ES2275865T3

ES2275865T3 - Un ensayo para detectar inhibidores de la enzima mieloperoxidasa.

Info

Publication number: ES2275865T3
Application number: ES02728295T
Authority: ES
Inventors: Anthony Free Radical Research Group KETTLE
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 2001-05-08
Filing date: 2002-05-06
Publication date: 2007-06-16
Anticipated expiration: 2022-05-06
Also published as: DE60216442D1; JP2004525646A; EP1387893A1; DK1387893T3; CN1507495A; DE60216442T2; AU2002258327B2; NZ528999A; CA2446039A1; CN1228452C; EP1387893B1; JP4095446B2; ATE346951T1; IL158462A0; WO2002090575A1

Abstract

Un método para identificar inhibidores de mieloperoxidasa (MPO), comprendiendo dicho método: hacer reaccionar mieloperoxidasa con peróxido de hidrógeno y una fuente de cloruro, para generar ácido hipocloroso en presencia de un inhibidor potencial de dicha mieloperoxidasa; hacer reaccionar con una amina adecuada cualquier ácido hipocloroso formado, para formar la cloramina correspondiente; opcionalmente eliminar cualquier peróxido de hidrógeno sin reaccionar; hacer reaccionar con 3, 3'', 5, 5''-tetrametilbencidina (TMB) cualquier cloramina formada, en presencia de yoduro para formar 3, 3'', 5, 5''-tetrametilbencidina (TMB) oxidada; determinar la cantidad de 3, 3'', 5, 5''-tetrametilbencidina (TMB) oxidada formada, midiendo la absorbancia a una longitud de onda adecuada; identificar como inhibidores de mieloperoxidasa aquellos compuestos que hagan que se reduzca la cantidad de 3, 3'', 5, 5''-tetrametilbencidina (TMB) oxidada formada; caracterizado porque dicho inhibidor potencial de mieloperoxidasa se disuelve en DMSO, estando dicho DMSO a una concentración por debajo de alrededor de 1%.

Description

Un ensayo para detectar inhibidores de la enzima mieloperoxidasa.

Antecedentes de la invención

La resistencia a la infección por microorganismos implica tanto mecanismos no específicos como respuestas inmunitarias adaptativas mediadas por linfocitos B y T. Los mecanismos no específicos, tales como la acción enzimática, el pH y la secreciones de tejidos epiteliales, evitan la invención por muchos organismos. Sin embargo, cuando la primera línea de defensa se rompe, los fagocitos engullen agentes infecciosos y los procesan, conduciendo a la estimulación de células B y T. Las deficiencias en el sistema fagocítico, ya sean hereditarias o adquiridas, tienen consecuencias graves, puesto que los microorganismos con una baja patogenia para individuos normales pueden provocar infecciones recurrentes en individuos con sistemas fagocíticos ineficaces.

Los leucocitos polimorfonucleares (PMN) son de particular importancia para combatir infecciones. Estas células contienen una enzima, la mieloperoxidasa, con acción microbiocida bien documentada. Los PMN actúan no específicamente mediante fagocitosis para engullir microorganismos, incorporarlos en vacuolas, denominadas fagosomas, que se funden con gránulos que contienen mieloperoxidasa para formar fagolisosomas. En los fagolisosomas, la actividad enzimática de la mieloperoxidasa conduce a la formación (a partir de peróxido de hidrógeno y cloruro) de ácido hipocloroso, un compuesto bactericida potente. El ácido hipocloroso es oxidante por sí mismo, y reacciona con mucha avidez con tioles y tioéteres, pero también convierte aminas en cloraminas y aminoácidos aromáticos clorados. Los macrófagos son células fagocíticas grandes que, al igual que los PMN, son capaces de fagocitar microorganismos. Los macrófagos pueden generar peróxido de hidrógeno, y, con la activación, también pueden producir mieloperoxidasa. Además, la mieloperoxidasa en el plasma es captada por macrófagos.

La conexión de la actividad de la mieloperoxidasa con la enfermedad ha estado implicada en numerosas enfermedades inflamatorias, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis múltiple, el asma, la aterosclerosis, el cáncer, la fibrosis cística, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la enfermedad inflamatoria del intestino, y la artritis reumatoide. Los ensayos para la identificación de inhibidores de mieloperoxidasa serán inestimables para demostrar la contribución del ácido hipocloroso a la patogénesis de tales enfermedades, así como herramientas de diagnóstico. También proporcionarán la plataforma para el desarrollo de fármacos eficaces contra el daño de tejidos dependiente de mieloperoxidasa. Un ensayo adecuado de identificación sistemática para inhibidores de MPO debe medir la actividad de cloración de mieloperoxidasa en condiciones fisiológicas reales. Debe de ser simple, sensible, y debe de producir un producto coloreado o fluorescente, y no debe de perturbar la actividad de MPO. El detector debe de estar presente en concentraciones suficientemente elevadas para depurar todo el ácido hipocloroso producido, pero no tanto como para que reaccione directamente con la enzima. Actualmente, el ensayo usado más habitualmente se basa en la formación primaria de la cloramina de taurina a partir de ácido hipocloroso y taurina. Los intentos previos para usar formas modificadas de este ensayo de cloramina de taurina, para medir la actividad de mieloperoxidasa, han revelado problemas específicos que invalidan su uso para identificar sistemáticamente inhibidores potenciales de la enzima. Los principales problemas son que el dimetilsulfóxido (DMSO), el disolvente en el que los compuestos de ensayo se disuelven de forma más conveniente y habitual, interfiere con el ensayo, y muchos de los compuestos de ensayo absorben en la misma región que el cromóforo usado habitualmente.

El documento de Bozeman (Biochem. Pharmacology, 1992, Vol. 44, p. 553-563) se refiere a la inhibición de la enzima leucocitaria humana mieloperoxidasa por dapsona. Describe un ensayo de MPO en presencia de peróxido de hidrógeno, taurina, una fuente de cloro, dapsona y una molécula detectora (Nbs).

El documento US-B-5976823 describe el uso de yoduro como catalizador en los ensayos de detección de cloraminas, en los que el yoduro se oxida mediante cloramina para formar yodo que, a su vez, oxida a la molécula detectora TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina) para formar la forma oxidada coloreada, que se mide como un indicador de la cantidad de cloramina presente en la muestra.

Fisiológicamente, la mieloperoxidasa derivada de PMN cataliza principalmente la oxidación, dependiente de peróxido de hidrógeno, de haluros tales como iones cloruro, pero su capacidad para usar, como sustrato, dadores de electrones, tales como O-dianisidina, forma la base de un ensayo para cuantificar los PMN en el tejido inflamado. Se han descrito adaptaciones del método para evitar artefactos causados por constituyentes de los tejidos/de la sangre, tales como las enzimas citosólicas, catalasa y glutationa peroxidasa, sustratos reductores tales como glutationa y ácido ascórbico, y hemoproteínas (Grisham et al., Methods in Enzymology, Vol. 186, Ed. Packer et al., San Diego: Academic Press, p. 729-742 (1990)). Sin embargo, existe la necesidad de un método analítico más fiable para cuantificar el contenido de PMN de los tejidos inflamados, que no se vea afectado por otros constituyentes tisulares
endógenos.

La presente invención describe un ensayo simple, sensible y robusto, que evita los problemas principales asociados con los ensayos actualmente conocidos, y que es muy adecuado para la identificación de inhibidores de mieloperoxidasa. En otro aspecto, la presente invención es útil para ciertos ensayos de diagnóstico asociados con mieloperoxidasa.

Descripción de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para identificar inhibidores de mieloperoxidasa (MPO), comprendiendo el método:

: hacer reaccionar mieloperoxidasa con peróxido de hidrógeno y una fuente de cloruro, para generar ácido hipocloroso en presencia de un inhibidor potencial de dicha mieloperoxidasa;

: hacer reaccionar con una amina adecuada cualquier ácido hipocloroso formado, para formar la cloramina correspondiente;

: opcionalmente eliminar cualquier peróxido de hidrógeno sin reaccionar;

: hacer reaccionar con una molécula detectora adecuada cualquier cloramina formada, en presencia de yoduro, para formar una molécula detectora oxidada;

: determinar la cantidad de molécula detectora oxidada formada, midiendo la absorbancia a una longitud de onda adecuada;

: identificar como inhibidores de mieloperoxidasa aquellos compuestos que hagan que se reduzca la cantidad de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) oxidada formada;

caracterizado porque dicho inhibidor potencial de mieloperoxidasa se disuelve en DMSO, estando dicho DMSO a una concentración por debajo de alrededor de 1%.

En una realización de la invención anterior, la amina usada es taurina, que se convierte, mediante ácido hipocloroso, en cloramina de taurina. Una concentración adecuada de taurina es alrededor de 5 a 10 mM.

En otra realización, cualquier peróxido de hidrógeno sin reaccionar se elimina usando catalasa. Una concentración adecuada de catalasa es alrededor de 10 hasta 20 \muM.

Como fuente de cloruro, se puede usar cloruro de sodio, por ejemplo, en una cantidad de alrededor de 50 hasta 150 mM.

Se puede usar peróxido de hidrógeno como tal, o se puede generar in situ usando, por ejemplo, la generación enzimática de peróxido de hidrógeno mediante una oxidasa, tal como glucosa oxidasa o xantina oxidasa. Una concentración adecuada de peróxido de hidrógeno es, por ejemplo, 10 a 100 \muM.

En otra realización, la molécula detectora usada es un derivado de bencidina. Un derivado de bencidina preferido es 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), y la 3,3',5,5'-tetrametilbencidina oxidada formada se evalúa midiendo la absorbancia a 645 hasta 650 nm.

En realizaciones alternativas, la molécula detectora es una sonda fluorescente, tal como una de las moléculas mostradas en la Figura 1.

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(Esquema pasa a página siguiente)

1

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Por ejemplo, como molécula detectora, se puede usar dihidrorrodamina. Este compuesto no fluorescente se oxida a rodamina, que emite fluorescencia a 536 nm cuando se excita a 500 nm.

Más particularmente, el método de la presente invención comprende

: hacer reaccionar mieloperoxidasa con peróxido de hidrógeno para generar ácido hipocloroso en presencia de un inhibidor potencial de mieloperoxidasa, y hacer reaccionar con taurina cualquier ácido hipocloroso formado, para formar la cloramina de taurina, en un tampón adecuado que contiene cloruro de sodio y 10 mM de taurina;

: opcionalmente añadir catalasa a una concentración de hasta alrededor de 20 \mug/ml para destruir cualquier peróxido de hidrógeno residual;

: hacer reaccionar cualquier cloramina de taurina formada con 3,3',5,5'-tetrametilbencidina en presencia de yoduro de potasio para formar la 3,3',5,5'-tetrametilbencidina oxidada, en un tampón adecuado que contiene 3,3',5,5'-tetrametilbencidina y 10 hasta 20% de dimetilformamida; y

: medir la cantidad de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina oxidada formada.

Los tampones que se pueden usar incluyen tampones de acetato, citrato o fosfato adecuados, de pH 5 a pH 8. El tampón debe de estar presente a una concentración de al menos 10 mM, preferiblemente al menos 20 mM. Preferiblemente, la reacción con yoduro de potasio se realiza a alrededor de pH 5,4.

De este modo, en una realización particular el método de la presente invención comprende:

: Hacer reaccionar mieloperoxidasa (2,5 nm) con peróxido de hidrógeno (100 \muM) y cloruro de sodio (140 mM) en 20 mM de tampón de fosfato pH 6,5 para generar ácido hipocloroso en presencia de un inhibidor potencial de mieloperoxidasa (en el disolvente del compuesto, DMSO, a 1%), y hacer reaccionar cualquier ácido hipocloroso formado con 10 mM de taurina para formar cloramina de taurina;

: detener y desarrollar el ensayo añadiendo, como concentraciones finales, ácido acético glacial (400 mM), yoduro potásico (100 \muM) y 3,3',5,5'-tetrametilbencidina en dimetilformamida (10 mM); y

: medir la cantidad de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina oxidada formada.

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En otra realización particular, el método de la presente invención comprende:

: hacer reaccionar mieloperoxidasa (5 a 20 nm) con peróxido de hidrógeno (100 \muM) para generar ácido hipocloroso en presencia de un inhibidor potencial de mieloperoxidasa, y hacer reaccionar cualquier ácido hipocloroso formado con una taurina para formar cloramina de taurina, en 20 mM de tampón de fosfato pH 6,5 que contiene 100 mM de cloruro de sodio y 10 mM de taurina;

: añadir catalasa hasta una concentración de 20 \mug/ml para destruir cualquier peróxido de hidrógeno residual;

: hacer reaccionar cualquier cloramina de taurina formada con 3,3',5,5'-tetrametilbencidina en presencia de 200 \muM de yoduro potásico para formar 3,3',5,5'-tetrametilbencidina oxidada, en 200 mM de tampón de acetato de sodio pH 5,4 que contiene 2 mM de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina, y 10 a 20% de dimetilformamida; y

: medir la cantidad de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina oxidada formada.

: hacer reaccionar mieloperoxidasa (2,7 nm) con peróxido de hidrógeno (50 \muM) en 20 mM de tampón de fosfato pH 6,5 que contiene 140 mM de cloruro de sodio y 10 mM de taurina, en presencia de un inhibidor potencial de mieloperoxidasa; esta disolución de ensayo (150 \mul) se añadió entonces a cada pocillo de una placa de 96 pocillos;

: detener y desarrollar la reacción añadiendo a cada pocillo 50 \mul de un reactivo que comprende yoduro de sodio (100 \muM), ácido acético (400 mM) y 10 mM de TMB en 50% de dimetilformamida; y

: medir la cantidad de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina oxidada formada.

En otra realización particular, el método de la presente invención usa un tampón de ensayo que comprende 20 mM de tampón de fosfato de sodio/potasio pH 6,5 que contiene 10 mM de taurina y 100 mM de NaCl, y un reactivo desarrollador que comprende 2 mM de TMB, 200 \muM de KI, 200 mM de tampón de acetato pH 5,4 con 20% de DMF.

Otras realizaciones particulares se describen en la sección de Ejemplos más abajo.

La presente invención supera dos problemas específicos que excluyen el uso de ensayos conocidos con cloramina de taurina para medir la actividad de mieloperoxidasa, como una forma de identificación sistemática de inhibidores potenciales de la enzima. En primer lugar, un disolvente usado habitualmente, el dimetilsulfóxido, interfería con estos ensayos, y, en segundo lugar, muchos compuestos de ensayo absorbían ópticamente en la misma región que el cromóforo.

La presente invención es un ensayo modificado de cloramina de taurina en el que se minimiza la interferencia por dimetilsulfóxido, y el proceso de detección está libre de interferencia óptica por los compuestos de ensayo.

La inhibición de mieloperoxidasa purificada por los compuestos de ensayo se ha medido usando en el ensayo modificado, dejando claro que el ensayo modificado es útil para evaluar la capacidad de los compuestos para inhibir mieloperoxidasa. Además, la presente invención satisface los requisitos para una identificación sistemática de alto rendimiento (HTS). Aún más, la invención proporciona un método para detectar inhibidores de mieloperoxidasa útiles para identificar compuestos con un potencial para tratar pacientes que sufren enfermedades en las que está implicada la actividad de MPO.

Se ha encontrado que la oxidación de una molécula detectora adecuada, tal como 3,3',5,5'-tetrametilbencidina, mediante cloramina de taurina, catalizada por yoduro a un pH adecuado, proporciona un ensayo que tiene una interferencia mínima con dimetilsulfóxido (DMSO). Cuando la molécula es 3,3',5,5'-tetrametilbencidina, se forma un producto azul que tiene un máximo de absorbancia a alrededor de 645 nm.

El ensayo de la presente invención es un método sensible y específico para detectar ácido hipocloroso, HOCl. También es útil para determinar la capacidad de los compuestos de ensayo para inhibir mieloperoxidasa. Particularmente es útil para la HTS para identificar inhibidores de mieloperoxidasa.

Para una realización particular descrita en el Ejemplo 3 más abajo, se ha encontrado que 20 mM de un tampón de fosfato pH 6,5 que contiene 100 mM de cloruro de sodio y 10 mM de taurina (RNH_{2}) (en lo sucesivo PBST) minimiza la inhibición de mieloperoxidasa por peróxido de hidrógeno, y se ha encontrado que es suficiente una concentración de taurina de 10 mM para asegurar que todo el ácido hipocloroso (HOCl) generado (véase la Reacción 1, más abajo) sea atrapado como cloramina de taurina (RNHCl) (véase la Reacción 2, más abajo). Se ha encontrado que la cloramina de taurina es estable a temperatura ambiente durante al menos una hora. Por lo tanto, para minimizar el consumo potencial de cloramina de taurina mediante reacción con compuestos de ensayo, el ensayo se ha diseñado de forma que la cantidad generada es alrededor de 5-10 veces mayor que la concentración del compuesto de ensayo.

: Reacción 1: H_{2}O_{2} + Cl^{-} en presencia de MPO \rightarrow HOCl + H_{2}O

: Reacción 2: HOCl + RNH_{2} \rightarrow RNHCl + H_{2}O

Como molécula detectora, se puede usar TMB. Se usa a una concentración final de alrededor de 1 mM, de forma que este presente en un gran exceso con respecto al oxidante, lo que asegura una estequiometría 1:1 para esta reacción con cloramina de taurina. La adición de yoduro de potasio es esencial porque cataliza la reacción entre cloramina de taurina y TMB, y no se produce ninguna reacción en ausencia de yoduro (véanse las Reacciones 3 y 4, más abajo). Se ha encontrado que es óptimo un pH de alrededor de 5,4 para mantener la estabilidad de la TMB oxidada, y para permitir que la cloramina de taurina oxide el yoduro. A un pH menor, se puede producir la oxidación no específica del yoduro, y, a un pH mayor, la oxidación del yoduro es lenta, y la TMB oxidada es menos estable.

: Reacción 3: RNHCl + I^{-} + H_{2}O + H^{+} \rightarrow RNH_{2} + HOI

: Reacción 4: HOI + TMEB \rightarrow TMB_{ox} + I^{-} + H_{2}O

El ensayo de cloramina de taurina de la presente invención comprende dos partes: una, un proceso para generar cloramina de taurina, y, dos, un proceso para oxidar una molécula detectora tal como TMB. En la primera reacción, la mieloperoxidasa forma ácido hipocloroso que se hace reaccionar con taurina para ser atrapado como cloramina de taurina. En la segunda reacción, la cloramina de taurina formada se usa para oxidar cuantitativamente, por ejemplo, TMB para formar TMB oxidada.

Como forma de validar el ensayo anterior, la cloramina de taurina se generó añadiendo el reactivo HOCl a 5,5 mM de taurina en 10 mM de tampón de fosfato pH 7,4 que contiene 140 mM de cloruro de sodio. Cuando se añadió a la cloramina de taurina un volumen igual de reactivo desarrollador, la disolución se puso azul. El espectro de absorción del producto tiene un pico amplio entre 500 y 700 nm, con el máximo a 645 nm. Se determinó que el coeficiente de extinción era 14.520 \pm 330 M^{-1} cm^{-1}. Se encontró que la absorción a 645 nm es directamente proporcional a la concentración de HOCl añadida al PBST.

La concentración óptima de yoduro se determinó empleando un intervalo de concentraciones de yoduro desde 0 hasta 1 mM. Se encontró que la formación máxima de TMB oxidada se produce a concentraciones de yoduro mayores que 10 \muM.

Se sabe que el DMSO interfiere con el ensayo de cloramina de taurina cuando se promueve la oxidación de TMB reduciendo el pH hasta 1. Por lo tanto, se midió la inhibición de la oxidación de TMB mediante DMSO en el ensayo de la presente invención. Para medir la inhibición, se añadió un intervalo de concentraciones de DMSO a PBST (pH 7,4) antes de añadir 56 \muM de HOCl. Se permitió que la reacción transcurriese durante 10 minutos antes de añadir un volumen igual de reactivo desarrollador. Se encontró que el DMSO sólo tuvo un efecto minoritario sobre la detección de cloramina de taurina, con tal de que la concentración de DMSO estuviese por debajo de alrededor de 1% en el PBST.

Se usó el ensayo de cloramina de taurina de la presente invención para detectar HOCl generado por mieloperoxidasa humana purificada. Se añadió peróxido de hidrógeno (100 \muM) a 20 mM de tampón de fosfato pH 6,5 que contiene 20 nm de mieloperoxidasa, 100 mM de NaCl y 10 mM de taurina. La mezcla se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente, y la reacción se detuvo añadiendo catalasa (10 \mug/ml). Cinco minutos más tarde, se añadió el reactivo desarrollador, para detectar la cloramina de taurina generada. La cantidad de cloramina de taurina producida se comparó con la formada añadiendo 100 \muM de HOCl al PBST. Por comparación con el patrón de HOCl, se mostró que 100 \muM de peróxido de hidrógeno se había convertido en 113 \muM de HOCl. Por lo tanto, dentro del error experimental, todo el peróxido de hidrógeno se había convertido en HOCl, y después se había atrapado como cloramina de taurina. La concentración de peróxido de hidrógeno madre se determinó usando E_{240} 43,6 M^{-1} cm^{-1}, y la de hipoclorito madre usando E_{292} 350 M^{-1} cm^{-1}.

Se realizaron estudios para determinar si se produce cualquier oxidación de TMB en ausencia de cloruro. En otras palabras, para mostrar que la oxidación de TMB está limitada a la formación original de HOCl, y no se produce a través de oxidación directa mediante peróxido de hidrógeno y mieloperoxidasa. La oxidación de TMB no se observó en ausencia de cloruro, y estudios adicionales con catalasa apoyan esta observación.

La capacidad de diversos compuestos para afectar a la actividad de cloración de mieloperoxidasa confirmó que el ensayo de la presente invención estaba midiendo la producción de HOCl, y que el ensayo es adecuado para revelar inhibidores potenciales de la enzima.

Se generó ácido hipocloroso mediante mieloperoxidasa en ausencia o en presencia de 10 \muM de compuestos de ensayo en las condiciones descritas anteriormente para el experimento de transcurso de tiempo. Las reacciones se iniciaron añadiendo peróxido de hidrógeno, y se detuvieron cinco minutos más tarde añadiendo catalasa. La adición de catalasa a 20 \mug/ml logró una inhibición del 90% de la formación de HOCl.

Todos los ensayos anteriores también se pueden llevar a cabo opcionalmente en presencia de tirosina. Una concentración adecuada de tirosina es alrededor de 5 hasta 20 \muM.

Un experimento de transcurso de tiempo mostró que la tirosina aumentó la producción de HOCl debido a que el peróxido de hidrógeno estaba inhibiendo la mieloperoxidasa. Este experimento también mostró que se estaba midiendo la actividad de cloración de mieloperoxidasa, debido a que la tirosina no afecta a la actividad de peroxidación. Esta conclusión está apoyada por el efecto de dapsona que se sabe que inhibe la actividad de cloración pero no la actividad de peroxidación de mieloperoxidasa. Otros experimentos mostraron que la dapsona, ABAH, p-bromoanilina y dimetoxibenceno inhibieron la producción de HOCl en un grado similar a como se ha mostrado en otros ensayos para determinar la actividad de cloración de mieloperoxidasa. De este modo, el ensayo de la presente invención es adecuado para revelar inhibidores de mieloperoxidasa. Los experimentos también mostraron que el DMSO no afecta a la detección de HOCl. Los resultados se presentan el al Tabla 1.

TABLA 1 Inhibidores de la producción de HOCl mediante mieloperoxidasa humana purificada

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En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un método de ensayo esencialmente como se describe anteriormente, para medir los niveles de la actividad de MPO, particularmente en fluidos biológicos. La actividad de mieloperoxidasa se ha visto implicada en numerosas enfermedades inflamatorias, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis múltiple, el asma, la aterosclerosis, el cáncer, la fibrosis cística, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la enfermedad inflamatoria del intestino, y la artritis reumatoide. El ensayo de la presente invención se puede usar de este modo para buscar MPO como un factor de riesgo en un amplio intervalo de enfermedades inflamatorias, incluyendo enfermedades neuroinflamatorias.

Los neutrófilos y otros fagocitos fabrican O_{2}^{-} (superóxido) mediante la reducción de un electrón de oxígeno a costa de NADPH. La mayoría del O_{2}^{-} reacciona consigo mismo para formar H_{2}O_{2} (peróxido de hidrógeno). A partir de estos agentes, se forma un gran número de oxidantes microbiocidas muy reactivos, incluyendo HOCl (ácido hipocloroso), que se produce mediante la oxidación, catalizada por mieloperoxidasa, de Cl^{-} por H_{2}O_{2}; OH (radical hidroxilo), producido por la reducción de H_{2}O_{2} por Fe^{++} o Cu^{+}; ONOO^{-} (peroxinitrito), formado por la reacción entre O_{2}^{-} y NO; y muchos otros. Estos oxidantes reactivos se fabrican con el fin de exterminar microorganismos invasores, pero también producen daño en los tejidos circundantes, y se piensa que son de una importancia patógena en un gran número de enfermedades (B. M. Babior, Am. J. Med., 2000, 109, 33-44). Entre estas se incluyen la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis múltiple, el asma, la aterosclerosis, al cáncer, la fibrosis cística, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la enfermedad inflamatoria del intestino, la artritis reumatoide, el enfisema, el síndrome disneico agudo, la lesión por reperfusión y las enfermedades tumorales.

La MPO también se ha visto implicada en arteriopatía coronaria (Hazen et al., JAMA, 2001, 286, 2136-2142). De este modo, el ensayo de la presente invención se puede usar para buscar MPO en neutrófilos de sangre periférica como un factor de riesgo para la aterosclerosis.

Los ensayos para la identificación de inhibidores de mieloperoxidasa serán inestimables para demostrar la contribución del ácido hipocloroso a la patogénesis de tales enfermedades, así como también como herramientas de diagnóstico. También proporcionarán una plataforma para el desarrollo de fármacos eficaces contra el daño tisular dependiente de mieloperoxidasa.

La invención se ilustra ahora por medio de los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1

Se describe aquí un ensayo in vitro de MPO que se desarrolló para evaluar la inhibición de la actividad enzimática. Esencialmente, el ensayo de MPO de diseñó para medir la producción de ácido hipocloroso (HOCl), que es el producto fisiológico clave generado por la enzima in vivo. Se da un esquema de las reacciones del ensayo:

		MPO
1.	H_{2}O_{2} + Cl^{-}	\rightarrow	HOCl + H_{2}O

2.	HOCl + RNH_{2} (taurina)	\rightarrow	RNHCl (cloramina de taurina) + H_{2}O

3.	RNHCl + I^{-} + H_{2}O	\rightarrow	RNH_{2} + HOI o Icl

		H+
4.	HOI (o ICl) + TMB	\rightarrow	TMB (oxidada) + I^{-} + H_{2}O

Las mezclas de reacción en 20 mM de tampón de fosfato pH 6,5 contenían 2,5 nm de MPO (enzima humana purificada procedente de Planta), 100 \muM de H_{2}O_{2}, 140 mM de NaCl, 10 mM de taurina, 20 \muM de tirosina y el disolvente del compuesto, DMSO, a 1%. Los compuestos se preincubaron con la enzima de MPO en tampón durante alrededor de 15 minutos antes del comienzo de la reacción con H_{2}O_{2}. Toda la reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 10 minutos en una placa de 96 pocillos. La reacción se terminó mediante un reactivo de parada/de desarrollo, que constó, en sus concentraciones finales, de ácido acético glacial (400 mM), KI (100 \muM) y TMB en dimetilformamida (10 mM). Todas las concentraciones de ensayo se realizaron por duplicado con al menos dos determinaciones separadas (n=2, excepto que se establezca de otro modo). La concentración inhibidora para un compuesto se presenta como pIC_{50}, que es -log IC_{50}.

Se han ensayado diversos compuestos frente a la MPO humana. Se puede observar que la dapsona es el inhibidor más potente de las sulfonas/sulfonamidas ensayadas. Los indoles y otros compuestos también son eficaces bloqueando la producción de HOCl mediante MPO humana. Todos los datos obtenidos para las sulfonas/sulfonamidas, para los indoles y otros compuestos se presentan en las Tablas 2, 3 y 4, respectivamente.

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TABLA 2 Inhibición de la producción de HOCl, mediante MPO humana, por las sulfonas/sulfonamidas

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TABLA 3 Inhibición de la producción de HOCl, mediante MPO humana, por indoles

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TABLA 4 Inhibición de la producción de HOCl, mediante MPO humana, por otros compuestos

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Ejemplo 2

Se describe aquí el uso de un ensayo de neutrófilos humanos funcionales para determinar los efectos de los inhibidores de MPO en la producción de HOCl. Este ensayo detecta la producción de HOCl a partir de neutrófilos humanos estimulados (por ejemplo, PMA, LPS, fMLP, zymozan). Los neutrófilos humanos se purificaron, a partir de sangre heparinizada reciente, mediante centrifugación de densidad en Polymorphprep (Nycomed). Estos neutrófilos se usaron inmediatamente después de la purificación. Una mezcla de reacción estándar contenía lo siguiente: 2 x 10^{6} neutrófilos, 140 mM de NaCl, 5 mM de taurina, 0,5 mM de MgCl_{2}, 1 mM de CaCl_{2} y 1 mg/ml de glucosa. Los compuestos de ensayo se completaron en DMSO, y se añadieron a las células, con una concentración final de DMSO de 0,5%. A los compuestos de ensayo se les sometió a una preincubación durante 15 minutos a 37ºC con neutrófilos, antes de la adición del estimulante de PMA (1 \mug/ml). El ensayo se dejó entonces transcurrir durante otros 30 minutos a 37ºC. Al final de la incubación, los sobrenadantes se recogieron mediante centrifugación y se ensayaron para determinar HOCl usando el reactivo de parada/desarrollo como antes. Todos los compuestos se ensayaron por duplicado con al menos dos determinaciones separadas, n=2 procedente de dos donantes diferentes.

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En la Tabla 5 se muestran los datos para algunos de estos inhibidores.

TABLA 5 Inhibición de la producción de HOCl mediante neutrófilos humanos estimulados

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También se ha mostrado que, en las condiciones del ensayo y a las concentraciones de inhibidores usadas, los neutrófilos humanos no se ven afectados por la citotoxicidad, según se evaluó mediante la liberación de lactato deshidrogenasa a partir de neutrófilos dañados. La actividad de lactato deshidrogenasa se midió como se describe por Boehringer Mannheim GmbH, Sandhofer Strabe 116, D-68305 Mannheim, Alemania (Kit de detección de citotoxicidad -LDH- nº de cat.: 1644793).

Ejemplo 3

En este ejemplo, el ensayo se realizó haciendo reaccionar mieloperoxidasa (5 a 20 nm) con peróxido de hidrógeno (100 \muM) para generar ácido hipocloroso en presencia de un inhibidor potencial de mieloperoxidasa, y haciendo reaccionar cualquier ácido hipocloroso formado con taurina para formar cloramina de taurina en 20 mM de tampón de fosfato de pH 6,5 que contiene 100 mM de cloruro de sodio y 10 mM de taurina. Después se añade catalasa hasta una concentración de 20 \mug/ml para destruir cualquier peróxido de hidrógeno residual. Después se añade un volumen aproximadamente igual de un reactivo desarrollador en 200 nm de tampón acetato de sodio pH 5,4 que contiene 2 mM de TMB, 200 \muM de yoduro de potasio y 10 a 20% de dimetilformamida. Después se mide la cantidad de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina oxidada formada, después de alrededor de 5 minutos, usando espectroscopia de absorbancia a alrededor de 645 nm.

Ejemplo 4

Se llevo a cabo un ensayo esencialmente como se describe en el Ejemplo 3, pero:

: medir la cantidad de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina oxidada formada.

La sensibilidad y estabilidad del ensayo como se describe en el Ejemplo 4 se estableció según lo siguiente. Se añadieron concentraciones variables de HOCl a 10 mM de tampón de fosfato que contiene 10 mM de taurina, para generar cloramina de taurina, se añadieron 150 \mul de las disoluciones a placas de 96 pocillos, seguido de 50 \mul de agente desarrollador. Las placas se leyeron (A_{650}) inmediatamente después del mezclamiento, y nuevamente a una hora, para determinar la sensibilidad y estabilidad del producto. Los resultados se muestran el la Figura 2.

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Figura 2. Curva patrón para la detección de HOCl usando el ensayo de TMB catalizado por yoduro. La A_{650} se leyó inmediatamente después del mezclamiento (\medbullet), y una hora más tarde (\blacksquare).

A partir de la figura 2, se puede observar que el ensayo de TMB puede detectar fácilmente 100 \muM de HOCl cuando se realiza en una placa de 96 pocillos. El producto es muy estable con un decaimiento menor que 10% a todas las concentraciones después de una hora a temperatura ambiente.

En la figura 3 se muestra el transcurso de tiempo para la producción de HOCl mediante MPO:

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Figura 3. Transcurso de tiempo para la producción de HOCl mediante MPO.

A partir de la figura 3, es manifiesto que la conversión de H_{2}O_{2} en HOCl tomó alrededor de 30 minutos en las condiciones de reacción descritas anteriormente. La forma de la curva del progreso indica que hubo poca inhibición mediante H_{2}O_{2}. Comparando las Figuras 2 y 3, es evidente que MPO convirtió todo el H_{2}O_{2} en HOCl. De este modo, no hubo necesidad de añadir ninguna catalasa para eliminar el exceso de H_{2}O_{2}.

La producción de color para la reacción a 5 minutos aumento en sólo 6% con respecto a la siguiente hora. Esto indica que la adición de reactivo desarrollador evita que MPO produzca más HOCl y que oxide directamente a TMB.

Ejemplo 5

Tampón de ensayo: 20 mM de tampón de fosfato de sodio/potasio pH 6,5 que contiene 10 mM de taurina y 100 mM de NaCl.

Reactivo desarrollador: 2 mM de TMB, 200 \muM de KI, 200 mM de tampón de acetato pH 5,4 con 20% de DMF.

A 10 \mul de compuestos diluidos en tampón de ensayo, se añadieron 40 \mul de MPO (concentración final 2,5 nm) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después, se añadieron 50 \mul de H_{2}O_{2} (concentración final 100 \muM), o tampón de ensayo solo como control, durante 10 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo añadiendo 10 \mul de 0,2 mg/ml de catalasa (concentración final 18 \mug/ml), durante 5 minutos, antes de que se añadiesen 100 \mul de reactivo desarrollador de TMB (2 mM de TMB en 200 mM en tampón de acetato pH 5,4 que contiene 20% de dimetilformamida (DMF) y 200 \muM de KI). Las placas se mezclaron y se leyeron subsiguientemente a 650 nm.

Usando el ensayo como se describe en el Ejemplo 5, el compuesto de referencia dapsona mostró una valor de Ic_{50} de 257 \pm 73 nm en ausencia de tirosina, y 7120 \pm 610 nm en presencia de 8 \muM de tirosina. Un compuesto de referencia adicional, la hidrazida del ácido 4-aminobenzoico (ABAH), mostró un valor de IC_{50} de 86 \pm 6 nm en ausencia de tirosina, y 118 \pm 8 nm en presencia de 8 \muM de tirosina.

Ejemplo 6

Este ejemplo describe un ensayo que usa dihidrorrodamina como la molécula detectora, que es adecuado para la identificación sistemática de alto rendimiento (HTS), usando placas de 384 pocillos.

Construcción del ensayo

Disolución de enzima	110 ml de 200 mM de NaH_{2}PO_{4} pH 6,5	(20 mM final)
	110 ml de 1,4 M de NaCl	(140 mM final)
	110 ml de 100 mM de taurina	(10 mM final)
	2,75 ml de 10 mM de tirosina	(25 \muM final)
	275 \mul de 10 \muM de MPO completado hasta	(25 nm final)
	1100 ml con agua destilada

Disolución de sustrato	110 ml de 200 mM de NaH_{2}PO_{4} pH 6,5	(20 mM final)
	110 ml de 1,4 M de NaCl	(140 mM final)
	110 ml de 100 mM de taurina	(10 mM final)
	20 \mul de 8,8 M de H_{2}O_{2} completado hasta	(160 \muM final)
	1100 ml con agua destilada

Disolución de detección	110 ml de 200 mM de NaH_{2}PO_{4} pH 6,5	(20 mM final)
	110 ml de 1,4 M de NaCl	(140 mM final)
	110 ml de 100 mM de taurina	(10 mM final)
	220 ml de DMSO	(20% final)
	16,5 ml de 20 mM de KI	(300 \muM final)
	8 ml de 72,5 mM de dihidrorrodamina	(527,3 \muM final)
	completado hasta 1100 ml con agua destilada

Control negativo	20 ml de 10 mM de dapsona completado hasta	(1 mM final)
	200 ml con agua destilada

Se prepararon diluciones de compuestos usando 5% de DMSO/H_{2}O, para proporcionar una concentración de compuesto de 110 \muM en 5 \mul.

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Los controles positivos negativos contienen 0,4 \mul de vehículo DMSO, y se diluyen al igual que el compuesto. Al completar la placa diluida, se añadieron a los pocillos del control negativo 5 \mul de 1 mM del compuesto de referencia dapsona.

Procedimiento

: Se añadieron 25 \mul de la disolución de enzima a todos los pocillos por placa;

: Las placas se preincubaron entonces durante 45 minutos;

: Se añadieron 25 \mul de la disolución de sustrato a todos los pocillos por placa;

: Las placas se preincubaron entonces durante 15 minutos;

: Se añadieron 25 \mul de la disolución de detección a todos los pocillos por placa;

: Las placas se contaron leyendo la intensidad fluorescente (excitación 485 nm, emisión 530 nm, dicroico 505 nm).

Ejemplo 7 Ensayo para uso diagnóstico

Los ensayos de la actividad de MPO también se pueden realizar en tejido que contiene MPO, como sangre, fracciones celulares de sangre, esputo o tejido aislado con una inflamación aguda. Para este tipo de ensayo, se prefiere usar glucosa oxidasa para generar el peróxido de hidrógeno a alrededor de 10 \muM/min., y después detener la reacción, tras 5 a 10 minutos, con el reactivo desarrollador. De esta manera, el ensayo proporciona un ensayo de diagnóstico simple, y la información así obtenida se puede usar ampliamente para evaluar MPO como un factor de riesgo en numerosas enfermedades inflamatorias.

Claims

1. Un método para identificar inhibidores de mieloperoxidasa (MPO), comprendiendo dicho método:

: hacer reaccionar mieloperoxidasa con peróxido de hidrógeno y una fuente de cloruro, para generar ácido hipocloroso en presencia de un inhibidor potencial de dicha mieloperoxidasa; hacer reaccionar con una amina adecuada cualquier ácido hipocloroso formado, para formar la cloramina correspondiente;

: opcionalmente eliminar cualquier peróxido de hidrógeno sin reaccionar;

: hacer reaccionar con 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) cualquier cloramina formada, en presencia de yoduro para formar 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) oxidada;

: determinar la cantidad de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) oxidada formada, midiendo la absorbancia a una longitud de onda adecuada;

: caracterizado porque dicho inhibidor potencial de mieloperoxidasa se disuelve en DMSO, estando dicho DMSO a una concentración por debajo de alrededor de 1%.

2. Un método según la reivindicación 1, en la que la amina es taurina.

3. Un método según la reivindicación 2, en que la reacción de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) con la cloramina de taurina, en presencia de yoduro, se lleva a cabo a alrededor de pH 5,4.

4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que cualquier peróxido de hidrógeno sin reaccionar se elimina usando catalasa.

5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se realiza como una identificación sistemática de alto rendimiento.