JP4108816B2 - 培養容器アセンブリ、これに用いる蓋およびこれを用いた細胞培養方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はインビトロ（in vitro）で細胞成長または組織培養するのための装置および方法に関する。より詳述すると、本発明はアセンブリを出入りするガスの拡散速度を変化させるための手段、およびそのアセンブリ内の細胞または組織培養に関して生物学的汚染を実質的に最低限にするための手段を有する培養容器アセンブリ、これに用いる蓋およびこれを用いた細胞培養方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
培養容器は、米国特許第4,495,289 号、第5,026 ，649 号、第5,358,871 号および第5,366,893 号ならびにヨーロッパ特許出願公開第0 483 620 A2号および英国特許出願公開第GB 2 268 187 A号に記載されている。培養容器は、ウェル（wells ）を備えており、それらのウェルは一般的に円形の形状をしているとともに細胞の付着、成長、および分化がその上で起こる膜を有する細胞培養挿入部（cell culture insert ）をそれらのウェル内に導入できるサイズを有する。ウェルを含んだ培養容器は、典型的には矩形であり、標準の分析装置に適合するように標準サイズを有する。培養容器に使用される細胞培養挿入部は、米国特許第4,871,674 号、第5,026,649 号および第5,366,893 号に記載されている（これは引用することで本明細書の一部とする）。
【０００３】
細胞の培養は、細胞損傷が生じることなく細胞に充分に酸素を供給する能力に依存する。細胞呼吸用の酸素は、細胞の上にある上部空間中の大気から液体培養培地を通って供給される。
【０００４】
例えば、スパージング、表面のエアレーション、培地灌流といった培養の通気は、酸素の利用性を増加することができる。しかしながら、かかる方法では細胞損傷が起こる可能性がある。シリコーンゴム製の管を用いてウェルと大気の間の配管（tubing）を行うことにより細胞培養におけるガス交換を改善することがなされているが、かかる方法は不便であり、細胞懸濁液が汚染されることがある。
【０００５】
多数の培養容器が市販され、特許公報に記載されているけれども、培養容器アセンブリを出入するガスの拡散速度を変化させるための手段を提供するにもかかわらず、依然として密閉系を提供し、それにより容器に対する生物学的汚染物の出入口が実質的に最低限にされるような培養容器は入手可能ではないと思われる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、培養容器アセンブリを出入りするガスの拡散速度を変化させるための手段および生物学的汚染物の出入りを実質的に最低限にするための手段をを有する培養容器アセンブリ、これに用いる蓋およびこれを用いた細胞培養方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載のアセンブリは、組織培養培地を受け入れるための開口部を有する複数のウェルおよび前記プレートの外縁を形成する直立した側壁を備える試験プレート、
前記プレート上に置かれる取り外しできる蓋であって、前記ウェルをおおって広がる、上面および下面を有する、本質的に平らなカバーと、前記カバーを包囲し、複数の角部を形成し、かつ下向きに延びて、内面および外面を有する側壁を形成するスカートを備える蓋、
前記平らなカバーに設けられたオリフィス、および
ガス透過性膜を前記オリフィスに連結したガス透過性膜
を備えることを特徴とする。
【０００８】
請求項２に記載のアセンブリは、請求項１において、前記オリフィスおよび前記ガス透過性膜をおおって前記アセンブリを出入りするガスの拡散を補助できるように前記カバーに完全にまたは部分的に取り外しできるように取り付けられたガス不透過性フィルムをさらに備えることを特徴とする。
【０００９】
請求項３に記載のアセンブリは、請求項１において、さらに前記試験プレートは前記プレートの前記側壁から内方に離隔しかつ前記側壁と前記ウェルの間で前記プレートの周りに延びている棚を備えており、前記側壁は棚の上方位置まで延び、それによって前記棚の周辺にリムを形成していることを特徴とする。
【００１０】
請求項４に記載の組織培養プレートと関連して用いる蓋は、上面と下面を備えている本質的に平らなカバー、
前記カバー上に複数の角部を形成し、かつ下向きに延びて、側壁を形成する前記カバーの周囲のスカート、
ガス透過性膜を備えた前記カバーに設けたオリフィス、および
前記オリフィスと前記ガス透過性膜をおおった前記カバーに完全にまたは部分的に取り外しできるように取り付けたガス不透過性フィルム
を備えていることを特徴とする。
【００１１】
請求項５に記載の蓋は、請求項４において、さらに前記スカートから内方に離隔しかつ前記カバーの前記下面から下向きに延びたフランジを備えることを特徴とする。
【００１２】
請求項６に記載のインビトロにおける細胞成長または組織培養のための装置は、本体と取り外しできる蓋を備えた装置であって、
前記本体は上面、下面、本質的に前記上面および下面の間に配置された複数のウェル、ならびに前記本体の外縁を形成する直立した側壁を備え、
前記取り外しできる蓋は上壁および前記上壁から延びた周囲のスカートを備え、前記装置を出入するガスの拡散を許容する手段を備えることを特徴とする。
【００１３】
請求項７に記載の装置は、請求項６において、装置を出入りするガスの拡散を許容する前記手段が、オリフィスおよび前記オリフィスと連結したガス透過性膜であることを特徴とする。
【００１４】
請求項８に記載の装置は、請求項６において、前記オリフィスをおおって、ガスの拡散を補助することができるように前記カバーに対して部分的にまたは完全に取り外しできるように取り付けられたガス不透過性フィルムをさらに備えることを特徴とする。
【００１５】
請求項９に記載の装置は、請求項６において、前記本体の前記側壁は上の区分および下の区分を備えた２段階の区分を含み、さらに環状肩部を備え、前記下の区分は前記環状肩部により前記上の区分から段状になっていることを特徴とする。
【００１６】
請求項１０に記載の細胞培養方法は、下記工程を備えることを特徴とする：
（ａ）組織培養培地を受け入れるための開口部を有する複数のウェルおよび当該プレートの外縁を形成する直立した側壁を備える試験プレート、
前記プレート上に取り外しできるように置かれ、前記ウェルをおおって広がる本質的に平らなカバーを備える蓋、
前記カバーの複数の角部を形成し、かつ前記プレートに関連して離隔して下向きに延びるスカート、
平らなカバーにおける複数のオリフィス、および
前記オリフィスに連結し前記膜をカバーするガス透過性膜
を備える培養容器を用意し、
（ｂ）前記培養容器から前記蓋を取り外し、
（ｃ）前記培養容器の前記ウェル内に、膜を備える細胞挿入部を置き、
（ｄ）前記培養容器内の前記細胞挿入部のそれぞれの膜の上に細胞の層を沈着し、
（ｅ）細胞の層を成長培地で覆い、
（ｆ）前記ウェルをカバーするために前記プレートの上に前記蓋を置き、
（ｇ）前記オリフィスをおおった前記ラベルを完全にまたは部分的に取り外し、再び取り付けることで、前記培養容器の前記蓋におけるオリフィスを通って空気が押し入って到達することができるようにすることにより、細胞挿入部の膜を換気する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明は、インビトロで細胞成長または組織培養するためのアセンブリに関するものである。そのアセンブリは、組織培養挿入部のような挿入部にまたは組織培養培地を受け入れるのに適用した形状のウェルおよび取り外しできる蓋を有する試験プレートを備えたものである。
【００１８】
好適には、試験プレートは、上面、下面、および複数のウェルを備えている。各ウェルは、本質的に試験プレートの上面および下面の間に配置される。
【００１９】
アセンブリは、さらに試験プレートの上面をおおって置くことができる取り外しできる蓋を含んでいる。その蓋は、ウェルの上壁および上壁から下向きに延びた、周縁スカート（peripheral skirt）を含んでいる。その蓋は、ウェルの内部からのサンプルの損失を防ぎ、周囲からアセンブリ内の内容物を保護し、有害な物質または潜在的に有害な物質が含まれていればアセンブリ内の内容物から使用者を保護するのに役立つ。
【００２０】
試験プレートおよびこれと関連する取り外しできる蓋は、異なるサイズおよび形状に形成して異なるサイズおよび形状の細胞培養挿入部を使用するようにしてもよい。プレートの上面をおおって蓋の位置を変える場合に、ウェルの間の相互汚染を減少させるために、取り外しできる蓋は、一つの方向でプレートの上面をおおって置かれるように形成してもよい。プレートおよび取り外しできる蓋は、ウェルおよび細胞培養挿入部が容易に見えるように、光学的に透明なプラスチックから製造されたものが好ましい。
【００２１】
蓋は、プレートのウェルを出入してガスが拡散できるようにするための手段を備えていることが好ましい。プレートのウェルを出入してガスが拡散できるようにする手段には、少なくとも１つの出入口（ポート）があり、さらに出入口はガスが透過できる膜と連結していることが最も望ましい。このガス透過性膜は液体に対して不透過性であることが最も望ましい。最も好適には、蓋は相方のプレート中にあるウェルと同じ数の出入口を備えている。さらに、最も好適には、出入口はウェルに合わせて位置づけるかまたは整列させる。したがって、蓋がプレートをおおって置かれたとき、各ウェルは蓋の上の出入口と連結している。ウェルに合わせて出入口を位置づけると、直接にそのウェルのガス交換が改善されるという利点が得られる。さらに、ガス交換はウェル毎により直接的に調節することができるが、この場合、各ウェルには、使用者によってガス交換について個別的に配慮がなされるようにしてもよい。
【００２２】
さらに、蓋に結びつけられているのは、試験プレートから蓋を取り外すことなしに、ガス透過性膜を選択的に閉塞するための手段である。膜を選択的に閉塞する手段としては、薄い不透過性のフィルムが好適である。薄いフィルムを出入口をおおう蓋の上に取り外しできるように取り付けて、ガス透過性膜を大気にさらすことを制限するようにしてもよい。蓋を試験プレートから持ち上げたりまたは取り外したりする必要がないので、薄い不透過性のフィルムは、ウェル内環境の生物学的な安全性を維持するのを助ける。
【００２３】
最も好適には、選択的に膜を閉塞するための手段は、剥ぎ取り式ガス不透過性ラベル（label ）である。最も好適には、ラベルはプラスチックである。好適なラベルの材料としては、ガスおよび液体に不透過性のポリマー性基質樹脂（polymeric substrate resins）があるが、これらに限定はされない。ラベルは透明でもまたは色を指定してもよい。さらに、ラベルの表面は、追加の情報をラベルの上に手書きできるようにすることもできる。
【００２４】
円形であるラベルを提供することは本発明の範囲内であるけれども、異なる形状のラベルを提供することもできる。
【００２５】
このラベルを用いると使用者は試験プレート中のガス交換を調節できるので、試験プレート中で細胞培養の所望の成長を得るのが容易になるが、同時に試験プレートのウェル内に微生物または他の汚染物が侵入するのを本質的に防ぐ密封系を依然として提供することができる。ラベルは、ガス交換をほぼ最大にする一方で、試験プレートのウェルにおける汚染の可能性を最小にする。さらなる利点としては、蓋を取り外すかまたは部分的に開く必要なしにもっぱら膜を通してガス交換が起こり、それゆえウェル中の滅菌性が失われることおよび漏出を実質的に最小にすることである。
【００２６】
ラベルは、試験プレートの滅菌性を弱めたりまたは漏出を招来するものではない。ラベルは再利用できるので製造かつ経済的に引き合うということは他の利点である。
【００２７】
最も著しいのは、本発明のアセンブリが以降の利点を提供することである。すなわち、（１）通気口がある閉じた環境で滅菌性を維持し、かつガス交換を調節していること、（２）潜在的に有害なサンプルを収容すること、および（３）酵母、バクテリア、および／またはウィルスのような環境内の／外因性の汚染物でアセンブリ内の試料が汚染されることを最小限にすることである。
【００２８】
さらに、本発明が特に有利なのは、無菌およびガス交換が制御された条件において皮膚移植のためのケラチン生成細胞を複数層生成することが望ましい皮膚の培養のように、複数層の細胞を培養する場合である。
【００２９】
さらに、本発明は、細胞挿入部（cell insert ）の膜の表面にある分裂中の細胞に対して直接に酸素を制御して通過することを可能にする。
【００３０】
本発明のアセンブリの原理にしたがって、現在知られておりかつ入手可能であるマルチウェル（multiwell ）組織培養アセンブリに対して著しい改善が提供される。最も重要なのは、本発明は、アセンブリを出入りするガスの拡散を本質的に改善するが、同時にマルチウェルプレートの内容物の滅菌性を維持し、かつウェルと外部の環境との間で充分なガス交換が起こるようにしている。従って、本発明のアセンブリは、細胞培養方法のための条件を最適にするために生物学的に密閉された環境を提供するものであり、その際生物学的な汚染物、ガスおよび／または液体の出入りは、本質的に最小にされる。
【００３１】
添付図面に図示し以下に詳細に説明するのは好適な本発明の実施態様である。本発明は多くの異なる形態の実施態様によって具現化されるけれども、本開示は、本発明の原理の一例であり、本発明を例示した実施態様に限定することを意図するものではない。種々の他の変形は、本発明の範囲および精神からそれることなしに当業者によって理解されおよび容易になされる。本発明の範囲は、添付された請求項およびそれらの均等物によって判断される。
【００３２】
図１および図２に示したように組織培養を成長させるための装置１０は、培養容器プレート２０および蓋５０を備えている。図２に示したように、培養容器プレート２０は、上面２２および下面２４を含んでいる。さらに培養容器プレートは、プレートの上面２２からプレートの下面２４まで延びた側壁２８を各々備えた多数のウェル２６を含んでいる。各ウェルは、上部３０および底部３６を備えている。上部３０は、開放端３２を備えており、それは閉塞端３８を備えた底部３６に向かって延びている。
【００３３】
６個、１２個、２４個、４８個、および９６個のウェルプレートは一般に知られており、かつ入手可能であるけれども、プレート２０におけるウェル２６の数はいくつでもよい。図１では、単に例示的な目的のために６個のウェルを有するプレートが例示されている。最も標準的なマルチウェルプレートは、使用される個々のウェルを明らかに同定できるようにするために直交した列と行に配置されたウェルを有する。もちろん、本発明により、いかなるウェルの配置も考えられるので、プレート２０におけるウェルの配置は、本質的に本発明を限定するものではない。
【００３４】
図に例示したようにプレート２０は、典型的には、透明であって、かつ例えば、ポリビニルクロライドまたはポリスチレンから成る成形品でもよい。
【００３５】
ウェルを囲み、プレート２０の外側の縁取り（border）を形成しているのが側壁４０である。本発明の実施態様において、プレート２０は６個の側壁を有する。組織培養プレートが矩形または四辺形の形であることは周知であるが、本発明の目的のためには、プレートは任意の実用的な形状に作製することができる。
【００３６】
プレートの側壁４０の内側に、かつプレート２０の上の区分の周りに設けられているのは、埋め込み式の棚（recessed ledge）２１であり、これは図１および図２に関連した図３および図４でより明らかに分かる。棚２１は、プレート２０の上面のウェルを囲んで縁取りを形成し、さらにそこで側壁４０は棚の上に高くした位置まで伸び、それによって棚の周辺にリム（rim ）を形成している。
【００３７】
側壁４０は、上の区分４２および下の区分４６を備えた２段階の区分から成る。下の区分４６は、上と下の区分の間の環状肩部４４によって上の区分４２から段状になったものである。それ故、上の区分４２は、上面２２から環状肩部４４まで延びており、下の区分４６は、環状肩部４４から下面２４の底面４８まで延びている。
【００３８】
本発明のマルチウェル組織培養アセンブリが使用中のときは、下の区分４６は、プレート２０に対して環状の基板として働く。
【００３９】
蓋５０は独立していて、プレートのウェルの全てをカバーする取り外しできる部材である。図面の全てに蓋５０が例示されているけれども、蓋５０の詳細は、図２および図３に最もよく例示されている。蓋５０は、プレートのウェルの全てをおおって広がるのに充分に大きい、本質的に平らなカバー５２を有している。平らなカバー５２は、上面５４および底面５６を有する。カバー５２の形状は、プレート２０の形状に合致する。最も好適なのは、図１に示したように、蓋５０は、使用者がプレートをおおった蓋を再度置こうとした場合に、ウェルの間の相互汚染を減少させるために一つの方向でプレートの上面をおおって置かれるように形成することである。
【００４０】
カバー５２の周りに延びた部分は、垂れ下がったスカート（skirt ）５８であり、これは蓋５０の周りに縁取りを形成する。スカート５８は、内壁面６０および外壁面６２、ならびに各々がカバーから底止め面６４まで下向きに延びている６個の側面を有している。内部に向かって、スカート５８から配列され、かつ平らなカバーの底面５６から下向きに延びているのがリブ（rib ）６６である。かかるリブは、本質的にスカート５８の各々の側面に対して平行に横たわっており、プレート中の埋め込み式の棚２１に下向きに付属するようにカバーの上に位置する。
【００４１】
図１から図３に示したように、多数のオリフィス７２をカバー５２上に設置する。ガス透過性であり、液体不透過性である膜７４は、図１から図３に示したように各オリフィスと連結している。ガス透過性膜の材料は、試験プレートに酸素および二酸化炭素のようなガスを自由に通過するけれども、バクテリアおよび真菌のような微生物の通過を防ぐ限りにおいて、任意の適当なガス透過性材料から作成することができる。
【００４２】
図４に示したように、蓋５０がプレート２０をおおって置かれるとき、スカート５８はプレートの環状肩部４４に向かって延びており、それによって環状肩部４４と底止め面６４のその間に空間６８が残る。それ故、図４に示したように、スカート５８の内壁面６０とプレートの側壁の上の区分４２との間に第２の空間７０がある。
【００４３】
図５に示したように、本発明の他の実施態様としては、図１の構成要素と本質的に同一である多くの構成要素を含んでいる。従って、同様の機能を果たす同様の構成要素は、図５においてそれらの同様の構成要素を同定するのに接尾辞“ａ”を用いることを除いては、図１におけるそれらの構成要素と全く同じに番号をつける。
【００４４】
図５に示されたように、任意的な剥ぎ取り式の薄いフィルムのラベル（以下、薄膜ラベルともいう）７６は、カバー５２ａに取り外しできるように取り付けられてオリフィス７２ａの膜７４ａを選択的に閉塞する。フィルムは、特定な培養の要求にしたがって、完全にまたは部分的に取り外すか、あるいは置いたままにしておくことができる。
【００４５】
慣用的な方法を用いて、カバーに対して剥ぎ取り式の薄膜ラベルを適用する。これらの方法は、感圧接着材料のような接着材料を含んでおり、そこで薄膜ラベルは、必要に応じてカバーから部分的にまたは完全に取り外すことが容易にでき、そして必要に応じて適用することができる。薄膜ラベル材料はポリエチレンまたはポリエチレンテレフタレートから作成してもよく、接着材料はアクリル系接着剤を含んでなるものであってもよい。
【００４６】
図５に示したように、任意の剥ぎ取り式薄膜ラベル７６は、円形であり、かつ使用しやすいようにつまみ７７を有する。円形の剥ぎ取り式薄膜を提供することは、本発明の範囲内であるけれども、異なる形状および寸法にしてもよい。
【００４７】
図６に示したように本発明の他の実施態様としては、図２の構成要素と本質的に同一である多くの構成要素を含んでいる。従って、同様の機能を果たす同様の構成要素は、図６においてそれらの同様の構成要素を同定するのに接尾辞“ｂ”を用いることを除いては、図２におけるそれらの構成要素と全く同じ番号をつける。
【００４８】
図６に示すようにラベル７９は、アセンブリ１０ｂに使用できるラベルの他の実施態様である。図６に示したように本発明のこの実施態様は、蓋５０ｂの平面的な被覆表面の全体をカバーするラベル７９である。
【００４９】
図７に示したように本発明の他の実施態様としては、図２の構成要素と本質的に同一である多くの構成要素を含んでいる。従って、同様の機能を果たす同様の構成要素は、図７においてそれらの同様の構成要素を同定するのに接尾辞“ｃ”を用いることを除いては、図２におけるそれらの構成要素と全く同じ番号をつける。
【００５０】
図７に示したように蓋５０ｃは、アセンブリ１０ｃに使用することができる蓋の他の実施態様である。図７に示したように本発明の他の実施態様は、平らなカバーに設置された２つのオリフィス９０であり、各々は液体不透過性フィルム９２を有し、これらは連結している。図７では２つのオリフィスのみを示しているが、平らなカバーに２つ以上のオリフィスを有することも十分に本発明の範囲内である。
【００５１】
使用の際には、本発明は以下のように細胞の培養に使用することができる。すなわち、
ａ．培養容器から蓋を取り除き、
ｂ．培養容器内で細胞挿入部の膜の上に細胞の層を沈着させ、
ｃ．細胞の層を成長培地で覆い、
ｄ．プレートをおおって蓋を置き、そして
ｅ．オリフィスをおおったラベルを取り外したりまたは部分的に取り外したりおよび再び取り付けることによって、培養容器の蓋のオリフィスを通って空気が押し入って到達することができるようにして各細胞挿入部の膜を直接的に換気する。
【００５２】
当業者に理解されるように、本発明の培養容器アセンブリは、単純な成形できる部品から作製することができ、それは、例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレートおよびポリプロピレンを含む種々の材料から大量生産が可能である。さらに、当業者に理解されるように、材料は、成長した培養細胞を引き続き検査するのに、使用しやすいように僅かな弾性度を与える物質を選ぶことが望ましい。
【００５３】
【発明の効果】
以上により、オリフィスとカバー上のガス透過性膜を連結させることで蓋を取り外すことなく直接的に膜をガス交換することができ、ガス透過性膜をおおったカバーに完全にまたは部分的に取り外しできるようにガス不透過性フィルムを取り付けることでガス透過性膜を選択的に閉塞することができる。このことにより、培養容器アセンブリを出入りするガスの拡散を本質的に改善し、同時にマルチウェルプレートの内容物の滅菌性を維持し、かつウェルと外部の環境との間で充分なガス交換が起こるようにすることができる。また、生物学的な汚染物、ガスおよび／または液体の出入りを最低限にすることができ、細胞培養の条件に最適な生物学的に密閉された環境を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のアセンブリの透視図である。
【図２】蓋を取り外した本発明のアセンブリの透視図である。
【図３】図１の線３−３に沿って分けたアセンブリの断面図である。
【図４】図３のアセンブリの部分断面図を拡大した図である。
【図５】各オリフィス（orifice ）をカバーするラベルを有する本発明の他の実施態様に関する透視図である。
【図６】全ての蓋をカバーするラベルを有する本発明の他の実施態様に関する透視図である。
【図７】蓋に１以上のオリフィスを示した本発明の他の実施態様に関する透視図である。
【符号の説明】
１０、１０ａ、１０ｂ 培養容器アセンブリ、装置
２０ 培養容器プレート
２１ 埋め込み式棚
２２ 上面
２４ 下面
２６ ウェル
２８ 側壁
３０ 上部
３２ 開放端、開口部
３６ 底部
３８ 閉塞端
４０ 側壁
４２ 上の区分
４４ 環状肩部
４６ 下の区分
４８ 底面
５０、５０ｂ 蓋
５２ カバー
５４ 上面
５６ 底面
５８ スカート
６０ 内壁面
６２ 外壁面
６４ 底止め面
６６ リブ
６８ 空間
７０ 第２の空間
７２、７２ａ オリフィス、出入口（ポート）
７４、７４ａ 膜
７６ 剥ぎ取り式薄膜ラベル
７７ つまみ
７９ ラベル
９０ オリフィス
９２ 液体不透過性フィルム
【発明の属する技術分野】
本発明はインビトロ（in vitro）で細胞成長または組織培養するのための装置および方法に関する。より詳述すると、本発明はアセンブリを出入りするガスの拡散速度を変化させるための手段、およびそのアセンブリ内の細胞または組織培養に関して生物学的汚染を実質的に最低限にするための手段を有する培養容器アセンブリ、これに用いる蓋およびこれを用いた細胞培養方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
培養容器は、米国特許第4,495,289 号、第5,026 ，649 号、第5,358,871 号および第5,366,893 号ならびにヨーロッパ特許出願公開第0 483 620 A2号および英国特許出願公開第GB 2 268 187 A号に記載されている。培養容器は、ウェル（wells ）を備えており、それらのウェルは一般的に円形の形状をしているとともに細胞の付着、成長、および分化がその上で起こる膜を有する細胞培養挿入部（cell culture insert ）をそれらのウェル内に導入できるサイズを有する。ウェルを含んだ培養容器は、典型的には矩形であり、標準の分析装置に適合するように標準サイズを有する。培養容器に使用される細胞培養挿入部は、米国特許第4,871,674 号、第5,026,649 号および第5,366,893 号に記載されている（これは引用することで本明細書の一部とする）。
【０００３】
細胞の培養は、細胞損傷が生じることなく細胞に充分に酸素を供給する能力に依存する。細胞呼吸用の酸素は、細胞の上にある上部空間中の大気から液体培養培地を通って供給される。
【０００４】
例えば、スパージング、表面のエアレーション、培地灌流といった培養の通気は、酸素の利用性を増加することができる。しかしながら、かかる方法では細胞損傷が起こる可能性がある。シリコーンゴム製の管を用いてウェルと大気の間の配管（tubing）を行うことにより細胞培養におけるガス交換を改善することがなされているが、かかる方法は不便であり、細胞懸濁液が汚染されることがある。
【０００５】
多数の培養容器が市販され、特許公報に記載されているけれども、培養容器アセンブリを出入するガスの拡散速度を変化させるための手段を提供するにもかかわらず、依然として密閉系を提供し、それにより容器に対する生物学的汚染物の出入口が実質的に最低限にされるような培養容器は入手可能ではないと思われる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、培養容器アセンブリを出入りするガスの拡散速度を変化させるための手段および生物学的汚染物の出入りを実質的に最低限にするための手段をを有する培養容器アセンブリ、これに用いる蓋およびこれを用いた細胞培養方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載のアセンブリは、組織培養培地を受け入れるための開口部を有する複数のウェルおよび前記プレートの外縁を形成する直立した側壁を備える試験プレート、
前記プレート上に置かれる取り外しできる蓋であって、前記ウェルをおおって広がる、上面および下面を有する、本質的に平らなカバーと、前記カバーを包囲し、複数の角部を形成し、かつ下向きに延びて、内面および外面を有する側壁を形成するスカートを備える蓋、
前記平らなカバーに設けられたオリフィス、および
ガス透過性膜を前記オリフィスに連結したガス透過性膜
を備えることを特徴とする。
【０００８】
請求項２に記載のアセンブリは、請求項１において、前記オリフィスおよび前記ガス透過性膜をおおって前記アセンブリを出入りするガスの拡散を補助できるように前記カバーに完全にまたは部分的に取り外しできるように取り付けられたガス不透過性フィルムをさらに備えることを特徴とする。
【０００９】
請求項３に記載のアセンブリは、請求項１において、さらに前記試験プレートは前記プレートの前記側壁から内方に離隔しかつ前記側壁と前記ウェルの間で前記プレートの周りに延びている棚を備えており、前記側壁は棚の上方位置まで延び、それによって前記棚の周辺にリムを形成していることを特徴とする。
【００１０】
請求項４に記載の組織培養プレートと関連して用いる蓋は、上面と下面を備えている本質的に平らなカバー、
前記カバー上に複数の角部を形成し、かつ下向きに延びて、側壁を形成する前記カバーの周囲のスカート、
ガス透過性膜を備えた前記カバーに設けたオリフィス、および
前記オリフィスと前記ガス透過性膜をおおった前記カバーに完全にまたは部分的に取り外しできるように取り付けたガス不透過性フィルム
を備えていることを特徴とする。
【００１１】
請求項５に記載の蓋は、請求項４において、さらに前記スカートから内方に離隔しかつ前記カバーの前記下面から下向きに延びたフランジを備えることを特徴とする。
【００１２】
請求項６に記載のインビトロにおける細胞成長または組織培養のための装置は、本体と取り外しできる蓋を備えた装置であって、
前記本体は上面、下面、本質的に前記上面および下面の間に配置された複数のウェル、ならびに前記本体の外縁を形成する直立した側壁を備え、
前記取り外しできる蓋は上壁および前記上壁から延びた周囲のスカートを備え、前記装置を出入するガスの拡散を許容する手段を備えることを特徴とする。
【００１３】
請求項７に記載の装置は、請求項６において、装置を出入りするガスの拡散を許容する前記手段が、オリフィスおよび前記オリフィスと連結したガス透過性膜であることを特徴とする。
【００１４】
請求項８に記載の装置は、請求項６において、前記オリフィスをおおって、ガスの拡散を補助することができるように前記カバーに対して部分的にまたは完全に取り外しできるように取り付けられたガス不透過性フィルムをさらに備えることを特徴とする。
【００１５】
請求項９に記載の装置は、請求項６において、前記本体の前記側壁は上の区分および下の区分を備えた２段階の区分を含み、さらに環状肩部を備え、前記下の区分は前記環状肩部により前記上の区分から段状になっていることを特徴とする。
【００１６】
請求項１０に記載の細胞培養方法は、下記工程を備えることを特徴とする：
（ａ）組織培養培地を受け入れるための開口部を有する複数のウェルおよび当該プレートの外縁を形成する直立した側壁を備える試験プレート、
前記プレート上に取り外しできるように置かれ、前記ウェルをおおって広がる本質的に平らなカバーを備える蓋、
前記カバーの複数の角部を形成し、かつ前記プレートに関連して離隔して下向きに延びるスカート、
平らなカバーにおける複数のオリフィス、および
前記オリフィスに連結し前記膜をカバーするガス透過性膜
を備える培養容器を用意し、
（ｂ）前記培養容器から前記蓋を取り外し、
（ｃ）前記培養容器の前記ウェル内に、膜を備える細胞挿入部を置き、
（ｄ）前記培養容器内の前記細胞挿入部のそれぞれの膜の上に細胞の層を沈着し、
（ｅ）細胞の層を成長培地で覆い、
（ｆ）前記ウェルをカバーするために前記プレートの上に前記蓋を置き、
（ｇ）前記オリフィスをおおった前記ラベルを完全にまたは部分的に取り外し、再び取り付けることで、前記培養容器の前記蓋におけるオリフィスを通って空気が押し入って到達することができるようにすることにより、細胞挿入部の膜を換気する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明は、インビトロで細胞成長または組織培養するためのアセンブリに関するものである。そのアセンブリは、組織培養挿入部のような挿入部にまたは組織培養培地を受け入れるのに適用した形状のウェルおよび取り外しできる蓋を有する試験プレートを備えたものである。
【００１８】
好適には、試験プレートは、上面、下面、および複数のウェルを備えている。各ウェルは、本質的に試験プレートの上面および下面の間に配置される。
【００１９】
アセンブリは、さらに試験プレートの上面をおおって置くことができる取り外しできる蓋を含んでいる。その蓋は、ウェルの上壁および上壁から下向きに延びた、周縁スカート（peripheral skirt）を含んでいる。その蓋は、ウェルの内部からのサンプルの損失を防ぎ、周囲からアセンブリ内の内容物を保護し、有害な物質または潜在的に有害な物質が含まれていればアセンブリ内の内容物から使用者を保護するのに役立つ。
【００２０】
試験プレートおよびこれと関連する取り外しできる蓋は、異なるサイズおよび形状に形成して異なるサイズおよび形状の細胞培養挿入部を使用するようにしてもよい。プレートの上面をおおって蓋の位置を変える場合に、ウェルの間の相互汚染を減少させるために、取り外しできる蓋は、一つの方向でプレートの上面をおおって置かれるように形成してもよい。プレートおよび取り外しできる蓋は、ウェルおよび細胞培養挿入部が容易に見えるように、光学的に透明なプラスチックから製造されたものが好ましい。
【００２１】
蓋は、プレートのウェルを出入してガスが拡散できるようにするための手段を備えていることが好ましい。プレートのウェルを出入してガスが拡散できるようにする手段には、少なくとも１つの出入口（ポート）があり、さらに出入口はガスが透過できる膜と連結していることが最も望ましい。このガス透過性膜は液体に対して不透過性であることが最も望ましい。最も好適には、蓋は相方のプレート中にあるウェルと同じ数の出入口を備えている。さらに、最も好適には、出入口はウェルに合わせて位置づけるかまたは整列させる。したがって、蓋がプレートをおおって置かれたとき、各ウェルは蓋の上の出入口と連結している。ウェルに合わせて出入口を位置づけると、直接にそのウェルのガス交換が改善されるという利点が得られる。さらに、ガス交換はウェル毎により直接的に調節することができるが、この場合、各ウェルには、使用者によってガス交換について個別的に配慮がなされるようにしてもよい。
【００２２】
さらに、蓋に結びつけられているのは、試験プレートから蓋を取り外すことなしに、ガス透過性膜を選択的に閉塞するための手段である。膜を選択的に閉塞する手段としては、薄い不透過性のフィルムが好適である。薄いフィルムを出入口をおおう蓋の上に取り外しできるように取り付けて、ガス透過性膜を大気にさらすことを制限するようにしてもよい。蓋を試験プレートから持ち上げたりまたは取り外したりする必要がないので、薄い不透過性のフィルムは、ウェル内環境の生物学的な安全性を維持するのを助ける。
【００２３】
最も好適には、選択的に膜を閉塞するための手段は、剥ぎ取り式ガス不透過性ラベル（label ）である。最も好適には、ラベルはプラスチックである。好適なラベルの材料としては、ガスおよび液体に不透過性のポリマー性基質樹脂（polymeric substrate resins）があるが、これらに限定はされない。ラベルは透明でもまたは色を指定してもよい。さらに、ラベルの表面は、追加の情報をラベルの上に手書きできるようにすることもできる。
【００２４】
円形であるラベルを提供することは本発明の範囲内であるけれども、異なる形状のラベルを提供することもできる。
【００２５】
このラベルを用いると使用者は試験プレート中のガス交換を調節できるので、試験プレート中で細胞培養の所望の成長を得るのが容易になるが、同時に試験プレートのウェル内に微生物または他の汚染物が侵入するのを本質的に防ぐ密封系を依然として提供することができる。ラベルは、ガス交換をほぼ最大にする一方で、試験プレートのウェルにおける汚染の可能性を最小にする。さらなる利点としては、蓋を取り外すかまたは部分的に開く必要なしにもっぱら膜を通してガス交換が起こり、それゆえウェル中の滅菌性が失われることおよび漏出を実質的に最小にすることである。
【００２６】
ラベルは、試験プレートの滅菌性を弱めたりまたは漏出を招来するものではない。ラベルは再利用できるので製造かつ経済的に引き合うということは他の利点である。
【００２７】
最も著しいのは、本発明のアセンブリが以降の利点を提供することである。すなわち、（１）通気口がある閉じた環境で滅菌性を維持し、かつガス交換を調節していること、（２）潜在的に有害なサンプルを収容すること、および（３）酵母、バクテリア、および／またはウィルスのような環境内の／外因性の汚染物でアセンブリ内の試料が汚染されることを最小限にすることである。
【００２８】
さらに、本発明が特に有利なのは、無菌およびガス交換が制御された条件において皮膚移植のためのケラチン生成細胞を複数層生成することが望ましい皮膚の培養のように、複数層の細胞を培養する場合である。
【００２９】
さらに、本発明は、細胞挿入部（cell insert ）の膜の表面にある分裂中の細胞に対して直接に酸素を制御して通過することを可能にする。
【００３０】
本発明のアセンブリの原理にしたがって、現在知られておりかつ入手可能であるマルチウェル（multiwell ）組織培養アセンブリに対して著しい改善が提供される。最も重要なのは、本発明は、アセンブリを出入りするガスの拡散を本質的に改善するが、同時にマルチウェルプレートの内容物の滅菌性を維持し、かつウェルと外部の環境との間で充分なガス交換が起こるようにしている。従って、本発明のアセンブリは、細胞培養方法のための条件を最適にするために生物学的に密閉された環境を提供するものであり、その際生物学的な汚染物、ガスおよび／または液体の出入りは、本質的に最小にされる。
【００３１】
添付図面に図示し以下に詳細に説明するのは好適な本発明の実施態様である。本発明は多くの異なる形態の実施態様によって具現化されるけれども、本開示は、本発明の原理の一例であり、本発明を例示した実施態様に限定することを意図するものではない。種々の他の変形は、本発明の範囲および精神からそれることなしに当業者によって理解されおよび容易になされる。本発明の範囲は、添付された請求項およびそれらの均等物によって判断される。
【００３２】
図１および図２に示したように組織培養を成長させるための装置１０は、培養容器プレート２０および蓋５０を備えている。図２に示したように、培養容器プレート２０は、上面２２および下面２４を含んでいる。さらに培養容器プレートは、プレートの上面２２からプレートの下面２４まで延びた側壁２８を各々備えた多数のウェル２６を含んでいる。各ウェルは、上部３０および底部３６を備えている。上部３０は、開放端３２を備えており、それは閉塞端３８を備えた底部３６に向かって延びている。
【００３３】
６個、１２個、２４個、４８個、および９６個のウェルプレートは一般に知られており、かつ入手可能であるけれども、プレート２０におけるウェル２６の数はいくつでもよい。図１では、単に例示的な目的のために６個のウェルを有するプレートが例示されている。最も標準的なマルチウェルプレートは、使用される個々のウェルを明らかに同定できるようにするために直交した列と行に配置されたウェルを有する。もちろん、本発明により、いかなるウェルの配置も考えられるので、プレート２０におけるウェルの配置は、本質的に本発明を限定するものではない。
【００３４】
図に例示したようにプレート２０は、典型的には、透明であって、かつ例えば、ポリビニルクロライドまたはポリスチレンから成る成形品でもよい。
【００３５】
ウェルを囲み、プレート２０の外側の縁取り（border）を形成しているのが側壁４０である。本発明の実施態様において、プレート２０は６個の側壁を有する。組織培養プレートが矩形または四辺形の形であることは周知であるが、本発明の目的のためには、プレートは任意の実用的な形状に作製することができる。
【００３６】
プレートの側壁４０の内側に、かつプレート２０の上の区分の周りに設けられているのは、埋め込み式の棚（recessed ledge）２１であり、これは図１および図２に関連した図３および図４でより明らかに分かる。棚２１は、プレート２０の上面のウェルを囲んで縁取りを形成し、さらにそこで側壁４０は棚の上に高くした位置まで伸び、それによって棚の周辺にリム（rim ）を形成している。
【００３７】
側壁４０は、上の区分４２および下の区分４６を備えた２段階の区分から成る。下の区分４６は、上と下の区分の間の環状肩部４４によって上の区分４２から段状になったものである。それ故、上の区分４２は、上面２２から環状肩部４４まで延びており、下の区分４６は、環状肩部４４から下面２４の底面４８まで延びている。
【００３８】
本発明のマルチウェル組織培養アセンブリが使用中のときは、下の区分４６は、プレート２０に対して環状の基板として働く。
【００３９】
蓋５０は独立していて、プレートのウェルの全てをカバーする取り外しできる部材である。図面の全てに蓋５０が例示されているけれども、蓋５０の詳細は、図２および図３に最もよく例示されている。蓋５０は、プレートのウェルの全てをおおって広がるのに充分に大きい、本質的に平らなカバー５２を有している。平らなカバー５２は、上面５４および底面５６を有する。カバー５２の形状は、プレート２０の形状に合致する。最も好適なのは、図１に示したように、蓋５０は、使用者がプレートをおおった蓋を再度置こうとした場合に、ウェルの間の相互汚染を減少させるために一つの方向でプレートの上面をおおって置かれるように形成することである。
【００４０】
カバー５２の周りに延びた部分は、垂れ下がったスカート（skirt ）５８であり、これは蓋５０の周りに縁取りを形成する。スカート５８は、内壁面６０および外壁面６２、ならびに各々がカバーから底止め面６４まで下向きに延びている６個の側面を有している。内部に向かって、スカート５８から配列され、かつ平らなカバーの底面５６から下向きに延びているのがリブ（rib ）６６である。かかるリブは、本質的にスカート５８の各々の側面に対して平行に横たわっており、プレート中の埋め込み式の棚２１に下向きに付属するようにカバーの上に位置する。
【００４１】
図１から図３に示したように、多数のオリフィス７２をカバー５２上に設置する。ガス透過性であり、液体不透過性である膜７４は、図１から図３に示したように各オリフィスと連結している。ガス透過性膜の材料は、試験プレートに酸素および二酸化炭素のようなガスを自由に通過するけれども、バクテリアおよび真菌のような微生物の通過を防ぐ限りにおいて、任意の適当なガス透過性材料から作成することができる。
【００４２】
図４に示したように、蓋５０がプレート２０をおおって置かれるとき、スカート５８はプレートの環状肩部４４に向かって延びており、それによって環状肩部４４と底止め面６４のその間に空間６８が残る。それ故、図４に示したように、スカート５８の内壁面６０とプレートの側壁の上の区分４２との間に第２の空間７０がある。
【００４３】
図５に示したように、本発明の他の実施態様としては、図１の構成要素と本質的に同一である多くの構成要素を含んでいる。従って、同様の機能を果たす同様の構成要素は、図５においてそれらの同様の構成要素を同定するのに接尾辞“ａ”を用いることを除いては、図１におけるそれらの構成要素と全く同じに番号をつける。
【００４４】
図５に示されたように、任意的な剥ぎ取り式の薄いフィルムのラベル（以下、薄膜ラベルともいう）７６は、カバー５２ａに取り外しできるように取り付けられてオリフィス７２ａの膜７４ａを選択的に閉塞する。フィルムは、特定な培養の要求にしたがって、完全にまたは部分的に取り外すか、あるいは置いたままにしておくことができる。
【００４５】
慣用的な方法を用いて、カバーに対して剥ぎ取り式の薄膜ラベルを適用する。これらの方法は、感圧接着材料のような接着材料を含んでおり、そこで薄膜ラベルは、必要に応じてカバーから部分的にまたは完全に取り外すことが容易にでき、そして必要に応じて適用することができる。薄膜ラベル材料はポリエチレンまたはポリエチレンテレフタレートから作成してもよく、接着材料はアクリル系接着剤を含んでなるものであってもよい。
【００４６】
図５に示したように、任意の剥ぎ取り式薄膜ラベル７６は、円形であり、かつ使用しやすいようにつまみ７７を有する。円形の剥ぎ取り式薄膜を提供することは、本発明の範囲内であるけれども、異なる形状および寸法にしてもよい。
【００４７】
図６に示したように本発明の他の実施態様としては、図２の構成要素と本質的に同一である多くの構成要素を含んでいる。従って、同様の機能を果たす同様の構成要素は、図６においてそれらの同様の構成要素を同定するのに接尾辞“ｂ”を用いることを除いては、図２におけるそれらの構成要素と全く同じ番号をつける。
【００４８】
図６に示すようにラベル７９は、アセンブリ１０ｂに使用できるラベルの他の実施態様である。図６に示したように本発明のこの実施態様は、蓋５０ｂの平面的な被覆表面の全体をカバーするラベル７９である。
【００４９】
図７に示したように本発明の他の実施態様としては、図２の構成要素と本質的に同一である多くの構成要素を含んでいる。従って、同様の機能を果たす同様の構成要素は、図７においてそれらの同様の構成要素を同定するのに接尾辞“ｃ”を用いることを除いては、図２におけるそれらの構成要素と全く同じ番号をつける。
【００５０】
図７に示したように蓋５０ｃは、アセンブリ１０ｃに使用することができる蓋の他の実施態様である。図７に示したように本発明の他の実施態様は、平らなカバーに設置された２つのオリフィス９０であり、各々は液体不透過性フィルム９２を有し、これらは連結している。図７では２つのオリフィスのみを示しているが、平らなカバーに２つ以上のオリフィスを有することも十分に本発明の範囲内である。
【００５１】
使用の際には、本発明は以下のように細胞の培養に使用することができる。すなわち、
ａ．培養容器から蓋を取り除き、
ｂ．培養容器内で細胞挿入部の膜の上に細胞の層を沈着させ、
ｃ．細胞の層を成長培地で覆い、
ｄ．プレートをおおって蓋を置き、そして
ｅ．オリフィスをおおったラベルを取り外したりまたは部分的に取り外したりおよび再び取り付けることによって、培養容器の蓋のオリフィスを通って空気が押し入って到達することができるようにして各細胞挿入部の膜を直接的に換気する。
【００５２】
当業者に理解されるように、本発明の培養容器アセンブリは、単純な成形できる部品から作製することができ、それは、例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレートおよびポリプロピレンを含む種々の材料から大量生産が可能である。さらに、当業者に理解されるように、材料は、成長した培養細胞を引き続き検査するのに、使用しやすいように僅かな弾性度を与える物質を選ぶことが望ましい。
【００５３】
【発明の効果】
以上により、オリフィスとカバー上のガス透過性膜を連結させることで蓋を取り外すことなく直接的に膜をガス交換することができ、ガス透過性膜をおおったカバーに完全にまたは部分的に取り外しできるようにガス不透過性フィルムを取り付けることでガス透過性膜を選択的に閉塞することができる。このことにより、培養容器アセンブリを出入りするガスの拡散を本質的に改善し、同時にマルチウェルプレートの内容物の滅菌性を維持し、かつウェルと外部の環境との間で充分なガス交換が起こるようにすることができる。また、生物学的な汚染物、ガスおよび／または液体の出入りを最低限にすることができ、細胞培養の条件に最適な生物学的に密閉された環境を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のアセンブリの透視図である。
【図２】蓋を取り外した本発明のアセンブリの透視図である。
【図３】図１の線３−３に沿って分けたアセンブリの断面図である。
【図４】図３のアセンブリの部分断面図を拡大した図である。
【図５】各オリフィス（orifice ）をカバーするラベルを有する本発明の他の実施態様に関する透視図である。
【図６】全ての蓋をカバーするラベルを有する本発明の他の実施態様に関する透視図である。
【図７】蓋に１以上のオリフィスを示した本発明の他の実施態様に関する透視図である。
【符号の説明】
１０、１０ａ、１０ｂ 培養容器アセンブリ、装置
２０ 培養容器プレート
２１ 埋め込み式棚
２２ 上面
２４ 下面
２６ ウェル
２８ 側壁
３０ 上部
３２ 開放端、開口部
３６ 底部
３８ 閉塞端
４０ 側壁
４２ 上の区分
４４ 環状肩部
４６ 下の区分
４８ 底面
５０、５０ｂ 蓋
５２ カバー
５４ 上面
５６ 底面
５８ スカート
６０ 内壁面
６２ 外壁面
６４ 底止め面
６６ リブ
６８ 空間
７０ 第２の空間
７２、７２ａ オリフィス、出入口（ポート）
７４、７４ａ 膜
７６ 剥ぎ取り式薄膜ラベル
７７ つまみ
７９ ラベル
９０ オリフィス
９２ 液体不透過性フィルム
Claims (7)
- 組織培養培地を受け入れるための開口部を有する複数のウェルおよび前記プレートの外縁を形成する直立した側壁を備える試験プレート、
前記プレート上に置かれる取り外しできる蓋であって、前記ウェルをおおって広がる、上面および下面を有する、本質的に平らなカバーと、前記カバーを包囲し、複数の角部を形成し、かつ下向きに延びて、内面および外面を有する側壁を形成するスカートを備える蓋、
前記平らなカバーに設けられたオリフィス、
ガス透過性膜を前記オリフィスに連結したガス透過性膜、および
前記オリフィスおよび前記ガス透過性膜をおおって、前記アセンブリを出入りするガスの拡散を補助できるように前記カバーに完全にまたは部分的に取り外しできるように取り付けられたガス不透過性フィルム
を備えることを特徴とするアセンブリ。 - さらに前記試験プレートは前記プレートの前記側壁から内方に離隔しかつ前記側壁と前記ウェルの間で前記プレートの周りに延びている棚を備えており、前記側壁は棚の上方位置まで延び、それによって前記棚の周辺にリムを形成していることを特徴とする請求項１に記載のアセンブリ。
- 上面と下面を備えている本質的に平らなカバー、
前記カバー上に複数の角部を形成し、かつ下向きに延びて、側壁を形成する前記カバーの周囲のスカート、
ガス透過性膜を備えた前記カバーに設けたオリフィス、および
前記オリフィスと前記ガス透過性膜をおおった前記カバーに完全にまたは部分的に取り外しできるように取り付けたガス不透過性フィルム
を備えていることを特徴とする組織培養プレートと関連して用いる蓋。 - さらに前記スカートから内方に離隔しかつ前記カバーの前記下面から下向きに延びたフランジを備えることを特徴とする請求項４に記載の蓋。
- 本体と取り外しできる蓋を備えた装置であって、
前記本体は上面、下面、本質的に前記上面および下面の間に配置された複数のウェル、ならびに前記本体の外縁を形成する直立した側壁を備え、
前記取り外しできる蓋は上壁および前記上壁から延びた周囲のスカートを備え、
オリフィスおよび前記オリフィスと連結したガス透過性膜である、前記装置を出入するガスの拡散を許容する手段を備え、
前記オリフィスをおおって、ガスの拡散を補助することができるように前記カバーに対して部分的にまたは完全に取り外しできるように取り付けられたガス不透過性フィルムを備えることを特徴とするインビトロにおける細胞成長または組織培養のための装置。 - 前記本体の前記側壁は上の区分および下の区分を備えた２段階の区分を含み、さらに環状肩部を備え、前記下の区分は前記環状肩部により前記上の区分から段状になっていることを特徴とする請求項５に記載の装置。
- 下記工程を備えることを特徴とする細胞培養方法：
（ａ）組織培養培地を受け入れるための開口部を有する複数のウェルおよび当該プレートの外縁を形成する直立した側壁を備える試験プレート、
前記プレート上に取り外しできるように置かれ、前記ウェルをおおって広がる本質的に平らなカバーを備える蓋、
前記カバーの複数の角部を形成し、かつ前記プレートに関連して離隔して下向きに延びるスカート、
平らなカバーにおける複数のオリフィス、および
前記オリフィスに連結し前記膜をカバーするガス透過性膜
を備える培養容器を用意し、
（ｂ）前記培養容器から前記蓋を取り外し、
（ｃ）前記培養容器の前記ウェル内に、膜を備える細胞挿入部を置き、
（ｄ）前記培養容器内の前記細胞挿入部のそれぞれの膜の上に細胞の層を沈着し、
（ｅ）細胞の層を成長培地で覆い、
（ｆ）前記ウェルをカバーするために前記プレートの上に前記蓋を置き、
（ｇ）前記オリフィスをおおった前記ラベルを完全にまたは部分的に取り外し、再び取り付けることで、前記培養容器の前記蓋におけるオリフィスを通って空気を進入させることにより、細胞挿入部の膜を換気する。
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