JP4095446B2 - 酵素ミエロペルオキシダーゼの阻害剤を検出するための検定 - Google Patents
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Description
載された[Grisham外、Methods in Enzymology、第186巻、編者Packer外、サンディエゴ:Academic Press、第729−742ページ(1990)]。しかしながら、他の内因性組織成分によって影響されない、より信頼性のある炎症性組織のPMN含量を定量する分析法が必要とされている。
ミエロペルオキシダーゼの可能性ある阻害剤の存在においてミエロペルオキシダーゼを過酸化水素および塩化物源と反応させて、次亜塩素酸を発生させること;
いずれの形成される次亜塩素酸をも適当なアミンと反応させて、相当するクロラミンを形成させること;
場合によりいずれの未反応過酸化水素をも除去すること;
いずれの形成されるクロラミンをもヨウ化物の存在において適当な検出体分子と反応させて、酸化された検出体分子を形成させること;
適当な波長での吸光度または蛍光を測定することによって、形成される酸化された検出体分子の量を決定すること;
形成される酸化された検出体分子の量を減少させる化合物をミエロペルオキシダーゼの阻害剤として同定すること;
を含む、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)の阻害剤を同定する方法を提供する。
可能性あるミエロペルオキシダーゼ阻害剤の存在においてミエロペルオキシダーゼを過酸化水素と反応させて、次亜塩素酸を発生させ、そしていずれの形成される次亜塩素酸をも、塩化ナトリウムおよび10mMのタウリンを含有する適当な緩衝液中でタウリンと反応させて、タウリンクロラミンを形成させること;
場合によりカタラーゼを約20μg/mLまでの濃度まで加えて、いずれの残留過酸化水素をも分解すること;
いずれの形成されるタウリンクロラミンをも、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンおよび10ないし20%ジメチルホルムアミドを含有する適当な緩衝剤中でヨウ化カリウムの存在において3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンと反応させて、酸化された3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンを形成させること;および
形成される酸化された3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンの量を測定すること;
を含む。
可能性あるミエロペルオキシダーゼ阻害剤の存在(化合物溶媒、DMSO中、1%)においてミエロペルオキシダーゼ(2.5nM)を20mMのリン酸塩緩衝剤pH6.5中の過酸化水素(100μM)および塩化ナトリウム(140mM)と反応させて、次亜塩素酸を発生させ、そしていずれの形成される次亜塩素酸をも10mMのタウリンと反応させて、タウリンクロラミンを形成させること;
最終濃度として氷酢酸(400mM)、ヨウ化カリウム(100μM)およびジメチルホルムアミド中の3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(10mM)を加えることによって検定を停止させそして顕色させること;および
形成される酸化された3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンの量を測定すること;
を含む。
可能性あるミエロペルオキシダーゼ阻害剤の存在においてミエロペルオキシダーゼ(5ないし20nM)を過酸化水素(100μM)と反応させて、次亜塩素酸を発生させ、そしていずれの形成される次亜塩素酸をも、100mMの塩化ナトリウムおよび10mMのタウリンを含有する20mMのpH6.5リン酸塩緩衝剤中でタウリンと反応させて、タウリンクロラミンを形成させること;
カタラーゼを濃度20μg/mLまで加えて、いずれの残留過酸化水素をも分解すること;
いずれの形成されるタウリンクロラミンをも200μMのヨウ化カリウムの存在において、2mMの3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンを含有する200mMの酢酸ナトリウム緩衝剤pH5.4および10ないし20%ジメチルホルムアミド中で3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンと反応させて、酸化された3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンを形成させること;および
形成される酸化された3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンの量を測定すること;
を含む。
可能性あるミエロペルオキシダーゼ阻害剤の存在においてミエロペルオキシダーゼ(2.7nM)を、140mMの塩化ナトリウムおよび10mMのタウリンを含有する20mMのリン酸塩緩衝剤pH6.5中で過酸化水素(50μM)と反応させ;次にこの検定溶液(150μL)を96ウェルプレートの各ウェルに加えること;
各ウェルにヨウ化ナトリウム(100μM)、酢酸(400mM)および50%ジメチルホルムアミド中の10mMのTMBを含む試薬50μLを加えることによって反応を停止させそして顕色させること;および
形成される酸化された3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンの量を測定すること;
を含む。
反応2:HOCl+RNH2 → RNHCl+H2O
反応4:HOI+TMB → TMBox+I-+H2O
分間進行させた後、等体積の顕色試薬を加えた。DMSOの濃度がPBST中約1%未満であるという条件で、DMSOは、タウリンクロラミンの検出に関してささいな影響しかないことがわかった。
の密度遠心分離によって新鮮なヘパリン化した血液から精製された。これらの好中球を、精製後直ちに使用した。標準反応混合物は、以下のものを含有した:2×106好中球、140mM NaCl、5mM タウリン、0.5mM MgCl2、1mM CaCl2および1mg/ml グルコース。試験化合物は、DMSO中で作成して、最終DMSO濃度0.5%で細胞に加えた。試験化合物を好中球とともに37℃で15分間予備インキュベートした後、PMA刺激剤(1μg/ml)を添加した。その後この検定を37℃でさらに30分間進行させた。インキュベーションの終わりに、上澄みを遠心分離によって集めて、上記のとおりの停止/顕色試薬を使用することによってHOClについて検定した。すべての化合物を、全く同一で、二人の異なるドナーからの少なくとも2回の別々の測定を、n=2、により試験した。
Mannheim GmbH、Sandhofer Strabe 116、D−68305 マンハイム、ドイツ国[細胞毒性検出キット(Cytotoxicity Detection Kit)−LDH−カタログ番号:第1644793号]によって記載されたように測定された。
顕色試薬を加えた。次に約645nMでの吸光度スペクトロスコピーを使用して約5分後に、形成された酸化された3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンの量を測定した。
各ウェルにヨウ化ナトリウム(100μM)、酢酸(400mM)および50%ジメチ
ルホルムアミド中の10mMのTMBを含む試薬50μLを加えることによって反応を停止させそして顕色させること;および
形成された酸化された3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンの量を測定すること;
を除き、本質的に実施例3に記載したとおりに検定を実施した。
顕色試薬:2mMのTMB、200μMのKI、20%DMFを含む200mMの酢酸塩緩衝剤pH5.4。
ために適当である、検出体分子としてジヒドロローダミンを使用する検定を説明する。
検定構成
酵素溶液 110mlの200mM NaH2PO4 pH6.5 (20mM最終)
110mlの1.4M NaCl (140mM最終)
110mlの100mM タウリン (10mM最終)
2.75mlの10mM チロシン (25μM最終)
275μlの10μM MPO (25nM最終)
1100mlにする蒸留水
基質溶液 110mlの200mM NaH2PO4 pH6.5 (20mM最終)
110mlの1.4M NaCl (140mM最終)
110mlの100mM タウリン (10mM最終)
20μlの8.8M H2O2 (160μM最終)
1100mlにする蒸留水
検出溶液 110mlの200mM NaH2PO4 pH6.5 (20mM最終)
110mlの1.4M NaCl (140mM最終)
110mlの100mM タウリン (10mM最終)
220mlのDMSO (20%最終)
16.5mlの20mM KI (300μM最終)
8mlの72.5mM ジヒドロローダミン (527.3μM最終)
1100mlにする蒸留水
負の対照 20mlの10mM ダプソン (1mM最終)
200mlにする蒸留水
化合物の希釈物を、5%DMSO/H2Oを用いて調製して、5μl中110μMの化合物濃度を得た。
25μlの酵素溶液をプレート当たりのすべてのウェルに加え;
次にプレートを45分間予備インキュベートし:
25μlの基質溶液をプレート当たりのすべてのウェルに加え;
次にプレートを15分間インキュベートし:
25μlの検出溶液をプレート当たりのすべてのウェルに加え;
蛍光強度(励起485nm、発光530nm、二色505nm)を読むことによりプレートを計数した。
MPO活性の検定はまた、血液、血液の細胞分画、痰または急性炎症をもつ分離組織のようなMPO含有組織に関して実施することもできた。この型の検定については、グルコースオキシダーゼを使用して過酸化水素を約10μM/分で発生させた後、5ないし10分後に顕色試薬を用いて反応を停止させることが好ましかった。こうしてこの検定は、簡単な診断試験を提供し、そしてこのようにして得られた情報は、多くの炎症性疾患における危険因子としてのMPOを評価するために広く使用することができる。
Claims (5)
- ミエロペルオキシダーゼの可能性ある阻害剤の存在においてミエロペルオキシダーゼを過酸化水素および塩化物源と反応させて、次亜塩素酸を発生させること;
いずれの形成される次亜塩素酸をもアミンと反応させて、相当するクロラミンを形成させること;
いずれの形成されるクロラミンをもヨウ化物の存在において3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンと反応させて、酸化された3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンを形成させること;
吸光度を測定することによって、形成される酸化された3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンの量を決定すること;
形成される酸化された、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンの量を減少させる化合物をミエロペルオキシダーゼの阻害剤として同定すること;
を含む、ミエロペルオキシダーゼの阻害剤を同定する方法において、ミエロペルオキシダーゼの可能性ある阻害剤がジメチルスルホキシドに溶解され、該ジメチルスルホキシドが1%以下の濃度であることを特徴とする方法。 - アミンがタウリンである、請求項1に記載の方法。
- ヨウ化物の存在における、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンとタウリンクロラミンとの反応をpH5.4で実施する、請求項2に記載の方法。
- いずれの未反応過酸化水素をも、カタラーゼを使用して除去する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 高処理量スクリーンとして実施する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
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