JP4095446B2 - 酵素ミエロペルオキシダーゼの阻害剤を検出するための検定 - Google Patents

Description

微生物による感染に対する抵抗性は、非特異的機構とＢおよびＴリンパ球によって媒介される適応免疫応答との両方を包含する。酵素作用、ｐＨおよび上皮組織分泌のような非特異的機構は、多くの生物による侵入を予防する。しかしながら、防御の第一線が破られるとき、食細胞は、感染因子を飲み込み、そしてそれらを処理してＢおよびＴ細胞の刺激に導く。正常な個体に対して低病原性を有する微生物が、無効な食細胞系を有する個体においては再発性感染を引き起こすことができるので、食細胞系における欠損は、遺伝性であっても後天性であっても、重大な結果を有する。

多形核白血球（ＰＭＮ）は、感染と戦うために特に重要である。これらの細胞は、十分に文書で証明された殺菌作用を有する酵素のミエロペルオキシダーゼを含有する。ＰＭＮは、食細胞活動によって非特異的に微生物を飲み込むように作用し、それらをファゴソームと呼ばれる液胞中に組み入れ、このファゴソームは、ミエロペルオキシダーゼを含有する顆粒と融合してファゴリソソームを形成する。ファゴリソソームにおいて、ミエロペルオキシダーゼの酵素活性は、有力な殺菌性化合物である次亜塩素酸の形成（過酸化水素および塩化物からの）を導く。次亜塩素酸は、本来酸化性であり、そしてチオールおよびチオエーテルと最も貪欲に反応するが、またアミンをクロラミンに変換し、そして芳香族アミノ酸を塩素化する。マクロファージは、ＰＭＮのように微生物を食菌することができる大きな食細胞である。マクロファージは、過酸化水素を発生させることができ、そして活性化したときまたミエロペルオキシダーゼを産生する。さらに、血漿中のミエロペルオキシダーゼは、マクロファージによって取り込まれる。

ミエロペルオキシダーゼ活性の疾患への連関は、アルツハイマー病、多発性硬化症、喘息、アテローム性動脈硬化症、癌、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、および慢性関節リウマチを包含する多くの炎症性疾患に関係があるとされてきた。ミエロペルオキシダーゼの阻害剤の確認のための同定は、このような疾患の病因論への次亜塩素酸の寄与を証明する際に、ならびに診断道具のために、非常に貴重であろう。それらはまた、ミエロペルオキシダーゼ−依存性組織損傷に対する有効な薬剤の開発のための基盤をも提供するであろう。ＭＰＯ阻害剤に対する適当なスクリーニング検定は、現実的な生理学的条件下でのミエロペルオキシダーゼの塩素化活性を測定すべきである。それは、簡単で、感度が良く、そして着色または蛍光生成物を生成しなくてはならず、そしてそれは、ＭＰＯの活性をかき乱してはならない。検出体は、生成されるすべての次亜塩素酸を掃去するがしかし直接酵素と反応しないように、十分高い濃度で存在することが必要であろう。目下、最も普通に使用される検定は、次亜塩素酸およびタウリンからのタウリンクロラミンの一次形成を基にしている。ミエロペルオキシダーゼの活性を測定するためのこのタウリンクロラミン検定の改良形を使用するための以前の試みは、この酵素の可能性ある（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）阻害剤をスクリーニングするためのその使用を否定する特定の問題を示した。主な問題は、試験化合物が最も好都合にそして普通に溶解させられる溶媒であるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）がこの検定を妨げ、そして試験化合物の多くが一般に使用される発色団と同一領域で吸収することである。

生理学的には、ＰＭＮ−由来のミエロペルオキシダーゼは、第一に塩化物イオンのようなハロゲン化物の過酸化水素−依存性酸化を触媒するが、しかしその基質としてＯ−ジアニシジンのような電子供与体を使用する能力が、炎症性組織中のＰＭＮを定量するための検定の基礎を形成する。細胞質型酵素、カタラーゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼのような組織／血液成分、グルタチオンおよびアスコルビン酸のような還元基質、およびヘムタンパク質によって引き起こされる人為的影響を回避するためのこの方法の適応が記
載された［Ｇｒｉｓｈａｍ外、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８６巻、編者Ｐａｃｋｅｒ外、サンディエゴ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、第７２９−７４２ページ（１９９０）］。しかしながら、他の内因性組織成分によって影響されない、より信頼性のある炎症性組織のＰＭＮ含量を定量する分析法が必要とされている。

本発明は、現在公知の検定に関連する主たる問題を回避し、そしてミエロペルオキシダーゼの阻害剤の同定に十分に適合する、簡単で、感度が良くそして確固とした検定を記載する。もう一つの観点において、本発明は、ミエロペルオキシダーゼに関連する特定の診断試験のために有用である。

第一の観点において、本発明は：
ミエロペルオキシダーゼの可能性ある阻害剤の存在においてミエロペルオキシダーゼを過酸化水素および塩化物源と反応させて、次亜塩素酸を発生させること；
いずれの形成される次亜塩素酸をも適当なアミンと反応させて、相当するクロラミンを形成させること；
場合によりいずれの未反応過酸化水素をも除去すること；
いずれの形成されるクロラミンをもヨウ化物の存在において適当な検出体分子と反応させて、酸化された検出体分子を形成させること；
適当な波長での吸光度または蛍光を測定することによって、形成される酸化された検出体分子の量を決定すること；
形成される酸化された検出体分子の量を減少させる化合物をミエロペルオキシダーゼの阻害剤として同定すること；
を含む、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の阻害剤を同定する方法を提供する。

上記発明の一つの態様においては、使用されるアミンは、次亜塩素酸によってタウリンクロラミンに変換されるタウリンである。適当なタウリンの濃度は、約５ないし１０ｍＭである。

もう一つの態様においては、いずれの未反応過酸化水素をも、カタラーゼを使用して除去する。適当なカタラーゼの濃度は、約１０ないし２０μＭである。

塩化ナトリウムを、適当な塩化物源として、例えば約５０ないし１５０ｍＭの量で、使用することができる。

過酸化水素は、それ自体として加えることができるか、または、例えばグルコースオキシダーゼまたはキサンチンオキシダーゼのようなオキシダーゼによる過酸化水素の酵素による発生、を使用して、その場で発生させることができる。適当な過酸化水素の濃度は、例えば１０ないし１００μＭである。

もう一つの態様においては、使用される検出体分子は、ベンジジン誘導体である。好ましいベンジジン誘導体は、３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）であり、そして形成される酸化された３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジンを、６４５ないし６５０ｎＭでの吸光度を測定することによって検定する。

別態様においては、検出体分子は、図１に示す分子のうちの１つのような蛍光プローブである。

例えば、ジヒドロローダミンを検出体分子として使用することができる。この非蛍光化合物は、ローダミンに酸化され、このローダミンは、５００ｎｍで励起されたとき５３６ｎｍで蛍光を発する。

さらに特定すれば、本発明の方法は：
可能性あるミエロペルオキシダーゼ阻害剤の存在においてミエロペルオキシダーゼを過酸化水素と反応させて、次亜塩素酸を発生させ、そしていずれの形成される次亜塩素酸をも、塩化ナトリウムおよび１０ｍＭのタウリンを含有する適当な緩衝液中でタウリンと反応させて、タウリンクロラミンを形成させること；
場合によりカタラーゼを約２０μｇ／ｍＬまでの濃度まで加えて、いずれの残留過酸化水素をも分解すること；
いずれの形成されるタウリンクロラミンをも、３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジンおよび１０ないし２０％ジメチルホルムアミドを含有する適当な緩衝剤中でヨウ化カリウムの存在において３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジンと反応させて、酸化された３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジンを形成させること；および
形成される酸化された３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジンの量を測定すること；
を含む。

使用することができる緩衝剤には、ｐＨ５ないしｐＨ８の適当な酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩緩衝剤がある。緩衝剤は、少なくとも１０ｍＭ、好ましくは少なくとも２０ｍＭ、の濃度で存在すべきである。好ましくはヨウ化カリウムとの反応は、約ｐＨ５.４で実施される。

こうして、一つの特定の態様において、本発明の方法は：
可能性あるミエロペルオキシダーゼ阻害剤の存在（化合物溶媒、ＤＭＳＯ中、１％）においてミエロペルオキシダーゼ（２.５ｎＭ）を２０ｍＭのリン酸塩緩衝剤ｐＨ６.５中の過酸化水素（１００μＭ）および塩化ナトリウム（１４０ｍＭ）と反応させて、次亜塩素酸を発生させ、そしていずれの形成される次亜塩素酸をも１０ｍＭのタウリンと反応させて、タウリンクロラミンを形成させること；
最終濃度として氷酢酸（４００ｍＭ）、ヨウ化カリウム（１００μＭ）およびジメチルホルムアミド中の３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン（１０ｍＭ）を加えることによって検定を停止させそして顕色させること；および
形成される酸化された３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジンの量を測定すること；
を含む。

もう一つの特定の態様において、本発明の方法は：
可能性あるミエロペルオキシダーゼ阻害剤の存在においてミエロペルオキシダーゼ（５ないし２０ｎＭ）を過酸化水素（１００μＭ）と反応させて、次亜塩素酸を発生させ、そしていずれの形成される次亜塩素酸をも、１００ｍＭの塩化ナトリウムおよび１０ｍＭのタウリンを含有する２０ｍＭのｐＨ６.５リン酸塩緩衝剤中でタウリンと反応させて、タウリンクロラミンを形成させること；
カタラーゼを濃度２０μｇ／ｍＬまで加えて、いずれの残留過酸化水素をも分解すること；
いずれの形成されるタウリンクロラミンをも２００μＭのヨウ化カリウムの存在において、２ｍＭの３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジンを含有する２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ５．４および１０ないし２０％ジメチルホルムアミド中で３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジンと反応させて、酸化された３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジンを形成させること；および
形成される酸化された３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジンの量を測定すること；
を含む。

もう一つの特定の態様において、本発明の方法は：
可能性あるミエロペルオキシダーゼ阻害剤の存在においてミエロペルオキシダーゼ（２.７ｎＭ）を、１４０ｍＭの塩化ナトリウムおよび１０ｍＭのタウリンを含有する２０ｍＭのリン酸塩緩衝剤ｐＨ６.５中で過酸化水素（５０μＭ）と反応させ；次にこの検定溶液（１５０μＬ）を９６ウェルプレートの各ウェルに加えること；
各ウェルにヨウ化ナトリウム（１００μＭ）、酢酸（４００ｍＭ）および５０％ジメチルホルムアミド中の１０ｍＭのＴＭＢを含む試薬５０μＬを加えることによって反応を停止させそして顕色させること；および
形成される酸化された３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジンの量を測定すること；
を含む。

もう一つの特定の態様において、本発明の方法は、１０ｍＭのタウリンおよび１００ｍＭのＮａＣｌを含有する２０ｍＭのリン酸ナトリウム／カリウム緩衝剤ｐＨ６.５を含む検定緩衝剤、および２０％ＤＭＦとともに２ｍＭのＴＭＢ、２００μＭのＫＩ、２００ｍＭの酢酸塩緩衝剤ｐＨ５.４を含む顕色試薬、を使用する。

さらに別の特定の態様は、下記の実施例の項に記載する。

本発明は、可能性ある酵素阻害剤に対するスクリーニングの方法としてのミエロペルオキシダーゼ活性を測定するための公知のタウリンクロラミン検定の使用を妨げた２つの特殊な問題を克服する。第一には、通常使用される溶媒、ジメチルスルホキシド、がこれらの検定を妨げ、そして第二には、多くの試験化合物が発色団と同一領域において光学的に吸収した。

本発明は、ジメチルスルホキシドによる妨害を最小にし、そして検出プロセスが試験化合物による光学的妨害を受けない改変されたタウリンクロラミン検定である。

試験化合物による精製ミエロペルオキシダーゼの阻害は、その改変検定が化合物のミエロペルオキシダーゼを阻害する能力を評価するために有用であることを確立している改変検定を使用して測定された。さらに、本発明は、高−処理量スクリーニング（ＨＴＳ）のために必要な要求を満たす。さらにそのうえ、本発明は、ＭＰＯ活性が関係する疾患に罹っている患者を治療するための潜在能力を有する化合物を同定するために有用な、ミエロペルオキシダーゼの阻害剤を検出する方法を提供する。

適当なｐＨでヨウ化物によって触媒される、タウリンクロラミンによる３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジンのような適当な検出体分子の酸化は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）による受ける妨害が最小の検定を提供することが見出された。検出体分子が３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジンであるとき、青色生成物が形成されて、約６４５ｎｍに吸光度の最大値を有する。

本発明の検定は、敏感であり、そして次亜塩素酸、ＨＯＣｌ、を検出するための特定法である。それはまた、試験化合物のミエロペルオキシダーゼを阻害する能力を決定するためにも有用である。それは、ミエロペルオキシダーゼの阻害剤を確認するためのＨＴＳのために特に有用である。

下記の実施例３で開示する特定の態様については、１００ｍＭの塩化ナトリウムおよび１０ｍＭのタウリン（ＲＮＨ₂）を含有する２０ｍＭのｐＨ６.５リン酸塩緩衝剤（本明細書中で以後ＰＢＳＴ）は、過酸化水素によるミエロペルオキシダーゼの阻害を最小にすることが発見され、そしてタウリン濃度１０ｍＭは、発生したすべての次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）（下記反応１参照）をタウリンクロラミン（ＲＮＨＣｌ）として捕捉する（下記反応２参照）ことを確実にするために十分であることがわかった。タウリンクロラミンは、室温で少なくとも１時間安定であることがわかった。そのため、試験化合物との反応による可能なタウリンクロラミンの消費を最小にするために、検定は、発生量が試験化合物の濃度よりも約５−１０倍大きいように設計された。

反応１：ＭＰＯの存在におけるＨ₂Ｏ₂＋Ｃｌ^- → ＨＯＣｌ＋Ｈ₂Ｏ
反応２：ＨＯＣｌ＋ＲＮＨ₂ → ＲＮＨＣｌ＋Ｈ₂Ｏ

ＴＭＢを検出体分子として使用することができる。それは、最終濃度約１ｍＭで使用され、その結果それは、オキシダントより大過剰に存在して、これがそのタウリンクロラミンとの反応のための１：１化学量論を確実にする。ヨウ化カリウムの添加は、それがタウリンクロラミンとＴＭＢとの間の反応を触媒し、そしてヨウ化物の不在においては反応が起こらないので、必須である（下記反応３および４参照）。ｐＨ約５.４は、酸化されたＴＭＢの安定性を保持し、タウリンクロラミンがヨウ化物を酸化することを許すために最適であることが見出された。これより低いｐＨでは、ヨウ化物の非特異的酸化が起こる可能性があり、そしてこれより高いｐＨでは、ヨウ化物の酸化は、ゆっくりであり、そして酸化されたＴＭＢは、より不安定である。

反応３：ＲＮＨＣｌ＋Ｉ^-＋Ｈ₂Ｏ＋Ｈ⁺ → ＲＮＨ₂＋ＨＯＩ
反応４：ＨＯＩ＋ＴＭＢ → ＴＭＢ_ox＋Ｉ^-＋Ｈ₂Ｏ

本発明のタウリンクロラミン検定は、２部分を含み、１は、タウリンクロラミンを発生させるプロセスであり、そして２は、ＴＭＢのような検出体分子を酸化するプロセスである。第一の反応において、ミエロペルオキシダーゼは、タウリンと反応してタウリンクロラミンとして捕捉される次亜塩素酸を形成する。第二の反応において、形成されたタウリンクロラミンは、定量的に、例えばＴＭＢを酸化して酸化されたＴＭＢを形成する、ために使用される。

上記検定を有効にする方法として、１４０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭのリン酸塩緩衝剤ｐＨ７.４中の５.５ｍＭのタウリンに試薬ＨＯＣｌを加えることによってタウリンクロラミンを発生させた。等体積の顕色試薬をタウリンクロラミンに加えたとき、溶液は、青色になった。生成物の吸収スペクトルは、６４５ｎｍに最大値を有する５００ないし７００ｎｍの間の広幅ピークを有する。吸光係数は、１４,５２０±３３０Ｍ^-1ｃｍ^-1であることが決定された。６４５ｎｍでの吸収は、ＰＢＳＴに加えたＨＯＣｌの濃度に直接比例することがわかった。

ヨウ化物の最適濃度は、０ないし１ｍＭの濃度範囲のヨウ化物を使用することによって決定した。酸化されたＴＭＢの最大形成は、１０μＭより大きなヨウ化物濃度で起こることがわかった。

ｐＨを１まで低下させることによってＴＭＢの酸化が促進されるとき、ＤＭＳＯがタウリンクロラミン検定を妨げることは、公知である。そのため、本発明の検定におけるＤＭＳＯによるＴＭＢの酸化の阻害を測定した。阻害を測定するために、５６μＭのＨＯＣｌを加える前に、ある濃度範囲のＤＭＳＯをＰＢＳＴ（ｐＨ７.４）に加えた。反応を１０
分間進行させた後、等体積の顕色試薬を加えた。ＤＭＳＯの濃度がＰＢＳＴ中約１％未満であるという条件で、ＤＭＳＯは、タウリンクロラミンの検出に関してささいな影響しかないことがわかった。

本発明のタウリンクロラミン検定は、精製したヒトミエロペルオキシダーゼによって発生させられたＨＯＣｌを検出するために使用された。２０ｎＭのミエロペルオキシダーゼ、１００ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのタウリンを含有する２０ｍＭのリン酸塩緩衝剤ｐＨ６.５に、過酸化水素（１００μＭ）を加えた。混合物を室温で１５分間インキュベートし、そしてカタラーゼ（１０μｇ／ｍｌ）を加えることによって反応を停止させた。５分後に顕色試薬を加えて、発生したタウリンクロラミンを検出した。生成されたタウリンクロラミンの量を、１００μＭのＨＯＣｌをＰＢＳＴに加えることによって形成されたものと比較した。ＨＯＣｌ標準との比較によって、１００μＭの過酸化水素が１１３μＭのＨＯＣｌに変換されたことが示された。そのため、実験誤差内で、すべての過酸化水素が、ＨＯＣｌに変換された後、タウリンクロラミンとして捕捉された。ストック（ｓｔｏｃｋ）の過酸化水素の濃度は、Ｅ₂₄₀４３.６Ｍ^-1ｃｍ^-1を使用して決定し、そしてストック（ｓｔｏｃｋ）の次亜塩素酸のそれは、Ｅ₂₉₂３５０Ｍ^-1ｃｍ^-1を使用して決定した。

いずれかのＴＭＢの酸化が塩化物の不在で起こるかどうかを決定するための研究が実施された。換言すれば、ＴＭＢの酸化が本来のＨＯＣｌの形成に限定され、そしてそれが過酸化水素およびミエロペルオキシダーゼによる直接酸化によっては起こらないことを示すためである。ＴＭＢの酸化は、塩化物の不在では観察されず、そしてカタラーゼを用いたそれ以上の研究も、この観察を支持する。

種々の化合物の、ミエロペルオキシダーゼの塩素化活性に影響を与える能力は、本発明の検定がＨＯＣｌ生成量を測定することであること、およびこの検定がこの酵素の可能性ある阻害剤を示すために適当であること、を確実にした。

時間経過実験について上記した条件下で１０μＭの試験化合物の不在または存在において、ミエロペルオキシダーゼによって次亜塩素酸を発生させた。反応を、過酸化水素を加えることによって開始させ、そしてカタラーゼを加えることによって５分後に停止させた。２０μｇ／ｍｌのカタラーゼの添加は、ＨＯＣｌの形成の９０％阻害を達成した。

上記検定のすべてはまた、場合によりチロシンの存在において実施してもよい。適当なチロシンの濃度は、約５ないし２０μＭである。

時間経過実験は、過酸化水素がミエロペルオキシダーゼを阻害していたので、チロシンがＨＯＣｌの生成を増大させたことを示した。この実験はまた、チロシンが過酸化活性に影響を与えないので、ミエロペルオキシダーゼの塩素化活性が測定されていることも示した。この結論は、ミエロペルオキシダーゼの塩素化活性を阻害するが過酸化活性を阻害しないことが公知であるダプソンの結果によって支持される。さらに別の実験は、ダプソン、ＡＢＡＨ、ｐ−ブロモアニリン、およびジメトキシベンゼンが、ミエロペルオキシダーゼの塩素化活性についての他の検定において示されたのと同程度までＨＯＣｌの生成を阻害したことを示した。こうして、本発明の検定は、ミエロペルオキシダーゼの阻害剤を示すために適当である。実験はまた、ＤＭＳＯがＨＯＣｌの検出に影響を与えないことをも示した。結果を表１に示す。

別の観点においては、本発明は、特に生物学的流体中の、ＭＰＯ活性水準を測定するための本質的に上記のとおりの検定法の使用に関する。ミエロペルオキシダーゼ活性は、アルツハイマー病、多発性硬化症、喘息、アテローム性動脈硬化症、癌、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、および慢性関節リウマチを包含する多くの炎症性疾患に関係があるとされてきた。本発明の検定は、こうして神経炎症性疾患を包含する広範囲の炎症性疾患における危険因子としてのＭＰＯを探すために使用することができる。

好中球およびその他の食細胞は、ＮＡＤＰＨを費やして酸素の一電子還元によってＯ₂ ^-（超酸化物）を製造する。Ｏ₂ ^-の大部分は、それ自体と反応して、Ｈ₂Ｏ₂（過酸化水素）を形成する。これらの因子から多くの高反応性殺菌性オキシダントが形成されるが、これには、ミエロペルオキシダーゼに触媒されたＨ₂Ｏ₂によるＣｌ^-の酸化によって生成されるＨＯＣｌ（次亜塩素酸）；Ｆｅ⁺⁺またはＣｕ⁺によるＨ₂Ｏ₂の還元によって生成されるＯＨ（ヒドロキシルラジカル）；Ｏ₂ ^-とＮＯとの間の反応によって形成されるＯＮＯＯ^-（ペルオキシニトライト）；および多数のその他のもの；が包含される。これらの反応性オキシダントは、侵襲する微生物を殺す目的のために製造されるが、それらはまた、近くの組織にも損傷を負わせ、多くの疾患において病原として有意であると考えられる（Ｂ．Ｍ．Ｂａｂｉｏｒ、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２０００、１０９、３３−４４）。これらに包含されるのは、アルツハイマー病、多発性硬化症、喘息、アテローム性動脈硬化症、癌、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、慢性関節リウマチ、気腫、急性呼吸不全症候群、再潅流障害および悪性疾患である。

ＭＰＯはまた、冠状動脈疾患に関係があるとされる（Ｈａｚｅｎ外、ＪＡＭＡ、２００１、２８６、２１３６−２１４２）。こうして、本発明の検定は、アテローム性動脈硬化症に対する危険因子としての末梢血好中球中のＭＰＯを探すために使用することができる。

ミエロペルオキシダーゼの阻害剤の確認のための検定は、このような疾患の病因論への次亜塩素酸の寄与を証明する際に、ならびに診断道具として、非常に貴重であろう。それらはまた、ミエロペルオキシダーゼ−依存性組織損傷に対する有効な薬剤の開発のための基盤をも提供するであろう。

本発明を、ここで下記の実施例によって具体的に説明するが、これらは、限定的なものではない。

ここで本発明者らは、酵素活性の阻害を評価するために開発されたインビトロＭＰＯ検定を説明する。本質的にこのＭＰＯ検定は、インビボでこの酵素によって発生させられる重要な生理学的生成物である次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）の生産量を測定するために設計された。この検定反応の概略を示す：

２０ｍＭのリン酸緩衝剤ｐＨ６.５中の反応混合物は、２.５ｎＭのＭＰＯ［プランタ（Ｐｌａｎｔａ）からの精製したヒト酵素］、１００μＭのＨ₂Ｏ₂、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのタウリン、２０μＭのチロシンおよび化合物溶媒、ＤＭＳＯ、１％、を含有した。化合物を約１５分間緩衝剤中でＭＰＯ酵素とともに予備インキュベートした後、Ｈ₂Ｏ₂との反応を開始させた。全反応を、９６−ウェルプレート中で室温で１０分間実施した。この反応を、それらの最終濃度で氷酢酸（４００ｍＭ）、ＫＩ（１００μＭ）およびジメチルホルムアミド中のＴＭＢ（１０ｍＭ）から成る停止／顕色試薬によって終結させた。すべての試験濃度を、全く同一で、少なくとも２回の別々の測定により実施した（他に説明しないかぎりｎ＝２）。化合物についての阻害濃度をｐＩＣ₅₀（これは、−ｌｏｇＩＣ₅₀である）として表す。

種々の化合物をヒトＭＰＯに対して試験した。ダプソンが、試験したスルホン／スルホンアミドの最も有力な阻害剤であることを知ることができた。インドールおよびその他の化合物もまた、ヒトＭＰＯによるＨＯＣｌの生成を遮断するのに有効であった。スルホン／スルホンアミド、インドールおよび雑多な化合物について得られたすべてのデータを各々表２、３および４に示す。

ここで本発明者らは、ＨＯＣｌの生成に関するＭＰＯ阻害剤の効果を決定するための機能的ヒト好中球検定の使用を説明する。この検定は、刺激された（例えばＰＭＡ、ＬＰＳ、ｆＭＬＰ、ザイモサン）ヒト好中球からのＨＯＣｌの生成を検出する。ヒト好中球は、ポリモルフプレプ（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ）［ニコメド（Ｎｙｃｏｍｅｄ）］上で
の密度遠心分離によって新鮮なヘパリン化した血液から精製された。これらの好中球を、精製後直ちに使用した。標準反応混合物は、以下のものを含有した：２×１０⁶好中球、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ タウリン、０.５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＣａＣｌ₂および１ｍｇ／ｍｌ グルコース。試験化合物は、ＤＭＳＯ中で作成して、最終ＤＭＳＯ濃度０.５％で細胞に加えた。試験化合物を好中球とともに３７℃で１５分間予備インキュベートした後、ＰＭＡ刺激剤（１μｇ／ｍｌ）を添加した。その後この検定を３７℃でさらに３０分間進行させた。インキュベーションの終わりに、上澄みを遠心分離によって集めて、上記のとおりの停止／顕色試薬を使用することによってＨＯＣｌについて検定した。すべての化合物を、全く同一で、二人の異なるドナーからの少なくとも２回の別々の測定を、ｎ＝２、により試験した。

これらの阻害剤のいくつかに対するデータを表５に示す。

本発明者らはまた、使用した検定条件および阻害剤の濃度下では、ヒト好中球は、傷害された好中球からの乳酸デヒドロゲナーゼの放出によって評価したとき、細胞毒性によって影響されなかったことも示した。乳酸デヒドロゲナーゼ活性は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ、Ｓａｎｄｈｏｆｅｒ Ｓｔｒａｂｅ １１６、Ｄ−６８３０５ マンハイム、ドイツ国［細胞毒性検出キット（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）−ＬＤＨ−カタログ番号：第１６４４７９３号］によって記載されたように測定された。

この実施例においては、可能性あるミエロペルオキシダーゼ阻害剤の存在においてミエロペルオキシダーゼ（５ないし２０ｎＭ）を過酸化水素（１００μＭ）と反応させて、次亜塩素酸を発生させ、そしていずれの形成された次亜塩素酸をも、１００ｍＭの塩化ナトリウムおよび１０ｍＭのタウリンを含有する２０ｍＭのｐＨ６.５リン酸塩緩衝剤中でタウリンと反応させて、タウリンクロラミンを形成させることによって、検定を実施した。次にカタラーゼを濃度２０μｇ／ｍＬまで加えて、いずれの残留過酸化水素をも分解した。次にほぼ等体積の、２ｍＭのＴＭＢ、２００μＭのヨウ化カリウムおよび１０ないし２０％のジメチルホルムアミドを含有する２００ｎＭの酢酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ５.４の
顕色試薬を加えた。次に約６４５ｎＭでの吸光度スペクトロスコピーを使用して約５分後に、形成された酸化された３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジンの量を測定した。

可能性あるミエロペルオキシダーゼ阻害剤の存在において１４０ｍＭの塩化ナトリウムおよび１０ｍＭのタウリンを含有する２０ｍＭのリン酸塩緩衝剤ｐＨ６.５中でミエロペルオキシダーゼ（２.７ｎＭ）を過酸化水素（５０μＭ）と反応させ；次にこの検定溶液（１５０μＬ）を９６ウェルプレートの各ウェルに加えること；
各ウェルにヨウ化ナトリウム（１００μＭ）、酢酸（４００ｍＭ）および５０％ジメチ
ルホルムアミド中の１０ｍＭのＴＭＢを含む試薬５０μＬを加えることによって反応を停止させそして顕色させること；および
形成された酸化された３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンの量を測定すること；
を除き、本質的に実施例３に記載したとおりに検定を実施した。

実施例４に記載したとおりの検定の感度および安定性は、以下のようにして確立された。変化する濃度のＨＯＣｌを、１０ｍＭのタウリンを含有する１０ｍＭのリン酸塩緩衝剤に加えて、タウリンクロラミンを発生させた。１５０μｌのこの溶液を９６ウェルプレートに加え、続いて５０μｌの顕色試薬を加えた。プレートを混合直後および１時間で再度読み（Ａ₆₅₀）、感度および生成物安定性を測定した。結果を図２に示す。

図２から、ＴＭＢ検定は、９６ウェルプレート中で実施したとき容易に１００μＭのＨＯＣｌを検出できることを見ることができる。生成物は、非常に安定であって、室温で１時間後にすべての濃度で崩壊は１０％未満であった。

ＭＰＯによるＨＯＣｌの生成に対する時間経過を図３に示す。

図３から、Ｈ₂Ｏ₂のＨＯＣｌへの変換は、上記の反応条件下で約３０分かかったことが明らかである。プログレス曲線の形は、Ｈ₂Ｏ₂による阻害がほとんどなかったことを示した。図２と３とを比較することにより、ＭＰＯがすべてのＨ₂Ｏ₂をＨＯＣｌに変換したことは、明白である。このため過剰のＨ₂Ｏ₂を除去するために全くカタラーゼを加える必要はなかった。

５分での反応に対する色収率（ｃｏｌｏｒ ｙｉｅｌｄ）は、その後の１時間にわたって６％しか増大しなかった。このことは、顕色試薬の添加が、ＭＰＯがより多くのＨＯＣｌを生成することおよびＴＭＢを直接酸化することを妨げることを示す。

検定緩衝剤：１０ｍＭのタウリンおよび１００ｍＭのＮａＣｌを含有する２０ｍＭのリン酸ナトリウム／カリウム緩衝剤ｐＨ６.５。
顕色試薬：２ｍＭのＴＭＢ、２００μＭのＫＩ、２０％ＤＭＦを含む２００ｍＭの酢酸塩緩衝剤ｐＨ５.４。

検定緩衝剤中に希釈した化合物１０μｌに、４０μｌのＭＰＯ（最終濃度２.５ｎＭ）を室温で１０分間加えた。次に５０μｌのＨ₂Ｏ₂（最終濃度１００μＭ）、または対照として検定緩衝剤単独、を室温で１０分間加えた。１０μｌの０.２ｍｇ／ｍｌカタラーゼ（最終濃度１８μｇ／ｍｌ）を５分間加えることによって反応を停止させた後、１００μｌのＴＭＢ顕色試薬を加えた［２０％ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）および２００μＭのＫＩを含有する２００ｍＭの酢酸塩緩衝剤ｐＨ５.４中の２ｍＭのＴＭＢ］。プレートを混合し、その後６５０ｎｍで読んだ。

実施例５に記載したとおりの検定を使用すると、基準化合物ダプソンは、チロシンの不在で２５７±７３ｎＭ、そして８μＭのチロシンの存在で７１２０±６１０ｎＭのＩＣ₅₀値を示した。さらに別の基準化合物、４−アミノ安息香酸ヒドラジド（ＡＢＡＨ）、は、チロシンの不在で８６±６ｎＭ、そして８μＭのチロシンの存在で１１８±８ｎＭのＩＣ₅₀値を示した。

この実施例は、３８４ウェルプレートを使用する高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）の
ために適当である、検出体分子としてジヒドロローダミンを使用する検定を説明する。
検定構成
酵素溶液 １１０ｍｌの２００ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄ ｐＨ６.５ （２０ｍＭ最終）
１１０ｍｌの１.４Ｍ ＮａＣｌ （１４０ｍＭ最終）
１１０ｍｌの１００ｍＭ タウリン （１０ｍＭ最終）
２.７５ｍｌの１０ｍＭ チロシン （２５μＭ最終）
２７５μｌの１０μＭ ＭＰＯ （２５ｎＭ最終）
１１００ｍｌにする蒸留水
基質溶液 １１０ｍｌの２００ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄ ｐＨ６.５ （２０ｍＭ最終）
１１０ｍｌの１.４Ｍ ＮａＣｌ （１４０ｍＭ最終）
１１０ｍｌの１００ｍＭ タウリン （１０ｍＭ最終）
２０μｌの８.８Ｍ Ｈ₂Ｏ₂ （１６０μＭ最終）
１１００ｍｌにする蒸留水
検出溶液 １１０ｍｌの２００ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄ ｐＨ６.５ （２０ｍＭ最終）
１１０ｍｌの１.４Ｍ ＮａＣｌ （１４０ｍＭ最終）
１１０ｍｌの１００ｍＭ タウリン （１０ｍＭ最終）
２２０ｍｌのＤＭＳＯ （２０％最終）
１６.５ｍｌの２０ｍＭ ＫＩ （３００μＭ最終）
８ｍｌの７２.５ｍＭ ジヒドロローダミン （５２７.３μＭ最終）
１１００ｍｌにする蒸留水
負の対照 ２０ｍｌの１０ｍＭ ダプソン （１ｍＭ最終）
２００ｍｌにする蒸留水
化合物の希釈物を、５％ＤＭＳＯ／Ｈ₂Ｏを用いて調製して、５μｌ中１１０μＭの化合物濃度を得た。

正および負の対照は、０.４μｌのＤＭＳＯ賦形剤を含有し、化合物を含むものと同様に希釈された。希釈したプレートが完成したら、５μｌの１ｍＭ基準化合物ダプソンを負の対照ウェルに加えた。

手順
２５μｌの酵素溶液をプレート当たりのすべてのウェルに加え；
次にプレートを４５分間予備インキュベートし：
２５μｌの基質溶液をプレート当たりのすべてのウェルに加え；
次にプレートを１５分間インキュベートし：
２５μｌの検出溶液をプレート当たりのすべてのウェルに加え；
蛍光強度（励起４８５ｎｍ、発光５３０ｎｍ、二色５０５ｎｍ）を読むことによりプレートを計数した。

診断使用のための検定
ＭＰＯ活性の検定はまた、血液、血液の細胞分画、痰または急性炎症をもつ分離組織のようなＭＰＯ含有組織に関して実施することもできた。この型の検定については、グルコースオキシダーゼを使用して過酸化水素を約１０μＭ／分で発生させた後、５ないし１０分後に顕色試薬を用いて反応を停止させることが好ましかった。こうしてこの検定は、簡単な診断試験を提供し、そしてこのようにして得られた情報は、多くの炎症性疾患における危険因子としてのＭＰＯを評価するために広く使用することができる。

検出体分子として使用される蛍光プローブ示す。 ヨウ化物に触媒されたＴＭＢ検定を使用するＨＯＣｌの検出のための標準曲線を示す。図中、（●）は混合直後の値の読みを、（■）は混合１時間後の値の読みを示す。 ＭＰＯによるＨＯＣｌの生成に関する時間経過を示す。

Claims (5)

1. ミエロペルオキシダーゼの可能性ある阻害剤の存在においてミエロペルオキシダーゼを過酸化水素および塩化物源と反応させて、次亜塩素酸を発生させること；
   いずれの形成される次亜塩素酸をもアミンと反応させて、相当するクロラミンを形成させること；
   いずれの形成されるクロラミンをもヨウ化物の存在において３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジンと反応させて、酸化された３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジンを形成させること；
   吸光度を測定することによって、形成される酸化された３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジンの量を決定すること；
   形成される酸化された、３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジンの量を減少させる化合物をミエロペルオキシダーゼの阻害剤として同定すること；
   を含む、ミエロペルオキシダーゼの阻害剤を同定する方法において、ミエロペルオキシダーゼの可能性ある阻害剤がジメチルスルホキシドに溶解され、該ジメチルスルホキシドが１％以下の濃度であることを特徴とする方法。
2. アミンがタウリンである、請求項１に記載の方法。
3. ヨウ化物の存在における、３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジンとタウリンクロラミンとの反応をｐＨ５.４で実施する、請求項２に記載の方法。
4. いずれの未反応過酸化水素をも、カタラーゼを使用して除去する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 高処理量スクリーンとして実施する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。

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