JP3880062B2 - Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘパリナーゼ遺伝子 - Google Patents
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Description
発明の背景
本発明は、一般的にヘパリナーゼの技術分野に関し、特に、Flavobacterium heparinum中で発現するヘパリナーゼＩをコードする遺伝子に向けられる。
アメリカ合衆国政府が、国立衛生研究所の認可番号25810により、本発明の権利を有する。
ヘパリンは、セリンプロテアーゼ阻害剤(セルピン(serpins))を活性化する抗凝血剤である。このヘパリンは、血液凝固カスケードにおいて、Damusら、Nature 246:355-357(1973)により記載のように、鍵となる役割を演じる。Lindahlら、Trends Biochem. Sci. 11:221-225(1986)によれば、ヘパリンは、現在既知である、最も酸性の天然ポリマーである。それは、D-ウロン酸1,4-β-D-グルコサミンである1,4結合ジサッカライドの主要な繰り返し単位からなり、モノサッカライド単位あたり４価の平均負電価(３つの硫酸基および１つのカルボキシラト基(carboxylate group))を有する。ヘパリンは、Kuscheら、Proc. Natl. Acad. Sci., 77:6551-6555(1980)およびComper、Polymer Monograph 7, 1981による報告のように、3,000〜45,000ダルトンの平均分子量を有する多分散系であり、かつD-グルクロン酸のL-イズロン酸への部分的エピマー化、および不完全なNおよびO-硫酸化により不均質である。
さらに、ヘパリンのようなプロテオグリカンは、広範囲の生物学的作用を有し、これには、血液化学、成長因子相互作用および傷治癒、細胞外マトリックスおよび免疫応答を介した細胞における塩基性構造タンパク質との相互作用を含む。タンパク質／ペプチド／ヘパリン／複合体炭水化物相互作用の基本的性質が、重要である。ヘパリンは、かなり不均質であると考えられるが、Cardin, A. D.およびH. J. R. Weintraub、Arteriosclerosis 9, 21-32(1989)により論評されるように、異なるヘパリン画分が、その生物学的役割に対して、なんらかの組成上、そして、おそらく構造上の特異性を示唆する明瞭で独特な特性を示すことは、現在、まったく明らかである。
ヘパリナーゼは、ヘパリンリアーゼとも呼ばれ、詳細にわたって特徴づけられているヘパリンを分解し得る唯一の既知の酵素である。ヘパリナーゼは、酵素委員会により、EC4.2.2.7と命名されている。Galliherら、Eur. J. Appl. Microbiol. 15:252(1982)によれば、本酵素は、グラム陰性土壌単離菌であるFlavobacterium heparinumのペリプラズム空間に見出されるポリサッカライドリアーゼである。HovingおよびLinker、J. Biol. Chem. 245:6170(1970)に記載のように、F. heparinumは、ヘパリンを、炭素および窒素の唯一の供給源として利用する。ヘパリナーゼは、ヘパリン異化の最初の酵素である。構造的には小量しか分泌されないが、Galliherら、App. Environ. Microbiol. 41:360(1981)は、酵素発現が、ヘパリンにより誘導され、培地中の硫化物により可逆的に抑制されることが発見された。Lindhardtら、Appl. Biochem. Biotechnol. 9:41(1984)は、ヘパリナーゼが他のポリアニオン性ポリサッカライドにより阻害されることを示した。
ヘパリナーゼは、標準的クロマトグラフ技術により精製され、その酵素特性が詳細にわたって明らかになった。これは、Yangら、J. Biol. Chem. 260:1849(1985)を含む科学者により記載されている。本酵素は、44,000ダルトンの単量体タンパク質で約9のpIを有する。
ヘパリナーゼは、エリミナーゼとして作用し、不飽和二重結合を非還元末端基に残す。この二重結合は、不飽和産物の232nmでの吸光度によるヘパリナーゼ活性のアッセイにおいて使用される。本酵素は、塩類に対する耐性が低く、ヘパリンに対し非常に特異的であり、30nMのKdを有する。ヘパリナーゼは、4.5Kcal/molの活性化エネルギー、8×10-6のkm値および4×10-7M/分の最大反応速度（Vmax）を有する。
ヘパリンは、しばしば外科的に使用され、血液凝固を防止し、心肺および腎臓透析機のような30の体外装置の適合性を高める。ヘパリナーゼによるヘパリンの酵素的な分解は、外科手術において、ヘパリンの抗凝血特性を除去するのに十分である。Langerら、in Biomaterials:「界面の現象および適用」、Adv. in Chem. Symposium Series, Chap. 13, 493頁-509頁(1982)に記載のように、この特性により、ヘパリナーゼは、固定化バイオリアクターとして心肺および腎臓透析機と組み合わせられ、血液を脱ヘパリン化するために使用されてきた。ヘパリナーゼバイオリアクターの商業上の適用は、臨床試験中である。
ヘパリナーゼバイオリアクター使用における主要な問題は、表面上に固定化される十分な量の純粋なヘパリナーゼの入手可能性にある。この理由は、主に、F. heparinum中で、構成的に発現されるヘパリナーゼの量が、非常に低いからである。F. heparinum中での、ヘパリンによるヘパリナーゼ発現の誘導は、必要とされるヘパリンの量と、どんな実際の用途に対しても合理的な量のヘパリナーゼを生産するための発酵の規模とのために非常に高価である。
ヘパリナーゼ遺伝子のクローニングおよび発現は、いくつかの方法において重要である。第１に、現在までに、クローニングされ、特徴が明らかであり、プロテオグリカンを脱重合する唯一の酵素は、ヘパリナーゼである。第２に、ヘパリンは、外科手術に一般的に使用される唯一の抗凝血剤である。したがって、血液の脱ヘパリン化は、重要な医学上の問題点である。さらに、RosenfeldおよびDanishefsky、Biochme. J. 237:639-646(1986)に記載のように、ヘパリナーゼに触媒されたヘパリンの、さらに低分子量のヘパリン分子への分解は、特異的抗凝血活性を有する生産物を生成するために使用され得る。
改変された活性を有する組換えヘパリナーゼをデザインすることは，学術上および商業的に興味深い。例えば、ヘパリナーゼは、この酵素がAT-III結合オリゴマーを正確に開裂するため、血液を脱ヘパリン化するのに使用される。他方、酵素結合の機構およびヘパリンの脱重合をさらに理解すれば、改変された特異性を有する組換えヘパリナーゼがデザインされ得る。すなわち、AT-III結合ヘパリンは、組換え酵素により開裂されない。これは、AT-III結合ヘパリンオリゴサッカライドを生産する非常に有用な方法で有り得る。そして、現在、このAT-III結合ヘパリンオリゴサッカライドは、抗凝血剤としての使用のために、大量には入手し得ない。酵素の精製または固定化を、補助および／または改善し得るヘパリナーゼの生産もまた、非常に重要である。例えば、標識(特定のペプチド配列)を、酵素の活性を変えないが、固定化の化学的作用を非常に効果的にする領域に付加し得る。これは、酵素の固定化基質上への装着の改善を助ける。
それゆえ、本発明の１つの目的は、ヘパリナーゼをコードする遺伝子および大量のヘパリナーゼの生産を容易にする発現用システムの提供である。
本発明のもう１つの目的は、遺伝子を改変し、改変された特異性および他の所望の特性を有する組換えヘパリナーゼの生産の方法と手段の提供である。
本発明のもう１つの目的は、サイトカイン−プロテオグリカン相互作用の領域で、繊維芽細胞成長因子−ヘパリン相互作用により例証されるように、道具または診断剤として使用する純粋なヘパリナーゼを提供することである。
発明の要旨
Flavobacterium heparinum由来のヘパリナーゼ遺伝子の、ポリメラーゼ連鎖反応を用いるクローニングを記載する。精製されたヘパリナーゼのトリプシンペプチド起源のアミノ酸配列に基づく２種の縮重オリゴヌクレオチドが、FlavobacteriumゲノムDNAをテンプレートとしてPCR中で使用され、600塩基対のプローブが生成された。このプローブは、pUC18 Flavobacteriumのゲノムライブラリをスクリーニングするのに使用された。このオープンリーディングフレーム(ORF)は、分子量が43,800ダルトンの前駆体タンパク質をコードする1152塩基対に対応する。11の異なるトリプシンペプチド(全アミノ酸の約48%)が、ORF中にマッピングされた。このアミノ酸配列は、20残基のリーダーペプチドを示す。
ヘパリナーゼは、上記遺伝子から発現され得る。さらに、上記遺伝子は、改変された酵素活性、または、特には改変された結合特性を有するヘパリナーゼを生産するように改変され得る。上記配列は、他の関連する酵素をコードする遺伝子の単離において、プローブとしてもまた使用され得る。
【図面の簡単な説明】
図１は、それぞれ、600および160塩基対である、PCR生産物Y1:CおよびD:Cの模式図である。この600塩基対PCR生産物は、プライマーであるDおよびCと共に、テンプレートとして使用され、160塩基対のD:C生産物を生成した。
図２は、ヘパリナーゼ遺伝子を含有する挿入断片を有するゲノムDNAのpUC18プラスミドである、pRS.HEP51の制限マップである。このプラスミドは、5631塩基長であり、約2300塩基対の挿入断片を有する。このヘパリナーゼ遺伝子は、KpnI-KpnIフラグメント中にある。
図３は、オープンリーディングフレーム中での、異なるトリプシンペプチドマッピングと共にヘパリナーゼ遺伝子の構造を示すKpnI-KpnIフラグメントの地図である。６つの異なるペプチドをヘパリナーゼ遺伝子翻訳領域中にマッピングした。
発明の詳細な説明
F. heparinumのヘパリナーゼをコードする遺伝子をクローニングした。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、以下に示す：
以下の配列(配列番号：１、塩基対１から172を含む)は、リーダーペプチドをコードする：
以下の配列(配列番号：１、塩基対173から1379を含む)は、ヘパリナーゼをコードする：
以下はヘパリナーゼのアミノ酸配列(配列番号：２)である：
実施例１： F. heparinumのヘパリナーゼをコードするcDNAの単離および分析
他者による、以下を用いた予備的なクローニングの試みが不成功だったため、ポリメラーゼ連鎖反応を、ヘパリナーゼ遺伝子のクローニングに使用した：1)抗体のスクリーニング、2)E. coli中の機能的に活性なヘパリナーゼのスクリーニング、および3)臭化シアン(CNBr)化学消化により再生されたタンパク質配列起源のプローブを用いたヘパリナーゼ遺伝子のスクリーニング。逆層精製ヘパリナーゼを、還元し、アルキル化し、そしてトリプリンで消化し、以下に記載のように、210nmおよび277nmで(チロシンおよびトリプトファンについて)モニターして、約60ペプチドのピークを、逆層HPLCにより分離採取した。
トリプシン消化およびタンパク質配列分析
ヘパリナーゼを、Dietrichら、J. Biol. Chem. 248:6408(1973)、Otataniら、Carbohyd. Res. 88:291(1981)、およびYangら、J. Biol. Chem. 260:1849(1985)に記載のように、精製した。これらの文献は、本明細書中に参考として援用した。最終精製段階は、タンパク質の疎水性残基を利用する逆層カラムを使用して高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)により実施した。1ナノモル(約45μg)の精製酵素を、50μlの8M尿素、0.4M炭酸アンモニウム溶液中で変性し、50℃、5mMジチオスレイトール(DTT)で還元し、室温に冷却し、そして、10mMヨードアセトアミドを用いて15分間暗黒中でアルキル化した。総反応容積は、200μlだった。この反応混合液に、1/25(w/w)のトリプシンを添加し、37℃で24時間消化を行った。反応は、サンプルを、65℃で2分間加熱することで停止した。消化物を、逆層HPLCで、0から80%のアセトニトリルのグラジエントを用いて分離した。トリプシンペプチドを、210nmおよび277nmでモニターした。
トリプシン消化に関するピークを、エッペンドルフチューブ(Eppendorff tube)に採取した。ペプチドピークの均質性に基づき、8つの異なるピークを、ＭＩＴの癌研究センターのバイオポリマー実験室にあるApplied Biosystems製シークエンサー、モデル477を、モデル120PTHアミノ酸分析装置とオンラインで共に用いて配列決定した。この配列を、以下の表Ｉに示す。(K,R)の記号は、表Ｉ中に使用され、トリプシンがリシンまたはアルギニン残基の一方を切断することを示す。表Ｉ中のアスタリスクは、決定し得なかったアミノ酸配列を表す。td Lxと記号化されるペプチドは、配列決定された最長のペプチドであり、38残基を有する。未変性のヘパリナーゼもまた、配列決定され、N末端アミノ酸を決定した。
3セットのプライマーを、表ＩＩに示すようにデザインし、合成した。プライマーを、ＭＩＴの癌研究センターのバイオポリマー実験室にあるApplied Biosystems製シークエンサーモデル477を、モデル120PTHアミノ酸分析装置とオンラインで共に用いて合成した。これらのプライマーセットを、ヘパリナーゼ遺伝子をクローニングするために、PCR増幅系で使用した。シンボル"I"は、イノシンヌクレオチドを表わす。各ペプチドのアミノ酸は、太字で書いているが、プライマーデザインのために選択された残基を表す。2つの異なるプライマーセットを、トリプシンペプチド33用に構築し、プライマーの3'末端でのイソロイシン置換の程度を減少した。
表ＩＩ：ヘパリナーゼプライマーのデザイン
ペプチド：td04
ペプチド：td43
ペプチド：td33
最初に配列決定されたRHPLCの6つのピーク(表Ｉ)のうち、３つを、プライマーのデザインのために使用した。プライマーの3つのセットをデザインした(表ＩＩ)。このプライマーtd43およびtd33の組み合せのPCR生産物は、約150塩基対の長さだった。td4およびtd33プライマーの組み合せでは、約600塩基対だった。プライマーtd43は、プライマーtd33に対して5'にあり、そしてプライマーtd4は、プライマーtd43に対して5'にあった。このtd4およびtd33のPCR生産物をテンプレートとして、そしてtd43およびtd4をプライマーとして使用して、予想した150塩基対生産物を得、td43が、td4とtd33との間にあることを確認した。
ヘパリナーゼを43,000ダルトン、そして、平均的にアミノ酸分子量を110ダルトンとすると、390アミノ酸に対応し、そして、その3倍で1170塩基と仮定すると、図１に示す600塩基対生産物は、ヘパリナーゼ遺伝子の約1170の総塩基対の約51%を示す。
600塩基対プローブを、高ストリンジェンシーのコロニーハイブリダイゼーションによりpUC18ライブラリをスクリーニングするために選択した。3回のコロニー精製で残った2つの陽性クローンを同定した。
ゲノムDNA、RNA、およびプラスミドライブラリ
F. heparinumゲノムDNAを、以下の改変をしたA.S.A.P.TMキット(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)で単離した。単離したDNAを、セファデックスTMG-50カラム(Nick columu, Pharmacia, Piscataway, NJ)で脱塩し、セントリコンTMP-30(Amicon Division, Beverly, MA)を用いて最終容積100ｌに濃縮した。典型的には、1×109の細胞から、105μｇから115μｇのDNAを得た。全細胞mRNAは、Promega技術情報出版TB 087 12/89, Promega Corp., Madison, WI 53711に説明されるグアニジンチオシアネート手法を用いて単離した。pUC18プラスミドは、マサチューセッツ工科大学の生物学部のA.J. Sinskey博士から得た。上記ライブラリは、F. heparinumゲノムDNAを用いて構築した。ゲノムDNAを、超音波処理し、EcoRIリンカーを添加して改変し、次いでpUC18ベクターに連結した。DH5aを、pUC18ゲノムライブラリで形質転換した。
PCR生産物の増幅
ヘパリナーゼのトリプシン消化プライマ−の増幅を、50mMのKCl、10mMのトリスHCl(pH8.3)、1.5mMのMgCl2および0.01%のゼラチンに、4種のデオキシリボースヌクレオチド3リン酸(dNTPs)を200μMで加え、0.5μMのプライマーおよび3μｌのゲノムDNAをテンプレートとして用い、そして、2.5ユニットのTaqポリメラーゼ(Cetus Corp., Emeryville, CA)を含有する25μlの反応容積および25μlの鉱物油で実行した。サンプルを、92℃(2分)、50℃(1分)および72℃(3分)のステップサイクルにプログラムした自動加熱ブロック(DNAサーマルサイクラー、Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT)上に置いた。このサイクルを、35回繰り返した。最終サイクルは、72℃で10分間の延長を加えた。PCR生産物を、0.6μg／mlの臭化エチジウムを含有する0.8%のアガロースゲル上で分析した。コントロール反応は、Cetusキットで行った。
Flavobacterium heparinumのpUC18ゲノムライブラリのスクリーニング
pUC18ライブラリを、約1500コロニーを得るように、タイタープレートで培養し、PCRにより生成したプローブによりテストした。各プレートは、直接にニトロセルロース上で適切な小さなサイズに成長した約100のコロニーを有した。次いで、このコロニーを１晩さらに成長するように複製した。
上記PCRプローブを、Random HexanucleotideTMキット(RHN)(IBI Biochemicals Ltd.)を用いて標識した。以下簡単に記載する。低温融解アガロースゲルから泳動したPCR生産物由来の1μgのDNAを単離し、95℃で10分間煮沸し変性し、次いで氷冷した。反応緩衝液中の変性DNAに、10mMのdNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)、ランダムヘキサヌクレオチド類、および50μCiの32PdCTP(3000 Ci/mmol)を添加した。この反応を、30分間37℃で、クレノウと共に実施し、0.2MのEDTAを用いて停止した。標識反応後、標識プローブを、遊離ヌクレオチドから、セファデックスG-50カラム(Nick Column, Pharmacia, Piscataway, NJ)を使用して精製した。上記コロニーを、上記標識プローブで、本明細書中に参考として援用するManiatisら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYに記載のような標準コロニーハイブリダイゼーション手法を用いて、スクリーニングした。
2つの陽性クローンを単離し、そのプラスミドを600塩基PCR生産物を生成する能力についてテストした。両クローンとも、テストの結果は陽性であり、そして制限マッピングでさらに特徴を明らかにした。クローンpRS Hep51は、約1.6kbのKpn-Kpnフラグメントを伴うpUC18中の2.3kbの挿入断片(図２に示す)である。このフラグメントは600塩基対のPCR生産物を生成するための陽性テンプレートだった。pRS51のKpnI-KpnIフラグメントを、M13中にサブクローニングし、配列決定した。
DNA配列決定
DNA配列決定は、M13ファージを用い、ジデオキシアデノシン5'-アルファ-35S-三リン酸およびシーケネース(Sequenase)(US Biochemical Corp, Cleaveland, OH)を、製造者により記載されるように使用して実施した。配列データを、サイクロンＩバイオシステムズ(International Biotechnologies Inc., New Haven, CT)によりT4のDNAポリメラーゼを使用して、M13の継続的に入れ子状に重なった欠失を使用して得、あるいは、合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列決定した。
この配列は、384のアミノ酸および約21アミノ酸のリーダー配列に対応する1152塩基対の単一の連続するオープンリーディングフレーム(ORF)を明らかにした。このPCR生産物は、開始部位から566塩基から1216塩基にわたり、全遺伝子の約57%に相当する。
まず、6つの異なるトリプシンペプチドをORF中にマッピングした。次いで、5つの他のペプチドを、構造研究のために配列決定し、それらの全てをORF中にマッピングし、全部で全367アミノ酸の約48%であった。全部で3つのシステインが存在する。その1つは、シグナルペプチドに結合していた。このシグナルペプチドは、原核生物の配列に典型的であり、電荷を持つN末端領域、中心の疎水性領域、および開裂する標準的なAla.xxx.Ala部位を含む開裂領域を有する。
実施例２：E.coliでのヘパリナーゼ遺伝子の発現
E.coliでのヘパリナーゼ発現について２つの異なる発現系を選択した：Omp A発現系およびpKK高発現系である。両方の発現系のためにデザインしたプラスミドを表IIIに示す。
30 Omp A発現系
Omp A発現系は、参照として、本明細書中に援用される、Ghrayebら、EMBO J. 3:2437(1984)に記載されるように、Omp Aシグナル配列に支配されて、ペリプラズム空間に目的のタンパク質を分泌する。ヘパリナーゼは通常、F.heparinumのペリプラズム空間へ発現されるので、この系を選択した。上記プラスミドは、lacレプレッサーの制御下にあり、そして培地へのIPTG（イソプロピル-β-Ｄチオガラクトシド）の付加によって誘導される。上記プラスミドをpIN-III Omp A-3ベクターに挿入した。
上記ヘパリナーゼ挿入断片は、EcoRI-BamHI部位へのクローン化に適合する、２つの適切な制限部位を伴うようにヘパリナーゼのＮ末端およびＣ末端を利用するPCRにより、作成した。２つのプライマーを表IIで示すように構築した。上記挿入断片はPCRの５サイクルで増幅し、そしてE.coliのペリプラズミックリーダー配列と共に、Omp A pINベクターに連結した。DH5αを形質転換し、そして発現を3〜5時間、1mMのIPTGで、誘導した。
表IIIに示すように、Omp A発現系の構築物はヘパリナーゼ遺伝子のアミノ末端に、GlyおよびIleである、２つの余分なアミノ酸を生じる。ヘパリナーゼ配列はGlnで始まる。
pKK発現系
pKK発現系は、参照として本明細書中に援用する、BrosiusおよびHoly、Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6929(1984)ならびにJaffeら、Biochem. 27:1869(1988)の方法に従い、タンパク質の過剰発現に用いられる。この系は、Omp A系のように、適当な宿主中で、lacレプレッサーによって調節され、そしてIPTGの付加によって誘導される、強いtacプロモーターを含有する。プラスミドpKK223-3は、pUC 8マルチクローニングサイトおよび隣接してtacプロモーターにつづく、強いrrnBリボソームターミネーターを有する。上記プラスミドのリボソーム結合部位（開始コドンATGから約12塩基）は、SmaＩ部位へのヘパリナーゼ遺伝子のクローニングにより利用される。Omp Aの構築物のように、ヘパリナーゼ挿入断片は、該タンパク質のＮおよびＣ末端に、SmaＩおよびHindIIIを有するように、PCRによって得られる。表IIIに示すように、未変性ヘパリナーゼのリーダー配列をペリプラズムに過剰生産するように用いた。
E.coliのペリプラズムタンパク質を、浸透圧ショックで単離した。簡単に言えば、1.5mlの細胞を誘導後に遠心分離し、そして10mMのトリス(pH7.5)で、洗浄した。そして細胞を20％スクロース、10mMのトリス(pH7.5)および0.5MのEDTA、5μl中で懸濁した。氷上で５分間インキュベートした後、細胞を遠心分離し、そして約150μlの水を加えて浸透圧ショックを行った。ペリプラズム抽出物を酵素活性の測定のために用いた。ヘパリナーゼ活性は、波長232ｎｍでモニタリングして測定し、そして参照として、本明細書中に援用した、Bernsteinら（Methods of Immunology 137:515(1988)）のアズールＡ法によって測定した。
ペリプラズム抽出物は、Laemmli、Nature 227:690(1974)の方法を用いて、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により分析し、そしてクーマシーブルーを用いて染色した。さらに、ウエスタンブロット法でヘパリナーゼモノクローナル抗体を用いて、ヘパリナーゼの存在の確認を行った。ヘパリナーゼは、GershoniおよびPalade、Analytical Biochem. 131:1(1983)の方法を用いて、電気泳動的にSDS-PAGEゲルからニトロセルロースに移動させ、そしてモノクローナル抗体と共にインキュベートした。この抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした２次抗体を用いて染色した。
RNAドットブロットアッセイ
すべての細胞質RNAをZetaプローブTMメンブレン(Biorad, Richmond, CA)上でアルカリRNA変性および固定によって固定化し、そして600塩基のPCR生産物を用いてプローブし、ヘパリナーゼ遺伝子をスクリーニングした。ハイブリダイゼーションはThomas、Proc. Natl. Acad Sci. 77:5201(1980)の方法に従って、ドットブロット装置で行った。異なる成長条件下のＲＮＡシグナルの研究は、Galliherら、Eur. J. Appl. Microbiol.(1982)によって継続している。その研究によって確立したものに、タンパク質レベルでヘパリナーゼが、低硫黄条件下で最適な発現を示し、そして誘導のためのヘパリン要求性を取り払う。従って、低硫黄成長条件下でヘパリナーゼmRNAシグナルをヘパリン誘導がある、および、ない状態で検討した。
Omp AおよびpKK系のいづれも、ヘパリナーゼを発現した。Omp A系は効率的にヘパリナーゼをペリプラズムに輸送しなかった。理由は明らかでないが、組換えヘパリナーゼの大きな断片は、そのOmp Aシグナル配列と一緒に細胞質の領域に保持された。そして増殖に、より低い温度（25〜30℃）では、ペリプラズム空間への分泌が認められた。
pKK過剰生産系はペリプラズム空間でのみ、ヘパリナーゼを生産した。上記pKK系は、天然のF.heparinumヘパリナーゼリーダー配列を用いた。それは外来のリーダー配列を伴う組換えタンパク質の輸送において問題がなかった。発現がより低い温度でさらに至適であるにもかかわらず、pKK系は異常なプロセシングなしに、ヘパリナーゼを発現した。ペリプラズム中のヘパリナーゼの存在は、ウエスタンブロット法、および組換えヘパリナーゼのin situトリプシン消化を天然のヘパリナーゼのそれと比較することにより、ピーク外形、および、単離および配列決定したいくつかのピークから確認した。
陽性シグナルを、ヘパリナーゼ遺伝子を単離するために用いられてきたPCR由来の600塩基対プローブを用いて、単離したF.heparium mRNAより得た。そして単離した遺伝子が、E.coliにクローン化したF.heparium遺伝子であることを確認した。
発現したヘパリナーゼは、少なくとも若干のヘパリナーゼ活性を有した。
上記配列は、ヘパリナーゼをコードする配列中に部位特異的突然変異誘発またはオリゴマー置換を用いて、特異的な酵素活性または結合特異性、あるいは１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換による親和力を改めるために改変され得る。これを行う方法および材料は、当業者に周知である。改変した遺伝子を発現し、そしてその生産物は改変された活性について機械的に選抜される。
２つの特異的な発現系を文献と共に記載したが、その他の発現系は充分周知であり、そして市販的に入手し得る。同様のベクターおよびシグナルペプチド、またはリーダー配列を用いることにより、これらの系でも、ヘパリナーゼ遺伝子を発現し得る。
本発明の修飾および改変は、当業者には自明である。そのような修飾および改変は、以下の請求の範囲に包含されるように意図される。
配列表
(1)一般的情報：
(i)出願人：マサチューセッツ インスティテュート，オブ テクノロジー
(ii)発明の名称：Flavobacterium heparinum由来のヘパリナーゼ遺伝子
(iii)配列数：2
(iv)連絡住所：
(A)住所人：キルパトリック アンド コーディー
(B)番地：スイート 2800，ピーチツリー ストリート 1100
(C)市：アトランタ
(D)州：ジョージア
(E)国：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：30309-4530
(v)コンピューター読み出し形態
(A)媒体型：フロッピーディスク
(B)コンピューター：IBM PC互換用
(C)操作システム：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：パテントインリリース#1.0、バージョン#1.25
(vi)現在の出願データ：
(A)出願番号：
(B)出願日：
(C)分類：
(viii)代理人／事務所情報：
(A)氏名：パブスト，パトレア エル．
(B)登録番号：31,284
(C)照会／記録番号：MIT5546
(ix)電話回線情報：
(A)電話：404-815-6508
(B)テレファックス：404-815-6555
(2)配列番号:１の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：1379塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(iii)ハイポセティカル配列：NO
(iv)アンチセンス：NO
(vi)起源：
(A)生物名：Flavobacterium heparinum
(xi)配列：配列番号:１：
(2)配列番号:２の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：384アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(iii)ハイポセティカル配列：NO
(iv)アンチセンス：NO
(v)フラグメント型：Ｎ末端
(vi)起源：
(A)生物名：Flavobacterium heparinum
(xi)配列：配列番号:２：
本発明は、一般的にヘパリナーゼの技術分野に関し、特に、Flavobacterium heparinum中で発現するヘパリナーゼＩをコードする遺伝子に向けられる。
アメリカ合衆国政府が、国立衛生研究所の認可番号25810により、本発明の権利を有する。
ヘパリンは、セリンプロテアーゼ阻害剤(セルピン(serpins))を活性化する抗凝血剤である。このヘパリンは、血液凝固カスケードにおいて、Damusら、Nature 246:355-357(1973)により記載のように、鍵となる役割を演じる。Lindahlら、Trends Biochem. Sci. 11:221-225(1986)によれば、ヘパリンは、現在既知である、最も酸性の天然ポリマーである。それは、D-ウロン酸1,4-β-D-グルコサミンである1,4結合ジサッカライドの主要な繰り返し単位からなり、モノサッカライド単位あたり４価の平均負電価(３つの硫酸基および１つのカルボキシラト基(carboxylate group))を有する。ヘパリンは、Kuscheら、Proc. Natl. Acad. Sci., 77:6551-6555(1980)およびComper、Polymer Monograph 7, 1981による報告のように、3,000〜45,000ダルトンの平均分子量を有する多分散系であり、かつD-グルクロン酸のL-イズロン酸への部分的エピマー化、および不完全なNおよびO-硫酸化により不均質である。
さらに、ヘパリンのようなプロテオグリカンは、広範囲の生物学的作用を有し、これには、血液化学、成長因子相互作用および傷治癒、細胞外マトリックスおよび免疫応答を介した細胞における塩基性構造タンパク質との相互作用を含む。タンパク質／ペプチド／ヘパリン／複合体炭水化物相互作用の基本的性質が、重要である。ヘパリンは、かなり不均質であると考えられるが、Cardin, A. D.およびH. J. R. Weintraub、Arteriosclerosis 9, 21-32(1989)により論評されるように、異なるヘパリン画分が、その生物学的役割に対して、なんらかの組成上、そして、おそらく構造上の特異性を示唆する明瞭で独特な特性を示すことは、現在、まったく明らかである。
ヘパリナーゼは、ヘパリンリアーゼとも呼ばれ、詳細にわたって特徴づけられているヘパリンを分解し得る唯一の既知の酵素である。ヘパリナーゼは、酵素委員会により、EC4.2.2.7と命名されている。Galliherら、Eur. J. Appl. Microbiol. 15:252(1982)によれば、本酵素は、グラム陰性土壌単離菌であるFlavobacterium heparinumのペリプラズム空間に見出されるポリサッカライドリアーゼである。HovingおよびLinker、J. Biol. Chem. 245:6170(1970)に記載のように、F. heparinumは、ヘパリンを、炭素および窒素の唯一の供給源として利用する。ヘパリナーゼは、ヘパリン異化の最初の酵素である。構造的には小量しか分泌されないが、Galliherら、App. Environ. Microbiol. 41:360(1981)は、酵素発現が、ヘパリンにより誘導され、培地中の硫化物により可逆的に抑制されることが発見された。Lindhardtら、Appl. Biochem. Biotechnol. 9:41(1984)は、ヘパリナーゼが他のポリアニオン性ポリサッカライドにより阻害されることを示した。
ヘパリナーゼは、標準的クロマトグラフ技術により精製され、その酵素特性が詳細にわたって明らかになった。これは、Yangら、J. Biol. Chem. 260:1849(1985)を含む科学者により記載されている。本酵素は、44,000ダルトンの単量体タンパク質で約9のpIを有する。
ヘパリナーゼは、エリミナーゼとして作用し、不飽和二重結合を非還元末端基に残す。この二重結合は、不飽和産物の232nmでの吸光度によるヘパリナーゼ活性のアッセイにおいて使用される。本酵素は、塩類に対する耐性が低く、ヘパリンに対し非常に特異的であり、30nMのKdを有する。ヘパリナーゼは、4.5Kcal/molの活性化エネルギー、8×10-6のkm値および4×10-7M/分の最大反応速度（Vmax）を有する。
ヘパリンは、しばしば外科的に使用され、血液凝固を防止し、心肺および腎臓透析機のような30の体外装置の適合性を高める。ヘパリナーゼによるヘパリンの酵素的な分解は、外科手術において、ヘパリンの抗凝血特性を除去するのに十分である。Langerら、in Biomaterials:「界面の現象および適用」、Adv. in Chem. Symposium Series, Chap. 13, 493頁-509頁(1982)に記載のように、この特性により、ヘパリナーゼは、固定化バイオリアクターとして心肺および腎臓透析機と組み合わせられ、血液を脱ヘパリン化するために使用されてきた。ヘパリナーゼバイオリアクターの商業上の適用は、臨床試験中である。
ヘパリナーゼバイオリアクター使用における主要な問題は、表面上に固定化される十分な量の純粋なヘパリナーゼの入手可能性にある。この理由は、主に、F. heparinum中で、構成的に発現されるヘパリナーゼの量が、非常に低いからである。F. heparinum中での、ヘパリンによるヘパリナーゼ発現の誘導は、必要とされるヘパリンの量と、どんな実際の用途に対しても合理的な量のヘパリナーゼを生産するための発酵の規模とのために非常に高価である。
ヘパリナーゼ遺伝子のクローニングおよび発現は、いくつかの方法において重要である。第１に、現在までに、クローニングされ、特徴が明らかであり、プロテオグリカンを脱重合する唯一の酵素は、ヘパリナーゼである。第２に、ヘパリンは、外科手術に一般的に使用される唯一の抗凝血剤である。したがって、血液の脱ヘパリン化は、重要な医学上の問題点である。さらに、RosenfeldおよびDanishefsky、Biochme. J. 237:639-646(1986)に記載のように、ヘパリナーゼに触媒されたヘパリンの、さらに低分子量のヘパリン分子への分解は、特異的抗凝血活性を有する生産物を生成するために使用され得る。
改変された活性を有する組換えヘパリナーゼをデザインすることは，学術上および商業的に興味深い。例えば、ヘパリナーゼは、この酵素がAT-III結合オリゴマーを正確に開裂するため、血液を脱ヘパリン化するのに使用される。他方、酵素結合の機構およびヘパリンの脱重合をさらに理解すれば、改変された特異性を有する組換えヘパリナーゼがデザインされ得る。すなわち、AT-III結合ヘパリンは、組換え酵素により開裂されない。これは、AT-III結合ヘパリンオリゴサッカライドを生産する非常に有用な方法で有り得る。そして、現在、このAT-III結合ヘパリンオリゴサッカライドは、抗凝血剤としての使用のために、大量には入手し得ない。酵素の精製または固定化を、補助および／または改善し得るヘパリナーゼの生産もまた、非常に重要である。例えば、標識(特定のペプチド配列)を、酵素の活性を変えないが、固定化の化学的作用を非常に効果的にする領域に付加し得る。これは、酵素の固定化基質上への装着の改善を助ける。
それゆえ、本発明の１つの目的は、ヘパリナーゼをコードする遺伝子および大量のヘパリナーゼの生産を容易にする発現用システムの提供である。
本発明のもう１つの目的は、遺伝子を改変し、改変された特異性および他の所望の特性を有する組換えヘパリナーゼの生産の方法と手段の提供である。
本発明のもう１つの目的は、サイトカイン−プロテオグリカン相互作用の領域で、繊維芽細胞成長因子−ヘパリン相互作用により例証されるように、道具または診断剤として使用する純粋なヘパリナーゼを提供することである。
発明の要旨
Flavobacterium heparinum由来のヘパリナーゼ遺伝子の、ポリメラーゼ連鎖反応を用いるクローニングを記載する。精製されたヘパリナーゼのトリプシンペプチド起源のアミノ酸配列に基づく２種の縮重オリゴヌクレオチドが、FlavobacteriumゲノムDNAをテンプレートとしてPCR中で使用され、600塩基対のプローブが生成された。このプローブは、pUC18 Flavobacteriumのゲノムライブラリをスクリーニングするのに使用された。このオープンリーディングフレーム(ORF)は、分子量が43,800ダルトンの前駆体タンパク質をコードする1152塩基対に対応する。11の異なるトリプシンペプチド(全アミノ酸の約48%)が、ORF中にマッピングされた。このアミノ酸配列は、20残基のリーダーペプチドを示す。
ヘパリナーゼは、上記遺伝子から発現され得る。さらに、上記遺伝子は、改変された酵素活性、または、特には改変された結合特性を有するヘパリナーゼを生産するように改変され得る。上記配列は、他の関連する酵素をコードする遺伝子の単離において、プローブとしてもまた使用され得る。
【図面の簡単な説明】
図１は、それぞれ、600および160塩基対である、PCR生産物Y1:CおよびD:Cの模式図である。この600塩基対PCR生産物は、プライマーであるDおよびCと共に、テンプレートとして使用され、160塩基対のD:C生産物を生成した。
図２は、ヘパリナーゼ遺伝子を含有する挿入断片を有するゲノムDNAのpUC18プラスミドである、pRS.HEP51の制限マップである。このプラスミドは、5631塩基長であり、約2300塩基対の挿入断片を有する。このヘパリナーゼ遺伝子は、KpnI-KpnIフラグメント中にある。
図３は、オープンリーディングフレーム中での、異なるトリプシンペプチドマッピングと共にヘパリナーゼ遺伝子の構造を示すKpnI-KpnIフラグメントの地図である。６つの異なるペプチドをヘパリナーゼ遺伝子翻訳領域中にマッピングした。
発明の詳細な説明
F. heparinumのヘパリナーゼをコードする遺伝子をクローニングした。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、以下に示す：
以下の配列(配列番号：１、塩基対１から172を含む)は、リーダーペプチドをコードする：
他者による、以下を用いた予備的なクローニングの試みが不成功だったため、ポリメラーゼ連鎖反応を、ヘパリナーゼ遺伝子のクローニングに使用した：1)抗体のスクリーニング、2)E. coli中の機能的に活性なヘパリナーゼのスクリーニング、および3)臭化シアン(CNBr)化学消化により再生されたタンパク質配列起源のプローブを用いたヘパリナーゼ遺伝子のスクリーニング。逆層精製ヘパリナーゼを、還元し、アルキル化し、そしてトリプリンで消化し、以下に記載のように、210nmおよび277nmで(チロシンおよびトリプトファンについて)モニターして、約60ペプチドのピークを、逆層HPLCにより分離採取した。
トリプシン消化およびタンパク質配列分析
ヘパリナーゼを、Dietrichら、J. Biol. Chem. 248:6408(1973)、Otataniら、Carbohyd. Res. 88:291(1981)、およびYangら、J. Biol. Chem. 260:1849(1985)に記載のように、精製した。これらの文献は、本明細書中に参考として援用した。最終精製段階は、タンパク質の疎水性残基を利用する逆層カラムを使用して高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)により実施した。1ナノモル(約45μg)の精製酵素を、50μlの8M尿素、0.4M炭酸アンモニウム溶液中で変性し、50℃、5mMジチオスレイトール(DTT)で還元し、室温に冷却し、そして、10mMヨードアセトアミドを用いて15分間暗黒中でアルキル化した。総反応容積は、200μlだった。この反応混合液に、1/25(w/w)のトリプシンを添加し、37℃で24時間消化を行った。反応は、サンプルを、65℃で2分間加熱することで停止した。消化物を、逆層HPLCで、0から80%のアセトニトリルのグラジエントを用いて分離した。トリプシンペプチドを、210nmおよび277nmでモニターした。
トリプシン消化に関するピークを、エッペンドルフチューブ(Eppendorff tube)に採取した。ペプチドピークの均質性に基づき、8つの異なるピークを、ＭＩＴの癌研究センターのバイオポリマー実験室にあるApplied Biosystems製シークエンサー、モデル477を、モデル120PTHアミノ酸分析装置とオンラインで共に用いて配列決定した。この配列を、以下の表Ｉに示す。(K,R)の記号は、表Ｉ中に使用され、トリプシンがリシンまたはアルギニン残基の一方を切断することを示す。表Ｉ中のアスタリスクは、決定し得なかったアミノ酸配列を表す。td Lxと記号化されるペプチドは、配列決定された最長のペプチドであり、38残基を有する。未変性のヘパリナーゼもまた、配列決定され、N末端アミノ酸を決定した。
表ＩＩ：ヘパリナーゼプライマーのデザイン
ペプチド：td04
ヘパリナーゼを43,000ダルトン、そして、平均的にアミノ酸分子量を110ダルトンとすると、390アミノ酸に対応し、そして、その3倍で1170塩基と仮定すると、図１に示す600塩基対生産物は、ヘパリナーゼ遺伝子の約1170の総塩基対の約51%を示す。
600塩基対プローブを、高ストリンジェンシーのコロニーハイブリダイゼーションによりpUC18ライブラリをスクリーニングするために選択した。3回のコロニー精製で残った2つの陽性クローンを同定した。
ゲノムDNA、RNA、およびプラスミドライブラリ
F. heparinumゲノムDNAを、以下の改変をしたA.S.A.P.TMキット(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)で単離した。単離したDNAを、セファデックスTMG-50カラム(Nick columu, Pharmacia, Piscataway, NJ)で脱塩し、セントリコンTMP-30(Amicon Division, Beverly, MA)を用いて最終容積100ｌに濃縮した。典型的には、1×109の細胞から、105μｇから115μｇのDNAを得た。全細胞mRNAは、Promega技術情報出版TB 087 12/89, Promega Corp., Madison, WI 53711に説明されるグアニジンチオシアネート手法を用いて単離した。pUC18プラスミドは、マサチューセッツ工科大学の生物学部のA.J. Sinskey博士から得た。上記ライブラリは、F. heparinumゲノムDNAを用いて構築した。ゲノムDNAを、超音波処理し、EcoRIリンカーを添加して改変し、次いでpUC18ベクターに連結した。DH5aを、pUC18ゲノムライブラリで形質転換した。
PCR生産物の増幅
ヘパリナーゼのトリプシン消化プライマ−の増幅を、50mMのKCl、10mMのトリスHCl(pH8.3)、1.5mMのMgCl2および0.01%のゼラチンに、4種のデオキシリボースヌクレオチド3リン酸(dNTPs)を200μMで加え、0.5μMのプライマーおよび3μｌのゲノムDNAをテンプレートとして用い、そして、2.5ユニットのTaqポリメラーゼ(Cetus Corp., Emeryville, CA)を含有する25μlの反応容積および25μlの鉱物油で実行した。サンプルを、92℃(2分)、50℃(1分)および72℃(3分)のステップサイクルにプログラムした自動加熱ブロック(DNAサーマルサイクラー、Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT)上に置いた。このサイクルを、35回繰り返した。最終サイクルは、72℃で10分間の延長を加えた。PCR生産物を、0.6μg／mlの臭化エチジウムを含有する0.8%のアガロースゲル上で分析した。コントロール反応は、Cetusキットで行った。
Flavobacterium heparinumのpUC18ゲノムライブラリのスクリーニング
pUC18ライブラリを、約1500コロニーを得るように、タイタープレートで培養し、PCRにより生成したプローブによりテストした。各プレートは、直接にニトロセルロース上で適切な小さなサイズに成長した約100のコロニーを有した。次いで、このコロニーを１晩さらに成長するように複製した。
上記PCRプローブを、Random HexanucleotideTMキット(RHN)(IBI Biochemicals Ltd.)を用いて標識した。以下簡単に記載する。低温融解アガロースゲルから泳動したPCR生産物由来の1μgのDNAを単離し、95℃で10分間煮沸し変性し、次いで氷冷した。反応緩衝液中の変性DNAに、10mMのdNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)、ランダムヘキサヌクレオチド類、および50μCiの32PdCTP(3000 Ci/mmol)を添加した。この反応を、30分間37℃で、クレノウと共に実施し、0.2MのEDTAを用いて停止した。標識反応後、標識プローブを、遊離ヌクレオチドから、セファデックスG-50カラム(Nick Column, Pharmacia, Piscataway, NJ)を使用して精製した。上記コロニーを、上記標識プローブで、本明細書中に参考として援用するManiatisら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYに記載のような標準コロニーハイブリダイゼーション手法を用いて、スクリーニングした。
2つの陽性クローンを単離し、そのプラスミドを600塩基PCR生産物を生成する能力についてテストした。両クローンとも、テストの結果は陽性であり、そして制限マッピングでさらに特徴を明らかにした。クローンpRS Hep51は、約1.6kbのKpn-Kpnフラグメントを伴うpUC18中の2.3kbの挿入断片(図２に示す)である。このフラグメントは600塩基対のPCR生産物を生成するための陽性テンプレートだった。pRS51のKpnI-KpnIフラグメントを、M13中にサブクローニングし、配列決定した。
DNA配列決定
DNA配列決定は、M13ファージを用い、ジデオキシアデノシン5'-アルファ-35S-三リン酸およびシーケネース(Sequenase)(US Biochemical Corp, Cleaveland, OH)を、製造者により記載されるように使用して実施した。配列データを、サイクロンＩバイオシステムズ(International Biotechnologies Inc., New Haven, CT)によりT4のDNAポリメラーゼを使用して、M13の継続的に入れ子状に重なった欠失を使用して得、あるいは、合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列決定した。
この配列は、384のアミノ酸および約21アミノ酸のリーダー配列に対応する1152塩基対の単一の連続するオープンリーディングフレーム(ORF)を明らかにした。このPCR生産物は、開始部位から566塩基から1216塩基にわたり、全遺伝子の約57%に相当する。
まず、6つの異なるトリプシンペプチドをORF中にマッピングした。次いで、5つの他のペプチドを、構造研究のために配列決定し、それらの全てをORF中にマッピングし、全部で全367アミノ酸の約48%であった。全部で3つのシステインが存在する。その1つは、シグナルペプチドに結合していた。このシグナルペプチドは、原核生物の配列に典型的であり、電荷を持つN末端領域、中心の疎水性領域、および開裂する標準的なAla.xxx.Ala部位を含む開裂領域を有する。
実施例２：E.coliでのヘパリナーゼ遺伝子の発現
E.coliでのヘパリナーゼ発現について２つの異なる発現系を選択した：Omp A発現系およびpKK高発現系である。両方の発現系のためにデザインしたプラスミドを表IIIに示す。
30 Omp A発現系
Omp A発現系は、参照として、本明細書中に援用される、Ghrayebら、EMBO J. 3:2437(1984)に記載されるように、Omp Aシグナル配列に支配されて、ペリプラズム空間に目的のタンパク質を分泌する。ヘパリナーゼは通常、F.heparinumのペリプラズム空間へ発現されるので、この系を選択した。上記プラスミドは、lacレプレッサーの制御下にあり、そして培地へのIPTG（イソプロピル-β-Ｄチオガラクトシド）の付加によって誘導される。上記プラスミドをpIN-III Omp A-3ベクターに挿入した。
上記ヘパリナーゼ挿入断片は、EcoRI-BamHI部位へのクローン化に適合する、２つの適切な制限部位を伴うようにヘパリナーゼのＮ末端およびＣ末端を利用するPCRにより、作成した。２つのプライマーを表IIで示すように構築した。上記挿入断片はPCRの５サイクルで増幅し、そしてE.coliのペリプラズミックリーダー配列と共に、Omp A pINベクターに連結した。DH5αを形質転換し、そして発現を3〜5時間、1mMのIPTGで、誘導した。
表IIIに示すように、Omp A発現系の構築物はヘパリナーゼ遺伝子のアミノ末端に、GlyおよびIleである、２つの余分なアミノ酸を生じる。ヘパリナーゼ配列はGlnで始まる。
pKK発現系
pKK発現系は、参照として本明細書中に援用する、BrosiusおよびHoly、Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6929(1984)ならびにJaffeら、Biochem. 27:1869(1988)の方法に従い、タンパク質の過剰発現に用いられる。この系は、Omp A系のように、適当な宿主中で、lacレプレッサーによって調節され、そしてIPTGの付加によって誘導される、強いtacプロモーターを含有する。プラスミドpKK223-3は、pUC 8マルチクローニングサイトおよび隣接してtacプロモーターにつづく、強いrrnBリボソームターミネーターを有する。上記プラスミドのリボソーム結合部位（開始コドンATGから約12塩基）は、SmaＩ部位へのヘパリナーゼ遺伝子のクローニングにより利用される。Omp Aの構築物のように、ヘパリナーゼ挿入断片は、該タンパク質のＮおよびＣ末端に、SmaＩおよびHindIIIを有するように、PCRによって得られる。表IIIに示すように、未変性ヘパリナーゼのリーダー配列をペリプラズムに過剰生産するように用いた。
ペリプラズム抽出物は、Laemmli、Nature 227:690(1974)の方法を用いて、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により分析し、そしてクーマシーブルーを用いて染色した。さらに、ウエスタンブロット法でヘパリナーゼモノクローナル抗体を用いて、ヘパリナーゼの存在の確認を行った。ヘパリナーゼは、GershoniおよびPalade、Analytical Biochem. 131:1(1983)の方法を用いて、電気泳動的にSDS-PAGEゲルからニトロセルロースに移動させ、そしてモノクローナル抗体と共にインキュベートした。この抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした２次抗体を用いて染色した。
RNAドットブロットアッセイ
すべての細胞質RNAをZetaプローブTMメンブレン(Biorad, Richmond, CA)上でアルカリRNA変性および固定によって固定化し、そして600塩基のPCR生産物を用いてプローブし、ヘパリナーゼ遺伝子をスクリーニングした。ハイブリダイゼーションはThomas、Proc. Natl. Acad Sci. 77:5201(1980)の方法に従って、ドットブロット装置で行った。異なる成長条件下のＲＮＡシグナルの研究は、Galliherら、Eur. J. Appl. Microbiol.(1982)によって継続している。その研究によって確立したものに、タンパク質レベルでヘパリナーゼが、低硫黄条件下で最適な発現を示し、そして誘導のためのヘパリン要求性を取り払う。従って、低硫黄成長条件下でヘパリナーゼmRNAシグナルをヘパリン誘導がある、および、ない状態で検討した。
Omp AおよびpKK系のいづれも、ヘパリナーゼを発現した。Omp A系は効率的にヘパリナーゼをペリプラズムに輸送しなかった。理由は明らかでないが、組換えヘパリナーゼの大きな断片は、そのOmp Aシグナル配列と一緒に細胞質の領域に保持された。そして増殖に、より低い温度（25〜30℃）では、ペリプラズム空間への分泌が認められた。
pKK過剰生産系はペリプラズム空間でのみ、ヘパリナーゼを生産した。上記pKK系は、天然のF.heparinumヘパリナーゼリーダー配列を用いた。それは外来のリーダー配列を伴う組換えタンパク質の輸送において問題がなかった。発現がより低い温度でさらに至適であるにもかかわらず、pKK系は異常なプロセシングなしに、ヘパリナーゼを発現した。ペリプラズム中のヘパリナーゼの存在は、ウエスタンブロット法、および組換えヘパリナーゼのin situトリプシン消化を天然のヘパリナーゼのそれと比較することにより、ピーク外形、および、単離および配列決定したいくつかのピークから確認した。
陽性シグナルを、ヘパリナーゼ遺伝子を単離するために用いられてきたPCR由来の600塩基対プローブを用いて、単離したF.heparium mRNAより得た。そして単離した遺伝子が、E.coliにクローン化したF.heparium遺伝子であることを確認した。
発現したヘパリナーゼは、少なくとも若干のヘパリナーゼ活性を有した。
上記配列は、ヘパリナーゼをコードする配列中に部位特異的突然変異誘発またはオリゴマー置換を用いて、特異的な酵素活性または結合特異性、あるいは１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換による親和力を改めるために改変され得る。これを行う方法および材料は、当業者に周知である。改変した遺伝子を発現し、そしてその生産物は改変された活性について機械的に選抜される。
２つの特異的な発現系を文献と共に記載したが、その他の発現系は充分周知であり、そして市販的に入手し得る。同様のベクターおよびシグナルペプチド、またはリーダー配列を用いることにより、これらの系でも、ヘパリナーゼ遺伝子を発現し得る。
本発明の修飾および改変は、当業者には自明である。そのような修飾および改変は、以下の請求の範囲に包含されるように意図される。
配列表
(1)一般的情報：
(i)出願人：マサチューセッツ インスティテュート，オブ テクノロジー
(ii)発明の名称：Flavobacterium heparinum由来のヘパリナーゼ遺伝子
(iii)配列数：2
(iv)連絡住所：
(A)住所人：キルパトリック アンド コーディー
(B)番地：スイート 2800，ピーチツリー ストリート 1100
(C)市：アトランタ
(D)州：ジョージア
(E)国：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：30309-4530
(v)コンピューター読み出し形態
(A)媒体型：フロッピーディスク
(B)コンピューター：IBM PC互換用
(C)操作システム：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：パテントインリリース#1.0、バージョン#1.25
(vi)現在の出願データ：
(A)出願番号：
(B)出願日：
(C)分類：
(viii)代理人／事務所情報：
(A)氏名：パブスト，パトレア エル．
(B)登録番号：31,284
(C)照会／記録番号：MIT5546
(ix)電話回線情報：
(A)電話：404-815-6508
(B)テレファックス：404-815-6555
(2)配列番号:１の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：1379塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：cDNA
(iii)ハイポセティカル配列：NO
(iv)アンチセンス：NO
(vi)起源：
(A)生物名：Flavobacterium heparinum
(xi)配列：配列番号:１：
(i)配列の特色：
(A)長さ：384アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(iii)ハイポセティカル配列：NO
(iv)アンチセンス：NO
(v)フラグメント型：Ｎ末端
(vi)起源：
(A)生物名：Flavobacterium heparinum
(xi)配列：配列番号:２：
Claims (13)
- 単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）ヌクレオチド配列（配列番号１のヌクレオチド１７３〜１３２４）
（ｂ）（ａ）のＤＮＡまたはその相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ該ヘパリナーゼの活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ、
からなる群より選択されるＤＮＡからなる、核酸分子。 - 単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）アミノ酸配列（配列番号２）
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失を有するアミノ酸配列からなり、かつ該ヘパリナーゼの活性を有する、タンパク質、
からなる群より選択されるタンパク質をコードする、核酸分子。 - 請求項１または２に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
- 請求項１または２に記載の核酸分子と分泌シグナルペプチドをコードする核酸フラグメントとを包含する、核酸分子。
- 請求項４に記載の核酸分子であって、前記分泌シグナルペプチドが、以下：
（ａ）ヌクレオチド配列（配列番号１のヌクレオチド１〜１７２）
からなる群より選択されるＤＮＡによりコードされる、核酸分子。 - 前記分泌シグナルペプチドが、細胞質からペリプラズムへの前記タンパク質の輸送を指令する、請求項４に記載の核酸分子。
- 前記タンパク質が、配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡにコードされるヘパリナーゼと異なる親和力でヘパリンに結合する、請求項１または２に記載の核酸分子。
- 前記タンパク質が、配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡにコードされるヘパリナーゼの比活性と異なる比活性を有する、請求項１または２に記載の核酸分子。
- Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ以外の原核生物細胞であって、請求項１または２に記載の核酸分子を含み、該分子を発現し得る、原核生物細胞。
- 低硫酸塩条件下で培養された、請求項９に記載の原核生物細胞。
- 改変された、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍからのヘパリナーゼＩ、をコードする核酸分子を得るための方法であって、以下：
配列番号２の配列からなるＥＣ４．２．２．７と称されるヘパリナーゼをコードする核酸分子を変異させる工程、
適切な宿主において該変異した核酸分子を発現させる工程、および
該発現したヘパリナーゼを酵素活性についてスクリーニングする工程、
を包含する、方法。 - 請求項１１に記載の方法であって、前記変異した核酸分子から発現されたヘパリナーゼを、改変した結合活性についてスクリーニングする工程をさらに包含する、方法。
- 請求項１１に記載の方法であって、増加した比活性についてスクリーニングする工程をさらに包含する、方法。
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