号６０）、Ｍ２ＣＧＦ１６（配列表の配列番号６３）およびＭ２ＣＧＲ１５（配列表の配列番号６４）、Ｍ１１Ｆ２０（配列表の配列番号６７）およびＭ１１Ｒ２０（配列表の配列番号６８）、Ｐ３Ｆ２０（配列表の配列番号７１）およびＰ３Ｒ１５（配列表の配列番号７２）、Ｐ５Ｆ２０（配列表の配列番号７５）およびＰ５Ｒ２５（配列表の配列番号７６）、Ｑ１６Ｆ２５（配列表の配列番号７９）およびＱ１６Ｒ２０（配列表の配列番号８０）、Ｓ１３Ｆ２５（配列表の配列番号８３）およびＳ１３Ｒ２４（配列表の配列番号８４）、Ｔ８Ｆ２２（配列表の配列番号８７）およびＴ８Ｒ２５（配列表の配列番号８８）、Ｔ１６Ｆ２４（配列表の配列番号９１）およびＴ１６Ｒ２６（配列表の配列番号９２）、ＷＫ９Ｆ２０（配列表の配列番号９５）およびＷＫ９Ｒ２0 （配列表の配列番号９６）からなる群より選ばれた２種あるいはそれ以上の組み合わせからなるオリゴヌクレオチドを用いることができる。
【００４７】
本発明で用いる対合プライマーについては、上記した対合プライマーのみに限定されるものではなく、識別性や融解温度（Ｔｍ）等の点で使用可能な対合プライマーを新たに設計して使用することもできる。
ここで、Ｔｍとは、ＤＮＡの２本鎖がそれぞれの１本鎖に分離する温度のことであり、ＰＣＲのアニーリング温度は、通常、使用するプライマーのＴｍ付近が適している。本発明においては、対合プライマーの併用に際し、Ｔｍの類似した対合プライマー同士を選択して使用し、Ｔｍに近い適正なアニーリング温度を選定することによって、各対合プライマーを単独で使用した場合に得られる識別バンドを１回あるいは数回のＰＣＲで得ることができる。
【００４８】
具体的には、使用する対合プライマーのＴｍの平均値と、各対合プライマーのＴｍとの差が１５℃（±１５℃）以内で、かつＰＣＲのアニーリング温度もその範囲内とすることが好ましい。
アニーリング温度を対合プライマーのＴｍの平均値よりも１５℃以上低い温度としてＰＣＲを行う場合には、本来識別バンドが現れない品種にも識別バンドが現れる恐れがあるため、好ましくない。一方、Ｔｍの平均値よりも１５℃以上高い温度としてＰＣＲを行う場合には、本来発現していた識別バンドが消えてしまうことがあり、好ましくない。
【００４９】
本発明では、対合プライマーを用いて、先に抽出した鋳型ＤＮＡと共にマルチプレックスＰＣＲを行う。
対合プライマーを適切に選定することにより、ＰＣＲにおいて、品種の識別に有用な識別バンドとなる塩基配列部位のみに選択的に結合する。その結果、本発明の目的とする穀類の判別が可能となるのである。
本発明において、対合プライマーのうちの１種類あるいは２種類以上の組み合わせを混合使用することが可能である。
本発明における対合プライマーの混合使用とは、選択した複数の対合プライマーを、品種の識別を行うためのＰＣＲにおいて、同一反応に併用することを意味する。従来のＲＡＰＤ法では、識別バンド以外に多数の共通バンドが発現するため、複数のプライマーを同時に使用することが困難であった。本発明では、適切な対合プライマーの組み合わせ（プライマーセット）を用いることにより、それぞれのプライマーに対応する識別バンドのみが電気泳動で発現することになるため、混合使用が可能である。
【００５０】
調製した対合プライマーは、全てが混合使用できるものではなく、各プライマー間で相互のプライマーダイマー生成が起こらないこと、識別バンドが重ならないこと等に注意しながら好適な組み合わせおよび配合割合を選定することが必要である。各種の好適な対合プライマーを混合使用することにより、プライマー毎にＰＣＲを行う必要がなくなり、１回のＰＣＲで多くの品種を正確、かつ簡便に識別することができるため、品種判別に要する労力、時間や費用を大幅に減少させることができる。
【００５１】
本発明において、対象品種のみに特異的に発現するポジティブバンドとは、対象品種のみに発現する特異的なバンドパターンであり、対象品種独自のパターンを示すものである。
たとえば、対象品種として「コシヒカリ」、対合プライマーとしてＷＫ９、Ｍ１１、Ｂ４３およびＧ２２の４種からなる対合プライマーセットを用いた場合、穀類試料が「コシヒカリ」であればＷＫ９の識別バンドは発現しないが、Ｍ１１、Ｂ４３およびＧ２２の３本の識別バンドは発現する。この識別バンドパターンは、他の品種では示すものはなく、対象品種である「コシヒカリ」に独自のバンドパターンを示すものである。
また、対象品種のみに特異的に発現するポジティブバンド識別用対合プライマーセットまたは対象品種のみに発現しないネガティブバンド識別用対合プライマーセットとは、上記のような対象品種独特のバンドパターンとなるプライマーセットのことである。
【００５２】
上記の場合、穀類試料が対象品種である「コシヒカリ」であると推定できる各率について検討してみる。すなわち、各識別バンドの発現確率を発現／非発現の０．５と仮定すると、「コシヒカリ」以外のある品種が偶然に４種類の識別バンドの全てにおいて対象品種である「コシヒカリ」と一致する確率は（０．５）4 であることから、０．０６２５となる。
このことから、未知の穀類試料の４種類のバンドパターンが、全て対象品種と一致した場合には、９０％以上の確率で対象品種と同じ品種であると推定することができる。
【００５３】
また、対象品種では識別バンドの発現しないネガティブバンドとは、他の品種には識別バンドが発現するが、対象品種には特異的に発現しないバンドパターンを示すものである。
たとえば、対象品種として「コシヒカリ」、対合プライマーとしてＷＫ９Ｆ２０（配列表の配列番号９５）およびＷＫ９Ｒ２０（配列表の配列番号９６）、Ｆ６Ｆ２５（配列表の配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列表の配列番号４４）、Ｂ７Ｆ２２（配列表の配列番号１９）およびＢ７Ｒ１７（配列表の配列番号２０）、Ａ６Ｆ２１（配列表の配列番号３）およびＡ６Ｒ２２（配列表の配列番号４）の４種類からなる対合プライマーセットを用いた場合、穀類試料が「コシヒカリ」であればＰＣＲ後の増幅ＤＮＡバンドが全く発現しない。
一方、穀類試料が他の品種である場合には、いずれかの識別バンドが発現する、すなわち他の品種が「きらら３９７」である場合は、識別バンドＷＫ９、「キヌヒカリ」の場合は、識別バンドＷＫ９およびＢ７、「むつほまれ」である場合は、識別バンドＢ７が発現するというバンドパターンを示すものである。
【００５４】
上記において、ネガティブバンド識別用対合プライマーを用いて第１次ＰＣＲを行ったとき識別バンドが発現せず、さらに第１表〜第２表に記載の他の対合プライマーを用いて第２次のＰＣＲを行ったとき発現した識別バンドパターンについても、対象品種である「コシヒカリ」と一致した場合、穀物試料は「コシヒカリ」である確率が非常に高いと判定される。
たとえば、対象品種では識別バンドの発現しないネガティブバンド識別用対合プライマー群および対象品種に特異的に発現するポジティブバンドまたは対象品種のみに発現しないネガティブバンド識別用対合プライマー群が、それぞれ４種類であって、前者で識別バンドが全く発現せずに、後者で識別バンドパターンが一致した場合には、穀類試料が「コシヒカリ」ではない確率Ｐは、（１／２）4 ×（１／２）4 ＝０．００３９であり、０．０１以下である。
【００５５】
したがって、対象品種では識別バンドが発現しないネガティブバンド識別用対合プライマー群によるＰＣＲで識別バンドが全く発現せず、かつ対象品種に特異的に発現するポジティブバンドまたは対象品種のみに発現しないネガティブバンド識別用対合プライマー群による識別バンドパターンも一致する場合には、当該穀物試料は９９．９％以上の確率で「コシヒカリ」であると推定することができる。
【００５６】
次に、穀類試料が対象品種に他の品種が混入されたものである場合、その混合品種を同定する方法について説明する。
たとえば、米の品種である「むつほまれ」と「コシヒカリ」の混米の場合、対象品種に特異的に発現するポジティブバンド識別用対合プライマー群として、ＷＫ９、Ｍ１１、Ｇ２２およびＢ４３の４種類の対合プライマーセットを用いることにより、単一品種同士の比較では、「コシヒカリ」では識別バンドの発現するＭ１１およびＧ２２において、「むつほまれ」では識別バンドが発現しないことから、両者の識別が可能である。
【００５７】
しかし、「むつほまれ」を「コシヒカリ」に少量混米した場合には、識別バンドＭ１１およびＧ２２では識別バンドが発現しないという「むつほまれ」のネガティブ性が、「コシヒカリ」の多量に発現するポジティブバンドに隠れてしまうために、混米の検知が不可能である。
したがって、混米中の混入品種の同定においては、単一品種同士の識別を目的とした特開２００１−９５５８９号公報に記載されている対合プライマー群のみでは不十分であり、新たに対象品種では識別バンドが現れないが他の品種では識別バンドの現れるネガティブバンド識別用対合プライマー群が必要となる。
【００５８】
前記したように、本発明は穀類のＤＮＡ品種判別方法を提供すると共に、当該方法に使用されるキットを提供する。当該キットは、対象品種では識別バンドを発現せず、混合品種のみに選択的に発現するネガティブバンド識別用対合プライマー群を含有することを特徴とする。好適には、さらに対象品種のみに特異的に発現するポジティブバンド識別用対合プライマー群および／または対象品種のみに特異的に発現しないネガティブバンド識別用対合プライマー群を含有するキットが挙げられる。
本発明のキットに含有される対合プライマー群としては、前記の各種プライマー群を使用することができる。さらに、本発明のキットは、ＰＣＲ法に使用される試薬類、例えばＤＮＡポリメラーゼや反応用緩衝液等を含んでいてもよい。
【００５９】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１（識別用ネガティブバンドＤＮＡ群による「コシヒカリ」への混米の検出例）
わが国の平成１１年度における作付け上位２０品種である「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「ヒノヒカリ」、「あきたこまち」、「きらら３９７」、「キヌヒカリ」、「ほしのゆめ」、「はえぬき」、「むつほまれ」、「日本晴」、「ササニシキ」、「つがるロマン」、「ハナエチゼン」、「夢つくし」、「ハツシモ」、「朝の光」、「月の光」、「あいちのかおり」、「祭り晴」、「アキホ」の玄米を試料とし、試験用精米機（山本製作所製、ライスパルVP31T ）を用いて歩留まり９０％に精白した。
精米試料をレッチェ社製超遠心粉砕機を用いて粉砕し、その６ｇからＣＴＡＢ法によってゲノムＤＮＡを抽出した。すなわち、７０℃の２％ＣＴＡＢ溶液（０．１Ｍ トリス塩酸、２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム、１．４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）６ｍｌを加えて撹拌し、５５℃の恒温槽に入れ、次いで上記ＣＴＡＢ溶液（１％溶液）６ｍｌを加えて３０分間ＤＮＡを抽出した。
【００６０】
その後、ＤＮＡ抽出液にクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を加えて撹拌した後、遠心分離して上清をとり、ＤＮＡ沈殿液（１％ＣＴＡＢ、２０ｍＭ トリス塩酸、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加えて4 ℃で一晩静置してＤＮＡを沈殿させた。次に、遠心分離して得られたＤＮＡ沈殿物から１ＭＮａＣｌによって抽出し、イソプロピルアルコール、エタノールによる洗浄、沈殿の後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）２００μｌに溶解してＤＮＡ試料液とした。
ＰＣＲの反応液組成は、滅菌水１１．７４μｌ、ポリメラーゼ（宝酒造（株）製、Taq polymerase（５Ｕ／μｌ）０．２μｌ、反応用緩衝液（１２ｍＭ トリス塩酸、６０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．３）２．５μｌ、ＭｇＣｌ2 ２．０μｌ、鋳型ＤＮＡ ２００ｎｇ／１μｌ、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）１μｌを混合して調製し、ＰＣＲに用いる対合プライマーとして、配列番号９５および９６のＷＫ９Ｆ２０およびＷＫ９Ｒ２０各０．６μｌ、配列番号４３および４４のＦ６Ｆ２５およびＦ６Ｒ２２各０．５μｌ、配列番号１９および２０のＢ７Ｆ２２およびＢ７Ｒ１７各０．５μｌおよび配列番号３および４のＡ６Ｆ２１およびＡ６Ｒ２２各０．４μｌを使用して合計２２．４４μｌとした。
【００６１】
反応装置は宝酒造（株）製ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（６２℃、１分）、伸長（７２℃、２分）を３５サイクル反応させた。増幅ＤＮＡの電気泳動はコスモバイオ（株）製ミューピッドIIを使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後の紫外線照射によりバンドパターンを検出した。検出結果を表３および図１に示す。
【００６２】
この結果、「コシヒカリ」以外の１９品種の場合には、全て何らかのポジティブバンドが発現し、混米を検出できることが明らかになった。
一方、特開２００１−９５５８９号公報の実施例１０において、Ｍ２ＣＧ、ＷＫ９およびＢ７の３種類のプライマー併用の場合は、「コシヒカリ」と「ハツシモ」の両者が識別バンドが発現しないので、「ハツシモ」を「コシヒカリ」に混米しても検出できない。このことから、本発明の方法が優れていることが明らかである。
【００６３】
【表７】
【００６４】
実施例２（識別用ネガティブ／ポジティブバンドＤＮＡ群による識別例）
平成１１年度のわが国の作付け上位２０品種、すなわち、「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「ヒノヒカリ」、「あきたこまち」、「きらら３９７」、「キヌヒカリ」、「ほしのゆめ」、「はえぬき」、「むつほまれ」、「日本晴」、「ササニシキ」、「つがるロマン」、「ハナエチゼン」、「夢つくし」、「ハツシモ」、「朝の光」、「月の光」、「あいちのかおり」、「祭り晴」、「アキホ」の玄米を試験用精米機（山本製作所製、ライスパルVP31T ）を用いて歩留まり９０％に精白した。これらの精米各１粒を乳鉢で粉砕して試料とし、ＤＮＡ抽出キットであるISOPLANT II によってゲノムＤＮＡを抽出した。
【００６５】
ＰＣＲの反応液組成は、滅菌水１０．４μｌ、ポリメラーゼ（宝酒造（株）製、Taq polymerase（５Ｕ／μｌ）０．２μｌ、反応用緩衝液（１２ｍＭ トリス塩酸、６０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．３）２．５μｌ、ＭｇＣｌ2 ２．０μｌ、鋳型ＤＮＡ ２００ｎｇ／μｌを１μｌ、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）１μｌを混合して調製し、ＰＣＲに用いる対合プライマーとして、配列番号９５および９６のプライマーＷＫ９Ｆ２０およびＷＫ９Ｒ２０各０．６μｌ、配列番号６７および６８のプライマーＭ１１Ｆ２０およびＭ１１Ｒ２０各０．３μｌ、配列番号５１および５２のプライマーＧ２２Ｆ２７およびＧ２２Ｒ２３各０．３μｌ、配列番号２７および２８のプライマーＢ４３Ｆ１７およびＢ４３Ｒ１８各０．１μｌ、配列番号７１および７２のプライマーＰ３Ｆ２０およびＰ３Ｒ１５各０．３μｌの合計２０．３μｌとした。
【００６６】
反応装置は宝酒造（株）製、ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（６２℃、１分）、伸長（７２℃、２分）を３５サイクル反応させた。
増幅ＤＮＡの電気泳動は、コスモバイオ（株）製ミューピッドIIを使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後の紫外線照射によりバンドパターンを検出した。検出結果を表４および図２に示す。
【００６７】
【表８】
【００６８】
この結果、実施例１で用いた４種類のプライマーであるＷＫ９、Ｆ６、Ａ６およびＢ７に、本実施例で用いたＭ１１、Ｇ２２、Ｂ４３およびＰ３の４種類の対合プライマーセットを併用することにより、作付け上位２０品種のうち、「ほしのゆめ」と「アキホ」の識別を除く全てを互いに識別することが可能である。
従って、実施例１と実施例２の組み合わせにより、「コシヒカリ」に対する混米の有無の判定に加えて、混米された品種の同定もほとんどが可能であることが示された。
【００６９】
実施例３（３種類の識別用ネガティブバンドＤＮＡ群による混米の検出例）
わが国の平成１１年度における作付け上位２０品種である「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「ヒノヒカリ」、「あきたこまち」、「きらら３９７」、「キヌヒカリ」、「ほしのゆめ」、「はえぬき」、「むつほまれ」、「日本晴」、「ササニシキ」、「つがるロマン」、「ハナエチゼン」、「夢つくし」、「ハツシモ」、「朝の光」、「月の光」、「あいちのかおり」、「祭り晴」、「アキホ」の玄米を試料とし、実施例１と同様にして精米粉末から鋳型ＤＮＡを調製した。
「コシヒカリ」に他品種を少量混米した場合を想定して、「コシヒカリ」のＤＮＡを８０％、他の品種のＤＮＡを２０％混合して鋳型ＤＮＡとし、配列番号８３および８４のプライマーＳ１３Ｆ２５およびＳ１３Ｒ２４各０．０８μｌ、配列番号３９および４０のプライマーＥ３０Ｆ２８およびＥ３０Ｒ２４各０．０５μｌ、配列番号６３および６４のプライマーＭ２ＣＧＦ１６およびＭ２ＣＧＲ２２各１．０μｌを加えてＰＣＲを行った。結果を表５および図３に示す。
【００７０】
【表９】
【００７１】
表5から明らかなように、「コシヒカリ」への混米判別用プライマーセットの場合、上位２０品種のうち、「あきたこまち」、「キヌヒカリ」、「つがるロマン」、「夢つくし」、「朝の光」、「祭り晴」、「月の光」以外の全てがポジティブバンドを有しており、「コシヒカリ」に対する混米の検出に有用である。
これら３種類のプライマーを、実施例１および２で示した９種類のプライマーセットと併用すると、実施例２では識別できなかった「ほしのゆめ」と「アキホ」の識別も可能となり、混米の同定に有効である。
なお、特開２００１−９５５８９号公報の実施例１のＭ２ＣＧとＳ１３のみのＰＣＲの場合は、表３から明らかなように、「コシヒカリ」と「日本晴」、「きらら３９７」の識別は可能であるが、「あきたこまち」、「キヌヒカリ」、「ササニシキ」、「つがるロマン」、「夢つくし」、「朝の光」、「月の光」、「祭り晴」の８品種は「コシヒカリ」と同様に識別バンドを全く生じないので混米されても検出が不可能であり、混米検出の点で明らかに劣っている。
【００７２】
実施例４（ネガティブバンド群およびネガティブ／ポジティブバンド群の併用による米飯試料の混米の検出および混米品種の同定例）
「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「ヒノヒカリ」、「あきたこまち」、「きらら３９７」、「キヌヒカリ」、「ほしのゆめ」、「はえぬき」、「むつほまれ」、「日本晴」の作付け上位１０品種を含む２０品種の玄米を試料とし、試験用精米機（山本製作所製、ライスパル VP31T）を用いて歩留まり９０％に精白した。
精米試料を１粒ずつプラスチックチューブ（アシスト、１．５ｍｌ容）に取り、脱イオン水３５μｌを加え、スタンドに立てて１時間浸漬した後、開封状態で電気炊飯器（東芝製、RC-183、外釜に脱イオン水７５ｍｌ添加）にて１５分間炊飯し、１５分間蒸らし、米飯試料とした。この試料からのＤＮＡの抽出は下記のように行った。
【００７３】
試料米飯各１粒をマイクロチューブに取り、トリス／塩酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ含有）３００μｌを加え、ペレットミキサーで粉砕した。次いで、耐熱性アミラーゼ（シグマ製、α−アミラーゼ、７９０Ｕ／ｍｇ ｓｏｌｉｄ，１ｍｇ／ｍｌ）を５μｌ添加し、６０℃で１時間反応させた。次いで、トリチラチウム・アルブム（Tritirachium album）由来のプロテアーゼＫ（オンコー製、２０ｍｇ／ｍｌ）を５μｌ添加し、３７℃で２時間反応させた。
酵素反応終了後、−２０℃に冷却したエタノール１ｍｌを添加し、−２０℃で１５分間静置した後、微量遠心機で遠心分離（１５０００Ｇ、４℃、１５分間、以下同様）を行って沈殿を得た。この沈殿を３００μｌのＴＥ（１０ｍＭ トリス／塩酸、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、フェノール４００μｌを加え、回転撹拌機で３０分間ＤＮＡを抽出した。
次いで、遠心分離を行って上清を採取し、等量のＰＣＩ（フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール：２５／２４／１）を加え、３０分間抽出したのち、遠心分離を行って上清を得た。この上清に５Ｍ ＮａＣｌを６ｍｌ添加し、冷却したエタノール４００μｌを加え、遠心分離して得た沈殿を７０％エタノールで２回洗浄し、最後の沈殿を４０μｌの１０倍希釈ＴＥに溶解してＤＮＡ試料液とした。ＰＣＲは以下のように行った。
【００７４】
前述の方法で米飯から調製したＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行った。ＤＮＡポリメラーゼとして東洋紡績（株）製Taq polymeraseを使用し、ＰＣＲの反応液組成は、滅菌水１０μｌ、ポリメラーゼ０．２μl 、反応用緩衝液２．５μｌ、ＭｇＣｌ2 ２．０μｌ、鋳型ＤＮＡ３μｌ、ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ）１μｌを混合し、配列番号８３および８４のプライマーＳ１３Ｆ２５およびＳ１３Ｒ２４各０．１μｌ、配列番号４３および４４のプライマーＦ６Ｆ２５およびＦ６Ｒ２２各０．２μｌ、配列番号３および４のプライマーＡ６Ｆ２１およびＡ６Ｒ２２各０．１μｌ、配列番号７１および７２のプライマーＰ３Ｆ２０およびＰ３Ｒ１５各０．２５μｌ合計２０．０μｌとした。
反応装置は宝酒造（株）製ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（６０℃、１分）、伸長（７２℃、２分）の条件で４５サイクル反応させた。ＰＣＲで増幅したＤＮＡの電気泳動および染色は、実施例１と同様にして行った。ＰＣＲを行った結果を表６に示す。
【００７５】
【表１０】
【００７６】
表６に示すように、４つの識別バンドが全てネガティブとなるのは、「ひとめぼれ」、「あきたこまち」、「ササニシキ」の３品種のみであるので、これらの３品種に、他の１７品種のいずれかを混米した場合、第１次ＰＣＲにより識別バンドがポジティブに発現するので、混米されていることを確実に検出できることが示された。
【００７７】
対象品種（この場合は「ひとめぼれ」と「あきたこまち」）の識別バンドが全てネガティブになる前述の第１次ＰＣＲに続いて、第２次のＰＣＲを行った。第２次ＰＣＲでは、配列番号９５および９６のプライマーＷＫ９Ｆ２０およびＷＫ９Ｒ２０各０．５μｌ、配列番号３９および４０のプライマーＥ３０Ｆ２８およびＥ３０Ｒ２４各０．０５μｌ、配列番号５１および５２のプライマーＧ２２Ｆ２７およびＧ２２Ｒ２３各０．２μｌ、配列番号７５および７６のプライマーＰ５Ｆ２０およびＰ５Ｒ２５各０．３μｌ、配列番号２７および２８のプライマーＢ４３Ｆ１７およびＢ４３Ｒ１８各０．２５μｌを用いたこと以外は全て本実施例の第１次ＰＣＲと同様に行った。
第２次ＰＣＲで増幅したＤＮＡを電気泳動して染色した結果を表７および図４に示す。
【００７８】
【表１１】
【００７９】
第２次ＰＣＲの結果から、第１次ＰＣＲで全てネガティブであった「ひとめぼれ」、「あきたこまち」および「ササニシキ」の３品種を互いに識別することが可能であることが示された。
また、第１次ＰＣＲでポジティブバンドが発現する１７品種も加えて、表６と表７を合わせて比較することにより、作付け上位２０品種を全て識別することが可能であることが示された。
したがって、対象品種である「ひとめぼれ」あるいは「あきたこまち」に対する混米の有無は、これらがネガティブバンドとなる第１次ＰＣＲによってこれら３品種以外の１７品種で可能であり、ネガティブな３品種同士も第２次ＰＣＲで識別が可能であった。さらに、第１次ＰＣＲでポジティブバンドの現れる１７品種の場合も、１粒の米飯試料による第２次ＰＣＲの結果を加えることによって全て識別できることが示された。
【００８０】
実施例５（ネガティブバンドＤＮＡ群の併用による混米の検出および混米品種の同定例）
平成１２年度のわが国の作付け上位２０品種、すなわち「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「ヒノヒカリ」、「あきたこまち」、「きらら３９７」、「キヌヒカリ」、「ほしのゆめ」、「はえぬき」、「むつほまれ」、「日本晴」、「ササニシキ」、「つがるロマン」、「ハナエチゼン」、「夢つくし」、「ハツシモ」、「朝の光」、「月の光」、「あいちのかおり」、「祭り晴」、「アキホ」の２０品種の玄米を試料とし、実施例１と同様にして精白、粉砕、ゲノムＤＮＡ抽出およびＰＣＲを行った。
【００８１】
ＰＣＲの反応液組成は、滅菌水１０μｌ、ポリメラーゼ（宝酒造（株）製、Taq polymerase（５Ｕ／μｌ））０．２μｌ、反応用緩衝液（１２ｍＭ トリス塩酸、６０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．３）２．５μｌ、ＭｇＣｌ2 ２．０μｌ、鋳型ＤＮＡ ２５ｎｇ（１μｌ）、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）１μｌを混合し、ＰＣＲに用いるオリゴヌクレオチドプライマーとして、「ヒノヒカリ」に対する混米を検出するために、Ｂ４３、Ｇ２８、Ｆ６、Ｔ１６のプライマーセット、「あきたこまち」に対する混米を検出するために、Ａ６、Ｅ３０、Ｆ６、Ｇ２２、Ｐ３のプライマーセットを調製し、配列番号２７および２８のプライマーＢ４３Ｆ１７およびＢ４３Ｒ１８各０．０５μｌ、配列番号５５および５６のプライマーＧ２８Ｆ１７およびＧ２８Ｒ２８各０．４μｌ、配列番号４３および４４のプライマーＦ６Ｆ２５およびＦ６Ｒ２２各０．３μｌ、配列番号８９および９０のプライマーＴ１６Ｆ３０およびＴ１６Ｒ３０各０．４μｌの合計１９．０μｌとした。また、配列番号３および４のプライマーＡ６Ｆ２１およびＡ６Ｒ２２各０．５μｌ、配列番号７１および７２のプライマーＰ３Ｆ２０およびＰ３Ｒ１５各２μｌ、配列番号３９および４０のプライマーＥ３０Ｆ２８およびＥ３０Ｒ２４各０．３μｌ、配列番号４３および４４のプライマーＦ６Ｆ２５およびＦ６Ｒ２２各０．３μｌ、配列番号５１および５２のプライマーＧ２２Ｆ２７およびＧ２２Ｒ２３各０．３μｌの合計２３．５μｌとした。
【００８２】
反応装置は宝酒造（株）製、ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（６１℃、１分）、伸長（７２℃、２分）を３５サイクル反応させた。
増幅ＤＮＡの電気泳動および染色は実施例１と同様に行った。検出結果を表８に示す。
【００８３】
【表１２】
【００８４】
表８の結果から、「ヒノヒカリ」、「あきたこまち」ともに、それぞれのネガティブプライマーセットによる「対象品種には現れずに他の品種のみに特有に現れる識別用ＤＮＡの群」を用いて、上位２０品種の全ての他品種の混米を検出できることが明らかとなった。
さらに、表８の９種類のプライマーによるＰＣＲ結果を総合すると、作付け上位２０品種を全て互いに識別することが可能であり、ネガティブプライマーセットでポジティブバンドの発現した混米の場合に、一粒ずつＤＮＡを抽出して鋳型ＤＮＡとし、上記９種類のプライマーで検定することによって混米された品種を同定することが可能であることが示された。
【００８５】
実施例６（大麦における品種混合の検出および混合品種の判別例）
３品種の大麦、すなわち「サンシュウ」、「イチバンボシ」および「大系ＨＫ６４」の種子を、研削式精麦機により、歩留まり６０％に搗精した。これらの精麦をレッチェ社製超遠心粉砕機によって粉砕して粉末試料を得た。
これらの粉末試料６ｇを秤り取り、実施例１と同様にＣＴＡＢ法によってＤＮＡを抽出・精製し、鋳型ＤＮＡとした。
【００８６】
ＰＣＲの反応液組成は、ポリメラーゼ（宝酒造（株）製、Taq polymerase（５Ｕ／μｌ））０．２μｌ、反応用緩衝液（１２ｍＭ トリス塩酸、６０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．３）２．５μｌ、ＭｇＣｌ2 ２．０μｌ、鋳型ＤＮＡ２００ｎｇ／１μｌ、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）１μｌを混合し、ＰＣＲに用いる対合プライマーとして、第１次ＰＣＲでは配列番号５９および６０のＪ６Ｆ１８およびＪ６Ｒ２０各０．６μｌ、配列番号７および８のＡ７Ｆ１９およびＡ７Ｒ１６各０．５μｌ、配列番号１９および２０のＢ７Ｆ２２およびＢ７Ｒ１７各０．５μｌおよび配列番号３９および４０のＥ３０Ｆ２８およびＥ３０Ｒ２４各０．４μｌの４種類の対合プライマーを使用し、滅菌水を加えて合計２０．７μｌとした。また、第２次のＰＣＲでは配列番号４７および４８のＧ４Ｆ１８およびＧ４Ｒ２４各０．５μｌ、配列番号４３および４４のＦ６Ｆ２５およびＦ６Ｒ２２各０．５μｌ、配列番号６３および６４のＭ２ＣＧＦ１６およびＭ２ＣＧＲ１５各０．５μｌ、配列番号９５および９６のＷＫ９Ｆ２０およびＷＫ９Ｒ２０各０．４μｌの４種類の対合プライマーを使用して反応液総量を合計２０．７μｌとした。
【００８７】
反応装置は宝酒造（株）製、ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（６２℃、１分）、伸長（７２℃、２分）を３５サイクル反応させた。増幅ＤＮＡの電気泳動はコスモバイオ（株）製、ミューピッドIIを使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後の紫外線照射によりバンドパターンを検出した。検出結果を表９に示す。
この結果、品種混合検出のための第１次ＰＣＲにおいて、「イチバンボシ」のみが４種類の対合プライマー全てにおいて識別バンドが発現しないのに対し、「サンシュウ」および「大系ＨＫ６４」ではＪ６の場合に識別バンドが発現するので、これらの品種を「イチバンボシ」に混合した場合に検出が可能である。
さらに、混合された品種の判定のための第２次ＰＣＲの結果、「サンシュウ」の場合には全てマイナスであるのに対し、「イチバンボシ」の場合はＭ２ＣＧ、「大系ＨＫ６４」の場合にはＧ４およびＭ２ＣＧの場合に識別バンドが発現するので、第１次ＰＣＲの結果とも総合して、これら「サンシュウ」と「大系ＨＫ６４」の判別が可能であった。
【００８８】
【表１３】
【００８９】
実施例７（トウモロコシにおける品種混合の検出および混合品種の判別例）
３品種のトウモロコシ、すなわち「ピーターコーン」、「ハニーバンタム」および「ワキシーコーン」の種子をアイラ製凍結乾燥機ＦＤ２００によって凍結乾燥した後、イワタニ製コーヒーミルサーによって粉砕して粉末試料を得た。これらの粉末試料６ｇを秤り取り、実施例１と同様にＣＴＡＢ法によってＤＮＡを抽出・精製し、鋳型ＤＮＡとした。
【００９０】
ＰＣＲの反応液組成は、滅菌水１１．７４μｌ、ポリメラーゼ（宝酒造（株）製、Taq polymerase（５Ｕ／μｌ））０．２μｌ、反応用緩衝液（１２ｍＭ トリス塩酸、６０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．３）２．５μｌ、ＭｇＣｌ2 ２．０μｌ、鋳型ＤＮＡ ２００ｎｇ／１μｌ、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）１μｌを混合し、ＰＣＲに用いる対合プライマーとして、第１次ＰＣＲでは配列番号７および８のＡ７Ｆ１９およびＡ７Ｒ１６各０．６μｌ、配列番号３９および４０のＥ３０Ｆ２８およびＥ３０Ｒ２４各０．５μｌ、配列番号４３および４４のＦ６Ｆ２５およびＦ６Ｒ２２各０．５μｌおよび配列番号８３および８４のＳ１３Ｆ２５およびＳ１３Ｒ２４各０．４μｌの４種類の対合プライマーを使用して合計２２．４４μｌとした。
【００９１】
また、第２次のＰＣＲでは配列番号３および４のＡ６Ｆ２１およびＡ６Ｒ２２各０．５μｌ、配列番号４７および４８のＧ４Ｆ１８およびＧ４Ｒ２４各０．５μｌおよび配列番号５９および６０のＪ６Ｆ１８およびＪ６Ｒ２０各０．４μｌ、配列番号６３および６４のＭ２ＣＧＦ１６およびＭ２ＣＧＲ１５各０．３μｌの４種類の対合プライマーを使用して合計２０．７μｌとした。
反応装置はアステック（株）製温度コントロールシステムＰＣ７００を使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（６２℃、１分）、伸長（７２℃、２分）を３５サイクル反応させた。増幅ＤＮＡの電気泳動はコスモバイオ（株）製ミューピッドIIを使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後の紫外線照射によりバンドパターンを検出した。検出結果を表１０に示す。
【００９２】
【表１４】
【００９３】
この結果、品種混合検出のための第１次ＰＣＲにおいて、「ハニーバンタム」および「ピーターコンーン」が４種類の対合プライマー全てにおいて識別バンドが発現しないのに対し、「ワキシーコーン」ではＡ７、Ｅ３０、Ｆ６、Ｓ１３の場合に識別バンドが発現するので、「ワキシーコーン」を「ハニーバンタム」あるいは「ピーターコーン」に混合した場合に検出が可能である。
さらに、混合品種判定のための第２次ＰＣＲの結果、「ハニーバンタム」の場合にはＡ６およびＭ２ＣＧ、「ピーターコーン」の場合にはＪ６、「ワキシーコーン」の場合にはＡ６、Ｇ４、Ｊ６、Ｍ２ＣＧの場合に識別バンドが発現するので、第１次ＰＣＲの結果とも総合してこれら３品種の判別が可能であった。
【００９４】
実施例８（プライマーの長さの範囲規定）
「コシヒカリ」および「ほしのゆめ」の２品種の試料玄米を用いた。
試験用精米機（山本製作所製、ライスパル VP31T）を用いて歩留まり９０％に精白した。各精米試料をレッチェ社製超遠心粉砕機を用いて粉砕し、その６ｇからＣＴＡＢ法によってゲノムＤＮＡを抽出した。紫外吸収法（２６０ｎｍ）によって測定したＤＮＡ濃度が約４００μｇ／ｍｌとなるように各試料ＤＮＡの濃度を調整してＰＣＲに供した。
【００９５】
ＰＣＲに用いるオリゴヌクレオチドプライマーとして、配列表の配列番号９７および９８の４０残基の配列を有する長い対合プライマー、配列番号８３（２５量体）および配列番号８４（２４量体）からなる対合プライマー、配列番号９９（１２量体）および配列番号１００（１２量体) からなる対合プライマーの３種類の対合プライマーをそれぞれ単独で使用した。
【００９６】
ＤＮＡポリメラーゼは東洋紡（株）製、Taq polymerase（５Ｕ／μｌ）を使用した。ＰＣＲの反応液組成は、滅菌水１０μｌ、ポリメラーゼ０．２μｌ、反応用緩衝液２．５μｌ、ＭｇＣｌ2 ２．０μｌ、鋳型ＤＮＡ３μｌ、ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ）１．０μｌを混合し、対合プライマー各１．０μｌ（合計２．０μｌ）の合計２０．７μｌとした。
反応装置は宝酒造（株）製、ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（３８℃、１分）、伸長（７２℃、２分）の条件で４５サイクル反応させた。
【００９７】
増幅ＤＮＡの電気泳動はコスモバイオ（株）製ミューピッドIIを使用し、２％アガロースゲルで４０分間泳動し、臭化エチジウム染色後の紫外線照射によりバンドパターンを検出した。その結果、４０残基の長い対合プライマーの場合はバンドが現れず、１２残基の短い対合プライマーの場合は多数のバンドが発現し、いずれの場合も本発明の目的とする正確な識別のためには不適当であった。
これに対して、２５量体と２４量体からなる対合プライマーの場合は、１．８ｋｂｐの識別バンドが「ほしのゆめ」で現れ、「コシヒカリ」で現れず、品種の識別が可能であった。
【００９８】
実施例９( 外国産米の米飯試料による識別例)
「コシヒカリ」（日本）、「一品」（韓国）、「バンニシキ」（中国）、「アマルー」（オーストラリア）、「タマキ」（米国）、「カオドークマリ１０５」（タイ）、「モトボイ」（ベトナム）の７種類の玄米各１０ｇをケット科学研究所製のパーレストによって歩留まり９０％に精白し、精米試料を１粒ずつプラスチックチューブ（アシスト、１．５ｍｌ容）に取り、脱イオン水３５μｌを加え、スタンドに立てて１時間浸漬した後、開封状態で電気炊飯器（東芝製、RC-183、外釜に脱イオン水７５ｍｌ添加）にて１５分間炊飯し、１５分間蒸らし、米飯試料とした。ＤＮＡの抽出は下記のように行った。
【００９９】
試料米飯各１粒をマイクロチューブに取り、トリス／塩酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ含有）３００μｌを加え、ペレットミキサーで粉砕した。次いで、耐熱性アミラーゼ（シグマ製、α−アミラーゼ、７９０Ｕ／ｍｇ ｓｏｌｉｄ，１ｍｇ／ｍｌ）を５μｌ添加し、６０℃で１時間反応させた。次いでトリチラチウム・アルバム（Tritirachium album）由来のプロテアーゼＫ（オンコー製、２０ｍｇ／ｍｌ）を５μｌ添加し、３７℃で２時間反応させた。
酵素反応終了後、−２０℃に冷却したエタノール１ｍｌを添加し、−２０℃で１５分間静置した後、微量遠心機で遠心分離（１５０００Ｇ、４℃、１５分間、以下同様）を行って沈殿を得た。この沈殿を３００μｌのＴＥ（１０ｍＭ トリス／塩酸、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、フェノール４００μｌを加え、回転撹拌機で３０分間ＤＮＡを抽出した。
次いで、遠心分離を行って上清を採取し、等量のＰＣＩ（フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール：２５／２４／１）を加え、３０分間抽出し、遠心分離して得た上清に５Ｍ ＮａＣｌを６ｍｌ添加し、冷却したエタノール４００μｌを加え、遠心分離して得た沈殿を７０％エタノールで２回洗浄し、最後の沈殿を４０μｌの１０倍希釈ＴＥに溶解してＤＮＡ試料溶液とした。
ＰＣＲは以下のようにして行った。
【０１００】
前述の方法で精米から調製したＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡの増幅を行った。ＤＮＡポリメラーゼとして東洋紡績（株）製、Taq polymeraseを使用し、ＰＣＲの反応液組成は、滅菌水１０μｌ、ポリメラーゼ０．２μｌ、反応用緩衝液２．５μｌ、ＭｇＣｌ2 ２．０μｌ、鋳型ＤＮＡ３μｌ、ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ）１．０μｌを混合し、配列番号９５および９６のプライマーＷＫ９Ｆ２０およびＷＫ９Ｒ２０各０．２５μｌ、配列番号７および８のプライマーＡ７Ｆ１９およびＡ７Ｒ１６各０．２５μｌ、配列番号８３および８４のプライマーＳ１３Ｆ２５およびＳ１３Ｒ２４各０．２５μｌ、配列番号５９および６０のプライマーＪ６Ｆ１８およびＪ６Ｒ２０各０．２５μｌ合計２０．７μｌとした。
反応装置は宝酒造（株）製ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰを使用し、変性（９４℃、１分）、アニーリング（６０℃、１分）、伸長（７２℃、２分）の条件で４５サイクル反応させた。
ＰＣＲで増幅したＤＮＡの電気泳動は実施例１と同様にして行った。作付け上位７品種の米飯から抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った結果を表１１に示す。
【０１０１】
表から明らかなように、本発明方法は外国産米から調製した米飯試料の場合にも適用が可能であることが示された。対合プライマーＷＫＡ９およびＳ１３のみの使用の場合には、「バンニシキ」と「モトボイ」の２品種、「アマルー」、「タマキ」、「カオドークマリ１０５」の３品種の識別が不可能であった。これに対し、Ａ７およびＪ６の２種類の対合プライマーを加えることにより、上記２品種および上記３品種の識別も可能となり、使用した７品種すべての識別が可能となった。
【０１０２】
【表１５】
実施例１０（その他のプライマー群の有用性）
試料玄米として「コシヒカリ」、「ヒノヒカリ」、「あきたこまち」、「キヌヒカリ」、「はえぬき」、「日本晴」、「ササニシキ」を用い、対合プライマーとして、配列番号１５および１６のＢ１Ｆ２５およびＢ１Ｒ２０、配列番号３５および３６のＥ２２Ｆ２０およびＥ２２Ｒ２１、配列番号７９および８０のＱ１６Ｆ２５およびＱ１６Ｒ２０、配列番号８７および８８のＴ８Ｆ２２およびＴ８Ｒ２５、配列番号２３および２４のＢ１８Ｆ１５およびＢ１８Ｒ２１を用いたこと以外は実施例１と同じ方法でＰＣＲおよび電気泳動を行った。試験結果を表１２に示す。
表から明らかなように、これらの対合プライマーにより、７品種間の識別が全て可能となった。
【０１０４】
【表１６】
【発明の効果】
本発明によれば、米、小麦、トウモロコシ、大麦等の穀粒に他の品種の穀粒が混合していることを、穀粒から抽出したＤＮＡを鋳型とするマルチプレックスＰＣＲを用いて判別することができ、かつ混入している穀粒の品種を識別することができる。すなわち、第１次ＰＣＲによって、簡易迅速に品種混合の有無を判定することができ、少量でも他の品種が混合していれば、判別できる。さらに、第２次ＰＣＲによって、当該混合品種を同定することができる。
【０１０６】
特に、本発明では識別性の高い対合プライマーによるＰＣＲを行うために、目的とする識別バンド以外のバンドが消失し、たとえば対象が「コシヒカリ」系統のような近縁種の場合にも、正確な品種判別が可能である。
しかも、本発明においては、ＰＣＲを、対合プライマーを混合して併用するマルチプレックス法で行うために、ＰＣＲの回数や電気泳動・染色回数を減らすことができ、品種判別を短時間、かつ低コストで実施することができる。
【０１０７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 識別用ネガティブバンドＤＮＡ群による「コシヒカリ」への混米の検出のためのＰＣＲの結果を示す泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍは分子量マーカー、１は「コシヒカリ」、２は「ひとめぼれ」、３は「ヒノヒカリ」、４は「あきたこまち」、５は「きらら３９７」、６は「キヌヒカリ」、７は「ほしのゆめ」、８は「はえぬき」、９は「むつほまれ」、１０は「日本晴」、１１は「ササニシキ」、１２は「つがるロマン」、１３は「ハナエチゼン」、１４は「夢つくし」、１５は「ハツシモ」、１６は「朝の光」、１７は「月の光」、１８は「あいちのかおり」、１９は「祭り晴」、２０は「アキホ」をそれぞれ示す。
【図２】 識別用ネガティブバンド／ポジティブバンドＤＮＡ群による「コシヒカリ」への混米の検出のためのＰＣＲの結果を示す泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍは分子量マーカー、１は「コシヒカリ」、２は「ひとめぼれ」、３は「ヒノヒカリ」、４は「あきたこまち」、５は「きらら３９７」、６は「キヌヒカリ」、７は「ほしのゆめ」、８は「はえぬき」、９は「むつほまれ」、１０は「日本晴」、１１は「ササニシキ」、１２は「つがるロマン」、１３は「ハナエチゼン」、１４は「夢つくし」、１５は「ハツシモ」、１６は「朝の光」、１７は「月の光」、１８は「あいちのかおり」、１９は「祭り晴」、２０は「アキホ」をそれぞれ示す。
【図３】 識別用ネガティブバンドＤＮＡ群による「コシヒカリ」への混米の検出のためのＰＣＲの結果を示す泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍは分子量マーカー、１は「コシヒカリ」、２は「ひとめぼれ」、３は「ヒノヒカリ」、４は「あきたこまち」、５は「きらら３９７」、６は「キヌヒカリ」、７は「ほしのゆめ」、８は「はえぬき」、９は「むつほまれ」、１０は「日本晴」、１１は「ササニシキ」、１２は「つがるロマン」、１３は「ハナエチゼン」、１４は「夢つくし」、１５は「ハツシモ」、１６は「朝の光」、１７は「月の光」、１８は「あいちのかおり」、１９は「祭り晴」、２０は「アキホ」をそれぞれ示す。
【図４】 ５種類のプライマーによる第２次ＰＣＲの結果を示す泳動写真である。
【符号の説明】
Ｍは分子量マーカー、１は「コシヒカリ」、２は「ひとめぼれ」、３は「ヒノヒカリ」、４は「あきたこまち」、５は「きらら３９７」、６は「キヌヒカリ」、７は「ほしのゆめ」、８は「はえぬき」、９は「むつほまれ」、１０は「日本晴」、１１は「ササニシキ」、１２は「つがるロマン」、１３は「ハナエチゼン」、１４は「夢つくし」、１５は「ハツシモ」、１６は「朝の光」、１７は「月の光」、１８は「あいちのかおり」、１９は「祭り晴」、２０は「アキホ」をそれぞれ示す。
Claims (16)
- 穀粒にイネ品種「コシヒカリ」以外の品種の穀粒が混合しているか否かを、当該穀粒もしくはその加工品から抽出したＤＮＡを鋳型とするマルチプレックスＰＣＲ法を用いて判別するに際し、イネ品種「コシヒカリ」では識別バンドを発現せず、混合品種のみに選択的に発現する以下の１）〜４）に示す４種の対合プライマーからなるネガティブバンド識別用対合プライマー群を用いることを特徴とするイネ品種「コシヒカリ」のＤＮＡ品種判別方法。
１）Ａ６Ｆ２１（配列番号３）およびＡ６Ｒ２２（配列番号４）
２）Ｂ７Ｆ２２（配列番号１９）およびＢ７Ｒ１７（配列番号２０）
３）Ｆ６Ｆ２５（配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列番号４４）
４）ＷＫ９Ｆ２０（配列番号９５）およびＷＫ９Ｒ２０（配列番号９６） - さらに、以下の５）〜８）に示す４種の対合プライマーからなる対合プライマー群を用いて第２次のマルチプレックスＰＣＲ法を行い、発現したＤＮＡバンドパターンによってイネ品種「コシヒカリ」であることを確認することを特徴とする請求項１記載のイネ品種「コシヒカリ」のＤＮＡ品種判別方法。
５）Ｂ４３Ｆ１７（配列番号２７）およびＢ４３Ｒ１８（配列番号２８）
６）Ｇ２２Ｆ２７（配列番号５１）およびＧ２２Ｒ２３（配列番号５２）
７）Ｍ１１Ｆ２０（配列番号６７）およびＭ１１Ｒ２０（配列番号６８）
８）ＷＫ９Ｆ２０（配列番号９５）およびＷＫ９Ｒ２０（配列番号９６） - 第２次のマルチプレックスＰＣＲ法において、さらに以下の９）に示す対合プライマーを用いることを特徴とする請求項１または２記載のイネ品種「コシヒカリ」のＤＮＡ品種判別方法。
９）Ｐ３Ｆ２０（配列番号７１）およびＰ３Ｒ１５（配列番号７２） - 穀粒にイネ品種「ひとめぼれ」以外の品種の穀粒が混合しているか否かを、当該穀粒もしくはその加工品から抽出したＤＮＡを鋳型とするマルチプレックスＰＣＲ法を用いて判別するに際し、イネ品種「ひとめぼれ」では識別バンドを発現せず、混合品種のみに選択的に発現する以下の１）〜４）に示す４種の対合プライマーからなるネガティブバンド識別用対合プライマー群を用いることを特徴とするイネ品種「ひとめぼれ」のＤＮＡ品種判別方法。
１）Ａ６Ｆ２１（配列番号３）およびＡ６Ｒ２２（配列番号４）
２）Ｆ６Ｆ２５（配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列番号４４）
３）Ｐ３Ｆ２０（配列番号７１）およびＰ３Ｒ１５（配列番号７２）
４）Ｓ１３Ｆ２５（配列番号８３）およびＳ１３Ｒ２４（配列番号８４） - さらに、以下の５）〜９）に示す５種の対合プライマーからなる対合プライマー群を用いて第２次のマルチプレックスＰＣＲ法を行い、発現したＤＮＡバンドパターンによってイネ品種「ひとめぼれ」であることを確認することを特徴とする請求項４記載のイネ品種「ひとめぼれ」のＤＮＡ品種判別方法。
５）Ｂ４３Ｆ１７（配列番号２７）およびＢ４３Ｒ１８（配列番号２８）
６）Ｅ３０Ｆ２８（配列番号３９）およびＥ３０Ｒ２４（配列番号４０）
７）Ｇ２２Ｆ２７（配列番号５１）およびＧ２２Ｒ２３（配列番号５２）
８）Ｐ５Ｆ２０（配列番号７５）およびＰ５Ｒ２５（配列番号７６）
９）ＷＫ９Ｆ２０（配列番号９５）およびＷＫ９Ｒ２０（配列番号９６） - 穀粒にイネ品種「ヒノヒカリ」以外の品種の穀粒が混合しているか否かを、当該穀粒もしくはその加工品から抽出したＤＮＡを鋳型とするマルチプレックスＰＣＲ法を用いて判別するに際し、イネ品種「ヒノヒカリ」では識別バンドを発現せず、混合品種のみに選択的に発現する以下の１）〜４）に示す４種の対合プライマーからなるネガティブバンド識別用対合プライマー群を用いることを特徴とするイネ品種「ヒノヒカリ」のＤＮＡ品種判別方法。
１）Ｂ４３Ｆ１７（配列番号２７）およびＢ４３Ｒ１８（配列番号２８）
２）Ｆ６Ｆ２５（配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列番号４４）
３）Ｇ２８Ｆ１７（配列番号５５）およびＧ２８Ｒ２８（配列番号５６）
４）Ｔ１６Ｆ３０（配列番号８９）およびＴ１６Ｒ３０（配列番号９０） - 穀粒にイネ品種「あきたこまち」以外の品種の穀粒が混合しているか否かを、当該穀粒もしくはその加工品から抽出したＤＮＡを鋳型とするマルチプレックスＰＣＲ法を用いて判別するに際し、イネ品種「あきたこまち」では識別バンドを発現せず、混合品種のみに選択的に発現する以下の１）〜５）に示す５種の対合プライマーからなるネガティブバンド識別用対合プライマー群を用いることを特徴とするイネ品種「あきたこまち」のＤＮＡ品種判別方法。
１）Ａ６Ｆ２１（配列番号３）およびＡ６Ｒ２２（配列番号４）
２）Ｅ３０Ｆ２８（配列番号３９）およびＥ３０Ｒ２４（配列番号４０）
３）Ｆ６Ｆ２５（配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列番号４４）
４）Ｇ２２Ｆ２７（配列番号５１）およびＧ２２Ｒ２３（配列番号５２）
５）Ｐ３Ｆ２０（配列番号７１）およびＰ３Ｒ１５（配列番号７２） - 試料米が米飯である請求項１〜７のいずれかに記載のＤＮＡ品種判別方法。
- 混入した試料米を各１粒ずつ検定することを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のＤＮＡ品種判別方法。
- 以下の１）〜４）に示す４種の対合プライマーを含むことを特徴とするイネ品種「コシヒカリ」のＤＮＡ品種判別用キット。
１）Ａ６Ｆ２１（配列番号３）およびＡ６Ｒ２２（配列番号４）
２）Ｂ７Ｆ２２（配列番号１９）およびＢ７Ｒ１７（配列番号２０）
３）Ｆ６Ｆ２５（配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列番号４４）
４）ＷＫ９Ｆ２０（配列番号９５）およびＷＫ９Ｒ２０（配列番号９６） - 以下の１）〜４）に示す４種の対合プライマーを含むことを特徴とするイネ品種「コシヒカリ」のＤＮＡ品種判別用キット。
１）Ｂ４３Ｆ１７（配列番号２７）およびＢ４３Ｒ１８（配列番号２８）
２）Ｇ２２Ｆ２７（配列番号５１）およびＧ２２Ｒ２３（配列番号５２）
３）Ｍ１１Ｆ２０（配列番号６７）およびＭ１１Ｒ２０（配列番号６８）
４）ＷＫ９Ｆ２０（配列番号９５）およびＷＫ９Ｒ２０（配列番号９６） - さらに以下の５）に示す対合プライマーを含むことを特徴とする請求項１１記載のイネ品種「コシヒカリ」のＤＮＡ品種判別方法。
５）Ｐ３Ｆ２０（配列番号７１）およびＰ３Ｒ１５（配列番号７２） - 以下の１）〜４）に示す４種の対合プライマーを含むことを特徴とするイネ品種「ひとめぼれ」のＤＮＡ品種判別用キット。
１）Ａ６Ｆ２１（配列番号３）およびＡ６Ｒ２２（配列番号４）
２）Ｆ６Ｆ２５（配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列番号４４）
３）Ｐ３Ｆ２０（配列番号７１）およびＰ３Ｒ１５（配列番号７２）
４）Ｓ１３Ｆ２５（配列番号８３）およびＳ１３Ｒ２４（配列番号８４） - 以下の１）〜５）に示す５種の対合プライマーを含むことを特徴とするイネ品種「ひとめぼれ」のＤＮＡ品種判別用キット。
１）Ｂ４３Ｆ１７（配列番号２７）およびＢ４３Ｒ１８（配列番号２８）
２）Ｅ３０Ｆ２８（配列番号３９）およびＥ３０Ｒ２４（配列番号４０）
３）Ｇ２２Ｆ２７（配列番号５１）およびＧ２２Ｒ２３（配列番号５２）
４）Ｐ５Ｆ２０（配列番号７５）およびＰ５Ｒ２５（配列番号７６）
５）ＷＫ９Ｆ２０（配列番号９５）およびＷＫ９Ｒ２０（配列番号９６） - 以下の１）〜４）に示す４種の対合プライマーを含むことを特徴とするイネ品種「ヒノヒカリ」のＤＮＡ品種判別用キット。
１）Ｂ４３Ｆ１７（配列番号２７）およびＢ４３Ｒ１８（配列番号２８）
２）Ｆ６Ｆ２５（配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列番号４４）
３）Ｇ２８Ｆ１７（配列番号５５）およびＧ２８Ｒ２８（配列番号５６）
４）Ｔ１６Ｆ３０（配列番号８９）およびＴ１６Ｒ３０（配列番号９０） - 以下の１）〜５）に示す５種の対合プライマーを含むことを特徴とするイネ品種「あきたこまち」のＤＮＡ品種判別用キット。
１）Ａ６Ｆ２１（配列番号３）およびＡ６Ｒ２２（配列番号４）
２）Ｅ３０Ｆ２８（配列番号３９）およびＥ３０Ｒ２４（配列番号４０）
３）Ｆ６Ｆ２５（配列番号４３）およびＦ６Ｒ２２（配列番号４４）
４）Ｇ２２Ｆ２７（配列番号５１）およびＧ２２Ｒ２３（配列番号５２）
５）Ｐ３Ｆ２０（配列番号７１）およびＰ３Ｒ１５（配列番号７２）
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