PL164564B1 - Sposób wytwarzania przeciwcial po l i k lo n a l nych reagujacych specyficznie z bialkiem ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania przeciwcial poliklonalnych reagujacych specyficznie z bialkiem ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, przez immunizacje zwierzat, znamienny tym, ze do immunizacji stosuje sie polipeptyd odpowiadajacy domenie podobnej do EG F ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, pobiera sie krew i izoluje przeciwciala. (62) Numer zgloszenia, z którego nastapilo wydzielenie: 283060 (43) Zgloszenie ogloszono: 01.07.1991 BUP 13/91 (45) O udzieleniu patentu ogloszono: 31.08.1994 WUP 08/94 PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych reagujących specyficznie z białkiem ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, przez immunizację zwierząt fragmentem polipeptydowym, pobranie krwi i izolację tych przeciwciał.

Tkankowy aktywator plazminogenu (t-PA) pełni kluczową rolę w aktywacji osoczowego systemu fibrynolitycznego powodując specyficzne przekształcenie nieaktywnego plazminogenu w plazminę trawiącą fibrynowe skrzepy, będące przyczyną poważnych zakłóceń w funkcjonowaniu układu krwionośnego. Specyficzność działania t-PA, w odróżnieniu od innych aktywatorów plazminogenu, takich jak urokinaza czy streptokinaza, polega na tym, że aktywacja przebiega selektywnie - wyłącznie w miejscach występowania złogów fibrynowych. Otrzymanie po raz pierwszy w 1983 r. aktywnego t-PA metodami inżynierii genetycznej umożliwiło pełniejsze zbadanie charakterystycznych własności tego białka. Okazało się, że t-PA jest najskuteczniejszym środkiem likwidującym skutki zawału serca oraz innych chorób układu krążenia o podłożu zakrzepowym.

Oznaczanie zarówno poziomu jak i aktywności tkankowego aktywatora plazminogenu jest niezbędne podczas monitorowania procesu terapii fibrynolitycznej (zwłaszcza w przypadku zawałów mięśnia sercowego lub wykrzepiania śródnaczyniowego). Może ono również służyć jako marker wczesnych zmian fizjologicznych w organiźmie (proces nowotworzenia) jak i zaburzeń hemostazy.

Znane dotychczas sposoby oznaczania ludzkiego t-PA obejmują dwie główne metody postępowania, wykorzystujące odpowiednio własności enzymologiczne i immunologiczne tego białka.

Pierwsza grupa metod oznaczania stężenia t-PA w osoczu krwi wykorzystuje swoistość enzymatyczną tego białka w stosunku do niskocząsteczkowych substratów syntetycznych, np.

164 564

S-2288 lub S-2252 (Soeda S. i wsp., Chem. Phar. Bull., 1989, [3] 37) lub plazminogenu. Inny sposób w tej samej grupie metod opiera się na zdolności t-PA do wywołania konwersji plazminogenu w plazminę i oznaczenie jego aktywności poprzez aktywność powstałej plazminy.

Znany sposób wykorzystujący własności immunologiczne uwzględnia zastosowania: a) radiojodowanych cząsteczek t-PA lub przeciwciał t-PA w metodzie radioimmunologicznej wykonywanej w fazie ciekłej lub stałej, bądź b) koniugatów przeciwciał dla t-PA z peroksydazą chrzanu w teście typu ELISA (Amiral J. i wsp., Thr. Res., 1988, Suppl. VIII). Ten ostatni test jest najczęściej stosowany w celu detekcji t-PA. Sposób ten składa się z następujących zasadniczych etapów:

a) opłaszczenie powierzchni studzienek w płytkach plastikowych przeciwciałami dla t-PA,

b) inkubacja opłaszczonych płytek z materiałem biologicznym lub oznaczanym roztworem t-PA,

c) po dokładnym odmyciu nieswoiście związanych białek, inkubacja płytek z przeciwciałami dla t-PA kowalencyjnie związanymi z peroksydazą chrzanową,

d) wywołanie reakcji enzymatycznej z substratem dla peroksydazy i ocena na podstawie intensywności barwy ilości cząsteczek t-PA związanych z opłaszczoną powierzchnią płytek.

Wszystkie te metody wymagają zastosowania rodzimego białka t-PA, które dotychczas uzyskiwano:

a) na drodze izolowania z osocza krwi,

b) hodowli komórek nowotworu czerniaka (melanoma) i izolowania t-PA z płynu hodowlanego, do którego przedostaje się w czasie wzrostu hodowli,

c) przez zastosowanie metody biotechnologicznej polegającej na wyodrębnieniu naturalnego genu kodującego t-PA, ligowaniu z wektorem ekspresyjnym i transformowaniu komórek gospodarza.

Wszystkie te metody otrzymania rodzimego t-PA są niezwykle skomplikowane, pracochłonne i kosztowne, co zawyża w znacznym stopniu koszty całego testu oznaczania t-PA.

Nieoczekiwanie okazało się, że możliwe jest oznaczanie białka rodzimego t-PA w oparciu o metodę, w której do wytworzenia przeciwciał stosuje się fragment peptydowy o odpowiedniej domenie wskazanej w sposobie według wynalazku. Stwierdzono, że można wykorzystać pełną reakcję krzyżową w teście immunologicznym przeciwciał otrzymanych dla fragmentu białka i rodzimej cząsteczki t-PA.

W odróżnieniu od znanych metod oznaczania t-PA, przy pomocy przeciwciał otrzymanych sposobem według wynalazku, nieoczekiwanie okazało się, że fragment peptydowy, a nie całe białko może służyć do produkcji swoistych przeciwciał rozpoznających tak samo zarówno fragment peptydowy, jak i rodzime białko. Fragment ten stosuje się również do uzyskania krzywej wzorcowej.

Sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych reagujących specyficznie z białkiem ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu przez immunizację zwierząt, polega według wynalazku na tym, że zwierzęta immunizuje się polipeptydem odpowiadającym domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, pobiera się krew i odzyskuje przeciwciała.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje się polipeptyd o sekwencji:

Pro-Val-Lys-Ser-Cys-Ser-Glu-Pro-Arg-Cys-Phe-Asn-Gly-Gly-ThrCys-Gln-Gln-Ala-Leu-Tyr-Phe-Ser-Asp-Phe-Val-Cys-Gln-Cys-ProGlu-Gly-Phe-Ala-Gly-Lys-Cys-Cys-Glu-Ile-Asp

W sposobie według wynalazku stosuje się otrzymany przez ekspresję zrekombinowanego DNA polipeptyd odpowiadający domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, zdolny do produkcji przeciwciał reagujących specyficznie z białkiem ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu oraz z tym polipeptydem i/lub reagującego specyficznie z przeciwciałami dla tego polipeptydu.

W sposobie według wynalazku, korzystnie stosuje się polipeptyd otrzymany przez ekspresję zrekombinowanego, zsyntetyzowanego chemicznie DNA o sekwencji:

(X)nCCGGTCAAAAGTTGCAGCGAACCACGATGTTTCAACGGAGGA

ACCTGCCAGCAGGCACTGTACTTCTCAGATTTCGTGTGCCAGTGT

CCAGAAGGATTTGCTGGAAAATGTTGTGAAATAGAT(y)n,

164 564 gdzie X oznacza AATTCATGAGTCAGGAT, Y oznacza CTGGAGAGTCAGGGATAATAAGCT, a n przyjmuje wartość 1 lub 0.

Wytworzone przeciwciała rozpoznają fragmenty polipeptydowe z epitopami antygenowymi również w rodzimej cząsteczce t-PA.

Stosowany w procesie według wynalazku fragment polipeptydowy odpowiadający domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu można na przykład otrzymać z oligonukleotydowych fragmentów ligowanych in vitro.

Oligonukleotydowe fragmenty można zsyntetyzować chemicznie na nośniku poprzez kolejne przyłączanie nukleozydów z zablokowanymi grupami czynnymi. Korzystnie do ochrony funkcji aminowej stosuje się grupę izopropoksyacetylową, co przedstawiono w opisie patentowym RP nr 159234.

Fragmenty oligonukleotydowe zsyntetyzowane chemicznie poddaje się enzymatycznej reakcji kinazowania, w trakcie której wprowadza się fosforan na końcach 5' za pomocą kinazy polinukleotydowej i ATP. Kinazowane oligonukleotydy liguje się in vitro wdwuniciowe odcinki ograniczone sekwencjami rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne. Zligowane odcinki klonuje się w wektorze pomocniczym. Poprawność sekwencji produktów ligowania i klonownaia tych fragmentów sprawdza się poprzez sekwencjonowanie metodą Maxama-Gilberta. Można stosować różne wektory pomocnicze, np. pUC19. Sklonowane w wektorze odcinki DNA namnaża się w komórkach gospodarza, którymi mogą być bakterie, drożdże i inne. Wektory z wkolonowanymi odcinkami izoluje się, a następnie odcinki odzyskuje się po trawieniu restryktazami na drodze elektroforezy w żelu poliakryloamidowym. Odzyskane odcinki włącza się do wektora ekspersyjnego po trawieniu odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Na tym etapie stosuje się różne wektory ekspresyjne, korzystnie plazmidowe lub fagowe. Przykładowo plazmid ekspersyjny pWR 450.1. zawiera gen kodujący β-galaktozydazę. Komórki gospodarza, korzystnie bakterii transformowane zrekombinowanym wektorem, są po namnożeniu źródłem fragmentu białka ludzkiego t-PA. Wytworzony w ten sposób fragment białka t-PA można stosować do otrzymywania przeciwciał sposobem według wynalazku, a także różnymi znanymi metodami·, oraz do wykreślenia krzywej wzorcowej niezbędnej do ilościowego oznaczania t-PA.

Otrzymane, za pomocą tego polipeptydu, wytworzone sposobem według wynalazku, przeciwciała można zastosować do oznaczania antygenu ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu oraz do otrzymania testu diagnostycznego do oznaczania tego antygenu.

Przykładowy sposób oznaczania antygenu ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu polega na tym, że badaną próbkę, korzystnie materiału biologicznego kontaktuje się z przeciwciałami dla polipeptydu odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, po czym oznacza się wytworzony kompleks antygen-przeciwciało.

W innej przykładowej metodzie najpierw wytwarza się kompleks dwuskładnikowy antygenu t-PA w próbce z pierwszym przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem, po czym wytwarza się kompleks trójskładnikowy przez skontaktowanie kompleksu dwuskładnikowego z drugim przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem, przy czym jako jedno z tych przeciwciał stosuje się przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu. Obecność kompleksu trójskładnikowego wykyrwa się za pomocą sygnału tworzonego przez odczynnik dający się oznaczyć analitycznie lub wyznakowanego przeciwciała przeciwimmunoglobulinowego.

Badaną próbkę, w której wykrywa się i oznacza antygen t-PA kontaktuje się i inkubuje z przeciwciałami reagującymi specyficznie z tym antygenem. Utworzenie kompleksu dwuskładnikowego antygen-przeciwciało wykrywa się i oznacza za pomocą środka wykrywającego i sygnalizującego reakcję, immunologiczną, jak na przykład przeciwciało reagujące specyficznie z t-PA znakowane odczynnikiem dającym się oznaczać analitycznie.

Środek wykrywający i sygnalizujący reakcję immunologiczną może być obecny podczas inkubowania antygenu z przeciwciałem. Na przykład można bezpośrednio wyznakować przeciwciała kontaktowane z badaną próbką i po przemyciu produktu reakcji uzyskać sygnał. Środkiem jest wówczas sam znacznik. Środek wykrywający można też dodać dopiero po wytworzeniu kompleksu dwuskładnikowego i usunięciu nieprzereagowanego materiału. Wykrywanie i oznaczanie prowadzi się wówczas następująco: dwuskładnikowy kompleks anytgen-przeciwciało po

164 564 odmyciu kontaktuje się z drugim przeciwciałem reagującym specyficznie z t-PA, przy czym jako jedno z tych przeciwciał stosuje się przeciwciało dla polipeptydu odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, otrzymane sposobem według wynalazku. Pozostałym (pierwszym lub drugim) przeciwciałem może być przeciwciało dla całej cząsteczki t-PA. Otrzymuje się wówczas kompleks trójskładnikowy przeciwciało-antygenprzeciwciało. Drugie przeciwciała mogą być bezpośrednio znakowane odczynnikiem dającym się oznaczyć analitycznie. Alternatywnie, stosuje się układ dwuskładnikowy zawierający drugie przeciwciała tworzące kompleks trójskładnikowy, który wykrywa się za pomocą przeciwciała przeciwimmunoglobulinowego.

Do znakowania można stosować enzym biotynę, izotop promieniotwórczy, przykładowo ¹²⁵J lub inne znane odczynniki. Wykrywanie i oznaczanie prowadzi się za pomocą sygnału wytwarzanego przez znacznik.

W tak prowadzonym procesie oznaczania lub wykrywania badaną próbkę, oznaczany antygen lub jedno z przeciwciał, korzystnie pierwsze, unieruchamia się na stałym nośniku takim jak płytka plastikowa, bibuła nitrocelulozowa lub inne.

Wykrywanie i oznaczanie dogodnie jest prowadzić za pomocą testu diagnostycznego. Przykładowy test diagnostyczny zawiera przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu otrzymane sposobem według wynalazku, ewentualnie unieruchomione na stałym nośniku lub rozpuszczone w fazie ciekłej. Przeciwciała są związane z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie.

Alternatywnie test diagnostyczny zawiera pierwsze przeciwciała reagujące specyficznie z białkiem ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, oraz układ do wykrywania kompleksu antygen-przeciwciało zawierający drugie przeciwciała zdolne do specyficznego reagowania z ludzkim tkankowym aktywatorem plazminogenu i ewentualnie przeciwciała przeciwimmunoglobulinowe, przy czym jedne z tych przeciwciał stanowią przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu. Korzystnie pierwsze przeciwciała są związane z fazą stałą lub ciekłą.

Test może dodatkowo zawierać nośnik stały lub ciekły dla związania próbki zawierającej antygen.

Układ do wykrywania kompleksu antygen-przeciwciało zawiera trzecie przeciwciała przeciwimmunoglobulinowe związane ze znacznikiem.

W sposobie i testach do oznaczania ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu można stosować przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego jego domenie podobnej do EGF wytworzone różnymi metodami.

Przykładowy sposób wykrywania przeciwciał dla t-PA w badanej próbce, korzystnie w materiale biologicznym, polega na tym, że polipeptyd odpowiadający domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu kontaktuje się z badaną próbką aż do związania przeciwciał, po czym wykrywa się produkt reakcji immunologicznej.

Reakcję, korzystnie prowadzi się w roztworze.

Dogodnie jest stosować test diagnostyczny do wykrywania antygenu t-PA zawierający przeciwciała z polipeptydem odpowiadającym domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, otrzymane sposobem według wynalazku. Polipeptyd jest związany z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie. Do znakowania można- stosować znane metody.

W opisie i przykładach używane są następujące skróty:

A: adenina; C: cytozyna; G: guanina; T: tymina; Ala: alanina; Arg: arginina; Asn: asparagina; Asp: kwas asparaginowy; Cys: cysteina; Gin: glutamina; Glu: kwas glutaminowy; Gly: glicyna; His: histydyna; Ile: izoleucyna; Leu: leucyna; Lys: lizyna; Met: metionina; Phe: fenyloalanina; Pro: prolina; Ser: seryna; Thr: treonina; Trp: tryptofan; Tyr: tyrozyna; Val: walina; DNA: kwas dezoksyrybonukleinowy; cDNA: komplementarny DNA; Tris-HCl: chlorowodorek trójhydroksymetyloaminometanu; EDTA: kwas etylenodwuaminoczterooctowy.

X bufor Eco R1: 100 mM Tris-HCl pH 7,5, 1M NaCl, 10 mM β-merkaptoetanol.

X bufor do kinazowania: 0,7 M Tris HCl pH 7,6, 0,1 M MgCk, 50 mM ditiotreitol.

X bufor ligacyjny: 660 mM Tris-HCl pH 7,6, 50 'mM MgCk, 50 mM ditiotreitol, 10 mM ATP.

164 564

Bufor do ekstrakcji: 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM octanu sodu, 4 mM EDTA.

Pożywka LB: 10 g bacto trypton, 5 g Yeast Extract, 5 g NaCl, na 1 litr roztworu.

Bufor TE: 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA.

Bufor z SDS: 10 g Tris-HCl pH 8,0, 77 g glicyny, 1 g SDS, na 1 litr roztworu.

Bufor do lizy komórek: 150 mg Tris, 400 mg SDS, 1 ml β-merkaptoetanol, 2 ml glicerolu, 7 ml wody.

Bufor R1: 50mM glukoza, 10mM EDTA, 25mM Tris-HCl pH 8,0, 4mg/ml liozymu (Pharmacia).

Bufor R II: 0,2 M NaOH, 1% SDS.

Bufor R III: 60 ml 5 M octan potasu, 11,5 ml kwas octowy lodowaty, 28,5 ml H 2O.

DTT: ditiotreitol, SDS: siarczan dodecylu sodu, PBS: zbuforowany roztwór soli fizjologicznej, ATP: trójfosforan adenozyny, HPLC: wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa.

Na załączonych rysunkach fig. 1 przedstawia wykres hydrofobowości łańcucha polipeptydowego t-PA stosowanego w sposobie wytwarzania przeciwciał według wynalazku. Fig. 2 przedstawia sekwencję fragmentu genu ludzkiego t-PA podzieloną na fragmenty syntetyzowane chemicznie. Fig. 3 przedstawia schemat konstrukcji fragmentu genu dla t-PA sklonowanego w wektorze rekombinacyjnym pUC-19 oraz ekspresyjnym pUR 450. Fig. 4 przedstawia elektroforezę w żelu poliakryloamidowym zawierającym SDS ekstraktów białkowych otrzymanych z komórek E. coli oraz oczyszczonego kompleksu białkowego t-PA z β-galaktozydaza: 1,2-<iałka inkluzyjne rozpuszczone w 6 mol. moczniku, 3-czysty koniugat β-galaktozydaza-II domena t-PA) po usunięciu mocznika (dializa wobec zbuforowanego roztworu soli fizjologicznej, B. Immunobloting sprawdzający czysty preparat. Fig. 5 przedstawia schemat rozbicia kompleksu białkowego i oczyszczania domeny t-PA o budowie podobnej do EGF.

Wynalazek jest bliżej wyjaśniony w przykładach wykonania.

Przykład I.

Etap 1.

A. Synteza oligonukleotydów.

Syntezę 18 oligonukleotydowych fragmentów (fig. 2) przeprowadza się metodą amidofosforynową na stałym nośniku. Jako nośnik stosuje się szkło o kontrolowanej porowatości, typu LCA-CPG, ze związaną pierwszą jednostką nukleozydową. Jednostka ta ma przyłączoną na końcu 5'-OH dezoksyrybozy blokującą grupę kwasolabilną - dimetoksytrityl (DMT), która usuwa się w środowisku kwaśnym. Odsłonięta w ten sposób grupa 5'-OH jednostki nukleozydowej przyłącza prekursor kolejnej jednostki: 3'-amidofosforyn odpowiedniego nukleozydu. Za pomocą jodu w obecności wody dokonuje się utlenienia grupy fosforynowej do fosforanu. Następnie usuwa się DMT z przyłączonej jednostki - tym samym cykl rozpoczyna się na nowo. W celu usunięcia nieprzereagowanych jednostek z wolnymi grupami 5'-OH stosuje się tzw. „capping“, tj. zablokowanie pomyłkowych sekwencji przez acetylowanie bezwodnikiem octowym w obecności aktywatorów. Po utworzeniu żądanego oligonukleotydu odcina się go od złoża i usuwa inne grupy wodnym roztworem amoniaku, oczyszcza elektroforetycznie następnie odsala metodą HPLC. (Waters C-18 RP, 10 pm). Oligonukleotydy przechowuje się w porcjach po ok. 0.5 OD.

B. Proces kinazowania i ligacji.

Poszczególne fragmenty nici DNA rozpuszcza się w wodzie destylowanej, tak aby w 5 pl znajdował się 1 fig fragmentu. Miesza się po 5 pl roztworu fragmentów od 1do 9 (I nić DNA) i od 10 do 18 (II nić DNA). Do mieszaniny fragmentów dodaje się 0.1 objętości buforu do kinazowania (50 mM Tris-HCl, 5 pM MgCb), 5 pl 20 mM ATP, 1 pl kinazy polinukleotydowej B (T4 poli nukleotide kinase). Reakcję prowadzi się przez 4 godziny w temperaturze 37°C. Miesza się obie nici i inkubuje przez 4 godziny w temperaturze 37°C. Miesza się obie nici i inkubuje przez 20 minut w temperaturze 100°C. Po powolnym ostudzeniu dodaje się do każdej próbki po 0.1 objętości buforu do ligacji, po 1 pl 200 mM ATP, 1 pl ligazy T4. Po dokładnym wymieszaniu reakcję prowadzi się przez 12 godzin w temperaturze 4°C.

C. Hydroliza enzymami.

Do rozpuszczonego DNA (80pl) dodaje się 10 X buforu EcoRi, 2U restryktazy EcoRI (firmy Pharmacia) oraz wody do objętości 100pl. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze 37°C przez 2

164 564

Ί godziny. Po tym czasie DNA strąca się etanolem, dodając 3 objętości alkoholu etylowego (99,8%), wymraża się w -20°C przez 5 minut, a następnie odwirowuje się przy 15 tys. obr., przez 5 minut. Osad rozpuszcza się w 20 μΐ buforu TE. W ten sam sposób postępuje się podczas hydrolizy restryktazą .Hind III.

D. Rozdział elektroforoetyczny.

W celu sprawdzenia czy zligowane fragmenty DNA mają odpowiednią długość, rozdziela się je w 8% żelu poliakryloamidowym z SDS w TBE. Rozdział prowadzi się przy napięciu 130 V w ciągu 3 godzin. Żel zabrawia się bromkiem etydyny (0,8 μg/ml - firmy Serva) przez 20 minut w temperaturze pokojowej, następnie płucze się 2 X wodą destylowaną. Rozdzielone produkty obserwuje się pod lampą UV. W celu oceny wielkości fragmentów DNA podczas -elektroforezy używa się następujących wzorców: pUC 19 trawiony Msp, pUC 19 trawiony Bsp RI. Zligowane fragmenty posiadają oczekiwaną długość. Po elektroforezie sprawdzającej wykonuje się elektroforezę preparatywną i uzyskuje się tą drogą fragment, który następnie liguje się z plazmidem pUC 19 trawionym Eco RI i Hind III w sposób wyżej opisany.

E. Przygotowanie kompetentnych komórek.

Z płytki z wysianymi bakteriami DHS, pobiera się jedną kolonię, którą szczepi się na 5 ml pożywkę LB. Bakterie hoduje się w temperaturze 37°C przez 18 godzin. Do 100 ml pożywki LB dodaje się 2 ml otrzymanej hodowli i prowadzi się hodowlę do gęstości optycznej OD 600 = 0,3. Zawiesinę bakterii zwirowuje się (5 tys. obr. 20 min.), a osad bakteryjny schładza się i zawiesza w 50 ml buforu SB i umieszcza w temperaturze 0°C. Zwirowuje się jak wyżej, a osąd zawiesza w 1/12 objętości wyjściowej buforem SB. Inkubuje się 20 w temperaturze, 0°C. Po tym- czasie z zawieszonych komórek pobiera się do sterylnych probówek po 200 μΐ zawiesiny komórek i inkubuje 30 minut w 0°C. Dodaje się 7 μΐ DTT i plazmidy (20 μΐ). Inkubuje się w lodzie (0°C) 30 minut, a następnie 45 sekund w 45°C. Ochładza się w lodzie i dodaje 800μΐ pożywki LB, a następnie inkubuje 1 godzinę w 37°C. Po tym czasie posiewa się na płytki. Wylewa się 200μΐ mieszaniny ligacyjnej na płytkę i inkubuje się w 37°C przez 18 godz.

E. Analiza otrzymanych transformantów.

Po 18 godzinach na płytce z wysianą mieszaniną transformacyjną obserwuje się pojedyncze kolonie. Do dalszej analizy wybiera się 10 kolonii. 5 ml pożywki szczepi się pojedynczymi koloniami i hoduje w 37°C przez 18 godzin, a następnie izoluje plazmidowy DNA.

Preparatyka plazmidowego DNA z 5 ml pożywki przebiega w. następujący sposób: Bakterie zwirowuje się (5 minut 5 obr./min.). Osad bakteryjny zawiesza się w 200μΐ buforu RI i przetrzymuje 5 minut w temperaturze 0°C. Dodaje się 400μΐ RII (0°C), a następnie 300μΐ RIII (0°C). Całość zwirowuje się (15 tys. obr./min., 5 minut). Supernatant przenosi się znad osadu do nowej probówki i dodaje się 2,5 objętości izopropanolu. Wymraża się w -20°C, zwirowuje, osad płucze 70% etanolem i suszy pod próżnią. Osad rozpuszcza się w 200μΐ TE i dodaje 20 μl roztworu RNazy o stężeniu 1 mg/ml. Inkubuje się 30 minut w 37°C. Dodaje się 200μΐ fenolu. Zbiera się fazę wodną i dodaje 200μΐ mieszaniny chloroform/alkohol izoamylowy (24:1, v/v). Zwirowuje się, zbiera supernatant, czynność powtarza się jeszcze raz. Do fazy wodnej dodaje się 0,1 objętości 3 M octanu sodu (pH = 5.2) oraz 2,5 objętości etanolu i wymraża 30 minut w -20°C. Zwirowuje się (15 tys. obr./min.), a osad przemywa 70% etanolem i suszy. Osad plazmidowego DNA rozpuszcza się w 40 μΐ buforu TE.

W celu wybrania klonu zawierającego plazmid pUC 19 z wklonowanym dwuniciowym fragmentem, przeprowadza się analizę otrzymanych DNA plazmidowych przy użyciu enzymów restrykcyjnych EcoRI i Hind III, a produkty trawienia rozdziela się w żelu poliakryloamidowym. Trawienie przeprowadza się jak w punkcie C, a rozdział elektroforetyczny jak w D.

G. Sprawdzenie sekwencji klonowanych fragmentów.

W celu upewnienia się czy sekwencja sklonowanego fragmentu jest prawidłowa, fragmenty sekwencjonuje się metodą Maxama i Gilberta (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 1980, 65).

H. Konstrukcja wektora ekspresyjnego.

Sprawdzony, dwuniciowy fragment DNA kodujący polipeptyd odpowiadający domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu liguje się z wektorem ekspresyjnym pWR 450.1 trawionym enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Hind III. Uzyskuje się w ten

164 564 sposób zrekombinowany plazmid ekspresyjny pW-t-PA. Tranformowanie tego wektora do komórek bakteryjnych odbywa się w sposób opisany w punkcie E.

I. Oczyszczanie ci^ł^łk inlduzyjnych.

Bakterie z kolonii bakteryjnej zawierającej zrekombinowany plazmid przenosi się do probówki zawierającej 1 ml pożywki LB + 5 μΐ ampicyliny o stężeniu 100 pg/ml i inkubuje przez 2-5 godzin w temperaturze 37°C, z ciągłym wytrząsaniem. Zawiesinę bakterii namnożonych w tej probówce przenosi się do kolby zawierającej 11 pożywki LB + 1ml ampicyliny o stężeniu 100pg/ml. Hodowlę prowadzi się 14 godzin, w temperaturze 37°C z ciągłym wytrząsaniem. Następnie bakterie zwirowuje się (15 min., 5000 obr./min.) i osad zawiesza się w 200 ml 0.1 M CaCl2 (buforowanym Trisem, pH = 7,5). Po inkubacji przez 20 minut w łaźni lodowej, zawiesinę wiruje się przez 20 minut przy 12000 obr./min. w temperaturze + 4°C) i osad ponownie zawiesza się w 200 ml 0.1 M CaCl2. Po kolejnej inkubacji przez 2 godz. w łaźni lodowej zawiesinę wiruje się (w dwóch probówkach wirowniczych) j. w. Osad zawiesza się w 20 ml (do obu probówek dodaje się po 20 ml) buforu fosforanowego, pH 6.2, a następnie dodaje się po 200pli 1 M glicerolu i 400 μΐ 1%glicerolu do obu probówek. Ogrzewa się je do temperatury pokojowej, dodaje się po 40 μΐ 0.5 M EDTA, pH 8.0 i po krótkiej inkubacji schładza w łaźni lodowej do temperatury ok. 0°C. Następnie probówki wstawia się na 1 minutę do łaźni o temperaturze 42°C (szok termiczny). Wiruje jak wyżej.

Osad po schłodzeniu zawiesza się w 100 ml 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, zawierającym 10 mM EDTA, inkubuje przez 5 minut w temperaturze 0°C i odwirowuje. Osad zawiesza się w 35 ml 100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 100 mM B-ME, 1 mM PMSF, 1% Triton Χ-100, pH 8.0. Poddaje się go działaniu ultradźwięków - 10 razy po 30 sek., po czym odwirowuje się (20 000 obr./min., 30 min., temp. + 4°C) otrzymując w ten sposób osad ciałek inkluzyjnych, które następnie przemywa się zawieszając je w 35 ml buforu 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM PMSF, 1 mm EDTA. Po ponownym ich zwirowaniu rozpuszcza się je w 9 M moczniku. W celu pozbycia się reszty zanieszczyszczeń (nierozpuszczalnych ciałek inkluzyjnych) zawiesinę ponownie wiruje się (20 000 obr./min., 30 min., temp. +4). W supernatancie winna znajdować się główna część białka. Dalsze oczyszczania koniugatu zawierającego II domenę t-PA przeprowadza się na kolumnie chromatograficznej DEAE-Sephacel.

Białka zawarte w ciałkach inkluzyjnych rozpuszczone w 9M moczniku dializuje się do roztworu 6M mocznika, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, zawierającego 10 mM EDTA, 1 mM pMsF. Tym samym buforem równoważy się dwie kolumny wypełnione złożem DEAE-Sephacel (o wymiarach 2,5 X 10 cm). Na jedną z nich nanosi się roztwór białek. Część białka, która po przejściu przez kolumnę nie zwiąże się ze złożem, nanosi się (po 2-3 krotnym rozcieńczeniu tym samym buforem na drugą kolumnę. Czysty koniugat wymywa się ze złoża 0.1 M NaCl.

J. Rozbicie kompleksu na drodze reakcji chemicznej.

Oczyszczone białko hybrydowe złożone z fragmentu β-galaktozydazy oraz II domeny t-PA dializuje się wobec buforu 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 w celu usunięcia mocznika, a następnie liofilizuje. Rozszczepienie wiązania Asp-Pro następuje w środowisku 75% kwasu mrówkowego. Zliofilizowany koniugat rozpuszcza się w kwasie mrówkowym (ok. 1 mg białka na 1ml kwasu) i nastawia się 16-godzinną inkubację w temperaturze pokojowej. Następnie usuwa się kwas w wyparce próżniowej i hydrolizat rozpuszcza się w 0.1% TFA (kwas trifluorooctowy). Rozbicie koniugatu sprawdzano elektroforetycznie. Produkty powstałe w wyniku tej reakcji analizuje się w żelu poliakryloamidowym po elektroforezie.

K. Sposób wyodrębniania domeny podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu za pomocą HPLC.

Fragment polipeptydowy odpowiadający domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu izoluje się z hydrolizatu otrzymanego w sposób jak opisano w punkcie H za pomocą HPLC. Rodział chromatograficzny przeprowadzono na kolumnie semipreparatywnej TSK G3000SW firmy LKB, Szwecja.

Etap 2.

A. Otrzymanie przeciwcńał.

W celu otrzymania surowicy poliklonalnej dla fragmentu białka ludzkiego t-PA immunizuje się tym białkiem króliki. Śródskórnie podaje się na drodze 30-40 iniekcji dawki 50 pg antygenu w 0.5 ml PBS i wymieszanego z 0.5 ml kompletnego adiuwantu Freuda. Po 7 dniach od każdego

164 564 szczepienia pobiera się krew z żyły usznej królików. Po wykrzepieniu w temperaturze 37°C przez 0.5-1.0 godziny, skrzep oddziela się od ścianek probówki i całość pozostawia w temperaturze 4°C na 12-24 godziny. Następnie surowicę odciąga się do jałowych probówek wirówkowych i wiruje przy 3 000 obr/min przez 20 minut. Surowicę inaktywuje się podczas inkubacji przez 30 minut w temperaturze 56°C. Miano poszczególnych próbek surowic określa się metodą radidimmunologiczną, oznaczając ich zdolność do wiązania znakowanego antygenu. Surowice o najwyższym mianie przeciwciał przechowuje się w temperaturze -20°C.

B. Oczyszczanie przeciwciał i ich skoniugowanie z preoksydazą.

Przeciwciała dla fragmentu t-PA oczyszcza się z surowicy odpornościowej za pomocą chromatografii powinowactwa. Immunoadsorbent zawiera fragment białka t-PA związany ze złożem CNBr-Sepharose 4B (Pharmacia). W celu przygotowania immunoadsoerbentu ' 1 g złoża przemywa się 200 ml roztworu 0.001 mol/l HCl i następnie zawiesza w buforze boranowym (pH 8.3). Natychmiast dodaje się 20 mg fragmentu białka t-PA rozpuszczonego w PBS i delikatnie miesza w temperaturze 4°C przez 2 godziny. Po odwirowaniu sprawdza się stężenie białka w supernatancie. Złoże zawiesza się następnie w roztworze glicyny (2 mol/l) w buforze boranowym o pH 8.3. Po 1-godzinnej inkubacji odwirowuje się je (10 mim. 4 000 obr/min) i przemywa się je 3 X buforem boranowym (pH 8.3), 1 X wodą destylowaną, 3 X buforem boranowym (pH 8.3). Z otrzymanym w ten sposób złożem inkubuje się 15 ml surowicy otrzymanej po immunizacji fragmentem białka t-PA, delikatnie mieszając przez 12-14 godzin w temperaturze 4°C. Do mieszaniny dodaje się 1 mM PMSF (Sigma) oraz 1 mM chlorku benzamidyny (Biochemical). Po odwirowaniu (10 min., 3 000 obr/min) złoże przemywa się buforem (PBS z 1% Tween 20), a następnie 4 X buforem (1 M/1 NaCl z 1% Tween 20 w PBS). Po każdym wirowaniu sprawdza się zawartość białek w supernatancie poprzez pomiar adsorpcji światła przy 280 nm. Następnie złoże umieszcza się w kolumnie (0.7 X 10 cm). Przeciwciała specyficznie związane z unieruchomionym na złożu białkiem eluuje się roztworem 0.5 mol/l kwasu octowego i zbiera się do probówek zawierających 100 pl roztworu 2 mol/l Tris. Frakcje o dużej zawartości białka łączy się i dializuje wobec PBS przez 24 godziny w 4°C.

C. Sprzęganie przeciwciał z peroksydazą.

Uzyskane w ten sposób przeciwciała dla fragmentu białka t-PA sprzęga się z peroksydazą. W tym celu rozpuszcza się 5 mg HRPO w 1ml świeżo przygotowanego 0,3 M kwaśnego węglanu sodu (NaHCOs), pH 8.1. Następnie dodaje się 0,1 ml 1% FDNB w alkoholu absolutnym. Delikatnie wytrząsa się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dodaje 0.04-0.08 M NaJO4 (rozpuszcz. w wodzie destyl.), delikatnie miesza przez 30 min. w temperaturze pokojowej. Kolor tego roztworu winien stać się zielonożółty. Następnie dodaje się 1.0 ml 0.16M glikolu etylenowego (rozp. w wodzie dest.) i delikatnie miesza w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po zakończeniu inkubacji roztwór dializuje się wobec 0.01M węglanu sodu, pH 9.5, temperatura 4°C (co najmniej 3 Mitrowe zmiany). Do 3 ml roztworu tak przygotowanego aldehydu peroksydazy (HRPO) dodaje się 5 mg IgG i delikatnie miesza przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej. IgG rozpuszcza się w 1 ml buforu węglanowego przed zmieszaniem lub dodaje w postaci zliofilizewanegd proszku wolnego od soli. Po dodaniu IgG wprowadza się 5 mg NaBH4 i pozostawia w 4°C od 3 do 12 godzin. Następnie roztwór dializuje się w 4°C wobec PBS. Jeśli powstaje precypitat, usuwa się go przez wirowanie. Próbkę nanosi się na kolumnę (85 X 1.5 cm), sephadex G-100, zrównoważoną PBS. Zbiera się frakcje po 1.5 ml i poziom białka w poszczególnych frakcjach oznacza spektrofotometrycznie. Frakcja IgG znakowanych HRPO schodzi w pierwszym szczycie. Roztwory tego koniugatu przechowuje się w obecności albuminy surowicy wołowej o stężeniu 10 mg/ml w temperaturze -20°C.

Etap 3.

Detekcja antygenu t-PA w badanej próbce za pomocą przeciwciał dla fragmentu polipeptydowego odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu.

Do roztworu antygenu w badanej próbce dodaje się wyznakowane peroksydazą przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu i inkubuje się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Do wywołania reakcji enzymatycznej stosuje się roztwór substratu - ortofenylodiaminę w 0.05 M

164 564 buforze cytrynianowym, pH 5.0, zawierającym 0.02% H2O2. Po 15 min. inkubacji pojawia się zabarwienie i reakcję hamuje się przez dodanie 3 M kwasu siarkowego. Adsorbancję mierzy się przy 492 nm. Wynik odczytuje się z krzywej wzorcowej wykreślonej dla standardowego roztworu t-PA.

Przykład II.

Wykonanie testu ELISA typu „kanapkowego przy wykorzystaniu przeciwciał wytworzonych sposobem według wynalazku.

Studzienki w płytce do testu ELISA (firmy Plastomed) opłaszcza się przeciwciałami poliklonalnymi dla fragmentu polipeptydowego odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu o stężeniu 10pg/ml, zawieszonymi w 50 mM buforze fosforanowym o pH 7.5. Niezwiązane białko odmywa się, a powierzchnię studzienek opłaszcza albuminą surowiczą. Testowane próbki osocza rozcieńcza się przed oznaczeniem 50 mM buforem fosforanowym, pH 7.5, zawierającym 0.15 M NaCl, 10 mM EDTA, 1% Tween 20 i 1% BSA i dodaje się po 200pl/dołek. Inkubuje się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji płytki 5-krotnie przemywa się 0.15 M NaCl zawierającym 0.1% Tween 20. Następnie dodaje 200pl koniugatu IgG-HRP (przeciwciała poliklonalne dla t-PA związane z preoksydazą) o stężeniu 5 pg/ml. Inkubuje 2 godziny w temperaturze pokojowej i ponownie 5-krotnie przemywa. W celu wywołania reakcji enzymatycznej dodaje się po 200pl roztworu substratu (0.4 mg/ml ortofenylodiaminy w 0.05 M buforze cytrynianowym, pH 5.0, zawierającym 0.02% H 2O2). Po 15 minutach inkubacji pojawia się zabarwienie i reakcję hamuje się przez dodanie 50 pl 3 M kwasu siarkowego. Adsorbancję mierzy się przy 492 nm. Wynik odczytuje się z krzywej wzorcowej wykreślonej dla standardowego roztworu t-PA w analogiczny sposób jak wyżej.

Przykład III.

Zastosowanie fragmentu polipeptydowego odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, do oznaczania poziomu przeciwciał otrzymanych sposobem według wynalazku dla t-PA w badanej próbce.

Fragment polipeptydowy odpowiadający domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu znakuje się izotopem jodu ^12eJ. Do 100pl radioznakowanego ligandu (ok. 60 000 cpm) dodaje się 100 pl badanej próbki (np. rozcieńczonej surowicy) i inkubuje się 12-16 godzin w 4°C. Następnie dodaje się 100pl badanej próbki (np. rozcieńczonej surowicy) i inkubuje się 12-16 godzin w 4°C. Następnie dodaje się przeciwciała przeciwimmunoglobulinowe (np. IgG królicze przeciw igG ludzkim). Po 2-godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej zwirowuje się immunoprecypitat i przemywa się zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej . Radioaktywność osadów mierzy się licznikiem gamma. Poziom przeciwciał dla t-PA odczytuje się na podstawie radioaktywności z krzywej wzorcowej dla standardowych przeciwciał dla t-PA w sposób analogiczny jak wyżej opisany.

Przykład IV. Zestaw testowy dla oznaczania poziomu ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu składa się z: pojemnika zawierającego zbuforowany roztwór soli fizjologicznej (PBS), pH 7.5, EDTA, Tween 20; pojemniczka z albuminą surowiczą; pojemniczka z przeciwciałami dla fragmentu polipeptydowego odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu; pojemniczka z wyznakowanymi peroksydazą przeciwciałami dla t-PA; pojemniczka z substratem (ortofenylodiąminą); pojemniczka z buforem cytrynianowym, pH 5.0 i pojemniczka z 3 M kwasem sialowym.

16-4564

Beta-galaktozydaza: białko t-Pa

produkty degradacji polipeptyd (EGF - trPA) beta - galaktozydazy

oczyszczanie produktów hydrolizy

Fig.5

164 564

Fig. 4

164 564

EcoRI

Hind III

Fig. 3

164 564 aattcatgagtcaggatccggicaaaagttgcagcgaaccacgatgtttcaacggagga

G1 AC1CAGTCCTAGGCCAGTTTTCAACGTCGCT TGGTGCTACAAAGTTGCCTCCT

ACCTGCCAGCAGGCACTGTAGTTCTCAGATT TCG1GTGCCAGTGTCCAGAAGGATTTGC TGGACGGTCGTCCGTGACATGAAGAGTCTAAAGCACACGGTCACAGGTCTTCCTAAACG tggaaaatgttgtgaaatagatciggagagtcagggataata agcttttacaacactttatctagaccictcagtccctattattcga

3* 5·

1. gtactcagtcctaggccag

2. TTTTCAACGTCGCT dolna nić

3. TGGTGCTACAAAGTTCCCTC

4. cttggacggtcgtc

5. CGTGACATGAAGAGTCTAAA

6. gcacacggtcacag

7. GTCTTCCTAAAC6ACCTTTTA

8- CAACACTTTATCTA6

9. acctctcagtgcctattattcga

Ί0. ataatagggactgaca

11. CGTCTAGATAAAGTGTTGTAA górna nic

12. AAGGTCGTTTAGGAA

13. GACCTGTGACCGTGTGCTTT

14. AGACTCTTCATGTC

15. ACCGACGACCGTCCAAGGAG

16. GCAACTTTGTAGCA

17. CCAAGCGACGTTGAAAACTG

18. GCCTAGGACTGAGTACTTAA

Fig.2

F ώ

i£

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 10 000 zł

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych reagujących specyficznie z białkiem ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, przez immunizację zwierząt, znamienny tym, że do immunizacji stosuje się polipeptyd odpowiadający domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, pobiera się krew i izoluje przeciwciała.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd o sekwencji:

   Pro-Val-Lys-Ser-Cys-Ser-Glu-Pro-Arg-Cys-Phe-Asn-GIy-Gly-ThrCys-Gln-Gln-Ala-Leu-Tyr-Phe-Ser-Asp-Phe-Val-Cys-Gln-Cys-ProGlu-Gly-Phe-Ala-Gly-Lys-Cys-Cys-Glu-Ile-Asp
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd otrzymany przez ekspresję zrekombinowanego DNA.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się zsyntetyzowany chemicznie DNA o sekwencji:

   (X)nCCGGTCAAAAGTTGCAGCGAACCACGATGTTTCAACGGAGGA

   ACCTGCCAGCAGGCACTGTACTTCTCAGATTTCGTGTGCCAGTGT

   CCAGAAGGATTTGCTGGAAAATGTTGTGAAATAGAT(y)n, gdzie X oznacza AATTCATGAGTCAGGAT, Y oznacza CTGGAGAGTCAGGGATAATAAGCT, a n przyjmuje wartość 1 lub 0.