JP3938574B2 - 分子認識ポリマー及びその製造方法 - Google Patents
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Takeuchi, T., Mukawa, T., Matsui, J., Higashi, M., Shimizu, K. D. Molecularly Imprinted Polymers with Metalloporphyrin-Based Molecular Recognition Sites Coassembled with Methacrylic acid, Anal. Chem. 2001, 73, 3869-3874. Matsui, J., Higashi, M., Takeuchi, T. Molecularly Imprinted Polymer as 9-Ethyladenine Receptor Having a Porphyrin-based Recognition Center, J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 5218-5219. Takeuchi, T., Dobashi, A., Kimura, K. Molecular Imprinting of Biotin Derivatives and Its Application to Competitive Binding Assay Using Non-isotopic Labeled Ligands, Anal. Chem. 2000, 72, 2418-2422. Molecularly Imprinted Polymers: Man made Mimics of Antibodies and Their Application in Analytical Chemistry, Sellergren, B. Ed., Elsevier, 2001. Takeuchi, T., Haginaka, J. Separation and Sensing Based on Molecular Recognition Using Molecularly Imprinted Polymers, J. Chromatogr. B 1999, 728, 1-20. Piletsky, S.A., Piletska, E.V., Chen, B.N., Karim, K., Weston, D., Barrett, G., Lowe, P., Turner, A.P.F. Chemical grafting of molecularly imprinted homopolymers to the surface of microplates. Application of artificial adrenergic receptor in enzyme-linked assay for beta-agonists determination. Anal. Chem. 2000, 72 (18):4381-4385.
(I)一般式(3)
で表されるモノマーと、
(II)少なくとも1種の架橋剤とを含むポリマー原料を、共重合させて得られる重合体から、一般式(4)
で表される分子が遊離除去されている構造であって、
さらに、重合体中の、メルカプト基がスルホン酸基に酸化されていることを特徴としている。
(I−1)本発明の分子認識ポリマーが選択的に認識する標的分子
本発明にかかる分子認識ポリマーが選択的に認識する標的分子は、上記一般式(1)で表される分子である。式(1)中、R1は水素原子又は水酸基、R2は水素原子又は水酸基、R3はアミノ基、N−置換アミノ基、又は水酸基、Xは置換基を有するか有しない炭素数1〜6のアルキレン基を示す。上記N−置換アミノ基としては、例えば、N−メチルアミノ基、N−エチルアミノ基等を挙げることができる。また、Xが有する置換基としては、例えば、オキソ基(=O)、水酸基等を挙げることができる。また、式(1)中、−X−R3の、ベンゼン環への結合位置は特に限定されるものではないが、−X−R3はR2に対してパラ位であることがより好ましい。
本発明にかかる分子認識ポリマーは、標的分子と結合できる1以上の官能基を特異的認識部位として有し、該官能基の少なくとも1つはスルホン酸基である。これにより、上記標的分子への吸着度、選択性を大幅に向上させることが可能となる。ここで、標的分子と結合できるとは、標的分子と相互作用し、吸着されるものであれば、その結合形式は特に限定されるものではなく、どのような結合形式であってもよい。かかる結合形式には、共有結合及び水素結合、静電的相互作用、イオン結合、疎水性相互作用、π-πスタッキング等の非共有結合が含まれる。
本発明にかかる分子認識ポリマーは、分子インプリンティング法により形成されたものである。ここで、分子インプリンティング法とは、ポリマーを合成する際、ポリマー合成用のモノマーに、標的分子を混入させて重合を行い、得られたポリマーから標的分子を遊離除去することにより、標的分子の鋳型をポリマー内にとる方法をいう。標的分子に特徴的な官能基があれば、そのような官能基と結合する官能基を提供するモノマー(機能性モノマー)を、ポリマー合成用のモノマーに混入させて重合を行なう。機能性モノマーを、ポリマー合成用のモノマーに混入させる方法は、非共有結合型と共有結合型とに大別される。非共有結合型インプリンティング法は、機能性モノマーと標的分子とをそのまま混入させ、水素結合や静電的相互作用などの非共有結合を利用して、重合反応液中に、標的分子と機能性モノマーとの複合体を生じさせる方法である。これに対して、共有結合型インプリンティング法は、あらかじめ機能性モノマーと標的分子とを共有結合で複合体とした後、この複合体をモノマーとして混入させる方法である。本発明にかかる分子認識ポリマーは、分子インプリンティング法により形成されており、標的分子と結合できる1以上の官能基を特異的認識部位として有し、該官能基の少なくとも1つは、スルホン酸基であればよく、スルホン酸基又はポストインプリンティング処理で該スルホン酸基に酸化されるメルカプト基のポリマーへの導入方法については特に限定されるものではない。従って、スルホン酸基又は上記メルカプト基は、非共有結合型分子インプリンティング法により導入されたものであってもよいし、共有結合型分子インプリンティング法によって導入されたものであってもよい。これらの方法のうち、本発明にかかる分子認識ポリマーは、共有結合で最初から標的分子とメルカプト基の由来となる機能性モノマーとが複合体となったものを架橋剤とともに重合する共有結合型インプリンティング法によって形成されていることが好ましい。共有結合型のインプリントポリマーでは標的分子と機能性モノマーとの複合体の合成や標的分子の遊離除去が難しいといった問題点があるが、均一な結合能をもつ結合部位を形成することが可能となる。すなわち、特異的認識部位としての官能基は、ポリマー中に形成される、標的分子を遊離除去した後の穴に標的分子が結合するときに、その標的分子の対応する官能基と一致する場所に導入されることが可能となる。
本発明にかかる分子認識ポリマーは、上述したように、いわゆる共有結合型分子インプリンティング法により製造することが好ましい。すなわち、本発明にかかる分子認識ポリマーは、標的分子と機能性モノマーとを結合した複合体であるモノマーと、架橋剤とを含むポリマー材料を共重合させて重合体をえる重合工程と、該重合工程で得られた重合体から標的分子を遊離除去させる遊離除去工程とを含む方法により製造できる。
本発明にかかる分子認識ポリマーは、カテコールアミンに対し、高い吸着能、選択性を有する。このような、カテコールアミンの吸着、選択は、カテコールアミンが極めて希薄な濃度であっても有効に行なうことができる。従って、種々の物質の混合物である生体試料から微量成分であるカテコールアミンのみを分析することが可能となり、疾病診断において非常に有用である。例えば、本発明にかかる分子認識ポリマーを、HPLCカラムに充填して、カテコールアミン又はその類似物質の分析を行なうことができる。また、発明の分子認識ポリマーを、分析前処理において、目的物質の濃縮に用いることもできる。さらには、センサーとして、目的物質の検出に用いることもできる。
<1.標的分子と機能性モノマーとの複合体(一般式(35)、(36)で表される化合物)の合成>
(1−1)チオ酢酸のラジカル付加
3,4-Dimethoxy styrene はAldrich(特級)から、チオ酢酸はTCI から、酢酸エチル(特級)、ヘキサン(1級)は和光純薬工業からそれぞれ購入した。
ジクロロメタン(特級)、塩化カルシウム(特級)、水素化カルシウム(特級)、三臭化ホウ素(特級)、ジエチルエーテル(特級)、硫酸ナトリウム(特級)、酢酸エチル(特級)、ヘキサン(1級)は和光純薬工業から購入した。
水酸化ナトリウム(特級)、エタノール(特級)、1 M 塩酸(精密分析用)、酢酸エチル(特級)、ヘキサン(1級)、硫酸ナトリウム(特級)は和光純薬工業から購入した。
トリエチルアミン(特級)、酢酸エチル(特級)、ヘキサン(1級)は和光純薬工業から購入し、アリルジスルフィド(特級)はAldrich から購入した。
4-Vinylphenyl Boronic Acid はAldrich から購入し、トルエン(特級)、硫酸マグネシウム(特級)、水素化カルシウム(特級)は和光純薬工業から購入した。
(2−1)重合過程
クロロホルム(特級)、ジビニルベンゼン(55%異性混合物)、スチレン(特級)、2-2,アゾイソブチロニトリル(特級)、硫酸マグネシウム(特級)、水素化カルシウム(特級)は和光純薬工業から購入した。
メタノール(特級)、水素化ホウ素ナトリウム(特級)、塩酸(精密分析用)は和光純薬工業から購入した。
硝酸銀(特級)、メタノール(特級)、硝酸鉄(III)九水和物(特級) 、チオシアン酸カリウム(特級)は和光純薬工業から購入した。
過酸化水素(特級)、酢酸(特級)、1 M 硫酸(容量分析用)、メタノール(特級)、塩化ナトリウム(特級)は和光純薬工業から購入した。
液体クロマトグラフィーによりインプリントポリマーの結合実験を行った。液体クロマトグラフィーにカラムを接続し、メタノール-10 mM リン酸バッファー(PH6.8)(50:50,v/v)を流量1 ml/min でベースラインが安定するまで流した。各サンプル10 μl をカラムにインジェクションし、ボイドマーカー(硝酸カリウム)、サンプル(ドーパミン)の保持時間を計測した。その他、対照サンプルとして保持時間を計測した物質に、カテコール、チラミン、3,4-Dihydroxyphenylacetic Acid(DOPAC)、4-Hydroxy-3-methoxyphenylacetic Acid(HVA)を用いた。液体クロマトグラフィーの計測にはオートインジェクター、ポンプ(322pump)、UV ランプ(UV/VIS-152)からなる計器(GILSON)にパソコンをつなぎ、計測プログラムにはUnipoint V.3.00 を使用して計測した。その際の溶離液はメタノール-10 mM リン酸バッファー(PH6.8)(50:50,v/v)を用い、波長はUV254 nm で行った。各サンプル、ボイドマーカーはそれぞれ10 mM のメタノール-10 mM リン酸バッファー(PH6.8) (50:50,v/v)溶液を調製し、クロマトチューブに移して計測した。
k'=(tR−t0)/t0 …(42)
式(42)中、t0はボイドマーカーとして用いた硝酸カリウムの溶出時間を、tRはサンプルの保持時間である。それぞれのインプリントポリマー IP1、IP2 に対するサンプルの保持係数を以下の表2に示す。
結合実験において、インプリントポリマー IP1、IP2 中のSH 基を酸化していないものを用いた以外は、実施例と同様にして、各サンプルについて、上記保持係数k’を求めた。それぞれのインプリントポリマー IP1、IP2 に対するサンプルの保持係数を以下の表2に示す。
ボロン酸エステルは通常アルカリ性(PH8 以上)の条件下で強く結合するためアルカリ性の緩衝液を用いることでこのボロン酸エステルの相互作用が強く現れると思われるが、アルカリ性の緩衝液ではポリマー中のSO3H基が中和されナトリウムなどの塩になってしまうことからSO3H 基とアミノ基の酸・塩基相互作用の影響がほとんどでないことが考えられる。このため今回は中性付近の緩衝液を溶離液としたが、さらにほかのPH 緩衝液での保持係数と比較する必要があると思われる。
102 機能性モノマー
103 架橋剤
104 ポリマー
105 インプリントポリマー
106 結合部位
Claims (7)
- 分子インプリンティング法により形成された、一般式(1)
で表される標的分子と結合できる官能基を特異的認識部位として有する分子認識ポリマーであって、
(I)一般式(3)
で表されるモノマーと、
(II)少なくとも1種の架橋剤とを含むポリマー原料を、共重合させて得られる重合体から、一般式(4)
で表される分子が遊離除去されている構造であって、
さらに、重合体中の、メルカプト基がスルホン酸基に酸化されていることを特徴とする分子認識ポリマー。 - 上記官能基の少なくとも1つは、スルホン酸基であることを特徴とする請求項1に記載の分子認識ポリマー。
- 上記スルホン酸基は、上記分子認識ポリマー中、上記標的分子のR 3 と対応する位置に配置されていることを特徴とする請求項1又は2に記載の分子認識ポリマー。
- 上記官能基として、ボロン酸基−B(OH) 2 を有することを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の分子認識ポリマー。
- 上記標的分子は、カテコールアミンであることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の分子認識ポリマー。
- (I)一般式(3)
で表されるモノマーと、
(II)少なくとも1種の架橋剤とを含むポリマー原料を、共重合させて重合体を得る重合工程と、
上記重合工程で得られた重合体から、一般式(4)
で表される分子を遊離除去してインプリントポリマーを得る遊離除去工程とを含むことを特徴とする、一般式(1)
で表される標的分子を認識する分子認識ポリマーの製造方法。 - さらに、上記遊離除去工程で得られたインプリントポリマーを酸化処理して、該インプリントポリマー中の、メルカプト基をスルホン酸基に酸化する酸化工程を含むことを特徴とする請求項6に記載の分子認識ポリマーの製造方法。
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