KR101118760B1 - 펜트락신 단백질 검출용 분자각인 고분자 및 그 제조방법 - Google Patents

펜트락신 단백질 검출용 분자각인 고분자 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 펜트락신 단백질 검출용 분자각인체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 반응기(R)와 펜트락신 단백질 리간드(L)가 결합된 반응기-펜트락신 단백질 리간드의 결합체(L-S-R)를 제조하고, 이를 펜트락신 단백질과 반응시킨 후 가교제 및 개시제를 혼합하고 광중합 또는 열중합 반응시켜 펜트락신 단백질과 분자각인 리간드가 결합된 중합체를 제조하고 여기서 펜트락신 단백질을 제거하는 것을 포함하는 펜트락신 단백질 검출용 분자각인 고분자의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 펜트락신 단백질 리간드(L)를 직접 반응성 표면에 중합할 수 있는 반응기-펜트락신 단백질 리간드의 결합체(L-S-R)를 분자각인된 형태로 반응성 표면에서 화학반응시킴으로써, 펜트락신 단백질이 보다 특이적으로 반응할 수 있는 분자각인체를 제조할 수 있다. 본 발명의 반응기-펜트락신 단백질 리간드의 결합체(L-S-R)를 이용하여 다양한 형태의 중합반응 또는 화학반응에 적용할 수 있으며, 단일 펜트락신 단백질 리간드 보다 강한 결합력을 갖도록 배열된 분자각인 펜트락신 단백질 리간드를 이용하여 펜트락신 단백질의 검출을 보다 용이하게 할 수 있다.
펜트락신 단백질, 반응성 리간드, 포스포콜린, 스티렌-포스포콜린 리간드, C-반응성단백질, 분자각인, 폴리스티렌

Description

펜트락신 단백질 검출용 분자각인 고분자 및 그 제조방법 {Molecular imprinted polymers for detecting Pentraxin protein and the methods thereof}
본 발명은 펜트락신 단백질 검출용 분자각인체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 반응기(R)와 펜트락신 단백질 리간드(L)가 결합된 반응기-펜트락신 단백질 리간드의 결합체(L-S-R)를 제조하고, 이를 펜트락신 단백질과 반응시킨 후 가교제 및 개시제를 혼합하고 광중합 또는 열중합 반응시켜 펜트락신 단백질과 리간드가 결합된 중합체를 제조하고 여기서 펜트락신 단백질을 제거하는 것을 포함하는 펜트락신 단백질 검출용 분자각인 고분자의 제조방법에 관한 것이다.
종래 C-반응성단백질을 검출하는 방법으로는, 항체를 이용하는 방법(대한민국 공개특허 2004-0064054)과 포스포콜린 리간드를 이용하는 방법(미국특허 0246522, 영국특허 02217335) 등이 보고된 바 있다. 항체를 이용하는 경우 문제점은, 고가의 항체 제조비용이 소요되고 항체의 활성을 유지하기 위하여 특별한 보관 방법을 사용하면서 활성저하 여부에 대한 정도관리가 필요하며, 포스포콜린 리간드 를 사용하는 경우는, 단백질, 아가로즈 젤 또는 폴리스티렌 등에 고정하기 위하여 중간체를 필요로 하는 단점이 있다.
이러한 문제점을 개선하기 위하여, 항체에 비하여 안정성 측면에서 우수한 분자각인 고분자를 이용한 검출법들을 개발하고자 많은 연구자들이 노력하고 있다. 따라서 본 발명에서는 C-반응성단백질 검출 효과를 높인 분자각인 고분자를 제조하는 방법을 제공하고자 한다. 이를 위하여, 포스포콜린 그룹을 포함하면서, 가교제인 스티렌과 중합이 가능하도록 고안된 스티렌-포스포콜린 리간드(12-(4-vinylbenzyloxycarbonyl)dodecyl phosphocholine, VDP)를 합성하였고, 이러한 스티렌-포스포콜린 리간드가 C-반응성단백질에 존재하는 5개의 포스포콜린 리간드 결합부위에 동시에 결합한 상태로 가교제의 중합 반응을 유도함으로써, 포스포콜린 리간드를 이용한 새로운 분자각인 기술을 개발하였다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 펜트락신 단백질에 특이하게 반응하면서 가교제와 중합이 가능한 반응기-펜트락신 단백질 리간드의 결합체를 합성하고, 이를 이용하여 펜트락신 단백질을 검출할 수 있는 펜트락신 단백질 검출용 분자각인체 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 펜트락신 단백질과 하기 구조식의 반응성 리간드를 결합시키는 단계; 상기 펜트락신 단백질과 반응성 리간드의 결합체를 반응성 표면의 계면에서 화학반응 시키는 단계; 및 상기 반응물에서 용출 완충용액으로 세척하여 펜트락신 단백질을 제거하는 단계를 포함하는 펜트락신 단백질 검출용 분자각인체의 제조방법을 제공한다:
[구조식]
L-S-R
L: 펜트락신 단백질의 리간드
R: 반응기
S: 펜트락신 단백질의 리간드와 반응기를 연결하는 결합기.
본 발명에서, 상기 “펜트락신 단백질(pentraxin protein)”은 단백질 그룹 가운데 하나로서, calcium 의존적 리간드 결합을 하며, 평평한 β-구조를 가진 단백질이다. “펜트락신”이라는 이름은 그리스어의 5개(penta)라는 말과 berry (ragos)라는 말이 결합된 것이다. 펜트락신 단백질은 5개의 monomer가 정5각형을 이루며 배열되어 있으며, 약 9.5 nm의 지름과, 3.5 nm의 높이를 가지고 있다. 비교적 작은 펜트락신 단백질로는 혈청 아밀로이드 P 구성요소(Serum Amyloid P component, SAP)와 C-반응성단백질(C-reactive protein, CRP)이 있고, 큰 단백질로는 PTX3(cytokine 조절 분자)과 기타 신경계 단백질이 있다.
상기 CRP는 대표적인 급성기 반응성단백(acute-phase reactant) 중 하나이다. CRP는 IL-6(Interleukin-6)에 대한 반응으로, 주로 간에서 생성되나, 죽상경화반, 관상동맥 평활근 세포, 대동맥 내피세포, 지방세포에서도 발현되는 것으로 보고되고 있다. 각각의 monomer에 칼슘 2가 이온 2개가 결합하며, 여기에 포스포릴콜린(phosphorylcholine)의 포스페이트(phosphate) 그룹이 높은 선택성을 가지고 결합한다.
상기 “반응성 리간드”는 생화학 또는 약학에서 생물분자와 결합하여 복합체(complex)를 이루는 리간드(L)에 라디칼 반응을 일으키는 비닐, 스티릴, 아크릴로일, 메타크릴로일, 이타코노일, 소르빌 또는 디에노일 기 등이나, 금속 또는 금속산화물과 결합할 수 있는 반응성 그룹(R)이 결합기(S)에 의해 연결된 물질을 말하며, 결국 반응성 리간드의 한쪽 끝은 타겟물질에 결합하는 리간드(L)이고, 다른 한쪽 끝은 중합 가능 또는 금속물과 결합이 가능한 반응기(R)로 구성되어 있다.
상기 “반응성 표면”은 완충용액 내에서 수용액 층과 분리된 층으로서, 반 응성 리간드의 반응기와 중합반응(예컨대, 공중합)이 가능한 유기물질 또는 상기 반응기와 결합(예컨대, in-situ 결합 반응) 가능한 금속 물질의 표면을 말한다. 본 발명에서는 구체적으로 반응성 표면으로서 styrene/DVB가 9:1로 혼합된 물질을 사용하였으며, 이 혼합물은 수용액과 섞이지 않고 수용액의 표면에 층을 이룬다. 이 때, 반응성 표면은 수용액과 styrene/DVB 혼합물층의 계면을 말하며, 수용액내의 반응성 리간드와 공중합이 일어나, 공중합 종료 후 반응성 표면은 반응성 리간드에 의한 개질이 이루어진다 (도 4 참조).
본 발명에서 사용된 용어 “분자각인체” 또는 “분자각인 고분자(MIP)”란, 적당한 주형물질(template)과 결합하고 있는 모노머(monomer)를 출발물질로 사용하여 고분자를 합성한 후 주형물질을 제거함으로써 주형물질과 형태가 동일한 공간이 존재하는 고분자를 말한다. 주형물질 공간에는 형태적으로 동일한 주형물질만 끼어들 수 있고 주형물질과 다른 입체구조를 지닌 분자는 끼어들 수 없기 때문에 주형물질 공간을 가진 고분자를 사용하여 주형물질과 다른 여러 분자들을 분리할 수 있다. 이것은 마치 항원에 대하여 형성된 항체가 항원과만 선택적으로 상호 작용하는 원리(Fischer's Lock-and-Key Concept)나 혹은 생체내의 효소가 특정한 기질(substrate)에 대하여서만 활성을 나타내는 것(Receptor Theory)과 같은 이치이다. 이러한 분자각인 기술은 분자각인 고분자를 이용한 특정물질의 감지나 분리 시스템 분야에서 많이 연구되고 있는데, 특히 분자각인 고분자의 선택적 흡착능은 광학 이성질체의 분리에도 매우 뛰어난 효능이 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 펜트락신 단백질은 C-반응성단백질(C-reactive protein), 혈청 아밀로이드 P 구성요소(serum amyloid P component), 및 PTX-3(Pentraxin 3)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 펜트락신 단백질일 수 있으며, 바람직하게는 C-반응성단백질이다. 상기 ‘C-반응성단백질(CRP)’은 염증성 질환 또는 체내 조직의 괴사와 같은 질환에서 현저하게 증가하는 혈장 단백질의 하나로 소위 급성상 반응 단백질의 대표적인 성분이다. CRP는 생체에 이상이 생긴 경우 6~24시간 이내라는 짧은 시간에 증가하는 동시에 병변 회복에서도 24시간 이내로 빨리 감소, 소실하는 등 통상 면역 글로불린 항체에서 볼 수 없는 특징을 나타내는 단백질이다. 따라서 CRP 측정은 염증성 또는 조직 붕괴성 질환의 존재 여부와 그 중증도 판정, 경과 관찰 및 예후 판정에 대단히 유용하다.
본 발명에서, 상기 펜트락신 단백질이 C-반응성단백질 일 때 펜트락신 단백질의 리간드(L)는 포스포콜린이고, 상기 펜트락신 단백질이 혈청 아밀로이드 P 구성요소일 때 펜트락신 단백질의 리간드(L)는 프롤린이고, 상기 펜트락신 단백질이 PTX-3일 때 펜트락신 단백질의 리간드(L)는 C1q(18개 아미노산)이다. 상기 리간드를 이용하여 각 펜트락신 단백질을 검출할 수 있는 반응성 리간드를 제조할 수 있다.
본 발명에서는, 상기 펜트락신 단백질 중 하나인 C-반응성단백질을 이용하여 펜트락신 단백질 검출용 분자각인체를 제조하였으며, 본 발명의 분자각인체를 제조하기 위한 방법은 C-반응성단백질을 이용하여 설명한다. 또한 그 개략적인 방법은 도 3과 같다. 기본적인 방법은, 펜트락신 단백질 중 하나인 C-반응성단백질과 스티렌-포스포콜린 리간드를 미리 반응시킨 후, 가교제 및 개시제가 포함된 완충용액에 첨가하여 광중합 반응으로 분자각인 고분자를 합성하는 것이다.
본 발명의 방법에서, 상기 반응기(R)는 중합 가능기, 또는 금속 또는 금속산화물과 반응하는 기능기일 수 있다.
상기 중합 가능기는 비닐, 스티릴, 아크릴로일, 메타크릴로일, 이타코노일, 소르빌 또는 디에노일에서 선택된 라디칼 중합 단량체일 수 있다. 본 발명에서는 중합 가능기로서 스티렌을 사용하였다.
상기 금속 또는 금속산화물과 반응하는 기능기는 티올, 디설파이드, 또는 티오에테르에서 선택된 금속 반응기, 또는 트리클로로실릴, 트리메틸실릴, 트리이소프로필실릴 또는 카테콜에서 선택된 금속산화물 반응기일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 결합기(S)는 알킬, 아릴, 아릴알킬, 올리고에틸렌 옥시드, 또는 이들 결합기의 조합일 수 있다. 본 발명에서는 결합기로서 알킬카르복실릭 에스터를 사용하였다.
본 발명의 방법에서, 상기 반응성 표면은 유기물질 또는 금속물질로 된 필름, 나노 입자, 나노와이어, 또는 다공성 입자의 표면일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 화학 반응은 반응성 리간드의 반응기와 단량체 및 가교제의 중합반응, 또는 반응성 리간드의 반응기와 금속 또는 금속산화물과의 화학적 결합반응일 수 있다.
상기 중합반응은 라디칼 중합 개시제 또는 광중합 개시제에 의한 열중합 또는 광중합 반응일 수 있다.
상기 화학적 결합반응은, 예를 들어 티올과 금입자의 결합반응 또는 트리클 로로실릴과 금속산화물의 결합반응일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 펜트락신 단백질은 C-반응성단백질이고, 하기 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 C-반응성단백질 검출용 분자각인체의 제조방법을 제공한다:
a) 스티렌과 포스포콜린 리간드가 결합된 스티렌-포스포콜린 리간드를 준비하는 단계;
b) C-반응성단백질과 상기 스티렌-포스포콜린 리간드를 반응시키는 단계;
c) 상기 반응물을 단량체, 가교제 및 개시제가 포함된 완충용액에 첨가하여 혼합하는 단계;
d) 상기 혼합물을 UV로 광중합 반응시켜 C-반응성단백질이 결합된 폴리스티렌 고분자를 제조하는 단계; 및
e) 상기 폴리스티렌 고분자를 용출 완충용액으로 세척하여 C-반응성단백질을 제거하는 단계.
본 발명의 제조방법에서, 상기 a)단계의 스티렌-포스포콜린 리간드는 도 1에 도시된 반응단계에 따라 제조되는 것을 특징으로 한다.(실시예 1 참조)
본 발명의 제조방법에서, 상기 b)단계의 C-반응성단백질과 스티렌-포스포콜린 리간드는 1:3 내지 1:7 몰비로 반응시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제조방법에서, 상기 c)단계의 단량체와 가교제는 스티렌(styrene)/DVB(divinylbenzene)이고 개시제는 DBK(dibenzylketone)인 것을 특징 으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 단량체:가교제:개시제는 8~18:1:1~5로 혼합하여 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 구체적으로 스티렌:DVB:DBK는 9:1:1로 혼합하여 사용하였다.
본 발명의 제조방법에서, 상기 d)단계의 광중합 반응은 35-40℃에서 1-3시간 동안 UV로 광중합 반응시킨 후, 80-100℃에서 1-3시간 동안 UV로 광중합 반응시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 구조식을 갖는 펜트락신 단백질과 결합가능한 반응성 리간드를 제공한다:
[구조식]
L-S-R
L: 펜트락신 단백질의 리간드
R: 반응기
S: 펜트락신 단백질의 리간드와 반응기를 연결하는 결합기.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 고상의 반응성 표면, 및 상기 반응성 표면의 계면에 결합된 상기 복수의 반응성 리간드로 이루어지고, 상기 복수의 반응성 리간드는 펜트락신 단백질과 결합될 수 있도록 분자각인 된 것을 특징으로 하는 펜트락신 단백질 검출용 분자각인체를 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 스티렌-포스포콜린 리간드의 제조
스티렌-포스포콜린 리간드의 제조과정을 도 1을 참조하여 설명한다. 도 1에서 나타나는 생성물들은 NMR을 통하여 확인하였다.
12-히드록시데칸산(12-hydroxydecanoic acid)과 탄산칼슘(potassium carbonate)을 100 ml의 N,N'-디메틸포름아마이드(N,N'-dimethylformamide)에 넣고 상온에서 약 10분간 교반시킨 후 4-비닐벤질 클로라이드(4-vinylbenzyl chloride)를 넣고 약 80℃ 이하로 가열하면서 교반하였다. 반응종료 후 N,N'-디메틸포름아마이드를 감압증류로 제거하고 디클로로메탄(dichloromethane)에 녹인 다음 물로 씻어주었다. 디클로로메탄 층을 모아서 황산마그네슘(magnesium sulfate)으로 건조시킨 뒤 건조시킨 디클로로메탄을 감압필터로 황산마그네슘을 제거하고 감압증류로 디클로로메탄을 제거한 뒤 전개액 hexane:ethyl acetate=3:1을 이용한 칼럼크로마토그래피로 정제하였다 (yield=79%).
1H NMR(CDCl3 400MHz): δ(ppm) 7.41(m 4H), 6.75(m 1H), 5.78(dd J1=13.6 J2=4.0 1H), 5.29(dd J1=6.8 J2=4.0 1H), 5.10(d J=7.2 2H), 3.63(t J=4.4 2H), 2.37(t J=4.8 2H), 1.64(m 4H), 1.27(br s 14H)
13C NMR(CDCl3 100MHz): δ(ppm) 173.74, 137.90, 137.52, 136.47, 136.40, 136.35, 135.62, 128.77, 128.47, 127.60, 126.36, 126.05, 126.01, 114.39, 114.30, 65.97, 65.83, 63.11, 34.35, 32.81, 29.56, 29.49, 29.41, 29.24, 29.12, 25.74, 24.96
LRMS (ESI+) m/z: 355(M+Na)
FT-IR (neat) ν(cm-1): 3328(br w), 2914(s), 2848(s), 1728(s), 1462(m), 1386(w), 1359(w), 1332(m), 1316(w), 1256(m), 1195(s), 1107(m), 1057(m), 1042(m), 1008(m), 989(m), 962(m), 899(m), 830(w), 850(w), 804(m), 728(m)
4-Vinylbenzyl-12-hydroxyl dodecanoate 1.5 g (496 mmol)와 트리에틸아민(triethylamine) 2.09 ml(14,9 mmol)을 디클로로메탄(amylene stabillized) 20 ml에 넣고 아이스-배스(ice-bath)로 0℃로 냉각하면서 교반하였다. 반응물에 2-Chloro-2-oxo-1,3,2-dioxaphospholane 0.684 ml (7.44 mmol)를 넣고 0℃에서 약 1시간 동안 교반한 뒤 아이스-배스를 제거하고 상온에서 반응시켰다. 반응종료 후 디클로로메탄을 감압증류로 제거하고 클로로포름(chloroform)에 녹여서 녹지 않는 고체들은 감압필터로 제거하고 전개액 hexane:ethyl acetate=1:2을 이용한 칼럼크 로마토그래피로 정제하였다 (중간체 화합물이 변하기 쉽기 때문에 1H NMR만 확인하고 다음 반응으로 진행하였다). 12-(2-Oxo-2λ5-[1,3,2]dioxaphospholan-2-yloxy)-dodecanoic acid 4-vinyl-benzyl ester 0.864 g (1.97 mmol)를 아세토니트릴 무수물(acetonitrile anhydrous)과 함께 압력용기(pressure bottle)에 넣고 -20℃로 냉각시킨다. 냉각된 반응용기에 트리메틸아민(trimethylamine) 0.55 ml (5.92 mmol)을 넣고 60℃ 이하로 가열하면서 교반하였다.
반응종료 후 아세토니트릴(acetonitrile)은 감압증류로 제거하고 전개액 Chloroform:Methanol:Wate=65:25:4를 이용한 칼럼크로마토그래피로 정제하였다(yield=24%).
1H NMR(CDCl3 400MHz): δ(ppm) 7.42(m 4H), 6.73(m 1H), 5.77(dd J1=13.6 J2=4.0 1H), 5.27(dd J1=6.8 J2=4.0 1H), 5.08(d J=7.2 2H), 4.26(br s 2H), 3.84(m 4H), 3.41(s 9H), 2.36(m 2H), 1.62(m 4H), 1.24(br s 14H)
13C NMR(CDCl3 100MHz): δ(ppm): 173.68, 137.87, 137.50, 136.46, 136.39, 136.33, 135.61, 128.77, 128.44, 127.57, 126.35, 126.01, 125.99, 114.39, 114.30, 66.25, 65.95, 65.81, 65.66, 65.60, 59.20, 54.29, 34.32, 31.07, 31.00, 29.70, 29.64, 29.53, 29.49, 29.32, 29.16, 25.92, 24.96
LRMS (ESI+) m/z: 520(M+Na)
FT-IR (neat) ν(cm-1): 3367(br w), 2923(s), 2852(m), 1732(s), 1483(w), 1380(w), 1232(s), 1164(s), 1057(s), 986(s), 966(s), 909(s), 874(w), 825(s), 796(s), 763(s), 713(s), 505(s)
상기와 같이 제조된 스티렌-포스포콜린 리간드( 12-(4-vinylbenzyl)oxycarbonyl dodecyl phosphocholine)는 NMR(Nuclear Magnetic Resonance; Avance 400, Bruker 사)을 사용하여 최종산물을 확인하였으며 NMR 분석결과는 도 2에 나타내었다.
실시예 2. 스티렌-포스포콜린 리간드가 분자각인된 폴리스티렌 필름 제조
본 발명의 분자각인 고분자의 제조방법은 도 4를 참고하여 설명하면 다음과 같다.
표준인산완충용액(pH 7.0) 10 ml에 가교제로서 스티렌(styrene)/DVB(divinylbenzene)를, 개시제로서 DBK(dibenzylketone)를 스티렌:DVB:DBK = 9:1:1의 비율로 하여 총 1 ml을 가한 후, 1:5 몰비율로 미리 반응시킨 C-반응성단백질과 스티렌-포스포콜린 리간드를 첨가하였다. 이 때, C-반응성단백질과 스티렌-포스포콜린 리간드는 칼슘 이온을 매개로 하여 강한 결합이 이루어지므로, 결합용 완충용액(0.1M Tris, 5mM CaCl2, 150mM NaCl, pH 8.0)에서 미리 반응시킨 후 광중합을 유도하였다. 중합반응 조건은, 37℃에서 2시간 동안 광중합하 여 단량체(스티렌-포스포콜린 리간드)가 C-반응성단백질과 결합되어 있는 상태로 가교제 층의 표면에 자리 잡도록 하고, 이어서 90℃에서 2시간 동안 광중합을 실시하여, 단단한 폴리스티렌 고분자가 형성될 수 있도록 하였다. 중합 반응 종료후, C-반응성단백질을 제거하기 위하여, 용출 완충용액 (0.1M Tris, 10mM EDTA, 150mM NaCl, pH 8.0)으로 2회 세척하였다.
실험예 1. 분자각인 고분자에 대한 C-반응성단백질 결합력 측정
분자각인 고분자에 대한 C-반응성단백질 결합력은 브래드포드(Bradford) 정량법과 면역분석법을 이용하여 C-반응성단백질을 검출하여 분석하였다. 이 때, 분자각인고분자(molecularly imprinted polymer, MIP)와 함께, CRP의 분자각인이 없이 반응성 리간드만 넣고 제조한 비분자각인 고분자(nin-imprinted polymer, NIP), 그리고, 반응성리간드와 CRP가 없이 제조한 폴리스티렌 고분자(control polymer, CP)를 제조하여, 분자각인 효과를 분석하였다.
1) 브래드포드 정량법
제조된 분자각인고분자에 CRP 5ug을 가하고, 0℃에서 30분간 반응시켰다. 비특이적으로 결합한 단백질을 제거하기 위하여, PBS로 3회 세척하거나, 0.1% Tween 20이 포함된 TBST 완충용액(0.1M Tris, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20)으로 3회 반복하여 세척한 후, 용출 완충용액 2 ml을 가하고 상온에서 15분간 방치하였다. 용출 완충용액내의 단백질량을 정량하기 위하여, 용출된 단백질 용액 1 ml에 브래드포드 시약(Sigma 사) 1 ml을 가하고, 10분간 상온에서 방치한 후 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준정량곡선을 작성하기 위하여, BSA 0, 0.5, 1, 1.5, 2 μg/ml 용액을 제조하고, 각각 1 ml을 취한 후, 브래드포드 시약 1 ml을 가하여 10분간 상온에서 방치한 후, 595 nm에서 흡광도를 측정하였다 (Varian-300 spectrophotometer).
2) 면역분석법
제조된 분자각인고분자에 CRP 5 μg을 가하고, 0℃에서 30분간 반응시켰다. 비특이적으로 결합한 단백질을 제거하기 위하여, PBS로 3회 세척하거나, 0.1% Tween 20이 포함된 TBST 완충용액(0.1M Tris, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20)으로 3회 반복하여 세척한 후, 항CRP 단일클론 항체(mouse monoclonal anti CRP antibody, Sigma사) 10 μg을 가하고, 0℃에서 30분간 반응시켰다. 비특이적으로 결합한 항체를 제거하기 위하여, PBS로 3회 세척하거나, 0.1% Tween 20이 포함된 TBST 완충용액(0.1M Tris, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20)으로 3회 반복하여 세척한 후, 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 결합된 항 마우스 IgG (anti mouse IgG, Sigma 사)를 1:30,000 비율로 희석하여 가한 후, 0℃에서 30분간 반응시켰다. 비특이적으로 결합한 항체를 제거하기 위하여, PBS로 3회 세척하거나, 0.1% Tween 20이 포함된 TBST 완충용액(0.1M Tris, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20)으로 3회 반복하여 세척한 후, 알칼리 포스파타아제의 기질인 NPP 용액(p-nitrophenolphosphate, Sigma 사) 1 ml을 가하고, 10분간 상온에서 방치한 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다 (Varian-300 spectrophotometer).
[표 1]. C-반응성단백질의 분자각인 효과
Figure 112009081311311-pat00001
표 1은 MIP와 NIP의 C-반응성단백질 분자각인 지수(Imprinting factor, IF)를 비교한 것이다. MIP에 결합한 C-반응성단백질 양이 NIP(Non-imprinted polymer)에 결합한 양보다 실험방법에 따라 8.1 또는 9.8배 높은 값을 나타내었다. 따라서 NIP의 상의 C-반응성단백질은 세척과정에서 용출되는 반면, MIP상의 C-반응성단백질은 용출되지 않고 남아 있는 것으로 판단할 수 있다.
실험예 2. MIP에 대한 결합상수 결정
도 5는 Langmuir isotherm 식을 이용한 그래프로서, 기울기와 y 절편 값을 통하여 MIP-C-반응성단백질 결합상수는 KA는 3.2×10-9/M이었다. 상기 Langmuir isotherm 식은 다음과 같다.
Figure 112009081311311-pat00002
Slope의 역수에서 Rmax를 구하고, Y 절편에서 KA를 구할 수 있다.
하기 표 2에는 지금까지 보고된 CRP 결합상수들을 나타내었다. 이는 종래 항 C-반응성단백질 항체를 이용한 검출방법들을 사용하는 경우에 비해 본 발명의 분자각인 고분자를 이용한 검출방법이 3차수 정도 높은 결합상수 값을 나타냄을 보여준다.
[표 2]. 본 발명과 기존의 검출방법의 결합상수 비교
Figure 112009081311311-pat00003
[1] Meyer MHF, et al., A new method to detect a well known protein Biosensors and Bioelectronics 2006;21:1987-90.
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실험예 3. MIP의 선택적 결합력 분석
CRP에 대한 MIP의 특이적 결합력을 확인하기 위하여, BSA 5 μg와 CA 5 μg를 각각 넣고 실험예 1과 동일한 방법으로 결합력을 분석하였다.
도 6은 BSA(Bovine Serum Albumin)과 CA(carbonic anhydrase)에 대한 MIP와 NIP 결합력을 나타낸다. 측정결과 도 6에 나타난 바와 같이, PS와 NIP는 CRP, BSA 및 CA에 대하여 0.5 μg 이하의 낮은 결합력을 나타내었으나, MIP는 C-반응성단백질에서만 2.5 μg 이상의 높은 결합력을 나타내어 MIP가 CRP에 대해서 특이적으로 결합함을 보여주었다.
실험예 4. AFM 분석
도 7은 MIP와 NIP에 결합되어 있는 C-반응성단백질의 분포를 AFM(Atomic Force Microscope, Vecco사, 모델명 D-V)로 관찰한 것이다. 관찰결과, MIP상의 단백질은 측면 높이가 비교적 고른 반면, NIP 상에서는 단백질이 부분적으로 엉겨 있거나 측면 높이가 일정하지 않은 형태로 결합되어 있음이 관찰되었다. 이것은 분자각인된 단백질의 경우 펜타머(pentamer)가 동시에 결합하여 평평하고 고른 측면 높 이를 보이는 반면, 분자각인 되지 않은 고분자 표면에서는 1개의 리간드만으로도 결합이 가능하므로, 단백질 결합 모양과 분포가 불규칙하여 MIP와 크게 다른 모습을 보여주었다.
실시예 3: 기능성 단량체가 분자각인된 폴리스티렌 비드 제조
분자각인 폴리스티렌 비드의 제조과정은 실시예 1과 동일하나, 스티렌/DVB를 수용액상에 분산시키기 위하여 0.1% Brij 78을 분산제로 첨가한 후 광중합 하였다.
도 8은 제조된 폴리스티렌 비드를 SEM(전자현미경)으로 관찰한 것이다. 비드의 크기는 1.2 내지 1.8 μm 범위를 나타내었다. 분자각인 지수는 3.6이었다. 브래드포드 정량법으로 확인 가능한 검출한계는 0.3±0.1 μg/ml로서, 혈중 농도 범위 이하의 농도에서 CRP 검출이 가능하였다. 표면 전도율을 측정한 결과, 리간드가 결합되지 않은 폴리스티렌 비드의 경우 0.0767 mS/cm인데 반하여, 리간드가 분자각인된 비드는 9.98 mS/cm를 나타내었다. 이는 반응성 리간드의 한쪽 끝이 콜린 그룹과 phosphate 그룹이 있어 +, - charge를 띄고 있으므로, 리간드가 결합하지 않은 폴리스티렌에 비하여 표면전도율이 증가한 것으로 보인다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 C-반응성단백질, 혈청 아밀로이드 P 구성요소, PTX-3와 같은 펜트락신 단백질의 검출 효과를 높인 분자각인체의 제조방법에 관한 것으로, 펜트락신 단백질 및 반응성 리간드를 직접 반응성 표면에 중합할 수 있는 반응기-펜트락신 단백질 리간드의 결합체를 이용하여 다양한 형태의 분자각인된 중합체에 적용할 수 있다, 또한 이를 이용하여 펜트락신 단백질 검출용 필름 및 비드를 제조할 수 있다. 따라서 단일 펜트락신 단백질의 리간드보다 강한 결합력을 갖는 분자각인 반응기-펜트락신 단백질 리간드의 결합체를 이용하여 펜트락신 단백질의 검출 및 정제를 보다 용이하게 할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 스티렌-포스포콜린 리간드의 제조방법을 단계별로 설명하는 도면이다.
도 2는 본 발명에 따라 제조된 스티렌-포스포콜린 리간드의 NMR 분석결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 스티렌-포스포콜린 리간드를 이용한 분자각인 고분자제조방법을 나타내는 개략도이다.
도 4는 본 발명에 따른 스티렌-포스포콜린 리간드를 이용한 분자각인 폴리스티렌 필름 제조방법을 나타내는 개략도이다.
도 5는 본 발명의 MIP에 대한 결합상수 결정하기 위한 Langmuir plot을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 MIP의 선택적 결합력을 BSA와 CA를 이용하여 결합력을 분석한 결과이다.
도 7은 본 발명의 MIP와 대조군인 NIP에 결합되어 있는 C-반응성단백질의 분포를 AFM으로 관찰한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따라 제조된 폴리스티렌 비드를 SEM으로 관찰한 현미경 사진이다.

Claims (13)

  1. 펜트락신 단백질과 하기 구조식의 반응성 리간드를 결합시키는 단계; 상기 펜트락신 단백질과 반응성 리간드의 결합체를 반응성 표면의 계면에서 화학반응 시키는 단계; 및 상기 반응의 결과물에서 용출 완충용액으로 세척하여 펜트락신 단백질을 제거하는 단계를 포함하는 펜트락신 단백질 검출용 분자각인체의 제조방법:
    [구조식]
    L-S-R
    L: 펜트락신 단백질의 리간드
    R: 반응기
    S: 펜트락신 단백질의 리간드와 반응기를 연결하는 결합기.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 펜트락신 단백질은 C-반응성단백질 (C-reactive protein), 혈청 아밀로이드 P 구성요소(serum amyloid P component), 및 PTX-3(Pentraxin 3)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 펜트락신 단백질 검출용 분자각인체의 제조방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 펜트락신 단백질이 C-반응성단백질 일 때 펜트락신 단백질의 리간드(L)는 포스포콜린이고, 상기 펜트락신 단백질이 혈청 아밀로이드 P 구성요소일 때 펜트락신 단백질의 리간드(L)는 프롤린이고, 상기 펜트락신 단백질이 PTX-3일 때 펜트락신 단백질의 리간드(L)는 C1q인 것을 특징으로 하는 펜트락신 단백질 검출용 분자각인체의 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 반응기(R)는 중합 가능기, 또는 금속 또는 금속산화물과 반응하는 기능기인 것을 특징으로 하는 펜트락신 단백질 검출용 분자각인체의 제조방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 중합 가능기는 비닐, 스티릴, 아크릴로일, 메타크릴로일, 이타코노일, 소르빌 또는 디에노일에서 선택된 라디칼 중합 단량체이고, 금속 또는 금속산화물과 반응하는 기능기는 티올, 디설파이드, 또는 티오에테르에서 선택된 금속 반응기, 또는 트리클로로실릴, 트리메틸실릴, 트리이소프로필실릴 또는 카테콜에서 선택된 금속산화물 반응기인 것을 특징으로 하는 펜트락신 단백질 검출용 분자각인체의 제조방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 결합기(S)는 알킬, 아릴, 아릴알킬, 올리고에틸렌 옥 시드, 또는 이들 결합기의 조합인 것을 특징으로 하는 펜트락신 단백질 검출용 분자각인체의 제조방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 반응성 표면은 필름, 나노 입자, 나노와이어, 또는 다공성 입자의 표면인 것을 특징으로 하는 펜트락신 단백질 검출용 분자각인체의 제조방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 화학 반응은 반응성 리간드의 반응기와 단량체 및 가교제의 중합반응, 또는 반응성 리간드의 반응기와 금속 또는 금속산화물과의 화학적 결합반응인 것을 특징으로 하는 펜트락신 단백질 검출용 분자각인체의 제조방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 중합반응은 라디칼 중합 개시제 또는 광중합 개시제에 의한 열중합 또는 광중합 반응인 것을 특징으로 하는 펜트락신 단백질 검출용 분자각인체의 제조방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 펜트락신 단백질은 C-반응성단백질이고, 하기 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 C-반응성단백질 검출용 분자각인체의 제조방법:
    a) 스티렌과 포스포콜린 리간드가 결합된 스티렌-포스포콜린 리간드를 준비하는 단계;
    b) C-반응성단백질과 상기 스티렌-포스포콜린 리간드를 반응시키는 단계;
    c) 상기 반응의 결과물을 단량체, 가교제 및 개시제가 포함된 완충용액에 첨가하여 혼합하는 단계;
    d) 상기 혼합의 결과물을 UV로 광중합 반응시켜 C-반응성단백질이 결합된 폴리스티렌 고분자를 제조하는 단계; 및
    e) 상기 폴리스티렌 고분자를 용출 완충용액으로 세척하여 C-반응성단백질을 제거하는 단계.
  11. 하기 구조식을 갖는 펜트락신 단백질과 결합가능한 반응성 리간드:
    [구조식]
    L-S-R
    L: 펜트락신 단백질의 리간드
    R: 반응기
    S: 펜트락신 단백질의 리간드와 반응기를 연결하는 결합기.
  12. 고상의 반응성 표면, 및 상기 반응성 표면의 계면에 결합된 제 11항에 따른 복수의 반응성 리간드로 이루어지고, 상기 복수의 반응성 리간드는 펜트락신 단백질과 결합될 수 있도록 분자각인 된 것을 특징으로 하는 펜트락신 단백질 검출용 분자각인체.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 펜트락신 단백질 검출용 분자각인체는 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 펜트락신 단백질 검출용 분자각인체.
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