JP3932559B2 - ヒドロキシム酸誘導体を含む薬剤組成物 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、ミトコンドリアゲノム及び／又はミトコンドリアを損傷から保護し、又はそのような損傷と関連する疾患の処置に適した薬剤組成物に関し、この組成物は、下記式のヒドロキシム酸（ｈｙｄｒｏｘｉｍｉｃ ａｃｉｄ）誘導体又はその薬学的に許容される酸付加塩を活性成分として含む。

但し、
Ｒ¹は水素原子又はＣ_1-5アルキル基を示す。
Ｒ²は水素原子、Ｃ_1-5アルキル基、Ｃ_3-8シクロアルキル基又はフェニル基であり、必要により水酸基もしくはフェニル基で置換されていてもよい。或いは、Ｒ¹とＲ²はそれらが結合する窒素原子と一緒に５〜８員環を形成し、これは更に１個又はそれ以上の窒素、酸素又は硫黄原子を含んでいてもよく、上記環はベンゼン環と縮合されていてもよい。
Ｒ³は水素原子、フェニル基、ナフチル基又はピリジル基で、これらの基は１個又はそれ以上のハロゲン原子又はＣ_1-4アルコキシ基で置換されていてもよい。Ｙは水酸基を示す。
Ｘはアミノ基を示し、
ＡはＣ_1-4アルキレン基又は化学結合又は下記式

（但し、Ｒ⁴は水素原子又はフェニル基を示し、
Ｒ⁵は水素原子又はフェニル基を示す。
ｍは０，１又は２の値である。
ｎは０，１又は２の値である。）
の基を示す。
背景技術
ハンガリー特許第１７７５７８号及びその対応米国特許第４，３０８，３９９号には、糖尿病性血管障害の治療に適した、式Ｉの化合物の範囲内にあるヒドロキシム酸誘導体が記載されている。
ハンガリー特許第２０７９８８号及びその対応ＥＰ特許第４１７２１０号にも、選択的なベータ遮断効果を有し、従って糖尿病性血管障害の治療に適している、ヒドロキシム酸ハロゲン化物が記載されている。
また、第Ｔ／６６３５０号として刊行されたハンガリー特許出願第２３８５／９２号にも、ヒドロキシム酸誘導体が記載されている。これらの公知の化合物は、血管の変形の治療、主に糖尿病の治療に使用することができる。
ヒトの細胞の核ゲノムが約１００，０００の遺伝子をコードしている一方で、細胞質にも少数の独立したミトコンドリアゲノムが存在していることは周知である［Ｗｅｌｌａｃｅ，Ｄ．Ｃ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６，６２８−６３２（１９９２）］。
ミトコンドリアゲノムは、１３の遺伝子のみをコードしている［Ｃｌａｙｔｏｎ，Ｄ．Ａ．，Ｃｅｌｌ，２８，６９３−７０５（１９８２）］。しかし、細胞は、そうした遺伝子なしに酸素を消費することはできず、従って、ミトコンドリアゲノムに損傷が生じた場合には、細胞は嫌気性となる。核ゲノムの場合と異なり、ミトコンドリアゲノムはＤＮＡ修復能力を有しておらず、またミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）はヒストンに囲まれてはいないので、ミトコンドリア遺伝子は、核でコードされている遺伝子よりはるかに傷付きやすい［Ｔｚａｇｏｌｏｆｆ，Ａ．，Ｍｙｅｒ，Ａ．Ｍ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５５，２４９−２８５（１９８６）］。細胞での酸素の消費の９０％以上は、ミトコンドリア内膜内で生じ、ここでは、通常の酸化のみならず、酸素フリーラジカルも形成される［Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）］。こうしたフリーラジカルは、形成されたばかりのミトコンドリアＤＮＡをたやすく修飾してしまう。こうした反応性酸素フリーラジカルの形成は、例えば、虚血後の再酸素負荷の間には有意に増大し、フリーラジカル濃度が増大した結果、ミトコンドリアＤＮＡに相当程度の不可逆的な損傷が生じ得る［Ｍａｒｋｌｕｎｄ，Ｓ．Ｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，２０，（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ＩＩ），２３−３０（１９８８）］。フリーラジカルは、正常な条件下でも、ｍｔＤＮＡに微小ではあるものの蓄積した損傷を引き起こす。従って、個々人によって差こそあるものの、ｍｔＤＮＡの損傷が加齢と共に増大すること［Ｗｅｌｌａｃｅ，Ｄ．Ｃ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１，１１７５−１２１２（１９９２）］、そして、こうしたｍｔＤＮＡの損傷によって、高齢者の心筋症や神経変性性疾患が十分生じ得るものであること［Ｃｏｒｔｏｐａｓｓｉ，Ｇ．Ａ．，Ａｒｎｈｅｉｍ，Ｎ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，６０２７−６０３３（１９９０）］は理解されよう。
ミトコンドリアゲノムの損傷は、細胞のエネルギー代謝に障害を及ぼすことによって、筋障害［Ｌｕｆｔ，Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，８７３１−８７３８（１９９４）］や拡張性心筋症或いは肥厚性心筋症［Ｏｚａｗａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１７０，８３０−８３６（１９９０）］などの重篤な疾病状態を引き起こすことがあり、また、数多くの神経変性性疾患（例えば、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病）や糖尿病の重篤な症状が加齢と共に悪化する際に何らかの役割を果たしている可能性がある［Ｌｕｆｔ，Ｒ．，上掲の文献］。
上記疾患（例えば筋障害）のいくつかでは、抗酸化剤による治療が行われてきた（コエンザイムＱ並びにビタミンＣを用いた治療）［Ｓｈｏｆｆｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｗａｌｌａｃｅ，Ｄ．Ｃ．，Ａｄｖ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１９，２６７−３３０（１９９０）］。こうした治療では結果が得られることは少ない。また、リポアミドを使用して抗酸化・代謝療法を行うことによって、虚血後の再酸素負荷による障害を防止する試験的治療も行われてきた。リポアミドは、一方では抗酸化作用によって、他方ではミトコンドリア代謝に正の影響を及ぼすことによって、虚血によって心臓に生じた障害を回復させる［Ｓｕｅｍｅｇｉ，Ｂａｌａｚｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２９７，１０９−１１３（１９９４）］。しかし、障害が進行する過程がよくわかっていないので、画期的な治療法はいまだに開発されていない。
上述した点から、ミトコンドリアゲノムを損傷から保護し、またそうした損傷を防止することのできる製剤製品の開発が必要とされている。
発明の開示
式Ｉの化合物は、ミトコンドリアゲノムを損傷から保護することができ、従って、式Ｉの化合物がミトコンドリアゲノム及び／又はミトコンドリアを損傷から保護したり、そうした損傷に関連した疾患を治療したりする上で適していることが見出された。ミトコンドリアを原因とする疾患の例としては、以下のものがある。
ＫＳＳ［カーンズ・セイアー症候群（Ｋｅａｒｎｓ−Ｓａｙｒｅ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）］
ＭＥＲＲＦ［ミオクローヌスエピレプシイー及びラギッド赤色線維症候群（ｍｙｏｃｌｏｎｕｓ ｅｐｉｌｅｐｓｙ ａｎｄ ｒａｇｇｅｄ ｒｅｄ ｆｉｂｅｒｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）］
ＬＨＯＮ［レーバー遺伝性視神経萎縮症（Ｌｅｂｅｒ’ｓ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｏｐｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）］
ＭＥＬＡＳ［ミトコンドリア筋障害、脳障害、乳酸アシドーシス及び発作様エピソード（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｙｏｐａｔｈｙ，ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ，ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄｏｓｉｓ ａｎｄ ｓｔｒｏｋｅ−ｌｉｋｅ ｅｐｉｓｏｄｅｓ）］
リー病（Ｌｅｉｇｈ ｄｉｓｅａｓｅ）
ＣＰＥＯ［慢性進行性外眼筋麻痺（ｃｈｒｏｎｉｃ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｐｈｔｈａｌｍｏｐｌｅｇｉａ）］
アルパース症候群（Ａｌｐｅｒ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）
ミトコンドリアゲノムの損傷を伴う年齢依存性変性性疾患の諸例：
神経変性性疾患（Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）：
アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）
パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）
ＡＬＳ［筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）］
ＨＤ［ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）］
心筋症及び他の筋障害（Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ）
従って、本発明は、式Ｉのヒドロキシム酸誘導体又はその薬学的に許容される酸付加塩を活性成分として０．１〜９５重量％（％ ｂｙ ｍａｓｓ）含有し、１又はそれ以上の通常の担体が混合された薬剤組成物に関する。
発明を実施するための最良の形態
明細書及び請求の範囲において、Ｃ_1-5アルキル基は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル又はｎ−ペンチル基であり、好ましくはメチル又はエチル基である。
Ｃ_3-8シクロアルキル基は、例えば、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル又はシクロオクチル基であり、好ましくはシクロペンチル又はシクロヘキシル基である。
１個又はそれ以上のヘテロ原子を含む５〜８員環は、例えば、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピペラジン、モルホリン、インドール、キノリン等の環とすることができる。
ハロゲン原子は、例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ又はイオド原子であり、好ましくはクロロ又はブロモ原子である。
式Ｉの化合物の薬学的に許容される酸付加塩は、塩酸、硫酸等の薬学的に許容される無機酸又は酢酸、フマル酸、乳酸等の薬学的に許容される有機酸と形成される酸付加塩である。
式Ｉの化合物の好適な小群は、下記式のヒドロキシム酸誘導体からなる。

（式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、ｍ及びｎは式Ｉに関して記載した通りであり、Ｘはアミノ基を示し、Ｙは水酸基を意味する。）
式ＩＩの特に好ましい化合物は、Ｒ¹及びＲ²がそれらが結合している窒素原子と共にピペリジノ基を形成し、Ｒ³がピリジル基を表し、ｍ及びｎが０の値であり、Ｘが上記定義通りである化合物である。これらの化合物のうちで、好ましい種は下記の通りである。
０−（３−ピペリジノ−２−ヒドロキシ−１−プロピル）ニコチン酸アミドキシム（化合物“Ｂ”）。
式Ｉの化合物は、ハンガリー特許第１７７５７８号で公知な方法によって製造することができる。
本発明の薬剤組成物は、式Ｉのヒドロキシム酸誘導体又はその薬学的に許容される酸付加塩を活性成分として０．１〜９５重量％、好ましくは１〜５０重量％、特に５〜３０重量％と、１又はそれ以上の通常の担体（ｃａｒｒｉｅｒ）を含む。
本発明の薬剤組成物は、経口、非経口又は直腸投与、又は局所処置に適しており、固体であっても液体であってもよい。
経口投与に使用する固形薬剤組成物は、散剤、カプセル、錠剤、フィルムコーティング錠剤、マイクロカプセルなどとすることができ、ゼラチン、ソルビトール、ポリ（ビニルピロリドン）などの結合剤；ラクトース、グルコース、デンプン、リン酸カルシウムなどの賦形剤；ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリ（エチレングリコール）、シリカなどの錠剤成形用助剤；ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤を担体として含有することができる。
経口投与に使用する液状薬剤組成物は、溶液、懸濁液又は乳液とすることができ、例えば、ゼラチン、カルボキシメチルセルロースなどの懸濁剤；ソルビタンモノオレエートなどの乳化剤；水、オイル、プロピレングリコール、エタノールなどの溶剤；ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルなどの防腐剤を担体として含有することができる。
非経口投与に使用する薬剤組成物は、一般に、活性成分の滅菌溶液から構成される。
上記した投薬形態及び他の投薬形態はそれ自体公知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ［レミントン製剤科学，第１８版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＵＳＡ，（１９９０）］を参照されたい。
本発明の薬剤組成物は、一般に、単位用量を含む。成人患者の典型的な一日当りの用量は、式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される酸付加塩０．１〜１０００ｍｇである。この用量は、１回で投与することも、何回かに分けて投与することもできる。実際の用量は多くの要因によって左右されるので、医師が決定を行うことになる。
本発明の薬剤組成物は、式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される酸付加塩を１又はそれ以上の担体に混合し、得られた混合物をそれ自体公知の方法で薬剤組成物にすることによって調製される。有効な方法は文献、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓで公知である。
本発明の別の態様は、式Ｉの化合物（但し、Ｒ、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｘ、Ｙ、Ａ及びＢは式Ｉに関して記載した通りである）又はその薬学的に許容される酸付加塩を、必要により薬剤組成物に通常用いられる１又はそれ以上の担体と混合して、ミトコンドリアゲノム及び／又はミトコンドリアが損傷することから保護するのに有効な薬剤組成物の調製に使用することからなる。
本発明の更に他の態様は、式Ｉの化合物（但し、Ｒ、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｘ、Ｙ、Ａ及びＢは式Ｉに関して記載した通りである）又はその薬学的に許容される酸付加塩を、必要により薬剤組成物に通常用いられる１又はそれ以上の担体と混合して、ミトコンドリアゲノム及び／又はミトコンドリアの損傷に関連した疾患の処置に有効な薬剤組成物の調製に使用することからなる。そのような疾患は、特に筋症（ｍｙｏｐａｔｈｙ）、心筋症（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ）、及びアルツハイマー病、パーキンソン病又はハンチントン病のような神経変性性疾患（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）を含む。
本発明の好適な使用では、式ＩＩで表され、式中のＲ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｘ、Ｙ、ｍ及びｎが式ＩＩに関して記載した通りであるヒドロキシム酸誘導体又はその薬学的に許容される酸付加塩が用いられる。
本発明の更に好適な使用では、式ＩＩで表され、式中のＲ¹及びＲ²がそれらが結合している窒素原子と共にピペリジノ基を形成し、ｍ及びｎの値が０であり、Ｘ及びＹが式ＩＩに関して記載した通りであるヒドロキシム酸誘導体又はその薬学的に許容される酸付加塩が用いられる。
本発明の特に好適な使用では、０−（３−ピペリジノ−２−ヒドロキシ−１−プロピル）ニコチン酸アミドキシム〔０−（３−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐｙｌ）−ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｍｉｄｏｘｉｍｅ〕、又はそれらの薬学的に許容される酸付加塩が用いられる。
インビトロでの試験
式Ｉのヒドロキシム酸誘導体のミトコンドリアゲノムの保護効果を、それらの酸化的リン酸化を保護する能力によりインビトロで調べた。この試験の理論的背景は、細胞にとって必要なエネルギーがミトコンドリア中で合成されるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）によって生産されるという点にある。基質の輸送やクエン酸回路の異常、呼吸複合体の欠陥、酸化的リン酸化での連絡切断が生じれば、細胞のエネルギー供給に支障がでる。この試験では、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母細胞及びＫ５６２ヒト赤血白血病細胞（ｈｕｍａｎ ｅｒｉｔｒｏｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｅｌｌｓ）に熱ショックを加えることによって酸化的リン酸化を損傷し、化合物“Ｂ”の保護効果を調べた。
熱ショックの直後、即ち２、３分以内に発現する障害作用の一つにより呼吸鎖が酸化的リン酸化から切断されることによって、ミトコンドリアに影響が及ぶことが知られている。化学的脱共役剤を使用した試験では、電子伝達の間に呼吸鎖の酵素複合体によってミトコンドリアの内膜と外膜の間の空間に汲み出されたプロトンが、脱共役剤の作用によって内腔へと戻ってしまい、その結果、ＡＴＰが合成されなくなることが示された。熱ショックの場合にも、同様の過程が進行し、その結果、細胞へのエネルギー供給が急激に低減する。
試験での使用材料：
サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞培養
Ｓ２８８Ｃ単相体野生型細胞系統（ｈａｐｌｏｉｄ ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）を、１％酵母エキス、２％ペプトン、３％グリセロールを含むＹＰＧ培地で培養した。培養は、液体培地で、水浴中、２５℃、好気的条件下にて振盪した。
Ｋ５６２培養
ヒト慢性骨髄性白血病（ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉｃ）に由来するＫ５６２赤血白血病（ｅｒｉｔｒｏｌｅｕｋｅｍｉｃ）型細胞系統を、ＲＰＭＩ １６４０液体培地で、１０％子ウシ血清の存在下、温度を３７℃とし、９５％の空気と５％の二酸化炭素を含む湿潤ガス混合物中で培養した。
オリゴマイシン
カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＩ−ＣＣＰ）（シグマ・ケミカルス（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）製）
酸素消費は、以下の方法により測定した。
指数成長期の細胞を遠心し、サッカロミケス・セレビシエの場合には、２％のグリセロールの代わりに１％のマンノースを含む１０倍量のＹＰＧ培養液に加えた。Ｋ５６２の場合には、分離の後に、細胞を４×１０⁶個／ｍｌの濃度で、２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地に加えた。酸素消費は、クラーレ電極により２ｍｌのサーモスタット付きキュベット中で測定した。方法の詳細は、以下の記事に記載されている。Ｐａｔｒｉａｒｃａ，Ｅ．Ｊ．及びＭａｒｅｓｃａ，Ｂ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９０，５７−６４（１９９０）。
呼吸速度に対する刺激は、％として下記式によって与えられる。
［（Ｖ^CI-CCP／Ｖ^Olig）−１］×１００
分離を行った後、熱ショックの１時間前に、１０^-5、２．５×１０^-5、５×１０^-5Ｍの化合物“Ｂ”と溶媒（ＰＢＳ、即ちリン酸緩衝液を含む生理食塩水）とを、培地にそれぞれ加えた。熱ショックは、培養を、もとの２５℃ではなく４２℃に５分間保つことによって加えた。Ｋ５６２細胞の場合には、培養を、もとの３７℃ではなく、４８℃に１０分間保った。
実験では、サッカロミケス・セレビシエ細胞及びＫ５６２細胞の双方について、熱ショックによって、電子伝達鎖がＡＴＰ合成から有意に脱共役されることが認められた。
得られた結果を表１並びに表２に示す。表中には、刺激（％）並びに得られた保護（％）と共に、処理の方法も示してある。

表１及び表２のデータからわかるように、化合物“Ｂ”を用いると、ミトコンドリアの呼吸複合体の脱共役が防止されることによって、細胞の保護が明らかに上昇した。
調べた範囲では、化合物“Ｂ”の最適濃度は２５マイクロモルであった。化合物“Ｂ”は、適正な細胞機能を維持するばかりでなく、酸素フリーラジカルの形成も間接的に防止している可能性が高い。こうしたことから、我々は化合物“Ｂ”を使用することによって、ミトコンドリアゲノムを損傷から保護し得ると結論づけることができる。
熱によって誘導した脱共役からのミトコンドリアの保護
正常な条件下では、ＮＡＤＨの酸化の間に、呼吸複合体がプロトンを汲み出し、ミトコンドリア内膜の両側にプロトン勾配が作り出される。このプロトン勾配は、ＡＤＰと無機リン酸塩からのＡＴＰ合成に対してエネルギーを供給する。プロトンが内膜腔（ｔｈｅ ｉｎｎｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｐａｃｅ）に再度入ることができるのは、Ｆ₁Ｆ₀ＡＴＰ分解酵素（Ｆ₁Ｆ₀ＡＴＰａｓｅ）を介する場合のみであり、その際には、ＡＤＰと無機リン酸塩（Ｐｉ）からのＡＴＰ合成に用いられるプロトン勾配のエネルギーが利用される。ＡＤＰ又はＰｉが存在しない場合は、プロトン勾配が増大し、呼吸複合体並びにミトコンドリアの酸素消費が阻害される。しかし、内膜に何らかの損傷が生じている場合には、この損傷領域からプロトンが再度内膜腔に入ることができ、プロトン勾配のエネルギーはＦ₁Ｆ₀ＡＴＰ分解酵素によって利用されることがなく、従って、ミトコンドリアでの酸化は、ＡＤＰ非依存性となる（ミトコンドリアが脱共役状態となる）。
熱ストレスが、ミトコンドリアでのエネルギー（ＡＴＰ）生成からミトコンドリアでの酸化の脱共役を誘導し得ることは周知であり、これは、ミトコンドリア内膜に熱ストレスによって損傷が生じた結果である。膜の損傷領域では、膜間腔から内膜内腔へとプロトンが漏れて戻り、その結果、ミトコンドリアでの酸化は、ＡＤＰ非依存性（ＡＤＰ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）となる。
試験にあたっては、対照ラット、あるいは調製を行う６時間前に４０ｍｇ／ｋｇの化合物“Ｂ”を投与しておいたラットからミトコンドリアを単離し、Ｓｕｅｍｅｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９，８７４８（１９８４）に記載されているように調製を行った。酸素消費は、チャンバー内で３７℃でクラーク電極を用いて測定した。５ｍＭのＡＤＰの存在下、並びにＡＤＰの不在下での酸素消費速度を測定した。測定値を、未処理のミトコンドリアと、４２℃で８分間予備インキュベートしたミトコンドリアの双方について、表３に示す。

表中のデータは、３回の実験での平均±標準誤差
表３から、正常条件下では、ミトコンドリアでの酸化はＡＤＰが存在している場合の方が、ＡＤＰ非含有培地中の場合より約６倍速く、ミトコンドリアでの酸化とＡＴＰ合成との間に良好な共役関係が存在していることがわかる。しかし、ミトコンドリアでの共役関係は、熱ストレスが加わると著しく弱まり、対照例ではこの値が下がっている（２．７）。しかし、化合物“Ｂ”で予め処理しておいた動物由来のミトコンドリアでは、相対的に高い共役比（５．１）が保持された。これらのデータから、式Ｉの化合物、特に化合物“Ｂ”によって、ミトコンドリアでのエネルギー生成（ＡＴＰ合成）が、熱ストレスによる損傷から保護されたことがわかる。
過酸化水素によって誘導した細胞変形からのコリン作動性（ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ）ニューロンの保護
過酸化水素が、細胞中で酸素関連フリーラジカルを発生させることによって細胞に酸化性の障害を引き起こすことは周知の通りである。従って、過酸化水素によって誘導した細胞障害は、ニューロンの変形についての一般的なモデルとして使用が可能である。ＳＮ６．１０．２．２ハイブリッド、Ｎ１８ＴＧ２＋ＥＤ１５中隔ニューロン（ｓｅｐｔａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ）細胞系統［Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４，１２３７（１９８６）］を使用して、神経変性性疾患の主たる経路となっている、酸素関連フリーラジカルによって生じる細胞障害に対する式Ｉの化合物の保護作用を調べた。
試験に際しては、細胞を９６ウェルプレート上で２つの群に分けた。一方の群は、化合物“Ｂ”（４０ｍｇ／ｌ）を含む培地に保持し、もう一方の群は、基本の培地に保持した。処理は、２群への分割の２４時間後に開始した。双方の群を異なった濃度の過酸化水素を含む培地で処理した。４８時間の処理期間の後に、生存試験を実施した。
生存試験：
ウェルから培地を取り除き、細胞を滅菌ＰＢＳで洗浄した後に、１５０μｇのアルカリフォスファターゼの基質を１５０μｇの新しいジエタノールアミンバッファー（ｐＨ９．８）に溶解したものを各ウェルに加えた。プレートを３０℃でインキュベートし、各ウェルに５０μｌの水酸化ナトリウムを加えることによって反応を停止させた。ダイナテック（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）のＥＬＩＳＡリーダーを使用して４０５ｎｍで吸光度を測定し、培地のみを含む各プレートの周辺部のウェルをブランクバックグラウンド測定に使用した。得られた結果を表４に示す。

表４にも示されているように、式Ｉの試験化合物（即ち、化合物“Ｂ”）を使用すると、コリン作動性ニューロンが、過酸化水素で誘導した細胞溶解から効果的に保護された。過酸化水素は、大量の酸素関連フリーラジカルを発生させることによって細胞を殺すので、化合物“Ｂ”は、酸素関連フリーラジカルに伴ってニューロンの損傷が生じているようなあらゆる疾患で、ニューロンを保護し得るものである。従って、式Ｉの化合物は、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、各種原因によるいくつかの痴呆［Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，５６，１１５１−１１７１（１９９５）］に有利に使用され得るものである。
インビボでの試験
式Ｉのヒドロキシム酸誘導体のミトコンドリアゲノムに対する保護作用を、インビボでも、ラットへの投与を行うことによって調べた。ＡＺＴ（３’−アジドチミジン、シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）製）を５０ｍｇ／ｋｇの用量で、ウイスターラットに１４日間毎日投与した。ある試験群には、ＡＺＴを化合物“Ｂ”（一日量、４０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせて投与した。投与期間中並びに投与後に、各種の測定を行った。
１）Ｓｃｈｉｌｌｅｒ ＡＴ−６心電計（ＥＣＧ）を使用して、動物の心機能を四肢でモニターした。技術文献［Ｋａｗａｉ，Ｃ．，Ｔａｋａｔｓｕ，Ｔ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２９３，５９２（１９７５）；Ａｎｇｅｌａｋｏｓ，Ｅ．Ｔ．，Ｂｅｒｎａｒｄｉｎｉ，Ｐ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１８，２６１−２６３（１９６３）］に記載されている標準的な方法を使用して、心電図の各種パラメータを調べた。我々が測定したのは、ＲＲ、ＰＲ、ＴＱ間隔と、Ｊ点の低減である。得られた結果を表５に示す。表中の値は５回の測定の平均値±標準偏差として示してある。

表５の結果からわかるように、ＡＺＴを投与した結果、動物の心拍数は対照群と比較して有意に長くなり（ＲＲ）、ＰＱ間隔も上昇した。更に、ＱＴ値も有意に上昇し、左心室の主筋肉塊を表す誘導Ｉ及びＶＬでは、Ｊ点の有意な低減（０．１ｍＶ超）がみられた。こうしたパラメータは、心筋の虚血状態が生じていたり、酸素消費に欠陥があったりする場合に特徴的なものである。しかし、ＡＺＴに加えて化合物“Ｂ”を一日当り４０ｍｇ／ｋｇ投与したケースでは、心臓のパラメータは正常範囲に戻っており、即ち、この化合物は、ＡＺＴによって誘導された異常状態から心臓を保護していた。
２）動物の呼吸活性を測定した。測定に際しては、ＮＡＤＨ：シトクロムＣ酸化還元酵素、シトクロムオキシダーゼ、並びにクエン酸シンターゼの活性を、技術文献［Ｓｕｅｍｅｇｉ，Ｂａｌａｚｓ ｅｔ ａｌ．；Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，１９２，９−１８（１９９０）］に記載された方法に従って測定した（ＮＡＤＨ：ニコチン酸アデニンジヌクレオチド、還元形態）。得られた結果を表６に示す。

表６にはっきりと示されているように、ＡＺＴを投与すると、心臓のミトコンドリアの呼吸複合体の活性が有意に低下する。このように、ＡＺＴは、心臓での酸化的エネルギー生成を著しく低下させ、その結果、心臓の基本的な働きが適正に実行されない状態を引き起こし得る（表５の心電図データを参照のこと）。また、ミトコンドリアでの呼吸能力が低下すると、ミトコンドリアでの代謝に異常が生じて心臓に更に損傷が及ぶことともなりかねない。
ＡＺＴを化合物“Ｂ”と組み合わせて動物に投与すると、ＡＺＴの呼吸活性低下作用はほぼ消失し、呼吸活性の値は正常な場合と近い値のままとなった。即ち、式Ｉの試験化合物は、呼吸複合体を保護することにより、ＡＺＴによって誘導されたミトコンドリア膜の損傷を有意に低減させた。
３）ミトコンドリアゲノムに対する損傷を調べた。ミトコンドリアゲノムに対する損傷は、ＰＣＲ法を用いることによって測定した（ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応）。プライマーは、欠失を調べるために、シトクロムオキシダーゼ成分ＩからシトクロムＢまでの範囲を増幅することによって選択した（プライマーは、Ｒａｎｓｏｎｈｉｌｌ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．から購入した）。使用した方法は、Ｓｕｅｍｅｇｉ，Ｂａｌａｚｓらの刊行物［Ｂ．Ｂ．Ａ．（１９９６）、現在編集中］に記載されている。ミトコンドリアゲノムの４９２９〜１６２９８までの領域の増幅にＰＣＲプライマーを使用したところ、ＡＺＴ投与ラットでは、０．５〜１．５ｋｂの範囲が有意に増幅された。なお、対照群の動物では、こうした短い範囲の増幅はみられない。非損傷ゲノムを用いた試験でプライマーが互いに１１．３ｋｂ以上離れていたことから、非損傷ゲノムでは、短いＤＮＡ範囲の増幅が生じることはないと理解される。ＡＺＴ投与ラットでこうした短いＤＮＡ範囲が増幅されたという事実からは、ＡＺＴ投与によって１０ｋｂの範囲がミトコンドリアゲノムから欠失したことがわかるし、プライマーが互いに０．５〜１．５ｋｂまで近づいたのも、こうした損傷の生じたゲノムでのことである。従って、ＤＮＡ範囲の増幅が可能となる。こうしたＤＮＡ範囲が増幅されたことからは、ミトコンドリアゲノムへの損傷が生じていること、即ち、シトクロムオキシダーゼのサブグループＩ、ＩＩ、並びにＩＩＩをコードしている遺伝子、ＡＴＰ６及び８をコードしている遺伝子、複合体Ｉ又はＮＡＤＨ：ユビキノン酸化還元酵素２、４、４Ｌ、５及び６をコードしている遺伝子、シトクロムＢをコードしている遺伝子の部分的欠失あるいは完全な欠失が生じていることがわかる。
ＡＺＴを化合物“Ｂ”と組み合わせて動物に投与すると、上述のような短いＤＮＡ範囲の増幅は有意に低減し、いくつかのＤＮＡ断片は検出不能となった。
このことは、化合物“Ｂ”を使用することによって、ＡＺＴによって誘導された損傷から上記のような遺伝子が保護され、あるいは少なくとも、そうした損傷が有意に低減したことを意味している。なお、ＡＺＴによって誘導された上記遺伝子に対する人工的な損傷は、虚血性心筋症あるいは高齢者の心筋症の結果としても生じるものである。
遺伝性ミトコンドリア心筋症（ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｉｃ）に対して式Ｉの化合物が及ぼす効果
試験は、化合物“Ｂ”を一日量４０ｍｇ／ｋｇで１４日間にわたって処理した遺伝性ミトコンドリア心筋症ラットを使用することによって実施した。ラットの心機能は、心電計（ＥＣＧ）で監視した。対照群並びに化合物“Ｂ”投与群について得られた心電図データを表７に示す。値は、３つの測定結果の平均±標準偏差として示してある。

心機能に異常をきたした遺伝性ミトコンドリア心筋症のラットを用いて試験を行った。この事実は、表７から容易にみてとれる。これらの心筋症ラットは、虚血性心筋症や高齢者の心筋症の完全なモデルとなる。化合物“Ｂ”を用いて１４日間処理を行った結果、動物の心機能は有意に改善され、心電図の各種パラメータは正常範囲に戻った。
上記試験からわかるように、式Ｉのヒドロキシム酸誘導体を使用すると、ミトコンドリアゲノムを各種の損傷から保護することが可能となる。使用した動物モデルの場合には、ヒドロキシム酸誘導体によってＡＺＴで誘導した心臓障害が実質的に解消されており、このことは、現在１０万人を越える人々が世界中でＡＺＴによる治療を受けていることを考えると、ヒト医科学において多大な意味を有するものである。
この化合物の使用に伴う更なる重要な特徴は、すでに発症してしまっている心筋症（ミトコンドリアの損傷は、虚血性心筋症や高齢者の心筋症の場合と類似している）の場合でも、こうした化合物によって心機能の異常が解消され、正常な心電図パラメータが回復されることである。
以上の試験からわかるように、式Ｉの化合物を活性成分として含む本発明の薬剤組成物は、ミトコンドリアゲノム又はミトコンドリアを損傷から保護することができ、更に、既に発生してしまったこの種の損傷を伴う疾患を治療することができる。

Claims (6)

1. 活性成分として、式
   

   

   ［但し、
   Ｒ¹は水素原子又はＣ_1-5アルキル基を示す。
   Ｒ²は水素原子、Ｃ_1-5アルキル基、Ｃ_3-8シクロアルキル基又はフェニル基であり、必要により水酸基もしくはフェニル基で置換されていてもよい。或いは、Ｒ¹とＲ²はそれらが結合する窒素原子と一緒に５〜８員環を形成し、これは更に１個又はそれ以上の窒素、酸素又は硫黄原子を含んでいてもよく、上記環はベンゼン環と縮合されていてもよい。
   Ｒ³は水素原子、フェニル基、ナフチル基又はピリジル基で、これらの基は１個又はそれ以上のハロゲン原子又はＣ_1-4アルコキシ基で置換されていてもよい。Ｙは水酸基を示す。
   Ｘはアミノ基を示し、
   ＡはＣ_1-4アルキレン基又は化学結合又は下記式
   

   

   （但し、Ｒ⁴は水素原子又はフェニル基を示し、
   Ｒ⁵は水素原子又はフェニル基を示す。
   ｍは０，１又は２の値である。
   ｎは０，１又は２の値である。）
   の基を示す。］
   のヒドロキシム酸誘導体又はその薬学的に許容される酸付加塩０．１〜９５重量％を１又はそれ以上の通常の担体と混合してなる、筋症又は神経変性性疾患を処置するための薬剤組成物。
2. 筋症が心筋症である請求の範囲第１項記載の薬剤組成物。
3. 活性成分が、Ｏ−（３−ピペリジノ−２−ヒドロキシ−１−プロピル）ニコチン酸アミドキシム又はその薬学的に許容される酸付加塩である請求の範囲第１項又は第２項記載の薬剤組成物。
4. 請求の範囲第１項記載の式Ｉ［但し、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｘ、Ｙ及びＡは請求の範囲第１項に記載した通りである］の化合物又はその薬学的に許容される酸付加塩を、必要により薬剤組成物に通常使用される１又はそれ以上の担体と混合しての、筋症又は神経変性性疾患を処置する活性を持つ薬剤を調製するための使用。
5. 筋症が心筋症である請求の範囲第４項記載の使用。
6. 式Ｉの化合物が、Ｏ−（３−ピペリジノ−２−ヒドロキシ−１−プロピル）ニコチン酸アミドキシム又はその薬学的に許容される酸付加塩である請求の範囲第４項又は第５項記載の使用。