CN1507495A - 检测髓过氧化物酶抑制剂的测定法 - Google Patents

检测髓过氧化物酶抑制剂的测定法 Download PDF

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Abstract

一种检测髓过氧化物酶抑制剂的测定法，该方法包括：在有所述髓过氧化物酶的可能抑制剂存在的条件下，使髓过氧化物酶与过氧化氢和氯化物源反应，产生次氯酸；使所有形成的次氯酸与适宜的胺反应，形成相应的氯胺；任选除去所有未反应的过氧化氢；在有碘化物存在的条件下，使所有形成的氯胺与适宜的检测分子反应，形成氧化的检测分子；通过在适宜的波长下测量吸光度或荧光而测定所形成的氧化检测分子的量；把引起所形成的氧化检测分子的量降低的那些化合物鉴定为髓过氧化物酶的抑制剂。还公开了髓过氧化物酶活性的诊断试验。

Description

检测髓过氧化物酶抑制剂的测定法
发明背景
抗微生物感染包括非特异性机理和由B淋巴细胞和T淋巴细胞介导的适应性免疫应答两个方面。非特异性机理，如酶的作用，pH值和上皮组织分泌物可防止很多微生物侵入。然而，当第一道防线被攻破时，吞噬细胞吞噬感染剂，并对它们进行处理，导致对B细胞和T细胞的刺激。吞噬系统缺陷，不论是先天的，还是获得性的，都会造成严重的后果，这是因为对正常个体而言，致病性较低的微生物会导致具有低效吞噬系统个体的复发性感染。
多形核白细胞(PMNs)对于抗感染特别重要。这些细胞含有一种酶，即髓过氧化物酶，经证明具有很好的杀微生物作用。PMNs利用吞噬作用非特异性地吞噬微生物，把它们掺入到被称作吞噬体的液泡中，其与含有髓过氧化物酶的颗粒体融合，形成吞噬溶酶体。在吞噬溶酶体中，髓过氧化物酶的酶活性导致次氯酸，即一种有效的杀菌化合物(从过氧化氢和氯化物)的形成。次氯酸自身发生氧化，它们绝大部分与硫醇和硫醚剧烈反应，并且可把胺转化成氯胺，并使芳族氨基酸氯化。巨噬细胞是大的吞噬细胞，如PMNs能够吞噬微生物。巨噬细胞可产生过氧化氢，在激活后，还可产生髓过氧化物酶。此外，血浆中的髓过氧化物酶可被巨噬细胞摄取。
髓过氧化物酶的活性与疾病之间的关联涉及到很多炎性疾病，包括阿尔茨海默氏病，多发性硬化，哮喘，动脉粥样硬化，癌症，囊性纤维化，慢性阻塞性肺病，炎性肠病，和类风湿性关节炎。鉴定髓过氧化物酶抑制剂的测定法对于证实次氯酸对这种疾病发病机理的影响而言非常重要，还可用作诊断的工具。它们还可为研制抗髓过氧化物酶依赖性组织损害的有效药物提供平台。MPO抑制剂的适宜筛选测定法应在实际的生理条件下测量髓过氧化物酶的氯化活性。这种测定法必须简单，灵敏，而且可产生有色的或发荧光的产物，但不能干扰MPO的活性。检测剂的浓度要足够高，从而清除产生的所有次氯酸，但不能与酶直接反应。目前，最普遍使用的测定法是以从次氯酸和牛磺酸形成牛磺酸氯胺为基础的。先前利用这种牛磺酸氯胺测定法的改进形式测量髓过氧化物酶活性的尝试揭示了下列特定问题，即，否定了其用于筛选酶的可能抑制剂的用途。主要问题是，通常最适于溶解试验化合物的溶剂二甲基亚砜(DMSO)会干扰测定，而且很多试验化合物都在与通常所用发色团相同的区内吸收。
生理上，PMN-衍生的髓过氧化物酶主要催化卤化物，如氯离子的过氧化氢依赖性氧化，但其利用电子供体，如O-联茴香胺作为底物的能力可形成测量发炎组织中PMNs的测定法的基础。方法适合就可避免由组织/血液成分，如胞质酶，过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶，还原性底物如谷胱甘肽和抗坏血酸，及血红素蛋白引起的假象，这些方法已经描述过(Grisham等，Methodsin Enzymology，Vol.186，Ed.Packer等，San Diego：Academic Press，pp.729-742(1990))。然而，仍然需要一种更可靠的分析方法来测量发炎组织的PMN含量，而不会受到其它内源性组织成分的影响。
本发明描述了一种简单，灵敏而且肯定的测定法，它可避免与目前已知测定法有关的主要问题，而且非常适于鉴定髓过氧化物酶的抑制剂。另一方面，本发明可用于与髓过氧化物酶有关的特定诊断试验。
发明描述
首先，本发明提供一种鉴定髓过氧化物酶(MPO)抑制剂的方法，该方法包括：
在有所述髓过氧化物酶的可能抑制剂存在的条件下，使髓过氧化物酶与过氧化氢和氯化物源反应，产生次氯酸；
使所有形成的次氯酸与适宜的胺反应，形成相应的氯胺；
任选除去所有未反应的过氧化氢；
在有碘化物存在的条件下，使所有形成的氯胺与适宜的检测分子反应，形成氧化的检测分子；
通过在适宜波长下测量吸光度或荧光而测定所形成的氧化检测分子的量；
把引起所形成的氧化检测分子的量降低的那些化合物鉴定为髓过氧化物酶的抑制剂.
在上述发明的其中一个实施方案中，所用的胺是牛磺酸，它可被次氯酸转化成牛磺酸氯胺。牛磺酸的适宜浓度约为5-10mM。
在另一实施方案中，所有未反应的过氧化氢是用过氧化氢酶除去的。过氧化氢酶的适宜浓度约为10-20μM。
氯化钠可用作适宜的氯化物源，例如，其量为大约50-150mM。
可直接加入过氧化氢，或利用氧化酶，如葡萄糖氧化酶或黄嘌呤氧化酶原位酶促产生过氧化氢。过氧化氢的适宜浓度为10-100μM。
在另一实施方案中，所用的检测分子是联苯胺衍生物。优选的联苯胺衍生物是3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)，所形成的氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺是通过测量645-650nM处的吸光度而测定的。
在可选择性的实施方案中，所述检测分子是一种荧光探针，如图1所示分子中的一种。
图1
Figure A0280955300051
例如，可使用二氢罗丹明作为检测分子。把这种非荧光化合物氧化成罗丹明，当在500nm处照射时，其在536nm处发射荧光。
更具体而言，本发明的方法包括：
在可能的髓过氧化物酶抑制剂存在的条件下，使髓过氧化物酶与过氧化氢反应，产生次氯酸，并在含有氯化钠和10mM牛磺酸的适宜缓冲液中，使所有形成的次氯酸与牛磺酸反应，形成牛磺酸氯胺；
任选加入过氧化氢酶至浓度高达约20μg/mL，从而除去所有残留的过氧化氢；
在有碘化钾存在的条件下，在含有3，3’，5，5’-四甲基联苯胺和10-20％二甲基甲酰胺的适宜缓冲液中，使所有形成的牛磺酸氯胺与3，3’，5，5’-四甲基联苯胺反应，形成氧化的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺；并
测量所形成的氧化的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺的量。
可使用的缓冲液包括pH值5-8的适宜醋酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液。缓冲液的浓度应为至少10mM，优选至少20mM。优选与碘化钾的反应是在大约pH5.4进行的。
因此，在其中一个具体实施方案中，本发明的方法包括：
在可能的髓过氧化物酶抑制剂(在化合物溶剂DMSO中的浓度为1％)存在的条件下，使髓过氧化物酶(2.5nM)与过氧化氢(100μM)和氯化钠(140mM)在pH6.5的20mM磷酸盐缓冲液中反应，产生次氯酸，并使所有形成的次氯酸与10mM牛磺酸反应，形成牛磺酸氯胺；
通过加入溶解在二甲基甲酰胺中的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(10mM)，碘化钾(100μM)和冰醋酸(400mM)而终止测定并显色，其中的浓度为终浓度；然后
测量所形成的氧化的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺的量。
在另一具体实施方案中，本发明的方法包括：
在可能的髓过氧化物酶抑制剂存在的条件下，使髓过氧化物酶(5-20nM)与过氧化氢(100μM)反应，产生次氯酸，并在含有100mM氯化钠和10mM牛磺酸的pH6.5的20mM磷酸盐缓冲液中，使所有形成的次氯酸与牛磺酸反应，形成牛磺酸氯胺；
加入20μM/mL浓度的过氧化氢酶以除去所有残留的过氧化氢；
在有200μM碘化钾存在的条件下，在含有2mM 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺和10-20％二甲基甲酰胺的pH5.4的200mM醋酸钠缓冲液中，使所有形成的牛磺酸氯胺与3，3’，5，5’-四甲基联苯胺反应，形成氧化的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺；并
测量所形成的氧化的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺的量。
在另一具体实施方案中，本发明的方法包括：
在可能的髓过氧化物酶抑制剂存在的条件下，使髓过氧化物酶(2.7nM)与过氧化氢(50μM)在含有140mM氯化钠和10mM牛磺酸的pH6.5的20mM磷酸盐缓冲液中反应；然后把该测定溶液(150μL)加入到96孔平板的各孔中；
通过向各孔中加入50μl试剂而终止反应并显色，其中所述试剂含有溶解在50％二甲基甲酰胺中的10mM TMB，醋酸(400mM)和碘化钠(100μM)；并
测量所形成的氧化的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺的量。
在另一具体实施方案中，本发明的方法使用了一种pH6.5的含有20mM磷酸钠/钾缓冲液的测定缓冲液，其中所述磷酸钠/钾缓冲液含有10mM牛磺酸和100mM NaCl，还使用了一种显色试剂，所述显色试剂含有2mM TMB，200μM KI，含有20％DMF的pH4.5的200mM醋酸盐缓冲液。
更具体的实施方案在下面的实施例部分中描述。
本发明克服了两个特定的问题，即已知的牛磺酸氯胺测定法作为一种筛选可能酶抑制剂的方法，不能用于测量髓过氧化物酶的活性。首先，通常所用的溶剂二甲基亚砜会干扰这些测定，其次，很多试验化合物在与发色团相同的区中光学吸收。
本发明是一种改进的牛磺酸氯胺测定法，其中二甲基亚砜所致的干扰减到了最小，而且试验化合物不会对检测过程造成光学干扰。
试验化合物对纯化的髓过氧化物酶的抑制已经使用改进的测定法测量，所述改进的测定法可用于评估化合物抑制髓过氧化物酶的能力。此外，本发明满足了高通量筛选(HTS)的要求。而且，本发明提供了一种检测髓过氧化物酶抑制剂的方法，用于鉴定可能治疗患有涉及MPO活性疾病的患者的化合物。
人们发现，在适宜的pH值下，由碘化物催化，利用牛磺酸氯胺氧化适宜的检测分子，如3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，可提供一种受二甲基亚砜(DMSO)干扰最小的测定法。当检测分子是3，3’，5，5’-四甲基联苯胺时，形成一种蓝色的产物，其在大约645nm处具有最大吸光度。
本发明的测定法对检测次氯酸HOCl而言，是一种灵敏而且特异的方法。它还可用于测定试验化合物抑制髓过氧化物酶的能力。它可特别用于HTS，鉴定髓过氧化物酶的抑制剂。
对于下面实施例3公开的具体实施方案而言，已经发现含有100mM氯化钠和10mM牛磺酸(RNH2)的pH6.5的20mM磷酸盐缓冲液(以下称为PBST)可使过氧化氢对髓过氧化物酶的抑制达到最小，而且10mM浓度的牛磺酸足以确保产生的所有次氯酸(HOCl)(见下面的反应1)作为牛磺酸氯胺(RNHCl)被捕获(见下面的反应2)。牛磺酸氯胺可在室温稳定至少1小时。因此，为使由于与试验化合物反应而消耗的牛磺酸氯胺减到最少，对该测定法进行了设计，以使所产生的量约为试验化合物浓度的5-10倍。
反应1：
反应2：
TMB可用作检测分子。它以大约1mM的终浓度使用，这样与氧化剂相比它就是过量存在的，从而保证其与牛磺酸氯胺以1∶1的化学数量反应。必须加入碘化钾是因为它催化牛磺酸氯胺与TMB之间的反应，而且在没有碘化物存在的条件下，反应不会发生(见下面的反应3和4)。大约5.4的pH值对于维持氧化的TMB的稳定性是最佳的，而且可使牛磺酸氯胺氧化碘化物。pH较低时，可以发生碘化物的非特异性氧化，pH较高时，碘化物的氧化较慢，而且氧化的TMB不太稳定。
反应3：
反应4：
本发明的牛磺酸氯胺测定法包括两个部分，一个是产生牛磺酸氯胺的过程，第二是氧化检测分子，如TMB的过程。在第一个反应中，髓过氧化物酶形成次氯酸，次氯酸与牛磺酸反应，变成牛磺酸氯胺被捕获。在第二个反应中，所形成的牛磺酸氯胺可用于定量氧化，例如TMB形成氧化的TMB。
作为一种验证上述测定法的方法，可通过在含有140mM氯化钠的pH7.4的10mM磷酸盐缓冲液中，加入试剂HOCl和5.5mM牛磺酸而产生牛磺酸氯胺。向牛磺酸氯胺中加入等体积的显色试剂时，溶液变成蓝色。产物的吸收光谱在500-700nm之间有一个较宽的峰，最大值出现在645nm处。经测定，消光系数为14,520±330M-1cm-1。645nm处的吸光度与加入到PBST中的HOCl浓度成正比。
碘化物的最佳浓度是通过使用0-1mM浓度的碘化物测定的。当碘化物的浓度大于10μM时，所形成的氧化的TMB最多。
已知当通过把pH值降低至1而促进TMB氧化时，DMSO会干扰牛磺酸氯胺测定。因此测量了本发明测定法中，DMSO对TMB氧化的抑制。为了测量抑制，在加入56μM HOCl之前，向PBST(pH7.4)中加入各种浓度的DMSO。在加入等体积显色试剂之前，该反应一直进行10分钟。人们发现，如果PBST中DMSO的浓度低于约1％，那么DMSO对牛磺酸氯胺检测的影响很小。
本发明的牛磺酸氯胺测定法可用于检测由纯化的人髓过氧化物酶产生的HOCl。把过氧化氢(10μM)加入到pH6.5的20mM磷酸盐缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液含有20nM髓过氧化物酶，100mM NaCl和10mM牛磺酸。把混合物室温温育15分钟，加入过氧化氢酶(10μM/ml)终止反应。5分钟后，加入显色试剂，以检测产生的牛磺酸氯胺。把产生的牛磺酸氯胺量与通过把100μM HOCl加入到PBST中形成的量进行比较。通过与HOCl标准比较，显示有100μM过氧化氢转化成了113μMHOCl。因此，在实验误差内，所有的过氧化氢都转化成了HOCl，然后作为牛磺酸氯胺被捕获。过氧化氢储液的浓度是使用E240 43.6M-1cm-1测定的，次氯酸盐储液的浓度是使用E292 350M-1cm-1测定的。
研究确定在没有氯化物存在的条件下TMB是否全部氧化。换句话说，是为了显示TMB的氧化被限制在HOCl的最初形成，而且它不会被过氧化氢和髓过氧化物酶直接氧化。在没有氯化物存在的条件下，未观察到TMB的氧化，而且使用过氧化氢酶进行的进一步研究支持了这一观察结果。
各种化合物影响髓过氧化物酶氯化活性的能力证实，本发明的测定法可测量HOCl的产生，而且该测定法适于发现酶的可能抑制剂。
在上述时间过程实验的条件下，在有或没有10μM试验化合物存在时，利用髓过氧化物酶产生次氯酸。加入过氧化氢开始反应，加入过氧化氢酶5分钟后终止反应。加入20μg/ml的过氧化氢酶可抑制90％HOCl的形成。
上述所有测定法也可任选在有酪氨酸存在的条件下进行。酪氨酸的适宜浓度约为5-20μM。
时间过程实验显示，酪氨酸可提高HOCl的产生，这是因为过氧化氢抑制髓过氧化物酶。该实验还显示可测量髓过氧化物酶的氯化活性，这是因为酪氨酸不会影响过氧化活性。这个结论可由氨苯砜的作用支持，已知其可抑制氯化活性，但不能抑制髓过氧化物酶的过氧化活性。进一步的实验显示，氨苯砜，ABAH，对-溴苯胺，和二甲氧基苯都可抑制HOCl的产生，其程度与在髓过氧化物酶氯化活性的其它测定法中显示的相似。因此，本发明的测定法适于发现髓过氧化物酶的抑制剂。实验还显示，DMSO不会影响HOCl的检测。结果在表1中给出。
表1纯化的人髓过氧化物酶所致的HOCl产生的抑制剂
    抑制剂     [HOCl](μM)     抑制％
无     56.2±2.1     0
氨苯砜     1.8±0.1     97
ABAH     5.5±1.1     90
酪氨酸     107.0±0.5     -90
对-溴苯胺     2.5±0.1     95.6
1，4-二甲氧基苯     15.2±1.0     73
过氧化氢酶     8.8±1.3     84
DMSO(0.1％)     52.8±1.2     6
另一方面，本发明涉及上述测定法测量MPO活性水平，特别是在生物流体中的水平的用途。髓过氧化物酶的活性涉及很多炎性疾病，包括阿尔茨海默氏病，多发性硬化，哮喘，动脉粥样硬化，癌症，囊性纤维化，慢性阻塞性肺病，炎性肠病，和类风湿性关节炎。因此，本发明的测定法可用于在很多炎性疾病，包括神经炎性疾病中寻找危险因子MPO。
嗜中性白细胞和其它吞噬细胞通过消耗NADPH时氧的一个电子还原而产生O2 -(超氧)。绝大多数O2 -自身反应形成H2O2(过氧化氢)。这些试剂可形成大量高度反应性的杀微生物氧化剂，包括HOCl(次氯酸)，它是利用H2O2通过髓过氧化物酶催化的Cl-氧化而产生的；OH(羟基)是利用Fe++或Cu+还原H2O2而产生的；ONOO-(过亚硝酸盐)是通过O2 -和NO之间的反应形成的；还有很多其它的杀微生物氧化剂。这些反应性氧化剂是为了杀死侵入的微生物而制造的，但它们也可损害近旁的组织，而且被认为是很多疾病的致病因素(B.M.Babior，Am.J.Med.，2000，109，33-44)。这些疾病包括阿尔茨海默氏病，多发性硬化，哮喘，动脉粥样硬化，癌症，囊性纤维化，慢性阻塞性肺病，炎性肠病，类风湿性关节炎，肺气肿，急性呼吸窘迫综合征，再灌注损伤及恶性肿瘤。
MPO还涉及冠状动脉疾病(Hazen等，JAMA，2001，286，2136-2142)。因此，本发明的测定法可用于在外周血嗜中性白细胞中寻找动脉粥样硬化的危险因子MPO。
鉴定髓过氧化物酶抑制剂的测定法对于证实次氯酸对这种疾病发病机理的影响很重要，而且可作为诊断的工具。它们还可为研制抗髓过氧化物酶依赖性组织损害的有效药物提供一个平台。
现在，通过下列非限制性实施例举例说明本发明。
实施例1
在这里我们描述一种体外MPO测定法，它可用于评估对酶活性的抑制。实质上，MPO测定法被设计用来测定次氯酸(HOCl)的产生，它是由酶体内产生的关键生理产物。下面给出测定反应的略图：
2.
3.
pH6.5的20mM磷酸盐缓冲液中的反应混合物含有2.5nM MPO(来源于Planta的纯化的人类的酶)，100μM H2O2，140mM NaCl，10mM牛磺酸，20μM酪氨酸和1％的化合物溶剂DMSO。在用H2O2开始反应之前，用缓冲液中的MPO酶预温育化合物大约15分钟。整个反应是室温时，在96孔平板中进行10分钟。加入终止/显色试剂终止反应，所述终止/显色试剂含有溶解在二甲基甲酰胺中的TMB(10mM)，KI(100μM)和冰醋酸(400mM)，其中所述浓度为终浓度。所有试验浓度都是进行至少两次单独的双份测定而获得的(除非另有说明，n＝2)。化合物的抑制浓度以pIC50表示，它是-log IC50。
已经对于人的MPO测试了各种化合物。从中可以看出，氨苯砜是所试验的砜类/磺胺类中最有效的抑制剂。吲哚和其它化合物也可有效阻断人MPO所致的HOCl产生。砜类/磺胺类，吲哚，和各种化合物的所有数据分别在表2，3和4中给出。
表2：砜类/磺胺类对人MPO-HOCl产生的抑制
    化合物     pIC50
氨苯砜     6.2
N-1(2-噻唑基)-磺胺     6.0
磺胺     6.0
磺胺吡啶     5.7
磺胺胍     5.5
硫代异噁唑     5.2
磺胺嘧啶     5.2
磺胺硝苯     5.1
 表3：吲哚对人MPO-HOCl产生的抑制
    化合物     pIC50
 5-甲氧基色醇     6.3
 5-甲氧基色胺     6.2
 N-乙酰-5-甲氧基色胺     6.1
 3-甲基吲哚     5.9
 6-甲氧基吲哚     5.8
 吲哚     5.7
 5-甲氧基吲哚     5.6
表4：各种化合物对人MPO-HOCl产生的抑制
    化合物     pIC50
氨基苯甲酸乙酯     6.2
3-氨基苯甲酸乙酯     6.2
对-氨基苯甲脒     5.6
吡氧噻嗪     5.6(n＝1)
双氯酚酸     5.4
香草醛     5.1
实施例2
在这里，我们描述功能性人嗜中性白细胞测定法用于测定MPO抑制剂对HOCl产生作用的用途。该测定法可检测HOCl从受刺激的(例如，PMA，LPS，fMLP，zymozan)人嗜中性白细胞的产生。人嗜中性白细胞是通过在Polymorphprep(Nycomed)上进行密度离心而从新鲜的肝素化血液中纯化的。这些嗜中性白细胞可在纯化后立即使用。标准的反应混合物含有下列成分：2×106个嗜中性白细胞，140mM NaCl，5mM牛磺酸，0.5mM MgCl2，1mM CaCl2和1mg/ml葡萄糖。试验化合物是在DMSO中配制的，并以0.5％的最终DMSO浓度加入到细胞中。在加入PMA刺激剂(1μg/ml)之前，37℃用嗜中性白细胞预温育试验化合物15分钟。然后使测定于37℃再进行30分钟。温育结束时，离心收集上清液，并使用上述终止/显色试剂测定HOCl。所有化合物都至少进行2次单独的双份测定，因为有2个不同的供体，所以n＝2。
其中一些抑制剂的数据在表5中给出。
表5：受到刺激的人嗜中性白细胞对HOCl产生的抑制
嗜中性白细胞所致的HOCl产生     pIC50
伯氨喹     4.9
磺胺     4.8
氨苯砜     4.7
磺胺吡啶     4.5
我们还可看出，在所用的测定条件和抑制剂浓度下，人嗜中性白细胞不受细胞毒性的影响，这是通过乳酸脱氢酶从受损嗜中性白细胞的释放而评估的。乳酸脱氢酶的活性是按照Boehringer MannheimGmbH，Sandhofer Strabe 116，D-68305 Mannheim，Germany(Cytotoxicity Detection Kit-LDH-Cat No：1 644 793)所述测量的。
实施例3
在这个实施例中，测定是这样进行的：在可能的髓过氧化物酶抑制剂存在的条件下，使髓过氧化物酶(5-20nM)与过氧化氢(100μM)反应产生次氯酸，然后在含有100mM氯化钠和10mM牛磺酸的pH6.5的磷酸盐缓冲液中，使所有形成的次氯酸与牛磺酸反应，形成牛磺酸氯胺。然后加入过氧化氢酶至20μg/mL的浓度，除去所有残留的过氧化氢。然后加入大约等体积的显色试剂，即含有2mM TMB，200μM碘化钾和10-20％二甲基甲酰胺的pH5.4的200nM醋酸钠缓冲液。大约5分钟后，利用吸收光谱法在大约645nM处测量所形成的氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺的量。
实施例4
这次测定基本上是按照实施例3所述进行的，区别在于：
在可能的髓过氧化物酶抑制剂存在的条件下，使髓过氧化物酶(2.7nM)与过氧化氢(50μM)在含有140mM氯化钠和10mM牛磺酸的pH6.5的20mM磷酸盐缓冲液中反应；然后把该测定溶液(150μl)加入到96孔平板的各孔中；
通过向各孔中加入50μL试剂而终止反应并显色，其中所述试剂含有溶解在50％二甲基甲酰胺中的10mM TMB，醋酸(400mM)和碘化钠(100μM)；然后
测量所形成的氧化的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺的量。
实施例4所述测定法的灵敏度和稳定性是如下确立的。把各种浓度的HOCl加入到含有10mM牛磺酸的10mM磷酸盐缓冲液中，产生牛磺酸氯胺。把150μl溶液加入到96孔平板中后，再加入50μl显色试剂。混合后，立即对平板读数(A650)，1小时后测定灵敏度和产物的稳定性。
结果在图2中表示。
图2.使用碘化物催化的TMB测定法检测HOCl的标准曲线。A650分别是在混合后立即读数的(●)，以及在1小时后读数的(■)。
从图2可以看出，当在96孔平板中进行时，TMB测定法可很容易地检测10μM HOCl。在各浓度下，室温1小时后，产物仍然非常稳定，减少不到10％。
MPO产生HOCl的时间曲线在图3中表示。
Figure A0280955300161
图3.MPO产生HOCl的时间曲线
从图3可以很明显地看出，在上述反应条件下，H2O2到HOCl的转化进行大约30分钟。曲线的形状表明，H2O2很少产生抑制。通过比较图2&3，很明显MPO可把所有的H2O2转化成HOCl。因此无需加入任何过氧化氢酶来除去过量的H2O2。
反应的颜色在5分钟的时候，只比1小时后增加了6％。这表明，加入显色试剂可防止MPO产生更多的HOCl，并防止直接氧化TMB。
实施例5
测定缓冲液：含有10mM牛磺酸和100mM NaCl的pH6.5的20mM磷酸钠/钾缓冲液。
显色试剂：2mM TMB，200μMKI，含有20％DMF的pH5.4的200mM醋酸盐缓冲液。
室温时，向10μl稀释在测定缓冲液中的化合物中加入40μl MPO(终浓度2.5nM)10分钟。然后室温加入50μl H2O2(终浓度100μM)，或加入作为对照的单独的测定缓冲液10分钟。在加入100μl TMB显色试剂(含有20％二甲基甲酰胺(DMF)和200μM KI的pH5.4的200mM醋酸盐缓冲液中，TMB的浓度为2mM)之前，通过加入10μl 0.2mg/ml的过氧化氢酶(终浓度18μg/ml)5分钟而终止反应。混合平板，随后在650nm处读数。
使用实施例5所述的测定法，在没有酪氨酸存在的条件下，对照化合物氨苯砜的IC50值为257±73nM，在有8μM酪氨酸存在的条件下，其IC50值为7120±610nM。另一个对照化合物，4-氨基苯甲酸酰肼(ABAH)在没有酪氨酸存在条件下的IC50值为86±6nM，在有8μM酪氨酸存在条件下的IC50值为118±8nM。
实施例6
该实施例描述了一种使用二氢罗丹明作为检测分子的测定法，其适于使用384孔平板进行高通量筛选(HTS)。
测定结构
酶溶液    110ml pH6.5的200mM NaH2PO4 (20mM终浓度)
          110ml 1.4M NaCl               (140mM终浓度)
          110ml 100mM牛磺酸             (10mM终浓度)
          2.75ml 10mM酪氨酸             (25μM终浓度)
          275μl 10μM MPO              (25nM终浓度)
          用蒸馏水补足至1100ml
底物溶液  110ml pH6.5的200mM NaH2PO4 (20mM终浓度)
          110ml 1.4M NaCl               (140mM终浓度)
          110ml 100mM牛磺酸             (10mM终浓度)
          20μl 8.8M H2O2            (160μM终浓度)
          用蒸馏水补足至1100ml
检测溶液  110ml pH6.5的200mM NaH2PO4 (20mM终浓度)
          110ml 1.4M NaCl               (140mM终浓度)
          110ml 100mM牛磺酸             (10mM终浓度)
          220ml DMSO                    (20％终浓度)
          16.5ml 20mM KI                (300μM终浓度)
          8ml 72.5mM二氢罗丹明          (527.3μM终浓度)
            用蒸馏水补足至1100ml
阴性对照    20ml 10mM氨苯砜            (1mM终浓度)
            用蒸馏水补足至200ml
化合物的稀释物是用5％DMSO/H2O制备的，化合物在5μl中的浓度为110μM。
阳性和阴性对照含有0.4μl DMSO赋形剂，并用化合物稀释。在稀释完平板后，向阴性对照孔中加入5μl 1mM对照化合物氨苯砜。
过程
向每个平板的所有孔中加入25μl酶溶液；
然后预温育平板45分钟；
向每个平板的所有孔中加入25μl底物溶液；
然后温育平板15分钟；
向每个平板的所有孔中加入25μl检测溶液；
然后通过阅读荧光强度而对平板计数(485nm激发，530nm发射，505nm二色)
实施例7
用于诊断用途的测定
MPO活性的测定法还可对急性炎症患者含有MPO的组织样血液，血液的细胞部分，唾液或分离组织进行。对于这种类型的测定法而言，优选使用葡萄糖氧化酶以大约10μM/分钟的速率产生过氧化氢，然后在5-10分钟后，使用显色试剂终止反应。以这种方法，所述测定法提供了一种简单的诊断试验，因此所获得的信息可广泛用于评估多种炎性疾病中的危险因子MPO。

Claims (7)

1.一种鉴定髓过氧化物酶(MPO)抑制剂的方法，该方法包括：
在有所述髓过氧化物酶的可能抑制剂存在的条件下，使髓过氧化物酶与过氧化氢和氯化物源反应，产生次氯酸；
使所有形成的次氯酸与适宜的胺反应，形成相应的氯胺；
任选除去所有未反应的过氧化氢；
在有碘化物存在的条件下，使所有形成的氯胺与适宜的检测分子反应，形成氧化的检测分子；
通过在适宜的波长下测量吸光度或荧光而测定所形成的氧化检测分子的量；
把引起所形成的氧化检测分子的量降低的那些化合物鉴定为髓过氧化物酶的抑制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测分子是3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述胺是牛磺酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其中3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)与牛磺酸氯胺的反应是在大约pH 5.4，有碘化物存在的条件下进行的。
5.根据权利要求1-4任何一项所述的方法，其中所有未反应的过氧化氢是用过氧化氢酶除去的。
6.根据权利要求1-5任何一项所述的方法，它是作为高通量筛选进行的。
7.权利要求1-6任何一项所述的方法用于髓过氧化物酶活性的诊断试验的用途。
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