JP2006218375A - 茶カテキンの分離濃縮方法、それに用いる分離剤および当該分離剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 茶抽出物中の特定の茶カテキンを高純度にかつ高収率で得ることのできる分離剤および分離濃縮法を提供する。
【解決手段】 所望の種類の茶カテキンの存在下、その茶カテキンに対し相補的に相互作用を有する化合物を導入した高分子粒子から茶カテキンを除去し、もって茶カテキンに対する鋳型構造を有する高分子粒子を製造する。この高分子粒子を分離剤として使用し、高速液体クロマトグラフィー法等によって茶抽出物と接触させ、分離剤に茶カテキンを吸着させることにより、所望の種類の茶カテキンを分離濃縮する。
【選択図】 なし

Description

本発明は、所望の種類の茶カテキンを分離濃縮する方法、それに好適に用いられる新規な分離剤、およびその分離剤の製造方法に関するものである。

茶葉中に多く含まれている茶カテキン類は、ポリフェノール化合物の一種であり、（−）エピカテキン（ＥＣ）、（−）エピガロカテキン（ＥＧＣ）、ならびにこれらの没食子酸エステルである（−）エピカテキンガレート（ＥＣｇ）および（−）エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）の４種が主なものとして挙げられる。これらの茶カテキン類は、乾燥茶葉中に通常１０〜１５質量％含まれている。

上記茶カテキン類には、抗酸化作用、抗菌作用、消臭作用、血中コレステロール抑制作用などの化学的・生理的活性作用があることが知られている。またこれらの作用は、遊離型カテキンよりも、エステル型カテキン（ガレート型カテキン）の方が強く、特に（−）エピガロカテキンガレートが強いと報告されている。

こうした茶カテキン類を高純度で得るには、茶葉中にて上記茶カテキン類と共存する夾雑物からの分離が不可欠である。かかる夾雑物としては、カフェイン（Ｃａｆ）、糖類、アミノ酸、有機酸、カテキン酸化重合物などがある。

従来、茶葉から茶カテキン類を回収する技術としては、有機溶媒を用いた液−液抽出法やクロマトグラフィーを用いた分離法が知られている。

例えば、特許文献１には、茶葉の抽出溶液からクロロホルムでカフェインを除去した後、酢酸エチルに転溶することにより、天然抗酸化剤としての茶カテキン類を製造することが記載されている。また、特許文献２には、クロマトグラフィーを用い、茶カテキン類を選択的に充填剤に吸着させた後、その茶カテキン類を親水性有機溶媒により溶出させることにより、茶カテキン類を製造することが記載されている。さらに、特許文献３には、ゲルビーズを用いた多段バッチプロセスにより、茶カテキン類を製造することが記載されている。
特公平１−４４２３４号公報 特開平２−３１１４７４号公報 特開平３−１４５７２号公報

しかしながら、これら従来の製造方法により得られるものは、茶カテキン類の混合物、すなわち、（−）エピカテキン、（−）エピガロカテキン、（−）エピカテキンガレートおよび（−）エピガロカテキンガレートを主とした茶カテキン類の混合物である。

具体的に、液−液抽出法においては、通常の溶媒では茶カテキン類と他の夾雑物との分配係数が１前後であるため、回収率が低く、多段抽出を必要とするとともに、茶カテキン類の混合物しか回収することができない。

また、粒径の比較的大きい樹脂を充填剤として用いた低圧クロマトグラフィー分離法によれば、茶カテキン類を高効率で回収することができるが、得られるものは茶カテキン類の混合物である。特許文献３に記載のバッチプロセスにおいても、茶カテキン類を混合物として回収している。

一方、中圧の分取用クロマトグラフィー分離法によれば、エステル型カテキン類と遊離カテキン類との分離が可能であり、また高圧の分取用クロマトグラフィー分離法によれば、個々の茶カテキン類を得ることが可能であるが、それらクロマトグラフィー分離法では高価なカラム充填剤を使用するため、所望の茶カテキンを経済的に生産することができない。

本発明は、このような問題に鑑みてなされたものであり、茶抽出物中の特定の茶カテキンを高純度にかつ高収率で得ることのできる分離剤および分離濃縮法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、第１に本発明は、所望の種類の茶カテキンを使用して得られた鋳型構造を有する高分子粒子からなる、茶カテキンを分離するための分離剤を提供する（請求項１）。

上記発明（請求項１）においては、分離剤を構成する高分子粒子が所望の種類の茶カテキンに対する鋳型構造を有し得るため、かかる分離剤によれば、当該所望の種類の茶カテキンを高純度にかつ高収率で分離・濃縮することが可能である。

上記発明（請求項１）に係る分離剤が、エピガロカテキンガレートを分離するための分離剤（請求項２）、エピカテキンガレートを分離するための分離剤（請求項３）、またはエピガロカテキンガレートおよびエピカテキンガレートの混合物を分離するための分離剤であれば（請求項４）、抗酸化作用、抗菌作用、消臭作用、血中コレステロール抑制作用などの化学的・生理的活性作用の強いエピガロカテキンガレートおよび／またはエピカテキンガレートを高純度にかつ高収率で得ることができる。

第２に本発明は、第１の種類の茶カテキンと、前記第１の種類の茶カテキンとフェノール性水酸基の数のみ異なる第２の種類の茶カテキンとを使用して得られた鋳型構造を有する高分子粒子からなる、前記第１の種類の茶カテキンおよび前記第２の種類の茶カテキンを分離するための分離剤を提供する（請求項５）。

上記発明（請求項５）に係る分離剤によれば、２種類の茶カテキンを混合物として高純度にかつ高収率で分離・濃縮することが可能である。２種類の茶カテキンの混合物が特定の作用を有する場合、上記発明（請求項５）に係る分離剤は非常に有用である。

上記発明（請求項５）において、前記第１の種類の茶カテキンはエピガロカテキンガレートであり、前記第２の種類の茶カテキンはエピカテキンガレートであることが好ましい（請求項６）。かかる発明によれば、抗酸化作用、抗菌作用、消臭作用、血中コレステロール抑制作用などの化学的・生理的活性作用の強いエピガロカテキンガレートおよびエピカテキンガレートの混合物を高純度にかつ高収率で得ることができる。

第３に本発明は、所望の種類の茶カテキンの存在下、前記茶カテキンに対し相補的に相互作用を有する化合物を導入した高分子粒子から前記茶カテキンを除去し、もって茶カテキンに対する鋳型構造を有する高分子粒子を製造することを特徴とする、茶カテキンを分離するための分離剤の製造方法を提供する（請求項７）。

上記発明（請求項７）によれば、上記発明（請求項１〜６）に係る分離剤を効率的に製造することができる。なお、上記発明（請求項７）において、存在させる所望の種類の茶カテキンは、１種であってもよいし、２種以上であってもよく、２種以上の場合には、その混合比を適宜変えることにより、分離濃縮対象となる２種以上の茶カテキンの比率を制御することが可能である。

上記発明（請求項７）において、前記化合物は重合性単量体であり、当該重合性単量体を種粒子に含浸させ、重合することにより前記高分子粒子を得ることが好ましい（請求項８）。かかる発明（請求項８）によれば、高速液体クロマトグラフィーに好適な粒子径および粒子径の変動係数を有する高分子粒子を製造することができる。

上記発明（請求項７，８）において、前記化合物は、含窒素複素環を有する化合物であることが好ましい（請求項９）。かかる発明（請求項９）によれば、茶カテキンに対する吸着能が非常に高い高分子粒子を製造することができる。

第４に本発明は、前記分離剤（請求項１〜６）と、茶抽出物とを接触させ、前記分離剤に茶カテキンを吸着させることを特徴とする茶カテキンの分離濃縮方法を提供する（請求項１０）。

上記発明（請求項１０）によれば、所望の種類の茶カテキンを高純度にかつ高収率で分離・濃縮することが可能である。上記分離剤（請求項１〜６）は、特に高速液体クロマトグラフィーに適用することが好ましく、それによって、茶抽出物から、複雑な前処理を行うことなく、所望の茶カテキンを高純度に、かつ低コストで連続的に製造することができる。

本発明によれば、茶抽出物中の特定の茶カテキンを高純度にかつ高収率で得ることのできる分離剤が得られる。また、本発明の分離濃縮法によれば、特定の茶カテキンを高純度にかつ高収率で得ることができる。

以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の分離剤は、所望の種類の茶カテキンに対する鋳型構造を有する高分子粒子からなる。かかる鋳型構造を有する高分子粒子の製造方法は特に限定されるものではなく、いわゆる分子インプリント法、例えば、鋳型分子である所望の茶カテキンの存在下、当該茶カテキンに対し相補的に相互作用を有する化合物を導入した高分子粒子から茶カテキンを除去する方法等によって製造することができる。

なお、分子インプリント法としては、共有結合により鋳型分子と機能性モノマーとの複合体を形成した後、架橋性モノマーを混合して重合し、得られたポリマーから加水分解等により鋳型分子を除去する共有結合型の方法（G. Wulff, W. Vesper, R. Grobe-Eisler and A. Sarhan, Makromol.Chem., 178, 2799 (1977)）；イオン結合、水素結合等の非共有結合により鋳型分子と機能性モノマーとの複合体を形成した後、架橋性モノマーを混合して重合し、得られたポリマーから抽出、蒸発等により鋳型分子を除去する非共有結合型の方法（K. Mosbach, Trends Biochem. Sci., 19, 9-14 (1994)）；溶解または溶融したポリマーに鋳型分子を溶解・分散させ、当該鋳型分子とポリマーの官能基とを共有または非共有結合させて固化した後、鋳型分子を除去する簡易分子インプリント法（H. Y. Wang, Langmuir, Vol.13, No.20, 5396-5400 (1997)；Yoshikawa M:, "Molecular and Ionic Recognition with Inprinted Polymers (ACS Symposium Series 703)", Bartsch RA, Maeda M ed., Chap.12, ACS, Washington DC (1998)）などが知られており、これらの方法を利用することもできる。

本発明の分離剤は、いわゆるシード重合法によって好ましく製造することができる。以下、本発明の一実施形態として、シード重合法による分離剤の製造方法について説明する。

シード重合法では、種粒子に重合性単量体を含浸させて種粒子を肥大化させるとともに、所望の茶カテキンの存在下、当該茶カテキンに対し相補的に相互作用を有する化合物、好ましくは重合性単量体を種粒子に含浸させた後、当該種粒子の懸濁液中にて重合を行うことが好ましい。

種粒子としては、乳化重合、ソープフリー乳化重合、分散重合、懸濁重合等の一般によく知られた造球重合により製造される重合体粒子を使用することができる。中でも、乳化重合、ソープフリー乳化重合または分散重合によって得られる重合体粒子は、懸濁重合により製造されたものに比較して、その粒子径分布が狭いため種粒子として好ましい。分散重合により製造された重合体粒子（粒径：１〜１０μｍ）を種粒子としてシード重合するにあたっては、例えば、特開昭６４−２６６１７号公報に記載の方法を利用することができる。

種粒子の材料としては、芳香族ビニル単量体および／または脂肪族ビニル単量体を重合してなる重合体が好ましい。この重合体は、上記単量体の単独重合体であってもよいし、芳香族ビニル単量体と脂肪族ビニル単量体との共重合体であってもよいし、上記単量体と他の単量体、例えば重合性ポリビニル単量体との共重合体であってもよい。ただし、重合体中における他の単量体の含有量は、１質量％以下であることが好ましい。種粒子の好ましい例として、ポリスチレンまたはポリメタクリル酸エステルからなる重合体粒子が挙げられる。

種粒子の粒子径は、０．１〜１０μｍであることが好ましく、粒子径の変動係数は１０％以下であることが好ましい。

種粒子に含浸させる重合性単量体としては、重合性ビニル単量体（重合性モノビニル単量体）および／または重合性ポリビニル単量体を使用することが好ましい。

重合性ビニル単量体としては、（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸等の不飽和カルボン酸類；（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル等の（メタ）アクリル酸アルキルエステル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸フェニル、（メタ）アクリル酸３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸２，３−ジヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸２−クロロエチル、（メタ）アクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸ジメチルアミノエチル、（メタ）アクリル酸ジエチルアミノエチル、（メタ）アクリル酸テトラヒドロフルフリル等の（メタ）アクリル酸エステル類；（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド誘導体； スチレン、メチルスチレン、α−メチルスチレン、クロロスチレン、クロロメチルスチレン等のスチレンおよびそのアルキルまたはハロゲン置換体；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類、メチルビニルエーテル、エチルビニルエーテル等のビニルエーテル類；アリルアルコールおよびそのエステルまたはエーテル類；（メタ）アクリロニトリル、ビニルスルホン酸、ｐ−スチレンスルホン酸等のその他のビニル化合物などが挙げられ、これらの重合性ビニル単量体は、単独でまたは二種類以上を混合して用いることができる。

また、重合性ポリビニル単量体としては、芳香族ポリビニル単量体または脂肪族ポリビニル単量体が好適である。芳香族ポリビニル単量体としては、ジビニルベンゼンやビスビニルフェニルアルカンが好ましい。脂肪族ポリビニル単量体としては、多価アルコールのポリ（メタ）アクリレートやアルキレンポリ（メタ）アクリルアミドが好ましく、具体的には、（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、グリセリンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラヒドロキシブタンジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、メチレンビスアクリルアミド、ピペラジンジアクリルアミド、ジアリル酒石酸ジアミド等が挙げられる。上記重合性ポリビニル単量体は、単独でまたは二種類以上を混合して用いることができる。

上記重合性ビニル単量体および重合性ポリビニル単量体の種類および量は、使用する種粒子の大きさと目的とする粒子の大きさを考慮して適宜決定されるが、得られる分離剤に耐溶媒性を付与するため、また得られる分離剤を高速液体クロマトグラフィー用分離剤として用いる場合には耐圧性を高めるため、種粒子に含浸される全重合性ビニル単量体中、重合性ポリビニル単量体を１質量％以上、特に２０〜９５質量％含むことが好ましい。

シード重合には、通常、ラジカル重合開始剤を使用する。ラジカル重合開始剤としては、過酸化ベンゾイル、ブチルパーオキシヘキサノエート等の過酸化物系開始剤、またはアゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソバレロニトリル等のアゾ系開始剤が好ましい。重合開始剤は、重合性単量体の含浸と同時にまたはその前後に種粒子に含浸させる。

シード重合中の種粒子の凝集、変形または融着を防止し、種粒子の分散安定性を増すために、水性媒体中には、分散安定剤（懸濁安定剤）を加えることが好ましい。分散安定剤としては、公知のアニオン系またはノニオン系の界面活性剤の他、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンイミン、ビニルアルコール／酢酸ビニル共重合体等を使用することができ、それらは単独でまたは二種類以上を混合して使用することができる。なお、アニオン系界面活性剤としては、セッケン、アルキルベンゼンスルフォン酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム等が挙げられ、ノニオン系界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェノラート、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。

シード重合法によって得られる高分子粒子の多孔性の有無は特に規定されるものではないが、分離剤を多量の茶カテキンの分離精製に使用する場合には、分離剤の吸着容量を大きくするために、高分子粒子は多孔質構造を有することが好ましい。高分子粒子に多孔質構造を導入するには、シード重合時に、多孔質化剤としての多孔質化溶媒を種粒子に含浸させることが好ましい。

多孔質化溶媒としては、シード重合時に相分離剤として作用し、粒子の多孔質化を促進する有機溶媒である、脂肪族または芳香族の炭化水素類、エステル類、ケトン類、エーテル類、アルコール類等が挙げられる。具体的には、例えば、トルエン、キシレン、シクロヘキサン、オクタン、酢酸ブチル、フタル酸ジブチル、メチルエチルケトン、ジブチルエーテル、１−ヘキサノール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール等が挙げられ、これらは単独でまたは２種以上混合して使用することができる。また、場合によっては、使用する多孔質化溶媒の種類、例えば芳香族炭化水素類であるかアルコール類であるかによって、得られる分離剤に所定の特性を付与することもできる。

シード重合時に存在させる鋳型分子としての茶カテキンの種類は特に限定されるものではなく、通常は、（−）エピカテキン、（−）エピガロカテキン、（−）エピカテキンガレートおよび（−）エピガロカテキンガレートからなる群から選ばれる少なくとも１種である。

ただし、本発明の分離剤を使用して分離濃縮する対象としては、抗酸化作用、抗菌作用、消臭作用、血中コレステロール抑制作用などの化学的・生理的活性作用が特に強い（−）エピガロカテキンガレート、当該化学的・生理的活性作用が比較的強い（−）エピカテキンガレート、またはそれら（−）エピガロカテキンガレートと（−）エピカテキンガレートとの混合物が好ましく挙げられる。それらの茶カテキンを分離濃縮可能な分離剤を得るには、（−）エピガロカテキンガレートのみ、（−）エピカテキンガレートのみ、または（−）エピガロカテキンガレートと（−）エピカテキンガレートとの混合物をシード重合時に存在させることが好ましい。

（−）エピガロカテキンガレートをシード重合時に存在させて得られた分離剤によれば、（−）エピガロカテキンガレートおよび（−）エピカテキンガレート、特に（−）エピガロカテキンガレートを分離濃縮することができる。また、（−）エピカテキンガレートをシード重合時に存在させて得られた分離剤によれば、（−）エピカテキンガレートおよび（−）エピガロカテキンガレート、特に（−）エピカテキンガレートを分離濃縮することができる。

（−）エピガロカテキンガレートおよび（−）エピカテキンガレートは、同じガレート型カテキンであり、（−）エピカテキンガレートは、（−）エピガロカテキンガレートよりもフェノール性水酸基の数が１つ少ない茶カテキンである。上記のように、（−）エピガロカテキンガレートと（−）エピカテキンガレートとの混合物をシード重合時に存在させて得られた分離剤によれば、（−）エピガロカテキンガレートおよび（−）エピカテキンガレートの混合物を分離濃縮することができる。また、シード重合時に存在させる（−）エピガロカテキンガレートと（−）エピカテキンガレートとの混合比率を変えることによって、分離濃縮される（−）エピガロカテキンガレートと（−）エピカテキンガレートとの比率を制御することも可能である。

茶カテキンに対し相補的に相互作用を有する重合性単量体は、茶カテキンが有するフェノール性水酸基に対して静電的相互作用を有するとともに、茶カテキンが有する芳香環に対してπ電子相互作用を有する、含窒素複素環を含むことが好ましい。含窒素複素環を含む重合性単量体としては、例えば、ビニルピリジン、ビニルピロリドン等が挙げられ、中でも特にビニルピリジンが好ましい。かかる重合性単量体を種粒子に含浸させ、得られる高分子粒子に含窒素複素環を導入することにより、茶カテキンに対する吸着能を極めて高くすることができる。

茶カテキンに対し相補的に相互作用を有する重合性単量体として、重合性ビニル単量体を用いる場合、種粒子に含浸させる全重合性ビニル単量体中、上記相互作用を有する重合性単量体を５質量％以上、好ましくは５〜８０質量％含有することが好ましい。

なお、シード重合法で製造される高分子粒子に分離対象としての化合物（本発明では茶カテキン）に対する鋳型構造を導入する方法としては、例えば、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｐ５５５，１９９７等に記載の方法を利用することができる。

上記重合性単量体、ラジカル重合開始剤、多孔質化溶媒、茶カテキンに対し相補的に相互作用を有する重合性単量体等を種粒子に含浸させる際に、種粒子に対して親和性が高い溶媒でそれらの成分を希釈して含浸させることもできる。このような溶媒としては、アルコール、アセトン等の水混和性溶媒や、ジクロロエタン、塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素等が挙げられる。

ここで、乳化重合法またはソープフリー乳化重合法で製造された０．１〜１．５μｍの重合体を種粒子とする場合には、まず１−クロロドデカン、フタル酸ジブチル等の膨潤助剤によって種粒子を一次膨潤させた後、重合性ビニル単量体および／または重合性ポリビニル単量体を種粒子に含浸させてシード重合することにより、粒子径が１００μｍ程度までであり、かつ粒子径が均一な多孔質高分子粒子を製造する方法（例えば J. Ugelstadら, Die Makromolekulare Chemie, Vol.180, p737, 1979）が好適に用いられる。

特に、上記一次膨潤の後に、種粒子に多孔質化溶媒および分散安定剤を含浸させる二次膨潤を行い、次いで、重合性ビニル単量体および／または重合性ポリビニル単量体、分散安定剤、茶カテキンならびに茶カテキンに対し相補的に相互作用を有する重合性単量体を種粒子に含浸させる三次膨潤を行った後、重合を開始することが好ましい。

シード重合は、種粒子の懸濁液を重合温度に昇温することによって開始される。重合温度は、使用する重合開始剤の種類にもよるが、通常は５０〜８０℃が好ましい。また、シード重合の重合時間は、重合開始剤の半減期前後またはそれ以上が好ましく、通常は３〜４８時間程度が好ましい。

上記のようにしてシード重合を行い、高分子粒子が製造されたら、その高分子粒子を洗浄し、重合開始剤その他の添加剤とともに、茶カテキンを除去することにより、所望の茶カテキンに対する鋳型構造を有する高分子粒子が得られる。なお、洗浄は、常法によって行うことができ、高分子粒子の表面に親水性高分子層を形成させた後に行ってもよい。

得られる高分子粒子の平均粒子径は、１〜１０００μｍであることが好ましく、特に１〜２００μｍであることが好ましい。さらには、平均粒子径が１〜２０μｍであり、かつ粒子径の変動係数が１０％以下であることが好ましく、かかる高分子粒子は、高速液体クロマトグラフィー用の分離剤として好適に用いられる。以上説明したシード重合法によれば、当該好ましい高分子粒子を製造することが可能である。

以上のようにして得られた鋳型構造を有する高分子粒子からなる分離剤と、茶抽出物とを接触させることにより、分離剤に所望の茶カテキンを選択的に吸着させることができ、したがって当該茶カテキンの分離濃縮を行うことができる。前述した通り、分離濃縮の対象としての茶カテキンは１種であってもよいし（例えば（−）エピガロカテキンガレートまたは（−）エピカテキンガレート）、２種（例えば（−）エピガロカテキンガレートおよび（−）エピカテキンガレート）またはそれ以上であってもよい。分離濃縮の対象としての茶カテキンが２種以上の場合、それらの比率を制御することも可能である。

上記分離剤は、具体的には、高速液体クロマトグラフィー、特に逆相高速液体クロマトグラフィーに好ましく適用することができる。

上記分離剤によれば、特に上記分離剤を使用した高速液体クロマトグラフィーによれば、茶抽出物から、複雑な前処理を行うことなく、所望の茶カテキンを高純度に、かつ低コストで連続的に製造することができる。

以下、実施例等により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例等に限定されるものではない。

〔実施例１〕
種粒子として、平均粒子径が１．０μｍ、粒子径の変動係数が１０％以下の球状ポリスチレン粒子を用意した。その球状ポリスチレン粒子の水懸濁液（固形分濃度：０．４９７ｍｌ／ｍｌ）０．１７ｍｌを、膨潤助剤としてのフタル酸ジブチル０．４８ｍｌおよび界面活性剤としてのドデシル硫酸ナトリウム０．０２ｇを水５．０ｍｌに分散させたマイクロエマルジョンと混合し、緩やかに室温で１５時間撹拌した（一次膨潤）。この一次膨潤は、光学顕微鏡による観察により、マイクロエマルジョンの液滴が見られなくなるまで行った。

次に、多孔質化溶媒としてのトルエン５．０ｍｌおよび開始剤としてのアゾビスジメチルバレロニトリル０．３７５ｇを、分散安定剤としての４．８％ポリビニルアルコール水溶液（重合度５００，ケン化度８６．５〜８９モル％）１０ｍｌと水１２．５ｍｌとを混合した溶液中に懸濁させて微分散液を調製し、得られた微分散液を上記一次膨潤後の懸濁液に加え、室温で２時間緩やかに撹拌した（二次膨潤）。

さらに、重合性ポリビニル単量体としてのエチレングリコールジメタクリレート５．０ｍｌ、鋳型分子としてのエピガロカテキンガレート０．５４４ｇ、エピガロカテキンガレートに対して相補的に相互作用を有する重合性ビニル単量体としての２−ビニルピリジン０．７３６ｇおよび界面活性剤としてのドデシル硫酸ナトリウム０．０２ｇを、分散安定剤としての４．８％ポリビニルアルコール水溶液（重合度５００，ケン化度：８６．５〜８９モル％）１０ｍｌと水５．０ｍｌとを混合した溶液中に懸濁させて微分散液を調製し、得られた微分散液を上記二次膨潤後の懸濁液に加え、室温で２時間緩やかに撹拌した（三次膨潤）。

三次膨潤の終了した懸濁液をアルゴン雰囲気下、緩やかに攪拌しながら、当該懸濁液の温度を５０℃に上げて重合を開始した。２４時間重合反応させた後、重合反応の終了した懸濁液を水２５０ｍｌ中に投入し、高分子粒子を沈降させた後、上澄み液を廃棄することで分散安定剤を除去した。さらに高分子粒子をメタノールに再分散させ、高分子粒子の沈降後に上澄み液を除く方法で高分子粒子を洗浄した。この操作をメタノールで更に１回、テトラヒドロフランで２回行うことにより、高分子粒子を洗浄するとともに高分子粒子中のエピガロカテキンガレートを溶解除去して、高分子粒子中に鋳型構造を導入した。洗浄が終了した高分子粒子は、濾過後、室温で減圧乾燥した。このようにして製造された高分子粒子（分離剤）の平均粒子径は５μｍ、粒子径の変動係数は１０％以下であった。

〔比較例１〕
エピガロカテキンガレートを使用しない以外、実施例１と同様にしてシード重合および後処理を行い、平均粒子径が５μｍ、粒子径の変動係数が１０％以下の高分子粒子（分離剤）を得た。

〔試験例１〕
実施例１で得られた高分子粒子を内径４．６ｍｍ、長さ１００ｍｍのステンレスカラムに充填し、濃度２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝３．２０）／アセトニトリル＝５０／５０の混合液（混合後のｐＨ＝４．０３）を移動相として、各種茶カテキンを５００ｎｇ注入し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで逆相高速液体クロマトグラフィー分析を行い、２１０ｎｍの紫外可視吸光度検出器により検出した。なお、茶カテキンとしては、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）、ガロカテキンガレート（ＧＣｇ）、エピカテキンガレート（ＥＣｇ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）およびエピカテキン（ＥＣ）を使用した。上記検出結果に基づき、以下の式に従って各茶カテキンの保持比（ｋ’）を算出した。結果を表１に示す。
保持比ｋ’＝｛（各化合物の保持容量）−（空保持容量）｝／（空保持容量）

また、比較例１で得られた高分子粒子を上記と同様のカラムに充填し、上記と同じ条件で各茶カテキンの逆相高速液体クロマトグラフィー分析を行い、同様にしてその保持比ｋ’を算出した。そして、上記実施例１の分離剤による保持比（ｋ’）と、比較例１の分離剤による保持比（ｋ’）とから、以下の式に従って選択性を求めた。結果を表１に示す。
選択性＝（実施例１の分離剤による保持比）／（比較例１の分離剤による保持比）

表１に示される通り、実施例１にて製造された分離剤は、ＥＧＣｇに対する選択性は１３．９０であり、ＥＣｇに対する選択性は９．８０であった。一方、他のカテキン類であるＧＣｇ、ＥＧＣおよびＥＣに対する選択性は１．６未満であった。この結果から、実施例１にて製造された分離剤によれば、ガレート型カテキン（ＥＧＣｇおよびＥＣｇ）、特にＥＧＣｇの分離・濃縮が可能であることが分かる。

〔実施例２〕
エピガロカテキンガレート０．５４４ｇの替わりに、エピカテキンガレート０．５ｇを用いる以外、実施例１と同様にしてシード重合および後処理を行い、平均粒子径が５μｍ、粒子径の変動係数が１０％以下の高分子粒子を得た。

〔比較例２〕
エピカテキンガレートを使用しない以外、実施例２と同様にしてシード重合および後処理を行い、平均粒子径が５μｍ、粒子径の変動係数が１０％以下の高分子粒子を得た。

〔試験例２〕
実施例２で得られた粒子を内径４．６ｍｍ、長さ１００ｍｍのステンレスカラムに充填し、水／エタノール＝３０／７０の混合液を移動相として、試験例１と同様の各種茶カテキンを５００ｎｇ注入し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで逆相高速液体クロマトグラフィー分析を行い、２１０ｎｍの紫外可視吸光度検出器により検出した。この検出結果に基づき、試験例１と同様にして各茶カテキンの保持比（ｋ’）を算出した。結果を表２に示す。

また、比較例２で得られた高分子粒子を上記と同様のカラムに充填し、上記と同じ条件で各茶カテキンの逆相高速液体クロマトグラフィー分析を行い、同様にしてその保持比ｋ’を算出した。そして、上記実施例２の分離剤による保持比（ｋ’）と、比較例２の分離剤による保持比（ｋ’）とから、試験例１と同様にして選択性を求めた。結果を表２に示す。

表２に示される通り、実施例２にて製造された分離剤は、ＥＣｇに対する選択性は５．０２であり、ＥＧＣｇに対する選択性は３．９８であった。一方、他のカテキン類であるＧＣｇ、ＥＧＣおよびＥＣに対する選択性は１．４未満であった。この結果から、実施例２にて製造された分離剤によれば、ガレート型カテキン（ＥＣｇおよびＥＧＣｇ）、特にＥＣｇの分離・濃縮が可能であることが分かる。

〔実施例３〕
エピガロカテキンガレート０．５４４ｇの替わりに、エピガロカテキンガレートを４０質量％およびエピカテキンガレートを１０質量％含有する茶抽出物０．５ｇを用いる以外、実施例１と同様にしてシード重合および後処理を行い、平均粒子径が５μｍ、粒子径の変動係数が１０％以下の高分子粒子を得た。

〔比較例３〕
エピガロカテキンガレートおよびエピカテキンガレートを使用しない以外、実施例３と同様にしてシード重合および後処理を行い、平均粒子径が５μｍ、粒子径の変動係数が１０％以下の高分子粒子を得た。

〔試験例３〕
実施例３で得られた粒子を内径４．６ｍｍ、長さ１００ｍｍのステンレスカラムに充填し、水／アセトニトリル＝５０／５０の混合液を移動相として、試験例１と同様の各種茶カテキンを５００ｎｇ注入し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで逆相高速液体クロマトグラフィー分析を行い、２１０ｎｍの紫外可視吸光度検出器により検出した。この検出結果に基づき、試験例１と同様にして各茶カテキンの保持比（ｋ’）を算出した。結果を表３に示す。

また、比較例３で得られた高分子粒子を上記と同様のカラムに充填し、上記と同じ条件で各茶カテキンの逆相高速液体クロマトグラフィー分析を行い、同様にしてその保持比ｋ’を算出した。そして、上記実施例３の分離剤による保持比（ｋ’）と、比較例３の分離剤による保持比（ｋ’）とから、試験例１と同様にして選択性を求めた。結果を表３に示す。

表３に示される通り、実施例３にて製造された分離剤は、ＥＧＣｇに対する選択性は５．７１であり、ＥＣｇに対する選択性は４．９６であった。一方、他のカテキン類であるＧＣｇ、ＥＧＣおよびＥＣに対する選択性は１．４未満であった。この結果から、実施例３にて製造された分離剤によれば、ＥＧＣｇおよびＥＣｇの分離・濃縮が可能であることが分かる。さらには、シード重合時におけるＥＣｇ含有量を変化させることにより、ＥＧＣｇに対する保持能を制御することが可能であることが分かる。

本発明は、所望の茶カテキンを高純度にかつ高収率で得るのに有用である。

Claims (10)

1. 所望の種類の茶カテキンを使用して得られた鋳型構造を有する高分子粒子からなる、茶カテキンを分離するための分離剤。
2. エピガロカテキンガレートを分離するための分離剤であることを特徴とする請求項１に記載の分離剤。
3. エピカテキンガレートを分離するための分離剤であることを特徴とする請求項１に記載の分離剤。
4. エピガロカテキンガレートおよびエピカテキンガレートの混合物を分離するための分離剤であることを特徴とする請求項１に記載の分離剤。
5. 第１の種類の茶カテキンと、前記第１の種類の茶カテキンとフェノール性水酸基の数のみ異なる第２の種類の茶カテキンとを使用して得られた鋳型構造を有する高分子粒子からなる、前記第１の種類の茶カテキンおよび前記第２の種類の茶カテキンを分離するための分離剤。
6. 前記第１の種類の茶カテキンはエピガロカテキンガレートであり、前記第２の種類の茶カテキンはエピカテキンガレートである請求項５に記載の分離剤。
7. 所望の種類の茶カテキンの存在下、前記茶カテキンに対し相補的に相互作用を有する化合物を導入した高分子粒子から前記茶カテキンを除去し、もって茶カテキンに対する鋳型構造を有する高分子粒子を製造することを特徴とする、茶カテキンを分離するための分離剤の製造方法。
8. 前記化合物は重合性単量体であり、当該重合性単量体を種粒子に含浸させ、重合することにより前記高分子粒子を得ることを特徴とする請求項７に記載の分離剤の製造方法。
9. 前記化合物は、含窒素複素環を有する化合物であることを特徴とする請求項７または８に記載の分離剤の製造方法。
10. 請求項１〜６のいずれかに記載の分離剤と、茶抽出物とを接触させ、前記分離剤に茶カテキンを吸着させることを特徴とする茶カテキンの分離濃縮方法。