JP4051448B2 - 海洋性微生物の培養法 - Google Patents
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Description
本発明は、海洋深層水を利用した海洋性微生物用の培地、及びこの培地を用いた海洋性微生物の効率的培養法に関するものである。
従来、微生物の培養では無機栄養塩類及びその他の微量栄養素を培地成分として添加し、滅菌処理を施した後、種菌を接収し培養を行っていた。しかし、無機栄養塩類及びその他の微量栄養素の要求性は微生物の種株によって千差万別である。このため、微生物を効率的に培養するためには、無機栄養塩類及びその他の微量栄養素の調製及び添加に多大な労力と経費を投入する必要があった。
近年、海洋深層水の持つ清浄性と豊富な無機栄養塩類成分が需要者の注目を浴びてブームを呼び、該海洋深層水を脱塩処理した水が飲料水の分野で利用されている。上記の海洋深層水は、現在世界中でも「ノルウエー沖」、「ハワイ沖」、「高知県の室戸岬沖」等の数カ所で実用的に取水されており、通常海洋表層で見られる風波とか表層温度変化に伴う対流、混合も生じない環境下にある海水であり、地上で使用されている各種の油類等の化学物質に起因する海洋汚染の影響を受けることがなく、極めて清浄であるという特徴がある（非特許文献１）。
海洋深層水を用いる植物プランクトンの培養において、増殖促進効果が認められることが知られている（特許文献１）。一方、海洋性微生物においても海洋深層水を利用した培養方法に増殖促進効果が認められることが知られている（特許文献２）が、後記比較例に記載しているように、豊富な無機栄養塩類成分を含む海洋深層水と培地成分（ペプトン、酵母エキス等）を一緒に高圧蒸気滅菌に供すると析出物を生じることがあり、培養後の微生物細胞回収の際に析出物も細胞と一緒に回収されてしまうという問題を生じること、更にこの析出により微生物の生長に必要な成分の一部が除かれてしまうと考えられるために同処理を施した培地中では微生物が良好な増殖を示さないことがわかった。このように高圧蒸気滅菌を利用する方法では限界があり、実用レベルでの大量培養方法として必ずしも適しているとは言えない。
本発明の課題は、特に海洋性微生物に適した培地、及びこの培地を用いた簡便で増殖促進性を有する培養法を提供することである。
本発明者らは、海洋性微生物の高効率な培養方法を見出すことを目的として、鋭意検討を行ってきた。その結果、本発明者らは、高圧蒸気滅菌処理を施さない海洋深層水中に海洋微生物の増殖を促進する効果があることを見出し、海洋深層水に濾過滅菌処理を施すことにより発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の内容は次のとおりである。
（１）海面下200メートル以深の深海から採水した海洋深層水、又は海面下200メートル以浅の海洋表層水又は既知成分の混合物である人工海水又は塩化ナトリウム水溶液（食塩水）に前記海洋深層水を混合した水溶液に濾過滅菌処理を施して得られる水溶液を含む微生物培養用培地。
（１）海面下200メートル以深の深海から採水した海洋深層水、又は海面下200メートル以浅の海洋表層水又は既知成分の混合物である人工海水又は塩化ナトリウム水溶液（食塩水）に前記海洋深層水を混合した水溶液に濾過滅菌処理を施して得られる水溶液を含む微生物培養用培地。
（２）海面下200メートル以深の深海から採水した海洋深層水、又は海面下200メートル以浅の海洋表層水又は既知成分の混合物である人工海水又は塩化ナトリウム水溶液（食塩水）に前記海洋深層水を混合した水溶液に濾過滅菌処理を施して得られる水溶液に、濾過滅菌処理又は高圧蒸気滅菌処理を施した炭素源及び窒素源等の培地成分を添加して得られる微生物培養用培地。
（３）（１）又は（２）に記載の微生物培養用培地を用いて微生物を培養することを特徴とする微生物の培養方法。
（４）（１）又は（２）に記載の微生物培養用培地を、予め滅菌処理を施された容器内に入れて混合した後、微生物の種母を植菌し、調製した培地を用いて微生物の培養を行うことを特徴とする微生物の培養方法。
（５）海面下200メートル以深の深海から採水した海洋深層水と海面下200メートル以浅の海洋表層水又は人工海水又は塩化ナトリウム水溶液との混合比率が0.001：0.999〜1.000：0である（３）又は（４）のいずれかに記載の微生物の培養方法。
（６）微生物が、海洋性微生物である（３）乃至（５）のいずれかに記載の微生物の培養方法。
（７）海洋性微生物が、ラビリンチュラ類微生物から選択される一種である（６）記載の微生物の培養方法。
（８）海洋性微生物が、スラウストキトリウム・アウレウム（Thraustochytrium aureum ）である（６）記載の微生物の培養方法。
本発明の培養法を用いることによって、細胞の増殖速度が従来の培養法に比して顕著に高まるので、高い増殖促進性を有するという利点がある。これにより、比較的短時間で多量の細胞を得ることが可能となり、培養コストの大幅な低下が達成できる。
培地の滅菌処理として従来の高圧蒸気滅菌に代わり濾過滅菌を施すことによって、滅菌後、培地中に析出物を生じずに、且つ従来方法より高い増殖促進性を有する海洋微生物培養法を実現した。
本発明における培地は、特に海洋性微生物の培養に適しているが、一般の微生物の培養にも使用することができる。そして、この海洋性微生物としてはラビリンチュラ類微生物、スラウストキトリウム・アウレウム（Thraustochytrium aureum ）等が挙げられる。
本発明における海洋深層水とは、深度 100〜10,000ｍ程度の深海から採取される海水である。なかでも好ましくは、深度 200〜1,000ｍ程度の深さから取水される海水が経済的に有利である。本発明において用いられる海洋深層水は、取水後使用することが可能である。また、海洋深層水を、海面約100ｍ以浅より取水された海水（本発明においては海洋表層水と称する）又は既知の成分の混合物である市販の人工海水又は海水の塩濃度付近の塩化ナトリウム（食塩）水溶液に適量添加して用いることも可能である。以下、塩化ナトリウム水溶液又は人工海水又は海洋表層水に海洋深層水を適量添加したものを「海洋深層水を含む水溶液」という。
本発明において、海洋深層水又は「海洋深層水を含む水溶液」の培地への混合比率は、培養しようとする海洋性微生物の種類によって使用範囲は適宜決定される。例えば、海洋性ラビリンチュラ類微生物の場合では、全培地容量の10％〜100 ％（塩化ナトリウム濃度：0.3％〜３.0％）、好ましくは25％〜80％（塩化ナトリウム濃度：0.75％〜2.4％）、さらに好ましくは40％〜60 ％（塩化ナトリウム濃度：1.2％〜1.8％）の海洋深層水又は「海洋深層水を含む水溶液」で培養される。
本発明において、「海洋深層水を含む水溶液」における海洋深層水の添加比率は、海洋深層水と海洋表層水又は人工海水又は塩化ナトリウム水溶液の比が0.001:0.999〜1:0の範囲、好ましくは0.01:0.99〜1:0、さらに好ましくは 0.1:0.9〜1:0の範囲で自在に用いることができる。
海洋性微生物の培地としては、「ＬＢ−ＮａＣｌ」培地 （培地１Lあたり、トリプトン 10g、酵母エキス 5gを溶解）（−：マイナス、ＬＢからＮａＣｌを除いたものを意味する）、「７９０Ｂｙ＋」培地（培地１Lあたり、グルコース 5g、ペプトン 1g、酵母エキス1gを溶解）などを基本培地として用いる。
基本培地成分を上述の海洋深層水又は「海洋深層水を含む水溶液に溶解して用いる。標準的な培養条件としては、例えば、ラビリンチュラ類微生物を培養する場合、「７９０Ｂｙ＋」培地成分を50％海洋深層水又は海水濃度として50％相当の「海洋深層水を含む水溶液」に溶解し、0.45μm又は0.22μmなどの一般に用いられているフィルターを使用した濾過滅菌処理を施して調製した培地を用い、温度25℃、振盪培養することで最も良好な生育結果が得られる。
次に本発明を実施例及び比較例に基づいてさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
［比較例］
「７９０Ｂｙ＋」培地の培地成分（培地１Lあたり、グルコース 5g、ペプトン 1g、酵母エキス1gを溶解）を50％海洋深層水（北海道岩内湾から取水した海洋深層水を脱イオン蒸留水と1：1で混合したもの）、50％海洋表層水（北海道苫小牧沿岸で取水した海洋表層水を脱イオン蒸留水と1：1で混合したもの）、50％人工海水（千寿製薬株式会社製マリンアートハイ（登録商標）を用い、同社規定の半分量を脱イオン蒸留水に溶解したもの）、1.5％塩化ナトリウム水溶液（50％海水の塩化ナトリウム濃度に相当）にそれぞれ溶解し、121℃、15分間の高圧蒸気滅菌処理を施した培地、各々15ｍLを滅菌済L字型試験管にそれぞれ入れた。そこにスラウストキトリウム・アウレウム（Thraustochytrium aureum）ATCC34304株を接種し、バイオフォトレコーダー（TVS126MA、アドバンテック東洋株式会社）、温度25℃で振盪培養を行い、吸光度（660ｎｍ）の変化を5分毎に測定し細胞の増殖をモニターした。その結果を図１に示す。図１において、(1)は1.5％塩化ナトリウム水溶液を用いた培地を、(2)は人工海水を用いた培地を、(3)は海洋表層水を用いた培地を、(4)は海洋深層水を用いた培地をそれぞれ示す。
「７９０Ｂｙ＋」培地の培地成分（培地１Lあたり、グルコース 5g、ペプトン 1g、酵母エキス1gを溶解）を50％海洋深層水（北海道岩内湾から取水した海洋深層水を脱イオン蒸留水と1：1で混合したもの）、50％海洋表層水（北海道苫小牧沿岸で取水した海洋表層水を脱イオン蒸留水と1：1で混合したもの）、50％人工海水（千寿製薬株式会社製マリンアートハイ（登録商標）を用い、同社規定の半分量を脱イオン蒸留水に溶解したもの）、1.5％塩化ナトリウム水溶液（50％海水の塩化ナトリウム濃度に相当）にそれぞれ溶解し、121℃、15分間の高圧蒸気滅菌処理を施した培地、各々15ｍLを滅菌済L字型試験管にそれぞれ入れた。そこにスラウストキトリウム・アウレウム（Thraustochytrium aureum）ATCC34304株を接種し、バイオフォトレコーダー（TVS126MA、アドバンテック東洋株式会社）、温度25℃で振盪培養を行い、吸光度（660ｎｍ）の変化を5分毎に測定し細胞の増殖をモニターした。その結果を図１に示す。図１において、(1)は1.5％塩化ナトリウム水溶液を用いた培地を、(2)は人工海水を用いた培地を、(3)は海洋表層水を用いた培地を、(4)は海洋深層水を用いた培地をそれぞれ示す。
海洋深層水を用いた場合、高圧蒸気滅菌処理後、培地中に析出物を生じる場合があることがわかった。高圧蒸気滅菌処理を施して調製した培地を用いた場合、人工海水で調製した培地での同菌株の増殖速度が一番良く、海洋深層水で調製した培地での増殖速度は人工海水で調整した培地よりも遅く、海洋表層水又は塩化ナトリウム水溶液で調整した培地と同程度であった。即ち、高圧蒸気滅菌処理を培地に施した場合、海洋深層水を用いることによる特段の増殖促進効果は得られなかった。
［実施例１］
所定の２倍量の「７９０Ｂｙ＋」培地の培地成分（培地１Lあたり、グルコース 10g、ペプトン 2g、酵母エキス 2g） を脱イオン蒸留水に溶解し、121℃、15分間の高圧蒸気滅菌処理を施した培地溶液 7.5ｍLに、121℃、15分間の高圧蒸気滅菌処理を施した100％海洋深層水、100％海洋表層水、100％人工海水、3％塩化ナトリウム水溶液、及び濾過滅菌処理（コーニング社製、ボトルトップフィルター、0.22μｍ 酢酸セルロース膜）を施した100％海洋深層水をそれぞれ1：1の割合で混合した培地、各々15ｍLを滅菌済L字型試験管にそれぞれ入れた。そこにスラウストキトリウム・アウレウム（Thraustochytrium aureum ） ATCC34304株を接種し、以下、比較例と同様に細胞の増殖をモニターした。その結果を図２に示す。図２において、高圧蒸気滅菌処理を施した(1) 1.5％塩化ナトリウム水溶液、(2) 人工海水、(3) 海洋表層水、(4)海洋深層水、を用いた培地、(5) 濾過滅菌処理を施した海洋深層水を用いた培地をそれぞれ示す。
所定の２倍量の「７９０Ｂｙ＋」培地の培地成分（培地１Lあたり、グルコース 10g、ペプトン 2g、酵母エキス 2g） を脱イオン蒸留水に溶解し、121℃、15分間の高圧蒸気滅菌処理を施した培地溶液 7.5ｍLに、121℃、15分間の高圧蒸気滅菌処理を施した100％海洋深層水、100％海洋表層水、100％人工海水、3％塩化ナトリウム水溶液、及び濾過滅菌処理（コーニング社製、ボトルトップフィルター、0.22μｍ 酢酸セルロース膜）を施した100％海洋深層水をそれぞれ1：1の割合で混合した培地、各々15ｍLを滅菌済L字型試験管にそれぞれ入れた。そこにスラウストキトリウム・アウレウム（Thraustochytrium aureum ） ATCC34304株を接種し、以下、比較例と同様に細胞の増殖をモニターした。その結果を図２に示す。図２において、高圧蒸気滅菌処理を施した(1) 1.5％塩化ナトリウム水溶液、(2) 人工海水、(3) 海洋表層水、(4)海洋深層水、を用いた培地、(5) 濾過滅菌処理を施した海洋深層水を用いた培地をそれぞれ示す。
図２の結果から明らかに、濾過滅菌処理を施した海洋深層水で調製した培地を用いた場合((5))の増殖速度が他の培地よりも良いことがわかった。即ち、海洋深層水には菌の増殖速度を促進する効果があること、及びその効果は海洋深層水を濾過滅菌することにより保持されるが、高圧蒸気滅菌することによって失われることがわかった。
［実施例２］
所定の２倍量の「７９０Ｂｙ＋」培地の培地成分（培地１Lあたり、グルコース 10g、ペプトン 2g、酵母エキス 2g ）を脱イオン蒸留水に溶解し、121℃、15分間の高圧蒸気滅菌処理を施した培地溶液 7.5ｍLに、濾過滅菌処理を施した100％海洋深層水、100％海洋表層水、100％人工海水をそれぞれ1：1の割合で混合した培地、各々15ｍLを滅菌済L字型試験管にそれぞれ入れた。そこにスラウストキトリウム・アウレウム（Thraustochytrium aureum ） ATCC34304株を接種し、以下、比較例と同様に細胞の増殖をモニターした。その結果を図３に示す。図３において、(1) は人工海水を用いた培地を、(2)は海洋表層水を用いた培地を、(3)は海洋深層水を用いた培地をそれぞれ示す。
所定の２倍量の「７９０Ｂｙ＋」培地の培地成分（培地１Lあたり、グルコース 10g、ペプトン 2g、酵母エキス 2g ）を脱イオン蒸留水に溶解し、121℃、15分間の高圧蒸気滅菌処理を施した培地溶液 7.5ｍLに、濾過滅菌処理を施した100％海洋深層水、100％海洋表層水、100％人工海水をそれぞれ1：1の割合で混合した培地、各々15ｍLを滅菌済L字型試験管にそれぞれ入れた。そこにスラウストキトリウム・アウレウム（Thraustochytrium aureum ） ATCC34304株を接種し、以下、比較例と同様に細胞の増殖をモニターした。その結果を図３に示す。図３において、(1) は人工海水を用いた培地を、(2)は海洋表層水を用いた培地を、(3)は海洋深層水を用いた培地をそれぞれ示す。
図３から、濾過滅菌処理を施した海洋深層水で調製した培地を用いると、濾過滅菌処理を施した海洋表層水や人工海水で調整した培地と比較し、明らかに菌の増殖速度が促進することがわかった。即ち、この増殖促進効果は、海洋深層水によってのみ達成されることがわかった。
［実施例３］
所定の２倍量の「７９０Ｂｙ＋」培地の培地成分（培地１Lあたり、グルコース 10g、ペプトン 2g、酵母エキス 2g ）を脱イオン蒸留水に溶解し、121℃、15分間の高圧蒸気滅菌処理を施した培地溶液 7.5ｍLに、濾過滅菌処理を施した海洋深層水と海洋表層水の混合比がそれぞれ0：1、0.001：0.999、0.01：0.99、0.1：0.9、0.25：0.75である「海洋深層水を含む水溶液」 7.5mLを加えたものを滅菌済L字型試験管にそれぞれ入れた。又、所定の２倍量の「７９０Ｂｙ＋」培地の培地成分（培地１Lあたり、グルコース 10g、ペプトン 2g、酵母エキス 2g ）を脱イオン蒸留水に溶解し、121℃、15分間の高圧蒸気滅菌処理を施した培地溶液 7.5ｍLに、濾過滅菌処理を施した海洋深層水と人工海水又は3％塩化ナトリウム水溶液の混合比がそれぞれ0.25：0.75である「海洋深層水を含む水溶液」 7.5mLを加えたものを、滅菌済L字型試験管にそれぞれ入れた。そこにスラウストキトリウム・アウレウム（Thraustochytrium aureum ） ATCC34304株を接種し、以下、比較例と同様に細胞の増殖をモニターした。その結果を図４に示す。図４において、「海洋深層水を含む水溶液」の海洋深層水と海洋表層水の混合比がそれぞれ(1) 0：1、(2) 0.001：0.999、(3) 0.01：0.99、(4) 0.1：0.9、(5) 0.25：0.75である培地、(6)「海洋深層水を含む水溶液」の海洋深層水と人工海水の混合比が0.25：0.75である培地、(7)「海洋深層水を含む水溶液」の海洋深層水と3％塩化ナトリウム水溶液の混合比が0.25：0.75である培地をそれぞれ示す。
所定の２倍量の「７９０Ｂｙ＋」培地の培地成分（培地１Lあたり、グルコース 10g、ペプトン 2g、酵母エキス 2g ）を脱イオン蒸留水に溶解し、121℃、15分間の高圧蒸気滅菌処理を施した培地溶液 7.5ｍLに、濾過滅菌処理を施した海洋深層水と海洋表層水の混合比がそれぞれ0：1、0.001：0.999、0.01：0.99、0.1：0.9、0.25：0.75である「海洋深層水を含む水溶液」 7.5mLを加えたものを滅菌済L字型試験管にそれぞれ入れた。又、所定の２倍量の「７９０Ｂｙ＋」培地の培地成分（培地１Lあたり、グルコース 10g、ペプトン 2g、酵母エキス 2g ）を脱イオン蒸留水に溶解し、121℃、15分間の高圧蒸気滅菌処理を施した培地溶液 7.5ｍLに、濾過滅菌処理を施した海洋深層水と人工海水又は3％塩化ナトリウム水溶液の混合比がそれぞれ0.25：0.75である「海洋深層水を含む水溶液」 7.5mLを加えたものを、滅菌済L字型試験管にそれぞれ入れた。そこにスラウストキトリウム・アウレウム（Thraustochytrium aureum ） ATCC34304株を接種し、以下、比較例と同様に細胞の増殖をモニターした。その結果を図４に示す。図４において、「海洋深層水を含む水溶液」の海洋深層水と海洋表層水の混合比がそれぞれ(1) 0：1、(2) 0.001：0.999、(3) 0.01：0.99、(4) 0.1：0.9、(5) 0.25：0.75である培地、(6)「海洋深層水を含む水溶液」の海洋深層水と人工海水の混合比が0.25：0.75である培地、(7)「海洋深層水を含む水溶液」の海洋深層水と3％塩化ナトリウム水溶液の混合比が0.25：0.75である培地をそれぞれ示す。
図４から明らかに、培地調製の際に用いる「海洋深層水を含む水溶液」は、その容積の1/1000量以上の海洋深層水を含んでいれば、スラウストキトリウム・アウレウム ATCC34304株の増殖を促進することがわかった。又、海洋深層水を混合する水溶液としては、海洋表層水の他、人工海水、塩化ナトリウム水溶液であっても良いことがわかった。
海洋性微生物は一般に増殖が非常に遅いため、それらから有用成分を生産すること等を目的とする大量培養において培養時間が長くなり、結果として培養コストが高くなる。本発明は、海洋深層水の利用により、培養時間の大幅な短縮、ひいては培養コストの大幅な削減を可能とするものであり、これら微生物由来の生理活性物質等を安価に提供することを可能とする等、産業上、極めて有用な培養技術である。
Claims (4)
- 海面下200メートル以浅の海洋表層水又は塩化ナトリウム水溶液（食塩水）に、海面下200メートル以深の深海から採水した海洋深層水に濾過滅菌処理を施した水溶液を添加した混合水溶液を含む、スラウストキトリウム属に属する海洋性微生物の培養用培地。
- 海面下200メートル以浅の海洋表層水又は塩化ナトリウム水溶液（食塩水）に、海面下200メートル以深の深海から採水した海洋深層水に濾過滅菌処理を施した水溶液を加えた混合水溶液に、濾過滅菌処理又は高圧蒸気滅菌処理を施した炭素源及び窒素源等の培地成分を添加した水溶液を含む、スラウストキトリウム属に属する海洋性微生物の培養用培地。
- 請求項１又は２記載のスラウストキトリウム属に属する海洋性微生物の培養用培地を用いてスラウストキトリウム属に属する海洋性微生物を培養することを特徴とするスラウストキトリウム属に属する海洋性微生物の培養方法。
- スラウストキトリウム属に属する海洋性微生物がスラウストキトリウム・アウレウムである請求項３記載の海洋性微生物の培養方法。
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