PL164565B1 - Sposób konstruowania zrekombinowanego wektora do klonowania i/lub ekspresjiw komórkach gospodarza bakteryjnego do wytwarzania polipeptydu zdolnego do produkcji przeciwcial reagujacych specyficznie z bialkiem ludzkiego tkankowego _______________________________aktywatora plazminogenu________________________ PL - Google Patents

Sposób konstruowania zrekombinowanego wektora do klonowania i/lub ekspresjiw komórkach gospodarza bakteryjnego do wytwarzania polipeptydu zdolnego do produkcji przeciwcial reagujacych specyficznie z bialkiem ludzkiego tkankowego _______________________________aktywatora plazminogenu________________________ PL

Info

Publication number
PL164565B1
PL164565B1 PL29977489A PL29977489A PL164565B1 PL 164565 B1 PL164565 B1 PL 164565B1 PL 29977489 A PL29977489 A PL 29977489A PL 29977489 A PL29977489 A PL 29977489A PL 164565 B1 PL164565 B1 PL 164565B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
antibodies
human tissue
plasminogen activator
tissue plasminogen
protein
Prior art date
Application number
PL29977489A
Other languages
English (en)
Inventor
Tadeusz Pietrucha
Czeslaw Czerniewski
Andrzej Plucienniczak
Maria Koziolkiewicz
Andrzej Grajkowski
Genowefa Goss
Andrzej Wilk
Wojciech J Stec
Andrzej Okruszek
Bogdan Uznanski
Original Assignee
Akad Medyczna
Pan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Akad Medyczna, Pan filed Critical Akad Medyczna
Priority to PL29977489A priority Critical patent/PL164565B1/pl
Publication of PL164565B1 publication Critical patent/PL164565B1/pl

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

1. Sposób konstruowania zrekombinowa- nego wektora do klonowania i/lub eskpresji w komórkach gospodarza bakteryjnego do wyt- warzania polipeptydu zdolnego do produkcji przeciwcial reagujacych specyficznie z bial- kiem ludzkiego tkankowego aktywatora plazmi- nogenu, przez laczenie fragmentów DNA, znamienny tym, ze wektor laczy sie z DNA kodujacym polipeptyd odpowiadajacy dome- nie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, zdolny do wytwa- rzania przeciwcial reagujacych specyficznie z bialkiem ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu. F ig .2 PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób konstruowania zrekombinowanego wektora zdolnego do klonowania i/lub ekspresji w komórkach gospodarza bakteryjnego do wytwarzania polipeptydu zdolnego do produkcji przeciwciał reagujących specyficznie z białkiem ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu i tym polipeptydem i/lub reagującego specyficznie z przeciwciałami dla tkankowego aktywatora plazminogenu, oraz z przeciwciałami dla tego polipeptydu.
Tkankowy aktywator plazminogenu (t-PA) pełni kluczową rolę w aktywacji osoczowego systemu fibrynolitycznego powodując specyficzne przekształcenie nieaktywnego plazminogenu w plazminę trawiącą fibrynowe skrzepy, będące przyczyną poważnych zakłóceń w funkcjonowaniu układu krwionośnego. Specyficzność działania t-PA, w odróżnieniu od innych aktywatorów plazminogenu, takich jak urokinaza czy streptokinaza, polega na tym, że aktywacja przebiega seiektywnńe- wyłącznie w miejscach występowania złogów fibrynowych. Otrzymanie po raz
164 565 pierwszy w 1983 r. aktywnego t-PA metodami inżynierii genetycznej umożliwiło pełniejsze zbadanie charakterystycznych własności tego białka. Okazało się, że t-PA jest najskuteczniejszym środkiem likwidującym skutki zawału serca oraz innych chorób układu krążenia o podłożu zakrzepowym.
Oznaczanie zarówno poziomu jak i aktywności tkankowego aktywatora plazminogenu jest niezbędne podczas monitorowania procesu terapii fibrynolitycznej (zwłaszcza w przypadku zawałów mięśnia sercowego lub wykrzepiania śródnaczyniowego). Może ono również służyć jako marker wczesnych zmian fizjologicznych w organizmie (proces nowotworzenia) jak i zaburzeń hemostazy.
Znane dotychczas sposoby oznaczania ludzkiego t-PA obejmują dwie główne metody postępowania, wykorzystujące odpowiednio własności enzymologiczne i immunologiczne tego białka.
Pierwsza grupa metod oznaczania stężenia t-PA w osoczu krwi wykorzystuje swoistość enzymatyczną tego białka w stosunku do niskocząsteczkowych substratów syntetycznych, np. S-2288 1sub S-2252 (Soeda S. i wsp., Chem. Phar. Bull., 1989, [3]37) lub plazminogenu. Inny sposób w tej samej grupie metod opiera się na zdolności t-PA do wywołania konwersji plazminogenu w plazminę i oznaczenie jego aktywności poprzez aktywność powstałej plazminy.
Znany sposób wykorzystujący własności immunologiczne uwzględnia zastosowania: a) radiojodowanych cząsteczek t-PA lub przeciwciał t-PA w metodzie radioimmunologicznej wykonywanej w fazie ciekłej lub stałej, bądź b) koniugatów przeciwciał dla t-PA z peroksydazą chrzanu w teście typu ELISA (Amiral J. i wsp., Thr. Res., 1988, Suppl. VIII). Ten ostatni test jest najczęściej stosowany w celu detekcji t-PA. Sposób ten składa się z następujących zasadniczych etapów:
a) opłaszczenie powierzchni studzienek w płytkach plastikowych przeciwciałami dla t-PA,
b) inkubacja opłaszczonych płytek z materiałem biologicznym lub oznaczanym roztworem t-PA,
c) po dokładnym odmyciu nieswoiśnie związanych białek, inkubacja płytek z przeciwciałami dla t-PA kowalencyjnie związanymi z peroksydazą chrzanową,
d) wywołanie reakcji enzymatycznej z substratem dla peroksydazy i ocena na podstawie intensywności barwy ilości cząsteczek t-PA związanych z opłaszczoną powierzchnią płytek.
Wszystkie te metody wymagają zastosowania rodzimego białka t-PA, które dotychczas uzyskiwano:
a) na drodze izolowania z osocza krwi,
b) hodowli komórek nowotworu czerniaka (melanoma) i izolowania t-PA z płynu hodowlanego, do którego przedostaje się w czasie wzrostu hodowli,
c) przez zastosowanie metody biotechnologicznej polegającej na wyodrębnieniu naturalnego genu kodującego t-PA, ligowaniu z wektorem ekspresyjnym i transformowaniu komórek gospodarza.
Wszystkie te metody otrzymania rodzimego t-PA są niezwykle skomplikowane, pracochłonne i kosztowne, co zawyża w znacznym stopniu koszty całego testu oznaczania t-PA.
Nieoczekiwanie okazało się, że możliwe jest oznaczanie białka rodzimego t-PA w oparciu o metodę, w której stosuje się fragment peptydowy otrzymany przy pomocy wektora otrzymanego sposobem według wynalazku. Stwierdzono, że można wykorzystać pełną reakcję krzyżową w teście immunologicznym przeciwciał otrzymanych dla fragmentu białka i rodzimej cząsteczki t-PA.
W odróżnieniu od znanych metod oznaczania t-PA, wytworzony przy pomocy wektora otrzymanego sposobem według wynalazku, fragment peptydowy, a nie całe białko służy do produkcji swoistych przeciwciał rozpoznających tak samo zarówno fragment peptydowy, jak i rodzime białko. Fragment ten stosuje się też do uzyskania krzywej wzorcowej.
Sposób wytwarzania zrekombinowanego wektora do klonowania i/lub ekspresji w komórkach gospodarza bakteryjnego przez łączenie fragmentów DNA, polega według wynalazku na tym, że wektor ekspresyjny łączy się z DNA kodującym polipeptyd odpowiadający domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu i zdolny do produkcji przeciwciał reagujących specyficznie z białkiem ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu oraz z tym polipeptydem i/lub reagującego specyficznie z przeciwciałami dla tego polipeptydu.
164 565
Korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje się zsyntetyzowany chemicznie DNA kodujący fragment cząsteczki t-PA od 50 do 90 aminokwasu od N-końca o sekwencji:
55 60
Pro-Val-Lys-Ser-Cys- Ser-Glu-Pro-Arg-Cys- Phe-Asn-Gly-Gly-Thr65 70 75
Cys-Gln-Gln-Ala-Leu-Tyr-Phe-Ser-Asp-Phe- Val-Cys-Gln-Cys-Pro80 85 90
Glu-Gly-Phe-Ala-GIy- Lys-Cys-Cys-GIu-IIe- Asp
W sposobie według wynalazku, korzystnie stosuje się zsyntetyzowany chemicznie DNA kodujący polipeptyd odpowiadający domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu o sekwencji:
(X)nCCGGTCAAAAGTTGCAGCGAACCACGATGTTTCAACGGAGGA
ACCTGCCAGCAGGCACTGTACTTCTCAGATTTCGTGTGCCAGTGT
CCAGAAGGATTTGCTGGAAAATGTTGTGAAATAGAT (y)n, gdzie X oznacza AATTCATGAGTCAGGAT, Y oznacza CTGGAGAGTCAGGGATAATAAGCT, a n przyjmuje wartość 1 lub 0.
Wytworzony sposobem według wynalazku zrekombinowany wektor może służyć do otrzymania fragmentu polipeptydowego zawierającego epitopy antygenowe rozpoznawane przez przeciwciała również w rodzimej cząsteczce t-PA.
Stosowany w procesie prowadzonym sposobem według wynalazku gen kodujący fragment polipeptydowy odpowiadający domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu można na przykład otrzymać z oligonukleotydowych fragmentów logowanych in vitro.
Oligonukleotydowe fragmenty można zsyntetyzować chemicznie na nośniku poprzez kolejne przyłączanie nukleozydów z zablokowanymi grupami czynnymi. Korzystnie do ochrony funkcji aminowej stosuje się grupę izopropoksyacetylową, co przedstawiono w opisie patentowym RP nr 159234.
Fragmenty oligonukeotydowe zsyntetyzowane chemicznie poddaje się enzymatycznej reakcji kinazowania, w trakcie której wprowadza się fosforan na końcach 5' za pomocą kinazy polinukleotydowej i ATP. Kinazowane oligonukleotydy liguje się in vitro w dwuniciowe odcinki ograniczone sekwencjami rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne. Zligowane odcinki klonuje się w wektorze pomocniczym. Poprawność sekwencji produktów ligowania i klonowania tych fragmentów sprawdza się poprzez sekwencjonowanie metodą Maxama-Gilberta. Można stosować różne wektory pomocnicze, np pUC19. Sklonowne w wektorze odcinki DNA namnaża się w komórkach gospodarza, którymi mogą być bakterie, drożdże i inne. Wektory z wklonowanymi odcinkami izoluje się, a następnie odcinki odzyskuje się po trawieniu restryktazami na drodze elektroforezy w żelu poliakryloamidowym. Odzyskane odcinki włącza się do wektora ekspresyjnego po trawieniu odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Na tym etapie stosuje się różne wektory ekspresyjne, korzystnie plazmidowe lub fagowe. Przykładowo plazmid ekspresyjny pWR 450.1. zawiera gen kodujący /--galaktojddięzę. Komórki gosoodarza, korzyntnie t^al^'^(irii transformowane zrekombinowanym wektorem, są po namnożeniu źródłem fragmentu białka ludzkiego t-PA.
Wytworzony przy pomocy otrzymanego sposobem według wynalazku zrekkmbiakoaaegk wektora, fragment białka t-PA można stosować do otrzymywania przeciwciał różnymi znanymi metodami, a także do wykreślenia krzywej wzorcowej niezbędnej do ilościowego oznaczania t-PA.
Przykładowy sposób wytwarzania przeciwciał pklrklkaalazch reagujących specyficznie z białkiem ludzkiego tkankowego aktywatora pldemrakgeau polega na tym, że immuaieuje się zwierzęta polipeptydem odpowiadającym domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plaemiakgenu, pobiera się krew i odzyskuje przeciwciała.
Przeciwciała otrzymane przy pomocy polipeptydu wytworzonego za pomocą wektora otrzymanego sposobem według wynalazku, można zastosować do oznaczania antygenu ludzkiego
164 565 5 tkankowego aktywatora plazminogenu oraz do otrzymania testu diagnostycznego do oznaczania tego antygenu.
Przykładowy sposób oznaczania antygenu ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu polega na tym, że badaną próbkę, korzystnie materiału biologicznego kontaktuje się z przeciwciałami dla polipeptydu odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, po czym oznacza się wytworzony kompleks antygen-przeciwciało.
W innej przykładowej metodzie najpierw wytwarza się kompleks dwuskładnikowy antygenu t-PA w próbce z pierwszym przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem, po czym wytwarza się kompleks trójskładnikowy przez skontaktowanie kompleksu dwuskładnikowego z drugim przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem, przy czym jako jedno z tych przeciwciał stosuje się przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu. Obecność kompleksu trójskładnikowego wykrywa się za pomocą sygnału tworzonego przez odczynnik dający się oznaczyć analitycznie lub wyznakowanego przeciwciała przeciwimmunoglobulinowego.
Badaną próbkę, w której wykrywa się i oznacza antygen t-PA kontaktuje się i inkubuje z przeciwciałami reagującymi specyficznie z tym antygenem. Utworzenie kompleksu dwuskładnikowego antygen-przeciwciało wykrywa się i oznacza za pomocą środka wykrywającego i sygnalizującego reakcję immunologiczną, jak na przykład przeciwciało reagujące specyficznie z t-PA znakowane odczynnikiem dającym się oznaczyć analitycznie.
Środek wykrywający i sygnalizujący reakcję immunologiczną może być obecny podczas inkubowania antygenu z przeciwciałem. Na przykład można bezpośrednio wyznakować przeciwciała kontaktowane z badaną próbką i po przemyciu produktu reakcji uzyskać sygnał. Środkiem jest wówczas sam znacznik. Środek wykrywający można też dodać dopiero po wytworzeniu kompleksu dwuskładnikowego i usunięciu nieprzereagowanego materiału. Wykrywanie i oznaczanie prowadzi się wówczas następująco: dwuskładnikowy kompleks antygen-przeciwciało po odmyciu kontaktuje się z drugim przeciwciałem reagującym specyficznie z t-PA, przy czym jako jedno z tych prezciwciał stosuje się przeciwciało dla polipeptydu odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu. Pozostałym (pierwszym lub drugim) przeciwciałem może być przeciwciało dla całej cząsteczki t-PA. Otrzymuje się wówczas kompleks trójskładnikowy przeciwciało-antygen-przeciwciało. Drugie przeciwciała mogą być bezpośrednio znakowane odczynnikiem dającym się oznaczyć analitycznie. Alternatywnie, stosuje się układ dwuskładnikowy zawierający drugie przeciwciała tworzące kompleks trójskładnikowy, który wykrywa się za pomocą przeciwciała przeciwimmunoglobulinowego.
Do znakowania można stosować enzym biotynę, izotop promieniotwórczy, przykładowo 125J lub inne znane odczynniki. Wykrywanie i oznaczania prowadzi się za pomocą syngału wytwarzanego przez znacznik.
W tak prowadzonym procesie oznaczania lub wykrywania badaną próbkę, oznaczany antygen lub jedno z przeciwciał, korzystnie pierwsze, unieruchamia się na stałym nośniku takim jak płytka plastikowa, bibuła nitrocelulozowa lub inne.
Wykrywanie i oznaczanie dogodnie jest prowadzić za pomocą testu diagnostycznego. Przykładowy test diagnostyczny zawiera przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, ewentualnie unieruchomione na stałym nośniku lub rozpuszczone w fazie ciekłej. Przeciwciała są związane z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie.
Alternatywnie test diagnostyczny zawiera pierwsze przeciwciała reagujące specyficznie z białkiem ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, oraz układ do wykrywania kompleksu antygen-przeciwciało zawierający drugie przeciwciała zdolne do specyficzngo reagowania z ludzkim tkankowym aktywatorem plazminogenu i ewentualnie przeciwciała przeciwimmunoglobulinowe, przy czym jedne z tych przeciwciał stanowią przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu. Korzystnie pierwsze przeciwciała są związane z fazą stałą lub ciekłą.
164 565
Test może dodatkowo zawierać nośnik stały lub ciekły dla związania próbki zawierającej antygen.
Układ do wykrywania kompleksu antygen-przeciwciało zawiera drugie przeciwciała bezpośrednio związane z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie albo też układ ten zawiera trzecie przeciwciała przeciwimmuglobulinowe związane ze znacznikiem.
W sposobie i testach do oznaczania ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu można stosować przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego jego domenie podobnej do EGF wytworzone różnymi metodami.
Przykładowy sposób wykrywania przeciwciał dla t-PA w badanej próbce, korzystnie w materiale biologicznym, polega na tym, że polipeptyd odpowiadający domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu kontaktuje się z badaną próbką aż do związania przeciwciał, po czym wykrywa się produkt reakcji immunologicznej.
Reakcję, korzystnie prowadzi się w roztworze.
Dogodnie jest stosować test diagnostyczny do wykrywania przeciwciał anty t-PA zawierający polipeptyd odpowiadający domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu wytworzony przy pomocy wektora otrzymanego sposobem według wynalazku. Polipeptyd jest związany z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie. Do znakowania można stosować znane metody.
W opisie i przykładach używane są następujące skróty:
A: adenina, C: cytozyna, G: guanina, T: tymina, Ala: alanina, Arg: arginina, Asn: asparagina, Asp: kwas asparaginowy, Cys: cysteina, Gln: glutamina, Glu: kwas glutaminowy, Gly: glicyna, His: histydyna, Ile: izoleucyna, Leu: leucyna, Lys: lizyna, Met: metionina, Phe: fenyloalanina, Pro: prolina, Ser: seryna, Thr: treonina, Trp: tryptofan, Tyr: tyrozyna, Val: walina, DNA: kws dezoksyrybonukleinowy, cDNA: komplementarny DNA, Tris-HCl: chlorowodorek trójhydroksymetyloaminometanu, EDTA: kwas etylenodwuaminoczterooctowy
10xbufor Eco R1: KX)mM Tris-HCl pH 7,5, 1 M NaCl, 10mM β-merkaptoetanol.
10xbufor do kinazowania:0,7 M Tris-HCl pH 7,6, 0,1 M MgCh, 50 mM ditiotreitol.
10xbufor ligacyjny: 600 mM Tris-HCl pH 7,6,50 mM MgCh, 50 mM ditiotreitol, 10 mM ATP.
Bufor do ekstrakcji: 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM octan sodu, 4 mM EDTA.
Pożywka LB: 10 g bacto trypton, 5 g Yeast Extract, 5 g NaCl na 1 litr roztworu.
Bufor TE: 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA.
Bufor z SDS: 10 g Tris-HCl pH 8,0, 77 g glicyny, 1 g SDS na 1 litr roztworu.
Bufor do lizy komórek: 150 mgTris, 400 mg SDS, 1 ml β-merkaptoetanol, 2 ml glicerolu, 7 ml wody.
Bufor R I: 50 mM glukoza, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl pH 8,0, 4 mg/ml lizozymu (Pharmacia).
Bufor R II: 0,2 M NaOH, 1% SDS.
Bufor R III: 60 ml 5 M octan potasu, 11,5 ml kwas octowy lodowaty, 28,5 ml H 2O.
DTT: ditiotreitol, SDS: Siarczan dodecylu sodu, PBS: zbuforowany roztwór soli fizjologicznej, ATP: trójfosforan adenozyny, HPLC: wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa.
Na załączonych rysunkach fig. 1 przedstawia wykres hydrofobowości łańcucha polipeptydowego t-PA wytworzonego przy pomocy zrekombinowanego wektora otrzymanego sposobem według wynalazku. Fig. 2 przedstawia sekwencję fragmentu genu ludzkiego t-PA podzieloną na fragmenty syntetyzowane chemicznie. Fig. 3 przedstawia schemat konstrukcji fragmentu genu dla t-PA sklonowanego w wektorze rekombinacyjnym pUC-19 oraz ekspresyjnym pUR 450. Fig. 4 przedstawia elektroforezę w żelu poliakryloamidowym zawierającym SDS ekstraktów białkowych otrzymanych z komórek E.coli oraz oczyszczonego kompleksu białkowego t-PA,z (/-galaktozydazą: 1,2-ciałka inkluzyjne rozpuszczone w 6 mol. moczniku, 3-czysty kniugat (β-galaktozydaza-II domena t-PA) po usunięciu mącznika (dializa wobec zbuforowanego roztworu soli fizjologicznej,
B. Immunobloting sprawdzający czysty preparat. Fig. 5 przedstawia schemat rozbicia kompleksu białkowego i oczyszczania domenty t-PA o budowie podobnej do EGF.
164 565 zawieszając je w 35 ml buforu 50 mM Tris-HCl, pH 7,4,1 mM PMSF, 1 mM EDTA. Po ponownym ich żwirowaniu rozpuszcza się je w 9 M moczniku. W celu pozbycia się reszty zanieczyszczeń (nierozpuszczonych ciałek inkluzyjnych) zawiesinę ponownie wiruje się (20 000 obr./min., 30 min., temp. + 4°C). W supernatancie winna znajdować się główna część białka. Dalsze oczyszczania koniugatu zawierającego II domenę t-PA przeprowadza się na kolumnie chromatograficznej DEAE-Sephacel.
Białka zawarte w ciałkach inkluzyjnych rozpuszczone w 9M moczniku dializuje się do roztworu 6M mocznika, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, zawierającego 10 mM EDTA, 1 mM PMSF. Tym samym buforem równoważy się dwie kolumny wypełnione złożem DEAE-Sephacel (o wymiarach 2,5 X 10 cm). Na jedną z nich nanosi się roztwór białek. Część białka, która po przejściu przez kolumnę nie zwiąże się ze złożem, nanosi się (po 2-3 krotnym rozcieńczeniu tym samym buforem na drugą kolumnę. Czysty koniugat wymywa się ze złoża 0.1 M NaCl.
H. Rozbicie kompleksu na drodze reakcji chemicznej.
Oczyszczone białko hybrydowe złożone z fragmentu β-galaktozydazy oraz II domeny t-PA dializuje się wobec buforu 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 w celu usunięcia mocznika, a następnie liofilizuje. Rozszczepienie wiązania Asp-Pro następuje w środowisku 75% kwasu mrówkowego. Zliofilizowany koniugat rozpuszcza się w kwasie mrówkowym (ok. 1 mg białka na 1 ml kwasu) i nastawia się 16-godzinną inkubację w temperaturze pokojowej. Następnie usuwa się kwas w wyparce próżniowej i hydrolizat rozpuszcza się w 0,1% TFA (kwas trifluorooctowy). Rozbicie koniugatu sprawdzano elektroforetycznie. Produkty powstałe w wyniku tej reakcji analizuje się w żelu poliakryloamidowym po elektroforezie.
I. Sposób wyodrębniania domeny podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu za pomocą HPLC.
Fragment polipeptydowy odpowiadający domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu izoluje się z hydrolizatu otrzymanego w sposób jak opisano w punkcie H za pomocą HPLC. Rozdział chromatograficzny przeprowadzono na kolumnie semipreparatywnej TSK G3000SW firmy LKB, Szwecja.
Przykład II.
Zastosowanie fragmentu polipeptydowego odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, wytworzonego przy pomocy wektora otrzymanego sposobem według wynalazku do oznaczania poziomu przeciwciał dla t-PA w badanej próbce.
Fragment polipeptydowy odpowiadający domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu znakuje się izotopem jodu 126j. Do 100μΐ radinznakowanego lagandu (ok. 60 000 cpm) dodaje się 100/il badanej próbki (np. rozcieńczonej surowicy) i inkubuje się 12-16 godzin w 4°C. Następnie dodaje się przeciwciała przeciwimmunogldbulmowe (np. IgG królicze przeciw IgG ludzkim). Po 2-nodzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej zwirowuje sięimmunoprecypitat i przemywa się zbufdrowanym roztworem soli fizjologicznej. Radioaktywność osadów mierzy się licznikiem gamma. Poziom przeciwciał dla t-PA odczytuje się na podstawie radioaktywności z krzywej wzorcowej dla standartowych przeciwciał dla t-PA w sposób analogiczny jak wyżej opisany.
164 565
Wynalazek jest bliżej wyjaśniony w przykładach wykonania.
Przykład I.
Etap 1.
A. Synteza oligonukleotydów.
Syntezę 18 oligonukleotydowych fragmentów (fig. 2) przeprowadza się metodą amidofosforynową na stałym nośniku. Jako nośnik stosuje się szkło o kontrolowanej porowatości, typu LCA-CPG, ze związaną pierwszą jednostką nukleozydową. Jednostka ta ma przyłączoną na końcu 5'-OH dezoksyrybozy blokującą grupę kwasolabilną - dimetoksytrityl (DMT), która usuwa się w środowisku kwaśnym. Odsłonięta w ten sposób grupa 5'-OH jednostki nukleozydowej przyłącza prekursor kolejnej jednostki: 3'-amidofosforyn odpowiedniego nukleozydu. Za pomocą jodu w obecności wody dokonuje się utlenienia grupy fosforynowej do fosforanu. Następnie usuwa się DMT z przyłączonej jednostki - tym samym cykl rozpoczyna się na nowo. W celu usunięcia przereagowanych jednostek z wolnymi grupami 5'-OH stosuje się tzw. „capping, tj. zablokowanie pomyłkowych sekwencji przez acetylowania bezwodnikiem octowym w obecności aktywatorów. Po utworzeniu żądanego oligonukleotydu odcina się go od złoża i usuwa inne grupy wodnym roztworem amoniaku, oczyszcza elektroforetycznie następnie odsala metodą HPLC. (Waters C-18 RP, 10//m). Oligonukleotydy przechowuje się w porcjach po ok. 0,5 OD.
B. Proces kinazowania i ligacji.
Poszczególne fragmenty nici DNA rozpuszcza się w wodzie destylowanej, tak aby w 5μ1 znajdował się 1 lg fragmentu. Miesza się po 5 μΐ roztworu fragmentów od 1do 9 (I nić DNA) i od 10 do 18 (II nić DNA). Do mieszaniny fragmentów 0,1 objętości buforu do kinazowania (50 mM Tris-HCl, 5 μM MgCh), 5 μΐ 20raM ΑΤΡι Ιμΐ yinazy uklinuyieotydowej Β (T4 pklinuideotide kinase). Reakcję prowadzi się przez 4 godziny w temperaturze 37°C. Miesza się obie nici i inkubuje przez 20 minut w temperaturze 100°C. Po powolnym ostudzeniu dodaje się do każdej próbki po 0,1 objętości buforu do ligacji, po 1 μΐ 200 mM ATP, 1 μΐ Hgyzy T4. Po doaładnmm yoieSeanipiri reakcję prowadzi się przez 12 godzin w temperaturze 4°C.
C. Hydroliza enzymami.
Do rozpuszczonego DNA (80μΐ) dodaje się 10xbuforu EcoRi, 2U restryktazy EcoRi (firmy Pharmacia) oraz wody do objętości 100μ1. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Po tym czasie DNA strąca się etanolem, dodając 3 objętości alkoholu etylowego (99,8%), wymraża się w -20°C przez 5 minut, a następnie odwirowuje się przy 15 tys. obr., przez 5 minut. Osad rozpuszcza się w 20μΐ bofozu TE. W ten mm spósób jpt^^tęjouje się pozazas hydlolizy restryktazą Hind III.
D. Rozdział elektroforetyczny.
W celu sprawdzenia czy gligomane fragmenty DNA mają odpowiednią długość, rozdziela sięje w 8% żelu poliakryloamidomym z SDS z TBE. Rozdział prowadzi się przy napięciu 130 V w ciągu 3 godzin. Żel zabarwia się bromkiem etydyny 0,5 eg/ml -firmy Serva) przez 20 minut w temperaturze pokojowej, następnie płucze się 2 X wodą destylowaną. Rozdzielone produkty obserwuje się pod lampą UV. W celu oceny wielkości fragmentów DNA podczas elektroforezy używa się następujących wzorców: pUC 19 trawiony Msp, pUC 19 trawiony Bsp RI. Zligowane fragmenty posiadają oczekiwaną długość. Po elektroforezie sprawdzającej wykonuje się elektroforezę preparatywną i uzyskuje się tą drogą fragment, który następnie liguje się z plazmidem pUC 19 'trawionym Eco RI i Hind III w sposób wyżej opisany.
E. Przygotowanie kompetentnych komórek.
Z płytki z wysianymi bakteriami DHS, pobiera się jedną kolonię, którą szczepi się na 5 mi pożywkę LB. Bakterie hoduje się w temperaturze 37°C przez 18 godzin. Do 100 ml pożywki LB dodaje się 2 ml otrzymanej hodowli i prowadzi się hodowlę do gęstości optycznej OD 600 = 0,3. Zawiesinę bakterii gwiromuje się (5 tys. obr. 20 min.), a osad bakteryjny schładza się i zawiesza w 50 ml buforu SB i umieszcza w temperaturze 0°C. Zmiromuje się jak wyżej, a osad zawiesza w 1/12 objętości wyjściowej buforem SB. Inkubuje się 20 minut w temperaturze 0°C. Po tym czasie z zawieszonych komórek pobiera się do sterylnych probówek po 200μΐ zawiesiny komórek i inkubuje 30 minut w 0°C. Dodaje się 7 μ' DTT i plazmidy (20 μΐ). kn^j^i siw w wodzie °0ο<3) Ό minut, a
164 565 natępnie 45 sekund w 45°C. Ochładza się w lodzie i dodaje 800pl pożywki LB, a następnie inkubuje 1 godzinę w 37°C. Po tym czasie posiewa się na płytki. Wylewa się 200pl mieszaniny ligacyjnej na płytkę i inkubuje się w 37°C przez 18 godz.
F. Analiza otrzymanych transformantów.
Po 18 godzinach na płytce z wysianą mieszaniną transformacyjną obserwuje się pojedyncze kolonie. Do dalszej analizy wybiera się 10 kolonii. 5 ml pożywki szczepi się pojedynczymi koloniami i hoduje w 37°C przez 18 godzin, a następnie izoluje plazmidowy DNA.
Preparatyka plazmidowego DNA z 5 ml pożywki przebiega w następujący sposób: Bakterie zwirowuje się (5 minut 5 obr./min.). Osad bakteryjny zawiesza się w 200pl buforu RI i przetrzymuje 5 minut w temperaturze 0°C. Dodaje się 400pR RII °0°C), a. następni3 300 pl RIII°0°C). Całość zwirowuje się (15 tys. obr./min., 5 minut). Supeimatant przenosi się znad osadu do nowej probówki i dodaje się 2,5 objętości izoprapanalu. Wymraża się w -20°C, zwirowuje, osad płucze 70% etanolem i suszy pod próżnią. Osad rozpuszcza się w 200pl TE i dodaje 20/d rortworu NNazo o stężeniu 1 mg/ml. Inkubie się 30 minut w 37°C. Dodaje się 200pl fenolu. Zbiera się fazę wodną i dodaje 200pl mieszaniny chloroform/alkohol izoamylowy (24:1, v/v). Zwirawoje się, zbiera supernatant, czynność powtarza się jeszcze raz. Do fazy wodnej dodaje się 0,1 objętości 3 M octanu sodu (pH = 5.2) oraz 2,5 objętości etanolu i wymraża 30 minut w -20°C. Zwirowuje się (15 tys. obr./min.), a osad przemywa 70% etanolem i suszy. Osad plazmidowego DNA rozpuszcza się w 40 pl buforu TE.
W celu wybrania kolonu zawierającego plazmid pUC 19 z wklonowanym dwoniciawym fragmentem, przeprowadza się analizę otrzymanych DNA plazmidowych przy użyciu enzymów restrykcyjnych EcoRI i Hind III, a produkty trawienia rozdziela się w żelu poliakryloamidawam. Trawienie przeprowadza się jak w punkcie C, a rozdział elektroforetyczny jak w D.
G. Sprawdzenie sekwencji klonowanych fragmentów.
W celu upewnienia się czy sekwencja sklonowanego fragmentu jest prawidłowa, fragmenty sekwencjanuje się metodą Maxama i Gilberta (Maxama Gilbert, Methods in Enzymalagy, 1980, 65).
H. Konstrukcja wektora ekspresyjnego.
Sprawdzony, dwuniciowy fragment DNA kodujący polipeptyd odpowiadający domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu liguje się z wektorem ekspresyjnym pWR 450.1 trawionym enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Hind III. Uzyskuje się w ten sposób ^kombinowany plazmid ekspresyjny pW-t-PA. Transformowanie tego wektora do komórek bakteryjnych odbywa się w sposób opisany w/punkcie E.
I. Oczyszczanie ciałek inkluzyjnych.
Bakterie z kolonii bakteryjnej zawierającej zrekombinowany plazmid przenosi się do probówki zawierającej 1 ml pożywki Lb + 5 pl ampicyliny o stężeniu 100pg/ml i inkubuje przez 2-5 godzin w temperaturze 39°C, z ciągłym wytrząsaniem. Zawiesinę bakterii namnożonych w tej probówce przenosi się do kolby zawierającej 11 pożywki LB + 1ml ampicyliny o stężeniu D0gg/ml. Hodowlę prowadzi się 14 godzin, w temperaturze 37°C z ciągłym wytrząsaniem. Następnie bakterie zwirowuje się (15 min., 5000 obr./min.) i osad zawiesza się w 200 ml 0,1M CaCb (buforowanym Trisem, pH = 7,5). Po inkubacji przez 20 minut w łaźni lodowej, zawiesinę wiruje się przez 20 minut przy 12000 obr./min. w temperaturze + 4°C i osad ponownie zawiesza się w 200 ml 0,1 M CaC2. Po kolejnej inkubacji przez 2 godz. w łaźni lodowej zawiesinę wiruje się ( w dwóch probówkach wirowniczych)j.w.. Osad zawiesza się w 20 ml (do obu probówek dodaje się po 20 ml) buforu fosforanowego, pH 6.2, a następnie dodaje się po 200pp 1 M glicoloZu i Ό0μ11 % glicerolu do obu probówek. Ogrzewa się je do temperatury pokojowej, dodaje po 40/aZ 0.5 M EDTA, pH 8,0 i po krótkiej inkubacji schładza w łaźni lodowej do temperatury ok. 0°C. Następnie probówki wstawia się na 1 minutę do łaźni o temperaturze 42°C (szok termiczny). Wiruje jakwyżej.
Osad po schłodzeniu zawiesza się w 100 ml 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, zawierającym 10 mM EDTA, inku^je przez 5 minut w temperaturze 0°C i odwirowuje. Osad zawiesza się w 35 ml 100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 100 mM B-ME, 1 mM PMSF, 1% Triton Χ-100, pH 8.0. Poddaje się go działaniu ultradźwięków - 10 razy po 30 sek., po czym odwirowuje się (20 000 obr./min., 30 min, temp. + 4°C) otrzymując w ten sposób osad ciałek inkluzyjnych, które następnie przemywa się
Beta-galaktozydaza: białko t-Pa
produkty degradacji beta - galaktozydazy
polipeptyd (EGF — trPA)
Fig.5
Fig.4
EcoRI
Fig. 3
AATTCATGAGTCAGGATCCGGICAAAAGrTGCAGCGAACCACGATGTTTCAACGGAGGA G1 AC1CAGTCCTAGGCCAGTITICAACGTCGCTTGGTGCTACAAAGTTGCCTCCT
ACC IGCGAGCACGCACTG1ACTTC1CAGATT TCG1GTGCCAGTGTCCAGAAGGATTTGC
Tggacggtcctccgtgacatgaagagtctaaagcacacggtcacaggtcttcctaaacg tggaaaatgttgtgaaatagatciggagagtcagggataata accttttacaacactttatctagaccictcagtccctattattcga
3' 5’
1. GTACTCAGTCCTAGGCCAG
2. TTTTCAACGTCGCT dolna nić
3. TGGTGCTACAAAGTTGCCTC
4. CTTGGACGGTCGTC
5. CGTGACATGAAGAGTCTAAA
6. GCACACGGTCACAG
GTCTTCCTAAAC6ACCTTTTA
8. CAACACTTTATCTA6
9- acctctcactgccTattattcga
10. ataatagggactgaca
11. CCTCTAGATAAAGTGTTGTAA górna nić
12. AA0GTC0TTTAG6AA
13. GACCTGTGACCGTGTGCTTT
14. AGACTCnCATGTC
15. ACCGACGACCGTCCA AGG AG
16. GCAACTTTGTAGCA
17. CCAAGCGACGTTGAAAACTG
18. GCCTACGACTGAGTACTTAA
Fig.2
Fig.1
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.
Cena 10 000 zł

Claims (5)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób konstruowania zrekombinowanego wektora do klonowania i/lub eskpresji w komórkach gospodarza bakteryjnego do wytwarzania polipeptydu zdolnego do produkcji przeciwciał reagujących specyficznie z białkiem ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, przez łączenie fragmentów DNA, znamienny tym, że wektor łączy się z DNA kodującym polipeptyd odpowiadający domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, zdolny do wytwarzania przeciwciał reagujących specyficznie z białkiem ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się zsyntetyzowany chemicznie DNA kodujący fragment cząsteczki t-PA od N-końca o sekwencji:
    50 55 60
    Pro-Val-Lys-Ser-Cys- Ser-Glu-Pro-Arg-Cys- Phe-Asn-Gly-Gly-Thr65 70 75
    Cys-Gln-Gln-Ala-Leu-Tyr-Phe-Ser-Asp-Phe- Val-Cys-Gln-Cys-Pro80 85 90
    Glu-Gly-Phe-Ala-Gly- Lys-Cys-Cys-Glu-Ile- Asp
  3. 3. Sposób według zastrz 1, znamienny tym, że stosuje się zsyntetyzowany chemicznie DNA kodujący polipeptyd odpowiadający domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu o sekwencji:
    (X)nCCGGTCAAAAGTTGCAGCGAACCACGATGTTTCAACGGAGGA
    ACCTGCCAGCAGGCACTGTACTTCTCAGATTTCGTGTGCCAGTGT
    CCAGAAGGATTTGCTGGAAAATGTTGTGAAATAGAT (y)n, gdzie X oznacza AATTCATGAGTCAGGAT, Y oznacza CTGGAGAGTCAGGGATAATAAGCT, a n ma wartość 1 lub 0.
  4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się wektor plazmidowy pUC 19.
  5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się plazmidowy wektor ekspresyjny pWR 450.1.
PL29977489A 1989-12-29 1989-12-29 Sposób konstruowania zrekombinowanego wektora do klonowania i/lub ekspresjiw komórkach gospodarza bakteryjnego do wytwarzania polipeptydu zdolnego do produkcji przeciwcial reagujacych specyficznie z bialkiem ludzkiego tkankowego _______________________________aktywatora plazminogenu________________________ PL PL164565B1 (pl)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL29977489A PL164565B1 (pl) 1989-12-29 1989-12-29 Sposób konstruowania zrekombinowanego wektora do klonowania i/lub ekspresjiw komórkach gospodarza bakteryjnego do wytwarzania polipeptydu zdolnego do produkcji przeciwcial reagujacych specyficznie z bialkiem ludzkiego tkankowego _______________________________aktywatora plazminogenu________________________ PL

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL29977489A PL164565B1 (pl) 1989-12-29 1989-12-29 Sposób konstruowania zrekombinowanego wektora do klonowania i/lub ekspresjiw komórkach gospodarza bakteryjnego do wytwarzania polipeptydu zdolnego do produkcji przeciwcial reagujacych specyficznie z bialkiem ludzkiego tkankowego _______________________________aktywatora plazminogenu________________________ PL

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL164565B1 true PL164565B1 (pl) 1994-08-31

Family

ID=20060547

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL29977489A PL164565B1 (pl) 1989-12-29 1989-12-29 Sposób konstruowania zrekombinowanego wektora do klonowania i/lub ekspresjiw komórkach gospodarza bakteryjnego do wytwarzania polipeptydu zdolnego do produkcji przeciwcial reagujacych specyficznie z bialkiem ludzkiego tkankowego _______________________________aktywatora plazminogenu________________________ PL

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL164565B1 (pl)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Aota et al. The short amino acid sequence Pro-His-Ser-Arg-Asn in human fibronectin enhances cell-adhesive function.
Tomkinson et al. Three distinct DNA ligases in mammalian cells.
Gabrielsen et al. Specific DNA binding by c-Myb: evidence for a double helix-turn-helix-related motif
AU596952B2 (en) Peptide anitbodies and their use in detecting oncogene products
ES2240979T3 (es) Enzima para la escision de la region de anclaje de las proteinas superficiales de bacterias gram positivas.
JP3880062B2 (ja) Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘパリナーゼ遺伝子
US5387504A (en) Monospecific antibodies and assay system for detecting stromelysin cleavage products
CA1313818C (en) Nuclear antigen la
Donahue et al. Three-dimensional structure of the platelet integrin recognition segment of the fibrinogen gamma chain obtained by carrier protein-driven crystallization.
US5773237A (en) Method for determining tyrosine kinase activity
Umekawa et al. The carboxyl terminal sequence of nucleolar protein B23. 1 is important in its DNA polymerase α-stimulatory activity
PL164565B1 (pl) Sposób konstruowania zrekombinowanego wektora do klonowania i/lub ekspresjiw komórkach gospodarza bakteryjnego do wytwarzania polipeptydu zdolnego do produkcji przeciwcial reagujacych specyficznie z bialkiem ludzkiego tkankowego _______________________________aktywatora plazminogenu________________________ PL
PL164144B1 (en) Method for making polypeptides, recombined vector and method for its forming, method for making antibodies, method and test for determination of human tissue activator of plasminogen or antibodies for that protein
US5591831A (en) Solubilization and purification of the active gastrin releasing peptide receptor
US7803917B2 (en) Breast cancer resistance protein (BCRP) and antibodies thereto
PL164564B1 (pl) Sposób wytwarzania przeciwcial po l i k lo n a l nych reagujacych specyficznie z bialkiem ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu PL
EP0733123B1 (en) Method for detection of methylthioadenosine phosphorylase deficiency in mammalian cells
US5039791A (en) Peptide fragments of tissue plasminogen activator
PL164991B1 (pl) Sposób wytwarzania przeciwcial poliklonalnych reagujacych specyficznie z bialkiem ludzkiego Inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu PL
PL164992B1 (pl) Sposób konstruowania zrekombinowanego wektora do klonowania i/lub ekspresji w komórkach gospodarza bakteryjnego do wytworzenia polipeptydu zdolnego do produkcji przeciwcial reagujacych specyficznie z bialkiem ludzkiego inhibitora tkankowegoaktywatora plazminogenu PL
PL165793B1 (pl) Sposób wytwarzania polipeptydu, zdolnego do produkcji przeciwciał reagujących specyficznie z białkiem ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu
PL164952B1 (pl) Sposób oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego Inhibitora tkankowego aktywatora plazmlnogenu i test diagnostyczny do oznaczania l/lub wykrywania antygenu ludzkiego Inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu PL
US6911309B2 (en) Nucleic acids encoding MTAse
PL164338B1 (pl) Sposób i test do oznaczania antygenu ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu PL PL PL
PL167058B1 (pl) Sposób wytwarzania polipeptydu stanowiącego fragment ludzkiego białka C zdolnego do produkcji przeciwciał reagujących specyficznie z ludzkim białkiem C oraz z tym polipeptydem i/lub reagującego specyficznie z przeciwciałami dla tego polipeptydu