JPH02117699A - ユニークなエラスターゼ誘発フイブリノーゲン切断部位抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト白血球プロテイナーゼ、特にエラスターゼは肺気腫
、慢性気管支炎、嚢胞性線維症、気管支拡張症、象、性
呼吸困難症候群、関節炎、糸球体腎炎、乾齋、脈管炎及
びアテローム性動脈硬化症を含む種々の結合組織破壊疾
患の発病に関係している、ヤノフ（Ｊａｎｏｆｆ）アン
、シブ。メト、（Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、　Ｍｅｄ、）第３６巻、２０７〜２１６頁（１
９８５年）。

またエラスターゼは他の肺疾患例えばＰｉＺＺ気腫、乳
児の呼吸困難症候群及び骨髄性白血病及び痛風に関係し
ている。中性ｐＨで活性なセリンブロテイナーゼである
エラスターゼは多形核白血球のアズール顆粒や一時的な
単核白血球のりソソームに貯えられる。本明細書中で用
いられるエラスターゼは白血球由来のエラスターゼとし
て定義される。本明細書中で用いられる白血球は、好中
球、マクロファージ及び単球を含む。細胞エラスターゼ
は細胞が食作用される物質に出合うか細胞自己消化する
とき＆ＩＩｍ中に放出される、上記ヤノフ。

この放出されたエラスターゼが内在結合組繊基質例えば
エラスチン・プロテオグリカン■及び■型コラーゲン及
びフィブリノーゲンに出会うとき組織の病変が生ずる、
ヤノフ、Ａｍ、　Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐｉｒ。

Ｄｉｓ、　　第１３２巻、４１７〜４３３頁（１９８５
年）。結合組織成分のほかにヒト白血球エラスターゼは
イムノグロブリン・フィブリン、フィブリノーゲン及び
補体タンパク質を含む種々の血漿タンパク質を加水分解
することができる。

細胞外ヒト好中球エラスターゼ（ＨＬ　Ｅ）活性は、循
環又は局所的に生産されるエラスターゼ阻害剤によって
制御される。循環エラスターゼ阻害剤はα−１−プロテ
ィナーゼ及びα−２−マクログロブリンを含む。α−１
−プロティナーゼ阻害剤は内在エラスターゼ活性の最も
効果のある調節剤であり、他の基質に作用することがで
きないのでエラスターゼと複合して酵素活性を遮断する
。

その時酵素阻害剤複合体は組織から除去される。

ヤノファン、レプ、メト、第３６８２０７〜２１６頁（
１９８５年）。

またエラスターゼ及び他の白血球関連ブロティナーゼは
フィブリノーゲンとフィブリンの溶解に関与するほかの
繊維素溶解経路にも関係している、ブロク、Ｊ、　Ｃｌ
１ｎ　Ｉｎｖｅｓｔ、第６９巻、５６４〜５７２頁（１
９８２年）。繊維素溶解活性は、血栓の減少に於て生理
的に重要であるが血液凝固に関係した病変症状を生ずる
、ワイプ等（Ｗｅｉｔｚ　ｅｔａｌ、）ジェー、タリン
、インベスト、（Ｊ、Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ）第７８巻、１５５〜１６２頁（１９８６
年）。

生理的及び病理的状態の両方に於て白血球エラスターゼ
の役割を充分理解することは、天然基質例えばヒトフィ
ブリノーゲンによって試験管内で酵素活性を検出するた
めの速かな能率のよい信頼できる分析が無く、妨げられ
ていた。放出ＨＬ　Ｅの酵素活性を直接測定することは
、放出酵素が急速に基質又は血清プロテイナーゼ阻害剤
に結合するために困難である。結合酵素は、速かに循環
から除去することができる、キャンベル等、ブロク。

ナトル、アカド、サイ、　　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ
　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、）米国第７９巻、６９４１〜６９５５頁（１９
８２年）、カブラン及び二−ルセンジェーバイオル、ケ
ム、（Ｊ、旧ｏｆ、ＣｈｅＩＩ＋、）第２５４巻。

７３２９〜７３３５頁（１９７９年）。放出酵素のイム
ノアッセイ分析、プロウ、ジェー、タリン。

インベスト、第６９巻、５６４〜５７２頁（１９８２年
）は、遊離酵素と阻害剤に結合した酵素を識別すること
ができず、酵素−阻害剤複合体の分析、ブロワ−及びバ
ーペル、ブランド第　６１巻、８４２〜８４９頁（１９
８３年）は失活酵素のみを検出する欠点がある。

生理液中で酵素的に活性な）ｒＬＥを直接検出すること
は信頼できていないためにＨＬＢ切断生成物の検出に依
存するほかの検定方法が計画された。

これらの方法の２つは標識としてエラスチンのエラスタ
ーゼ切断産物を使用している。１つの方法は、尿デスモ
シン、即ちエラスチンの主要な架橋アミノ酸をラジオイ
ムノアッセイキング等、コネクト、ティッシュ　レス、
　（Ｃｏｎｎｅｃｔ、　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｒｅｓ、）第７
巻、２６３〜２６７頁（１９８６年）及びバレル等、ア
ム、レブ、レスプ、ディス、（Ａｍ。

Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐ、　Ｄｉｓ、）第１２２巻、７６９
〜７７３頁（１９８０年）で測定した。健康体の人と慢
性肺疾患の患者間に矛盾のない差異は見られていない、
ベルハム等、アム、レブ、レスプ、ディス、第１３２巻
、８２１〜８２３頁（１９８５年）。同様の結果は、肺
疾患患者と正常な対照の血清のエラスターゼ発生エラス
チン由来ペプチドのＥＬＩＳＡ測定法を用いて報告され
ている、ドックマン等、アム、レブ、レスプ、ディス第
１３３巻、ＡＣ３頁（１９８６年）。

プラスミン生成フィブリノーゲン分解産物（ＦＤＰ）を
検出するために計画された検定は、フィブリノーゲン切
断産物を検出するために使用される。初期の検定にはヒ
トフィブリノーゲンをヒトプラスミンにより室温で１２
〜３６時間消化させて調製したヒ）ＦＤＰと反応性の抗
体が利用された、米国特許第３．９１２，８０５号。こ
の抗体は赤血球に付着し受身凝集検定で使用されてＦＤ
Ｐを検出する。精製ＦＤＰフラグメント例えばフラグメ
ントＤ及びＥもまたフィブリノーゲン分解産物を同定定
量するために用いられていた、米国特許第４．０９０，
８４６号。検定は、間接法からなり、ヒト血清又は尿は
精製り及びＥフラグメントに対する抗血清と混合され、
ラテックスビーズに結合したＦＤＰをこれに添加する。

ほかのフィブリノーゲンフラグメントは血液中のフラグ
メントを検出するために使用することができる抗体を生
産するために用いられている。プラスミノーゲン由来フ
ラグメント例えばＦｇ−Ｅはチェノ及びシュロフ、トロ
ンポス、レス、　　（Ｔｈｒｏｍｂｏｓ、　Ｒｅｓ、）
第１６巻。

６０１〜６１５頁（１９７９年）に記述されており、フ
ラグメントに対する抗体はラジオイムノアッセイに使用
されて血漿中のフラグメントを検出する。

ＨＬＥを用いてヒトフィブリノーゲンを消化することに
より調製したフィブリノーゲン分解産物は、液体中のエ
ラスターゼ切断産物を評価する検定を開発するために使
用されている、ブロク等、ジュー。ラブ、タリフ。メト
、　　（Ｊ、Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｍｅｄ　、　）第１０２巻、８５８〜８６８頁（１９８
３年）。ヒトフィブリノーゲンはヒト白血球エラスター
ゼと１　：　５０　（Ｗ／Ｗ）の酵素：基質比で３７℃
に於て２４時間温浸されている。優勢なフラグメントは
分子量８０，０００のＤ−様フラグメントであり、Ｄｅ
と表わされる。このフラグメントに対する抗体は、自然
のままのフィブリノーゲンとプラスミン分解産物を用い
て吸着させた後ラジオイムノアッセイに於てＤｅの認識
能を保持した。プロウはこれがエラスターゼ分解産物に
よってのみ示されるエラスターゼ誘発新生抗原の認識を
意味することを示唆している。エラスターゼ分解産物を
正常な血漿に加えたとき、エラスターゼ誘発新生抗原は
ラジオイムノアッセイで量的に検出することができる。

フィブリノーゲン分解産物検定方法°の主な欠点は検定
される物質が操作上でのみ定義されることである。ＨＬ
Ｅ　（又はプラスミン）切断部位は充分にわかっていな
い。従って抗血清の特異性は厳密に探究することができ
ず、イムノアッセイで測定される生産物の正確な種類は
不明である。

フィブリノーゲンのトロンビン切断の生産物を検定する
ために計画されたイムノアッセイは数種類の動物で記述
されている。例えばラジオイムノアッセイはウシフィブ
リノーゲンＡα鎖のアミノ末端からペプチドＦ−ＣＢ１
ａを同定することが記述されている、トランスウェル等
エウロ、ジ工、バイオケム、（Ｅｕｒｏ、　Ｊ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、）第８８巻。

５６５〜５７１頁（１９７８年）。Ｆ−ＣＢ１のトロン
ビン切断は、２種のフラグメントフィブリノペプチドＡ
（残基１〜１９、ヒト残基ｌ〜１６に相当する）及びカ
ルボキシ末端フラグメントＴｈ２（残基２０〜５４、ヒ
ト残基１７〜５１に等しい）を生成した。

フィブリノペプチドＡ　（ＦＰＡ）はトロンビン切断に
よって放出され、フィブリノーゲン切断産物ＦＰＡの検
定に用いることができる抗体を生産するために使用され
ている。カンフイールド等、バイオケム、　　（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、）第１５巻、１２０３〜１２０９頁（１９７
６年）。ＦＰＡと反応性の抗体はヒトフィブリノーゲン
のヒトエラスターゼ切断産物を研究するために用いられ
た、ビレジキアン及びノッセル、ブラッド、第５０巻、
２１〜２８頁（１９７７年）。エラスターゼ分解産物は
、ＦＰＡに特異的なラジオイムノアッセイによって決定
されたトロンビン分解産物と異なることが見い出された
。エラスターゼ切断産物はＦＰＡよりわずかに大きく、
免疫学的手段によってＦＰＡと区別される。

ＦＰＡと特異的に反応性の抗体は、生体内でヒト白血球
エラスターゼ活性を評価するために用いられた、ワイプ
等、ジエー、クリン、インへスト。

第７１巻、１５５〜１６２頁（１９８６年）。ワイプは
白血球エラスターゼがフィブリノーゲンをエラスターゼ
活性の指標として用いることができるフィブリノペプチ
ドＡ含有フラグメントに切断することを見い出した。ヒ
ト白血球エラスターゼは、２１アミノ酸ペプチド、フィ
ブリノーゲンＡα１−２１形ヒトフィブリノーゲンのα
鎖のアミノ末端を切断する。この人α１−２１ペプチド
は全ＦＰＡペプチドを含む。ワイプ検定は、エラスター
ゼ切断産物を直接測定しないが、ヒトフィブリノーゲン
の正常なヒトトロンビン切断産物であるＦＰＡ、Ａα１
−１６を測定する。ブロムバック等、ネイチュア第２７
５頁、５０１〜５０５頁（１９７８年）。ワイプの２段
階ラジオイムノアッセイはヒトトロンビンで処理あるい
は処理されないエタノール処理された恐らく全部のフィ
ブリノーゲンが除去された新鮮なヒト血漿を使用する。

免疫反応性ＦＰＡ、Ａα１〜１６に於て処理されたトロ
ンビンと未処理試料との相違は、最初の試料に存在する
Ａα１〜２１の量による。この検定は、体液中のどのエ
ラスターゼ切断産物も直接測定せず、２段階方法を必要
とし、単一エラスターゼ切断産物であると思われるもの
を検出する。

本発明は、ヒトフィブリノーゲンの特異性ヒトエラスタ
ーゼ切断産物の１種以上を検出させる。

これは自然なままのタンパク質、他の部位に酵素的切断
を有する生産物又は切断ペプチドと関係する他のエピト
ープを有する生産物と交差反応しない切断部位のアミノ
又はカルボキシル末端と反応性の特異性抗体の使用によ
って達成される。検定方法は、特異性切断ペプチドの迅
速な再現性のある検出を考慮する１段階検定である。特
異性抗体は、切断部位に結合し、自然のままのフィブリ
ノーゲンタンパク質と反応しない。

従って本発明の目的は、ヒトフィブリノーゲンの主なヒ
ト白血球エラスターゼ（ＨＬ　Ｅ）切断産物と関係する
ペプチド抗原を提供することである。

他目的は、ユニークな抗原を合成し、それらを高分子量
担体タンパク質に特異的に結合させることである。更に
他の目的は、特異性抗原に対する単一特異性抗体を産生
ずることである。さらに他の目的は抗体特異性を決定す
るためにユニークなプローブを合成し、特異性抗体を検
出することである。ほかの目的は生体内又は試験管内で
エラスターゼ切断産物を決定するための簡単で迅速で且
つ能率のよい方法を提供することである。さらに他の目
的は、生体内でエラスターゼ活性を測定するためのキッ
トを提供することである。更に他の目的は全血試料中の
好中球又は単球からＨＬ　Ｅの放出を刺激し、イムノア
ンセイキットを用いて有効なＨＬＥ活性を監視してＨＬ
Ｅ切断産物であるペプチドの産生を測定することによっ
て溶液、組織抽出液又は生理液のエラスターゼ阻害能を
検定することである。本発明のこれらの及び他の目的は
、以下の記述から明らかになるであろう。

ヒトフィブリノーゲンのヒト白血球エラスターゼ切断部
位のアミノ及びカルボキシル末端と関係のある新規なペ
プチドが開示される。これらのペプチドに対して抗体が
生じ、これは酵素的切断部位の両側のわずかに５個のア
ミノ酸に特異的である。ペプチドと対応する抗体は生体
内エラスターゼ切断産物の迅速な決定のための新規な検
定に用いられる。この抗体は、自然のままのフィブリノ
ーゲン分子と又は他の部位で酵素的切断によって生産さ
れるペプチドと交差反応せずに切断部位ペプチドに特異
的である。エラスターゼ誘発フィブリノーゲン切断産物
を含む試料は、ヒト好中球エラスターゼ切断フィブリノ
ーゲンのカルボキシル又はアミノ末端のペプチドと関係
あるエピトープに特異的な抗体の１種以上と接触させ製
置される。

次いでこの試料を特異性抗体を生じさせるために用いら
れる抗原に相当する標識プローブ又は抗原と接触させる
。抗体結合プローブの量を定量し、無標識ペプチドの量
を標準曲線に比較して決定する。エラスターゼ阻害能の
欠乏が疑われる患者から得た全血試料を好中球からＨＬ
　Ｅを放出するアゴニストと接触させる。エラスターゼ
活性は特異性ＨＬＥ切断産物の産生を測定することによ
って検定される。

本発明は、自然のままのフィブリノーゲン分子内の時間
依存の主なヒト白血球エラスターゼ切断部位の同定に関
する。哺乳類フィブリノーゲンの構造は、当業界で既知
であり、ヒトフィブリノーゲンアミノ酸配列は、ドーリ
ットル　アン、エヌ。

ソイ６アカド、サイ、　　（Ａｎｎ、　Ｎ、Ｙ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、）第４０８巻、１３〜２６頁（１９８
３年）によって図式的に表わされている。ヒトフィブリ
ノーゲンＡα−５Ｂβ−及びｒ−８１４のアミノ酸配列
も当業界で既知であり、ヘンジエン等、アン、エヌ。

ワイ、アカド、サイ、第４０８巻、２８〜４３頁（１９
８３年）によって確認されている。酵素的切断部位はヒ
トフィブリノーゲン（シグマ）約２００ナノモルをＨＬ
Ｅ　（エラスチンプロダクツ）又は卓球エラスターゼ、
約１ナノキルと約３７℃で約０分から約２時間の範囲の
種々の時間反応させて決定される。この反応は、許容し
得る緩衝液、好ましくはトリス中でｐＨ約７．０に於て
最終容量約１．０ｍｔ！で行なわれる。各反応は、冷却
アルコール、好ましくは３℃のエタノールを添加するこ
とにより停止させ、約３℃で約２０分間製置される。

温置後懸濁液は約３℃で約２００ナノ３．０００　ｘｇ
で遠心分離される。上澄み液を集め、きれい・な・：試
“膜管に移し一、　５ｐｅｅｄ−Ｖａｃ中で約１６時間
；Ｗｍｍ１ｉ１．。

される、各試料は許容し得る高性能液°俸゛ダ台・“豪
：Ｆ′グラフィ（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）緩衝液、好ましく１・
氷・°：と：ｉア：′□セトニトリルの混合液で再構成
され、Ｃ−１８デュポン−ゾルバクスト（Ｄｕｐｏｎｔ
−Ｚｏｒｂａｘｔ）カラム、約０．４Ｘ２５Ｃ１１でク
ロマトグラフィ処理される。

ヘフチトハ約９５　：　５　：　０．２　Ｖ／Ｖ／Ｖ（
７）　ＨｚＯ：　７’セトニトリル：トリフルオロ酢酸
から約６０：４０：　０．２　Ｖ／Ｖ／Ｖの■２０ニア
セトニトリルニトリフルオロ酢酸までからなる線状勾配
で溶離される。ペプチドピークを集め、再びクロマトグ
ラフィ処理して純度を示し、アプライド　バイオ　シス
テムズ　プロティン　ペプチド　シークエンサー　モデ
ル（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ　ＰｅｐｔｉｄｅＳｅｑｕｅｎｃｅｒ、　Ｍｏｄ
ｅｌ）　　４７０　ＡによりＮ−末端アミノ酸配列解析
にかけられる。８本の主ピークを同定し、このアミノ酸
配列を使用してＨＬＥ切断部位が決定される。また１９
本の副アミノ酸のピークを同定し、副又は二次的ＨＬＥ
切断部位を同定するために使用することができる。主Ｈ
ＬＥ切断部位は以下の表に示される。

表　　１ ヒトフィブリノーゲンの主な一ト白血球エラスターゼ切
断部位 鎖 切断部位 Ａα ２１−一−・−−−・２２ Ｖａｌ　　　　Ｇｌｕ Ａα ３６０−・−３６１ Ｖａｌ　　　　Ｓｅｒ Ａα ４５０・−・・・４５１ Ｖａｌ　　　　ｌｉｅ Ａα ４６、ｔ−一一一・−４６５ Ｖａｌ　　　　Ｔｈｒ Ａα ４７６−・−−−−−４７７ Ｍｅｔ　　　　　Ａｓｐ Ａα ５６Ｂ−−・−５６９ Ｔｈｒ　　　　Ｓｅｒ Ｔｈｒ　　　　Ｓｅｒ ３４７−−−−・・−３４８ Ｖａｌ　　　　Ｔｙｒ γ ３５７−−−−−−・−３５８ Ａｌａ　　　　Ｓｅｒ ヒトフィブリノーゲンの特異性エラスターゼ切断部位を
知ることにより、主切断産物のアミノ及びカルボキシル
末端に対応するアミノ酸の長さの異なる抗原ペプチド及
びペプチドプローブを合成させる。本明細書中で用いら
れる抗原ペプチドは抗原に対して生じた特異性抗体と組
み合わせ又は結合することができるかあるいは抗原と反
応する抗体の生・成を誘発することができるペプチドを
示す。抗原ペプチドとペプチドプローブの好ましい実施
態様は記述した酵素切断部位のカルボキシルあるいはア
ミノ側に最初の１５個のアミノ酸を含むがこれに限定さ
れない。本発明の実施態様が約５個のアミノ酸から約２
５個のアミノ酸まで、又はこれ以上の長さの範囲のペプ
チドを含むことは理解されるべきである。本明、細書で
示される全アミノ酸配列は、ヘンジエン等アン、エヌ、
ワイ、アカド、サイ、第４０８巻、２８〜４３頁（１９
８３年）に５よ、って表わされる図式に従ってアミノ末
端からカル、ボ１、キシル、末端まで番号がつけられる
。代表的−一辱、−＼ト（４ なカルボキシル末端抗原ペプチド及びプローブペプチド
アミノ酸配列は次の表に示される。

表２ カルボキシル末端抗原ペプチド Ａα鎖 １、Ａｓｐ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ
　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ　　Ｖａｌ　　Ａｒｇ
　　Ｇｌｙ　　Ｐｒｏ　　Ａｒｇ　　Ｖａｌ　　Ｖａ１
２、Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｙ　　Ｓｅｒ
　　Ａｌａ　　Ｇｌｙ　　Ｈｉｓ　　Ｔｒｐ　　Ｔｈｒ
　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｖａ１
３、　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｓｅ
ｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ
　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｔ４、　Ｖａｔ　ｌｌｅ　Ｇｌ
ｙ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ
　Ｖａｔ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｖａ１５
、　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ
　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　
Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｍｅｔ５５４−　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　、、　　、．５６８６、　Ａ
ｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｙ
ｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ
　Ｓｅｒ　Ｔｈｒγ鎖 １、Ａｓｐ　　Ｇｌｙ　　Ｐｈｅ　　Ａｓｐ　　Ｐｈｃ
ｉ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｐ　　Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ｓｅ
ｒ　　Ａｓｐ　　Ｌｙｓ　　Ｐｈｅ　　Ｐｈｅ　　Ｔｈ
ｒ２、　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　（Ｔｒｐ）” Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｇ
ｌｙ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｖａ１本暫定
的なアミノ酸 抗原ペプチドとペプチドプローブの特異性は、酵素切断
部位のアミノ又はカルボキシル末端に直接隣接したエピ
トープによって決定される。本明細書中で用いられるエ
ピトープは既知構造、アミノ酸配列の抗原行列式部位を
示し、これは、抗原の特異性に関与し、エピトープを含
む抗原に対して生ずる抗体と特異的に反応することがで
きる。エピトープの好ましい実施態様は記述した酵素的
切断部位のカルボキシルあるいはアミノ側に最初の５個
のアミノ酸を含むがこれに限定されない。代表的なカル
ボキシル末端エピトープアミノ酸配列は次の表に示され
る。

犬−主 カルボキシル末端エピトープペプチド Ａα鎮　　　　　　γ鎖 １、　　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　　
　　　　１．Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ
２゜ Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ３゜ Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ４゜ Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ５゜ Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｍｅｔ６゜ Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ２、　　Ｈｉ
ｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ３゜ Ｔｈｒ　　Ｔｙｒ　　Ｓｅｒ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ代表
的なアミノ末端抗原ペプチドとプローブペプチドアミノ
酸配列は次の表で示される。

表４ ７ミノ末端抗原ペプチド Ａα鎖 １、Ｇｌｕ　　Ａｒｇ　　Ｈｉｓ　　Ｇｌｎ　　Ｓｅｒ
　　Ａｌａ　　Ｃｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｐ　　Ｓｅｒ
　　Ａｓｐ　　Ｔｒｐ　　Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ　　Ｃｙｓ
２、　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌ
ｎ　Ｔｒｐ　ｌ１ｉｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌ
ｙ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ３、　Ｔｉｅ　Ｇｌｙ　Ｐ
ｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　ｌ１ｉｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｖ
ａｔ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔｈ
ｒ４、　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｐ　　
Ｇａｙ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｐ　　Ｃｙｓ　　Ｐｒｏ　　
Ｇｌｕ　　Ａｌａ　　Ｍｅｔ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　　
Ｇｌｙ５、Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ｔｈｒ　　
Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｉｌｅ　　Ｇｌｙ　　
Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｙ　　Ｐｈｅ　　
Ａｒｇ６、　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ
　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　
Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓγ鎮 ７、Ｓｅｒ　　Ｈｉｓ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｙ　　Ｍｅｔ
　　Ｇｉｎ　　Ｐｈｅ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｔｒｐ
　　Ａｓｐ　　Ａｓｎ　　Ａｓｐ　　Ａｓｎ　　Ａｓｐ
８、　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈ
ｒ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ
　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ９、　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒ
ｏ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ
　ｒｌｅ　ｌ１ｅ（Ｔｒｐ）”本暫定的なアミノ酸 Ａｌａ　Ｔｈｒ　（Ｔｒｐ）” １． ２゜ ３゜ ４゜ ５゜ ６゜ 代表的なアミノ末端エピトープアミノ酸配列は次の表に
示される。

表５ アミノ末端エピトープ−５個のアミノ酸Ａα鎖 Ｇｌｕ　　Ａｒｇ　　ｌ１ｉｓ　　Ｇｉｎ　　Ｓｅｒ■
。

γ　鎖 Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ＭｅｔＳｅｒ　Ｇｌ
ｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ１１ｅ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　
Ａｓｐ　ＧｌｙＴｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌ
ｙＡｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ２゜ ３゜ Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ３５８　　　
　　　、　　　３６２ Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　ＧｌｙＳｅｒ　Ｔｙ
ｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ上記の同定記述したペプチ
ドはエラスターゼ切断産物のユニークなアミノ酸配列と
特異的に反応する抗体を産生ずる抗原として使用される
。また新規なペプチドは体液中の抗血清力価を定量する
ための特異性プローベ又は抗原としても用いられる。種
々のペプチドは、この種々のペプチドに対して調製され
たユニークな抗体の特異性を評価するために特異性ペプ
チドとして使用することができる。

免疫原は動物に於て抗体合成を誘発することができる免
疫原性担体分子に個々の抗原ペプチド又は個々のエビト
ープペプチド又は該エピトープを含むあらゆるペプチド
を付着させることによって調製される。免疫原は、本明
細書中では動物に導入された場合特異性抗原又はエピト
ープと反応性の抗体の産生を刺激する充分なサイズの物
質として定義される。免疫原性担体は本明細書中では、
抗原又はエピトープを試験管内で結合させ、免疫応答を
刺激することができる抗原又はエピトープにするタンパ
ク質又は他の高分子量化合物として定義される。特異性
アミノ酸エピトープを含むペプチドは本明細書中で抗原
ペプチドと呼ばれる。

抗原ペプチドは、表２、表３、表４、表５に示されるペ
プチドを含むがこれに限定されない。本発明の実施態様
は、抗体生成の直接刺激薬として免疫担体を添加せずに
又は他の化学変性せずに定義されたエピトープ及び抗原
を使用することを含むは理解されるべきである。

本発明のペプチド抗原は、適当なペプチド合成手法、例
えばマリフィールド、ジェー、アム、ケム、ツク、第８
５巻、２１４９〜２１５４頁の方法に従う固相ペプチド
合成化学を用いて合成することができる。カルボキシル
基で終わるペプチドは標準マリフィールド樹脂で合成さ
れる。アミド基で終わるペプチドは４−メチルベンズヒ
ドリルアミン樹脂で合成される。この樹脂がら得たＣ末
端アミノ酸残基のフン化水素酸切断はアミド末端を含む
ペプチドを生じる。この方法は当業界で既知である。リ
ンキングアミノ酸例えばシスティンは、免疫原性担体に
カップリングを促進する遊離スルヒドリル基を与えるた
めに必要があれば抗原ペプチドのアミノあるいはカルボ
キシル末端に合成中あるいは合成後化学的に添加される
。リンキングアミノ酸は反応されるタンパク質分解切断
部位が残っている担体タンパク質に付着させるためにペ
プチド配列の切断部位から反応の末端に付加される０分
子内標識例えばノルロイシンもまた担体に結合したペプ
チド分子の数を求めるために抗原ペプチドの合成中に加
えることができる。ノルロイシンは天然タンパク質の標
準のアミノ酸成分でないために好ましい。合成されたペ
プチドは、分取用逆相高、性能液体クロマトグラフィ　
（ＨＰＬＣ）によって精製され、同定及び純度は当業界
で既知の手法、ファーストアトムボンバードメント（Ｆ
ＡＢ）質量分析及びアミノ酸分析によって決定される。

抗原ペプチドは高分子量担体タンパク質に共有結合で結
合され、このタンパク質にはウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、ウシチログロブリン（Ｂ　Ｔ）、キーホールリン
ペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、オバルブミン（ＯＡ）
等を含み、ＢＳＡ及びＢＴが好ましいがこれに限定され
ない。抗原ペプチドは、マレイミド−ＮＨ５−エステル
へテロ三官能性カップリング試薬によってリンキングア
ミノ酸、システィンに結合され、この試薬には、ｍ−マ
レイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル（ＭＳＢ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−スルホ
スクシンイミドエステル（Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ）、スク
シンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキ
サン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）スルホスクシ
ンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサ
ン−１−カルホキシレー）　（Ｓｕｌｆ−ＳＭＣＣ）、
スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチ
レート、（ＳＭＰＢ）、スルホスクシンイミジル４−（
ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、（Ｓｕｌｆ−Ｓ
ＭＰＢ）、を含み、ＭＢＳ及びＳｕｌｆｏ−ＭＢＳ　、
が好ましいがこれに限定されない。担体タンパク質、一
般にはＢＳＡ又はＢＴは、約１０■を約ｐＨ７、２５の
約１００１リン酸塩（に゛）緩衝成約２．５ｍｊｌ！に
溶解することによって調製される。カップリング過程で
用いられる緩衝液は全て使用前に徹底的に脱気されなけ
ればならない。この溶解した担体にカップリング試薬約
５■を加え、この溶液は１５〜３０分間撹拌される。

活性タンパク質担体はセファデックスゲルはとんどＧ２
５ＰＤ１０予め充填したカラム（ファルマシア）を用い
てサイズ排除クロマトグラフィーによって精製される。

活性担体は、担体−ペプチド結合のために約６μモルの
精製凍結乾燥ペプチドに入れた約１００ｍＭリン酸塩（
Ｋ゛）緩衝液、ｐＨ約５．８の約３．５ｍｌで溶離され
る。この混合液を約４°Ｃで一晩維持し、架橋ペプチド
をセファデックスゲルはとんどＧ２５（ファルマシア）
を用いるサイズ排除クロマトグラフィー又は透析によっ
て精製され、凍結乾燥される。

抗原ペプチド−担体結合体は担体の各分子に結合したペ
プチドの分子の数を測定するために解析される。ペプチ
ド−担体結合体約０．５■の試料は、ＨＣｌを真空中で
約２４時間一定に沸騰させて約１１０°Ｃに維持した約
６．ＯＮｌｌＣｆ約１　ｍｌで加水分解される。この加
水分解物中担体に結合した各ペプチド分子に対してノル
ロイシン分子は１個である。１５アミノ酸ペプチドある
いは５アミノ酸ペプチドを含む適当な免疫原は、担体１
モル□に対して少なくとも５モルの抗原ペプチドを含む
ことになる。

抗原ペプチドに対する単一特異性抗体は、ペプチドと担
体の両方に反応性の抗体を含む哺乳類抗血清から精製さ
れるか又はコーラ−及びミルスティン、ネイチュア第２
５６巻、４９５〜４９７頁（１９７５年）の手法を用い
て特異性ペプチドのみと反応性の単クローン性抗体とし
て調製される。

本明細書中で使用される単一特異性抗体は適切なペプチ
ド抗原に対して均一な結合特性を有する１個の抗体種又
は複数の抗体種として定義される。

本明細書中で使用される均一結合は抗体種の特異性抗原
又はエピトープ例えば前述したヒトフィブリノーゲンの
ＨＬＥ切断部位と関係するものへの結合能を意味する。

ペプチド特異性抗体はマウス、ラット、モルモット、ウ
サギ、ヤギ、ウマのような動物で好ましくはウサギやモ
ルモットに適当な濃度の特異性ペプチド−担体複合体で
免疫アジュバントを用いであるいは用いずに免疫するこ
とによって生じる。免疫前血清は初回免疫感作前に集め
られる。各動物は許容し得る免疫アジュバントと関係す
る単一ペプチドー担体複合体約５０〜３００■を受ける
。かかる許容し得るアジュバントはフロイント完全、フ
ロインド不完全、ミョウバン沈降物、コリネバクテリウ
ム　バルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａ
ｒｖｕｍ）とｔＲＮＡを含む油中水型エマルジョンを包
含するがこれに限定されない。初回免疫感作は、皮下あ
るいは皮肉で複数部位に於いて好ましくはフロイント完
全アジュバント中の特異性ペプチド−担体結合体からな
る。各動物は定期的に好ましくは毎週採血されて抗体価
を測定する。動物は初回免疫“感作に続いて追加注射を
受けてもあるいは受けなくてもよい。追加注射を受゛け
る動物は、フロインド不完全アジュバント中ペプチド−
担体結合体を同量、同じ経路で投与される。追加注射は
、約３週間毎に最大力価が得られるまで投与される。各
追加免疫の約７日後又は１回の免疫のほぼ１週間後に動
物を採血し、血清を集め、アリコートにし、約−２０℃
で貯蔵する。

表２．３．４及び５に示される通りヒト白血球エラスタ
ーゼ切断フィブリノーゲンのペプチド抗原と反応性の単
クローン性抗体（ｍＡｂ）は近交マウス好ましくはＢａ
１ｂ／Ｃを適当なペプチド−結合体で免疫して調製され
る。マウスを腹腔内又は皮下経路により約０．５＋ｗｊ
！の緩衝液又は食塩水を同量の許容し得るアジュバント
に混合した液中の特異性抗原ペプチド結合体約０．１〜
１０■、好ましくは約１■で免疫する。かかる許容し得
るアジュバントはフロイント完全、フロインド不完全、
ミョウバン沈降物、−コリネバクチリウムパルプム及び
ｔ−ＲＮｘを含む゛油中水型エマルジョンを含み、フロ
インド不完全アジュバント（ＩＦＡ）が好ましいがこれ
らに限定されない。マウスはθ日目に初回免疫感作を受
は約２４週間休止される。免疫したマウスは緩衝液例え
番にリン酸′班゛緩衝食塩水中の結合体又はペプチド約
１■の追加免疫を静脈内経路により投与される。追加免
疫の約３日後ペプチド抗体に対してマウスを試験する。

抗体陽性マウスからのリンパ球、好ましくは牌リンパ球
は、当業界で既知の標準方法によって免疫したマウスか
ら肺臓を取り除いて得られる。ハイブリドーマ細胞は、
牌リンパ球を適当な融合パートナ−と安定なハイブリド
ーマを生成させる条件下で混合して産生させる。融合パ
ートナ−にはマウス骨髄腫Ｐ３−ＮＳＩ−Ａｇ４−１、
ＭＰＣ−１１、Ｓ−１９４、ＮＳ、１及びＳ　ｐ　２　
／　Ｏを含み、Ｓ　ｐ　２　／　Ｏが好ましいがこれら
に限定されない。抗体産生細胞及び骨髄腫細胞は、分子
量約１０００のポリエチレングリコール巾約３０〜５０
％の濃度で融合される。融合ハイブリドーマ細胞は当業
界で既知の方法によってヒボキサンチン、チミジン及び
アミノプテリン補足ダルベツコ修飾イーグル培地（ＤＭ
ＥＭ）の増殖により選択される。約１４．１８．２１日
に増殖陽性ウェルから上澄みを集め、抗原として特異性
ペプチド抗原を用いて固相イムノラジオアッセイ　（Ｓ
ＰＩＲＡ）により抗体産生をふるい分ける。また培養の
上澄みをオクテルロニ沈降検定で試験してｍＡｂのイソ
タイプを決定する。

抗体陽性ウェルからの細胞はマクファーソン、ソフト　
アガール　テクニックス、ティシュカルチュア　メソッ
ズ　アンド　アプリケーション、クルセ及びパターソン
、アカデミツクプレス編集１９７３年の手法によって軟
寒天でクローン化される。

単クローン抗体は、ブリスタン感作ＢＡＬＢ／Ｃマウス
、マウス１匹につき約０．５ｍｊ！に約２×１０６〜６
Ｘ１０’ハイブリドーマ細胞を感作の約４日後に注入し
て生体内で産生される。腹水を約８〜１２日に集め、単
クローン性抗体を約３５〜６０％、好ましくは４５％飽
和の硫酸アンモニウムで沈降させ、水洗し、生理的に許
容し得る緩衝液、ｐＨ約７．２に再浮遊させる。かかる
生理的に許容し得る緩衝液にはリン酸塩緩衝食塩水、リ
ン酸塩緩衝食塩水グルコース、緩衝食塩水等を含むがこ
れらに限定されない。

抗ペプチドｍＡｂの試験管内産生は、約２％胎仔ウシ血
清を含むＤＭＥＭ中でハイブリドーマを増殖させて充分
な量を得ることによって行なわれる。

この試験管内産生ｍＡｂは腹水に対すると同じ方法によ
って精製さ杵る。更に単クローン性抗体は、４２９〜４
３６頁（１９７８年）の手法又は他の抗体イソタイプに
対するのと同様の手法を用いてアフィニティークロマト
グラフィーによって精製される。この精製型クローン性
抗体は、約ＩＭＩＪン酸塩緩衝液、ｐｌ＋約８．０で中
和され前述の通り貯蔵される。

動物血清又は単クローン性抗体の抗体価、抗体。

特異性、体液中の未知抗原の抗体特異性及び存在及び濃
度は、沈降、受身凝集、酵素結合免疫吸着剤（ＥＬＩＳ
Ａ）手法及びラジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）を含む
種々の血清学的又は免疫学的検定によって決定され、Ｒ
ＩＡが好ましい。力価は本明細書中で血清試料中の抗体
の濃度の尺度として定義される。一定血清試料の抗体価
は、抗原に対する抗体の親和性に関係する。血清学的又
は免疫学的検定は、特異性抗原又は抗体が検定に用られ
る混合物の特定成分又は既知物質の特定量を決定する方
法として定義される。各検定には適当な対照を含む。ｔ
Ａは緩衝食塩水、リン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝食塩水
、夕゛ルベソコのリン酸塩緩衝食塩水、ダルベツコのカ
ルシウム及びマグネシウムを含まない緩衝食塩水が含ま
れダルベツコのカルシウム及びマグネシウムを含まない
リン酸塩緩衝食塩水（ＧＩＢＣＯ）が好ましいが、これ
らに限定されない検定緩衝液中で行なわれる。この検定
緩衝液は、単独で又は好ましくは約０．１％ゼラチン、
約０．０１％チメラソル及び１．０　ｍＭエチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で補足して使用することができ
る。抗血清又は単クローン性抗体は検定緩衝液に希釈し
て抗体価定量に調製される。

開始希釈度は一般に１　：　　１．０００．１　：　　
５，０００及び１　：　１０．ＯＱＯである。

抗体結合及び力価定量に有用な抗原プローブは、特異性
エピトープを含む合成あるいは天然特異性抗原ペプチド
を包含する。抗原プローブとして用いられるペプチドは
、表２．３．４及び５に示される特異性アミノ酸エピト
ープ配列又はアミノ酸抗原配列及びその変形のみを含む
ことができ又はこれらは特異性抗原又はエピトープ配列
及び変形を含むフィブリノーゲンのＡα又はＴ鎖の長鎖
ペプチドユニットを包含することができる。また抗原プ
ローブは約２０〜３０個はどのアミノ酸を有する天然ペ
プチド又は合成ペプチドを包含することができるが特異
性抗原又はエピトープ配列も含んでいる。合成ペプチド
プローぺは前記メリフィールド手法によって産生される
。プローベは標識又はトレーサー例えば酵素、螢光染料
、放射性同位元素又はハプテンに容易に付着されるよう
に選択又は計画される。トレーサー又は標識は血清反応
を定量化させる。合成ペプチドは抗原プローブに標識を
カンブリングさせるＬ種以上の追加アミノ酸を含むよう
に計画される。本発明の実施態様には放射性同位元素が
好ましい標識又はトレーサーである。プローベペプチド
はトリチウム（３■）、■炭素Ｃ４Ｃ）、１′ヨウ素（
＋ｚｓ■）又は１３＋１で標識されＩ！１１が好ましい
。放射性ヨウ素化を促進するために各合成ペプチドは抗
原プローブに標識をカップリングさせるために自然配列
の一部であることができる１種以上のチロシン残基を含
むように計画される。放射性ヨウ素化はクロラミンＴ１
ヨードゲン又はラクトパーオキシダーゼ方法を用いて達
成され、クロラミンＴ方法が好ましい。標識プローベペ
プチドは逆相ＨＰＬＣ，サイズ排除クロマトグラフィー
又はイオン交換クロマトグラフィーによって精製され、
Ｔ（ＰＬＯが好ましい。

ペプチド１個当りの放射能の量は当業界で既知の方法に
よって決定される。

放射性プローベは検定緩衝液で希釈されて１アリコート
当り約１０，０００力ウント／分Ｃｃｐｍ）から約３０
．０００　ｃｐｍまで生成するが約２０，０００　ｃｐ
ｍが好ましい。適当な濃度の特異性プローブは希釈した
抗体と接触される。定量は全て２回の実験で行なわれる
。希釈抗体を標識プローブと接触させた後、混合物は４
℃で約１０〜２０時間製置される。

非抗体結合放射性プローブはクロマトグラフィー沈降、
免疫沈降又は吸着手法によって非結合プローベをデキス
トラン被覆活性炭に吸着させる手法が好ましく、反応混
合物から除去される。デキストラン被覆木炭は約３％（
Ｗ／Ｖ）の活性炭ＵＳＰを約０．２５％（Ｗ／Ｖ）デキ
ストラン、平均分子量約６０　、０００〜９０．０００
好ましくは平均分子量約７０．０００を含む１０ｍＭリ
ン酸塩緩衝液ｐＨ７，５に懸濁させて調製される。この
デキストラン−木炭混合物は一晩放置され、遠心分離で
沈降させ、前述のデキストラン含有リン酸塩緩衝液で１
回洗浄し、再び遠心分離される。デキストラン被覆活性
炭は、同じ緩衝液に３％濃度位まで再び懸濁させる。検
定に使用する直前にデキストラン被覆活性炭をダルベツ
コのＰＢＳで約１０倍に希釈し、遊離プローブを十分結
合する量を各試料に加える。氷水のスラリーに短時間製
置した後木炭を遠心分離で沈降させ、上澄み液を集め、
ガンマ計数管で計数される。

各検定は、全カウントの定量に対してＰＢＳの約ｌ　ｍ
Ｉｌを加える木炭を含まない対照及び非特異性結合の定
量に対して抗体を含まない対照を包含する。各抗血清希
釈度に於ける特異性結合％は、抗血清結合値から非特異
性結合値を引いた後１分当りの全カウントで割ることに
よって求められる。

また抗血清の感受性は血清学的検定によって定量され、
ＲＩＡが好ましい。この抗血清ば、約１５〜４０％の全
放射性プローブ好ましくは約２５％を結合するように適
当な緩衝液、例えば検定緩衝液に希釈される。同様の緩
衝液は全ての希釈に対して用いられる。特異性抗体に相
補性の適当なペプチド抗原は、適当な濃度まで検定緩衝
液で希釈され１検定アリコート当り約１ピコモル、約０
．１ピコモル、約０．Ｏｌピｈモルのペプチドを生成す
る。本明細書中で用いられる相補性は、抗エピトープ抗
体となるそのエピトープに対して特異的に生ずる抗体に
特異的に結合するエピト−プの特異性アミノ酸配列とし
て定義され゛る。特異性抗体に相補性の放射性プローブ
ｌ’２ｓ４−標識ベブチドは検定緩衝液で希釈さ゛れて
１検定アリコート当り約１０，０００　ｃｐｍを生成す
る。この検定は、非特異性結合の定量に対して抗体を含
まない試料、及びプローブ結合の制御レベルを定量する
ために無標識ペプチドを含まない抗体及びプローブを含
む対照を包含する。定量は全て２回の実験で行なわれる
。

希釈抗体を標識プローブと接触させた後、混合物は約４
℃で約ｌθ〜２０時間温間される。非結合プローブから
抗体結合放射性プローブはクロマトグラフィー、沈降、
免疫沈降又は吸着手法好ましくは前述の通り非結合プロ
ーブをデキストラン被覆木炭に吸着させて除去される。

希釈されたデキストラン被覆活性炭が各試料に加えられ
る。氷水のスラリー中で短時間温間した後、木炭を遠心
分離で沈降させ、上澄液を集め、ガンマ計数管で計数さ
れる。非標識ペプチドの存在は標識プローブの結合を阻
止する。阻止は非標識ペプチドの濃度が増大するにつれ
て増加する。各ペプチドレベルに於ける阻止程度は非標
識ペプチドが存在しないときに観察される特異性結合の
％とじて計算される。抗血清の感受性は、各抗血清に対
して特異性ペプチドの５０％阻止濃度（ＩＣ，。）を定
量した後、別の血清値と比較することによって比較され
る。本明細書中で用いられるＩＣ５６は、プローブ結合
の５０％阻止を生ずる・抗原濃度として定義される。

また個々の抗血清の感受性も前述の通り血清学的検定好
ましくはＲＩＡによって定量される。こ抗血清は、約１
５〜４０％の全放射性プローブ好ましくは約２５％を結
合する濃度まで適当な緩衝液例えば検定緩衝液で希釈さ
れる。種々の長さのプローベペプチドは、標識として抗
血清に相補性の特異性ペプチド抗原を包含するＡα又は
γ鎖のアミノ又はカルボキシル切断部位に隣接した少な
くとも５個のアミノ酸を含むことができ、検定緩衝液で
希釈されて検定アリコート巾約ＩＱ−１３〜１０−６モ
ルの範囲にある量を生成する。コントロールには特異性
エピトープを含まないプローブを包含する。特異性抗体
に相補性の１２Ｊ−標識ペプチドの放射性プローブは検
定緩衝液で希釈されてｌ槍定アリコート当りｓ、ｏｏｏ
〜２５，０００　ｃｐｍ、好ましくは１０，０００〜２
０．０００　ｃｐＩ！１を生成する。１検定中各反応物
の容量は約１〜１　ｍｌの範囲であることができ、約１
００＋ｃｊ７が好ましい。特異性は平衡検定あるいは非
平衡検定によって決定される。平衡検定では特異性プロ
ーブを希釈し、一定量の抗体と接触させ更に一定量の相
補性標識プローブと接触させ、約１０〜２０時間製置さ
れる。

非平衡検定では、特異性プローブを希釈し、一定量の抗
体と接触させ、約２〜２０−時間温置される。

最初の温置後、揮識プローブを加え、試料を約３０分か
ら約４時間２回目として温置される。平衡検定が好まし
い検定である。この検定には、非特異性結合を評価する
ために抗体を含まない対照及びプローブ結合の制御レベ
ルを決定するために非標識ペプチドを含まない抗体とプ
ローブを含む対照を包・含する。

抗体と特異性プローブを接触させ、次に標識プローブを
加えた後、混合物は約４℃で約１０〜２０分間製置され
る。抗体結合放射性プローブは非結合プローブから前述
の通り、クロマトグラフィー、沈降、免疫沈降又は吸着
手法、好ましくは非結合プローブをデキストラン被覆活
性炭に吸着させることによって分離される。氷水のスラ
リー中で短時間温間した後、木炭を遠心分離によって沈
降させ、抗体結合プローブを含む上澄み液を集め、ガン
マ計数管で計数される。手法の全ては当業界で既知であ
る。

プローブ結合の制御レベルが定量され、各濃度の特異性
プローブに於ける阻止程度は、特異性プローブのないと
きに観察される特異性結合％から計算される。各抗血清
の特異性は、標識プローベ結合の５０％阻止を生じる種
々の特異性プローブのレベルを比較することによって測
定される。特異性の高い抗血清に対して抗血清に相補性
の特異性抗血清より非常に高いレベルの特異性プローブ
が５０％阻止を生じるために必要とされる。

上述の通り、同定及び確認された単一特異性抗体は全血
又は他の体液腹腔液、喀痰又は気管支肺胞洗浄液中の相
補性エラスターゼ切断産物抗原又はエピトープの生成の
検定のために用いられる。

切断産物の検定は試料中の白血球エラスターゼの存在に
依存する。好ましいエラスターゼは好中球エラスターゼ
であるが本発明の実施態様は全白血球エラスターゼを包
含する。エラスターゼは、以下に述べられる通り、試料
液に存在する白血球から放出されるか又は、生長し得る
白血球を加えるか白血球抽出液又は精製エラスターゼを
加えることによって検定に添加することができる。疾病
症状は一般に何の液体試料がエラスターゼ切断産物の検
出に必要であるかを決定する。血液及び気管支肺胞洗浄
液が次の疾患症状、肺気腫、慢性気管支炎、嚢胞性線維
症、慢性閉鎖肺疾患、気管支拡張症、成人の呼吸困難症
候群、骨髄性白血病及び乳児呼吸困難症候群に対して好
ましい液体である。

血液及び滑液は次の疾病、関節炎及び痛風に対して好ま
しい液体である。糸球体腎炎に選択される液体は、血液
、尿及び腹腔液である。

新しく採取した血液又は細胞を含む洗浄洗液を包含する
他の体液のアリコートは抗凝固剤で処理される。かかる
抗凝固剤は、シュウ酸アンモニウム又はシュウ酸カリウ
ム、クエン酸二ナトリウム、セフニストレン、フッ化物
及びヘパリンを包含し、ヘパリンが好ましいがこれらに
限定されない。この試料は細胞内エラスターゼの放出を
もたらす白血球の細胞膜を賦活する（ｐｅｒｔｕｒｂ）
ことができる化合物の存在下で温間される。本明細書中
で用いられる賦活（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）は白血
球細胞及び嚢胞膜の正常な構造の完全さの変異又は変調
又は偏位として定義される。賦活剤（ｐｅｒｔｕｒｂａ
ｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）は、細胞内酵素例えばエラスタ
ーゼを自然のままの細胞からエキソサイト−シス等を引
き起こす膜変調によって放出させるか膜を溶解及び酵素
を放出させることができる。膜を賦活することができる
試薬はザイモサン抗原−抗体複合体、補体Ｃ５ａ、Ｎ−
ホルミル−し−メチオニル−Ｌ−ロイシル−し−フェニ
ルアラニン（ＦＭＬＰ）ホルボール−１２−ミリステー
ト−１３−アセテ−）　（ＤＭＡ）とサイトカラシンＢ
、ｎ−ホルミル−し一ノルロイシルーＬ−ロイシルーし
一フェニルアラニン（ＦＮＬＰ）とサイトカラシンＢ及
びカルシウムイオノフオアＡ２３１Ｂ？、血小板活性化
因子又は細胞内酵素の放出が生じる白血球膜を変質する
ことができるいかなる賦活剤も包含するがこれらに限定
されない。膜状活に好ましい試薬は１アリコート当り約
７５〜３００ｍＭの範囲の濃度のカルシウムイオノフオ
アＡ　２３．１８７である。血液又は体液に加える前に
カルシウムイオノフオアはＤＭＳＯに溶解され、血液中
のＤＭＳＯの最終濃度は約０．２％で一定のままである
。約３７℃で約２５分製置した後血液又は体液は約２．
０００　’ｘｇで遠心分離され、血漿又は細胞を含まな
い体液が集められる。血漿又は細胞性液体中のフィブリ
ノーゲンのユニークなエラスターゼ切断産−物は前述の
方法によって検定することができ又はタンパク質はエタ
ノール：血漿又は液体約３：１の比に於て冷却エタノー
ルで沈降させることにより血漿から除去することができ
る。この血漿−エタノール又は液体−エタノール混合液
は、約３．０００　ｘｇで遠心分離され、上澄み液を集
め、５ｐｅｅｄ−ｖａｃコンセントレイターで蒸発乾固
される。処理された血漿又は液体は、蒸留水で元の容量
に再構成され試料は、特異性抗原又はエピトープを検出
することができる検定方法によってフィブリノーゲンの
ユニークなエラスターゼ切断産物の存在に対して検定さ
れる。カルシウムイオノフオアＡ２３１８７の濃度が増
大するにつれて切断産物の量はイオノフオア濃度の最大
約１５０ｍＭに到るまで増加する。

また好中球を含まない液体試料も同様の方法で検定する
ことができる。これらの試料は、好中球の標準濃度で処
理した後、賦活剤で処理することができ又は精製エラス
ターゼの標準量で処理することができる。液体、細胞及
びエラスターゼはほとんどの状態で同種である。

エラスターゼ切断産物は、種々のイムノアッセイによっ
て同定され、濃度を定量することができ、これには標識
抗体、ミレス及びハレス、ネイチュア、第２１９巻、１
８６頁〜（１９６８年）又はアディソン及びハレス　ホ
ルモン　メタ、レス。

（Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｍｅｔａ、　Ｒｅｓ、）第３巻、５
９頁〜（１９７１年）によるサンドインチ変法を使用す
るイムノラジオメーターアッセイ、パンウェーマン及び
ショウアスの方法、Ｆ、Ｅ、Ｂ、　Ｓ、Ｌｅｔｔ、第１
５巻、２３２頁〜（１９７１年）による抗原−酵素結合
体と競合検定又はエンバール及びパールマンの方法イム
ノ　ケム、第８巻、８７１頁〜（１９７１年）による酵
素−標識抗体検定又はハマーマトロム等の方法、ブロク
、ナトル、アカド、サイ、米国第７２巻、１５２８頁〜
（１９７５年）による第二抗体による検出を使用する酵
素−標識抗体検定の変法又は非競合サンドインチ（ＥＬ
ＩＳＡ）法、ナカムラ等のハンドブックオブ　エクスペ
リメンタル　イムノロジー、第１巻、イムノケミストリ
ー　Ｄ、Ｍ、　　ウアーアー第４版（１９８６年）ブラ
ックウェル　サイエンティフィック　バブリケーション
　オックスフォード２７．１〜２７゜２０頁参照又は前
述した標識抗原（ｔＡ）を使用する酵素イムノアッセイ
又は、抗原濃度を決定するいかなる他の検定も包含する
がこれらに限定されない。好ましい検定は、おおむね前
述され、以下で更に詳細に記述されるＲＩＡである。検
定液体の全量は、約５〜１ｒａβの範囲であることがで
き、約１００〜５００ｍｊ！が好ましい。既知又は未知
切断産物の標準溶液は、適当な容量、緩衝液約１００Ｉ
ＩＩｌ中約０．０１〜２．０ピコモルの範囲のペプチド
量を表わす約ｌＸｌ０−’°〜２Ｘ１０””Ｍの範囲で
前述の通り検定緩衝液中で調製される。

未知の標準溶液又は希釈液は抗体溶液と接触させる。こ
の抗体溶液は、表２．３，４．５に列挙した抗原と特異
的に反応性の１種以上の単一特異性抗体又はフィブリノ
ーゲンのあらゆる長さのフラグメントについて表に列挙
したあらゆるエピトープと反応性の抗体を含むことがで
きる。抗体溶液は一般に陽性反応を充分得る濃度通常適
当な緩衝液例えば検定緩衝液中の血清の希釈度約１　：
　１０００である。抗原及び抗体を含む試料を混合し、
特異性抗体又は抗体に相補性の標識プローブが加えられ
る。放射性プローブ又はプローブは、適当な緩衝液、検
定緩衝液で希釈して緩衝液約１００ｎ＋ｔ！当り約１０
，０００〜２５，０００　ｃｐｍを生成する。各検定に
は非特異性結合を測定するために抗体を含まない対照及
びペプチド結合の制御レベルを定量するために標準又は
未知を加えずに抗体とプローブを含む対照を包含する。

希釈した抗体を標識プローブと接触させた後、混合物を
約４℃で約１０〜２０時間又は約３７℃で約１０分から
約２時間製置される。抗体結合放射性プローブを非結合
放射性プローブから前述の通りクロマトグラフィー沈降
、免疫沈降、又は吸着手法、好ましくは非結合プローブ
をデキストラン被覆活性炭に吸着させて分離される。希
釈デキストラン被覆活性炭が各試料に加えられる。氷水
のスラリー中で短時間温置した後、木炭を遠心分離によ
り沈降させ、上澄み液を集め、ガンマ計数管で計数され
る。各検定には全カウントの定量に対して木炭を含まな
い対照及び非特異性結合の定量に対して抗体を含まない
対照を包含する。抗体を含まない対照及びゼロペプチド
抗体対照はガンマ計数管で計数されて各々０％結合値及
び１００％結合値を決定する。検定の標準は、計数され
抗体対照に関連して結合プローブ％を決定し、標準曲線
が生成される。標準のペプチド量の対数を関数として結
合％をプロットすると、約８０％制御から約２０％制御
の限度で直線に近いＳ状の曲線が生成される。未知のも
のを計数し、それらの制御％を計算し、標準曲線と比較
して試料に存在するペプチド量を決定する。約８０〜２
０％の制御結合で計数する未知のものだけが有効と考え
られる。

前記で定義した検定工学は、ヒト及び霊長動物の血液中
のヒト白血球エラスターゼ活性についてヒトエラスター
ゼ阻害剤の活性を監視するために用いられる。一般にエ
ラスターゼ阻害剤は全血と混合又は霊長動物又はヒトに
投与され、フィブリノーゲンによる白血球エラスターゼ
の効果が求められる。新しく採取したヘパリン化ヒト全
血のくり返しのアリコートは約３００■／ｍ１以下の濃
度のエラスターゼ阻害剤で調製される。阻害剤と予め短
時間温置した後、膜賦活剤例えばカルシウムイオノフオ
アＡ２３１′８７は約７５〜３００ｍＭの濃度で加えら
れる。血液を含む卵膜賦活剤対照及び賦活剤だけの対照
は非阻止ペプチド生成の程度を測定するために包含され
る。全ての検定試料は約３７℃で約２５分間インキュベ
ートされる。

次いで血漿を調製し、前述の通りフィブリノーゲン切断
産物に対して検定される。エラスターゼ阻害剤は、フィ
ブリノーゲン切断産物の生成を阻害することができ阻害
レベルはこの新規な検定系を用いて容易に検出される。

霊長動物をエラスターゼ阻害剤で処理した後フィブリノ
ーゲン切断産物の生体内阻害が評価される。血液又は液
体試料は、エラスターゼ阻害剤あるいは食塩水で処理さ
れる前と後の両方で集められる。各ヘパリン化血液試料
は約４つのアリコート（約１　ｍｎ）に分けられ、前述
の通り処理される。動物をエラスターゼ阻害剤で処理す
ると生産されるエラスターゼ切断産物の量に著しい減少
が生じる。

新規な検定のユニークなフィブリノーゲン切断産物存在
の分析能及びこれらの産生物の相対量の測定能はα１−
プロティナーゼ阻害剤（αＩ　Ｐｉ）、正常な血清エラ
スターゼ阻害剤の遺伝的に欠乏した個体からの血液で評
価される。αＩＰｉの欠乏した個体はＰｉＺＺ表現型を
示し、白血球エラスターゼの自然阻害剤である循環のα
ＩＰｉの正常なレベル以下しか生じない、ヤノフ　ァム
、レプ、レスヒア、ディス、　　（Ａｍ、　Ｒｅｖ、　
Ｒｅ５ｐｉｒ、　Ｄｉｓ、）第１３２巻、４１７〜４３
３頁（１９８，５年）。従ってＰｉＺＺ表現型を示す個
体はエラスターゼ活性阻止能を持たず、前記方法で検定
したときフィブリノーゲン切断産物が増加している。Ｐ
ｉＺＺ表現型を有し前述の通り処理され、特異性切断ペ
プチド抗原のレベルが測定される個゛体からヘパリン化
血液を集めるとき、このレベルは正常な志願者より高い
。

次の実施例は、本発明を具体的に説明するものであるが
、これらに限定されるものではない。

実施炎上 ヒト白血球エラスターゼによるヒトフィブリノーゲンの
− 精製ヒトフィブリノーゲン（シグマ）をヒト好中球エラ
スターゼ（エラスチンプロダクツ）とトリス緩衝液、ｐ
Ｈ７中２００モルのフィブリノーゲン／ヒト好中球エラ
スターゼ１モルの割合で最終容量１．０ｍｆに混合した
。この反応混合液の試料を３７°で５，１５．３０．４
５．６０分間インキュベートした。この反応を３容量の
水冷却エタノール（３°Ｃ）を添加して停止させ、その
温度で３０分間温温置た温置後この試料を３°Ｃで２０
分間３，０００　ｘｇで遠心分離し、上澄み液を除去し
、清浄試験管に入れ、この試料を５ｐｅｅｄ−Ｖａｃで
一晩？ａ縮乾固した。各試料を水とアセトニトリルの混
合液からなる高性能液体クロマトグラフィーＨＰＬＣｌ
、！街液で再構成し、デュポン−ゾルバクストＣ−１８
カラム（０，４Ｘ　２５ｃｍ）によりりＣ）７トグラフ
イ処理した。Ｈ２０ニアセトニトリルニトリフルオロ酢
酸９５　：　５　：　０．２　Ｖ／Ｖ／Ｖ＝ＨｚＯ：　
７　セトニトリルニトリフルオロ酢酸、６０：４０：０
．２　Ｖ／Ｖ／Ｖで７５分間隔にわたって直線勾配が展
開された。カラムから出るペプチドピークを集め、再び
クロマトグラフィー処理して純度を表わし、アプライド
バイオシステムスプロテインペプチドシークエンサー　
モデル４７０Ａにより製造業者の操作に従ってＮ−末端
アミノ酸配列解析にかけた。１５分のインキュベーショ
ン時間はフィブリノーゲン切断産物を最良に分解させた
。８本の主ピークと１９本の副ピークを同定した。主ピ
ークは一次切断産物を表わし、副ピークは、副又は二次
切断部位を表わす。主ペプチドピークのアミノ酸配列解
析は、ヒトフィブリノーゲンに９個のエラスターゼ切断
部位が同定された。切断部位の６個はＡα鎖にあり、一
方３個の部位はγ鎖に位置される、表１参照。

ヒトフィブリノーゲンのＡα及びγ両頭の特異性エラス
ターゼ切断部位、実施例１．を知ることにより、切断部
位に隣接したアミノ及びカルボキシル末端を表わす抗原
ペプチド及びペプチドプローブが同定された。カルボキ
シル末端と関係のある特異性アミノ酸配列は表２、と３
に例示され、アミノ末端と関係のある配列は表４と５に
例示される。

ペプチド抗原及びベプチドプローベはＳＡＭＴＷＯペプ
チドシンセサイザー（バイオサーチ社）及びアプライド
バイオシステムス（モデル４３０）ペプチドシンセサイ
ザーによるｔ−ＢＯＣ化学を用いて合成した。カルボキ
シル基で終結するペプチドは、メリフィールド標準樹脂
により合成した。

合成方法はＳＡＭ　　ＴＷＯベプチドシンセサイザーオ
ペレーターズマニュアル（バイオサーチ。

１９８５年）に詳細に記載される。樹脂からのペプチド
の切断はＳＡＭ　　ＴＷＯオペレーターズマニュアルに
略述されている操作に従ってプロティンリサーチ　ファ
ンデーションフッ化水素装置でフッ化水素で処理して達
成した。各ペプチドのファーストアトム衝撃スペクトル
分析により補正分子イオンを得た。このペプチドをＳＡ
Ｍ　　ＴＷＯオペレーターズマニュアルに記載される１
８個の炭素原子（Ｃ１８）を有するアルキルシラン基質
を用いてＨＰＬＣにより精製した。個々のペプチドの純
度を逆相ＨＰＬＣと再びＳＡＭ　　ＴＷＯオペレーター
ズマニュアルに記載されるセット操作に従うアミノ酸分
析により評価した。補正分子イオンを各ペプチドのファ
ーストアトム衝撃質量分析によって得た。Ａα鎖、Ｇｌ
ｙ（１７）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｔ（２１）
のＶａｔ（２１，Ｇｌｕ（２２）表１参照、エラスター
ゼ切断部位に対するカルボキシル末端と関係のある一次
抗原は２個のアミノ酸残基を追加して合成される。シス
ティン−ノルロイシンをＡα１７−２１抗原に付着させ
て次の抗原Ｃｙｓ−Ｎｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−＾ｒｇ−
Ｖａｌ−Ｖａｌを得る。バリン末端残基のカルボキシル
基の完全さは変わらなかった。システィンは、抗原を免
疫原性担体に結合又は付着させるため、リンキングアミ
ノ酸である。ノルロイシンを内部標識として１個の免疫
原性担体に付着される抗原分子の実際の数を定量するた
めに加えた。

実施例２で得た抗原ペプチドの担体タンパク質への付着
は、ヘテロ三官能性カップリング試薬ＭＢＳあるいはス
ルホ−ＭＢＳ　（プライス、ケミカル社）を用いてラー
ナー等、ブロク、ナト、アカド、サイ、米国第７８巻、
３４０３〜３４０７頁（１９８１年）の方法の変法によ
り行なった。ペプチド抗原は、リン酸塩緩衝液、２０ｍ
Ｍ、ｐＦ１７．ｏ、２．５ｍ！！に溶解したＢ５Ａ１０
ｎｖをスルホ−ＭＢＳ４．２■と混合し、室温で３０分
間攪拌しながらインキュベートして担体ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）に付着される。次いで担体カップリング
試薬混合物を脱気した５０ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ６
，０で平衡にしたＰＤ−１０使い捨てセファデックスＧ
−２５カラム（ファルマシア）に適用した。

試料適用中力ラムから溶離される物質はカラムの無効容
量に相当し捨てた。６μモルの精製凍結乾燥ペプチド抗
原を含む小さなガラスびんをカラムの出口に置き、活性
アルブミンをｐＨ６，ｏの緩衝液を更に加えたガラスび
んに溶離した。ペプチド抗原−活性担体複合体を一晩反
応させておいた。この抗原−担体複合体を前述の通り２
回目のゲル濾過によって精製し、蒸留水の３種の変化に
対して透析し、凍結乾燥した。

カップリングの程度を１１０℃で２４時間維持した６、
０　）ＪＩＩＣｌｌ　ｍｌ中で凍結乾燥結合体０．５　
ｍｇを加水分解するアミノ酸分析によって定量した。

この試料をニンヒドリン検出によるアミノ酸分析にかけ
た。この分析はＢＳＡ　１モル当り抗原ペプチド１１モ
ルであることを示した。

ニュージ−ランドホワイトラビットとハートレー非近交
系モルモットを実施例３の免疫原で免疫した。ビツアカ
イチス　メソ、エンザイモル。

（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）第７３巻、４６〜５
２頁（１９８１年）によって記載される方法に基づいて
多回皮肉（ＩＤ）注射を用いた。初回免疫は食塩水１ｍ
１当り免疫原結合体１ｍｇをフロイント完全アジュバン
ト１　　ｍｌｌで均質化して使用した。ウサギに全量２
１を２０ケ所の■Ｄ蔀位に分けて接種し、モルモットに
１　　ｍｌｌを接種した。３０日後動物に追加接種した
。ウサギに食塩水１　ｍｌ当り免疫原０．５■をフロイ
ンド不完全アジュバント１　ｍｊ２で均質化して接種し
、モルモットには免疫原０．２５■を接種した。追加免
疫は筋肉内と皮下部位とに分けた。抗血清の力価及び感
受性を評価するためにときどき分析用採血をした。抗体
価はほとんど追加免疫前に基礎レベルに落とした。最後
の追加免疫の１０日後動物に採血し、血清を集め、この
血清を凍結し、−７０°Ｃで貯蔵した。

夷権桝ｌ 査底１旦ニブ 抗体特異性を決定し、フィブリノーゲン切断産物の存在
と量を評価するために抗原プローブを実施例２の方法に
よって合成した。切断産物の存在と量を定量するために
用いられる抗原プローベは、このプローブが＋２ＳＩに
結合されるようにエピトープに遠い末端でチロシン残基
を含むよう計画した。抗体価を定量するために用いられ
る開始プローベはＡα鎖の最初の２１個のアミノ酸とア
ミノ末端チロシン残基から構成される。

Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐｈｅ Ｌｅｕ 八ｌａ Ｇｌｕ ｃｔｙ−ｃｔｙ Ｇｌｙ−Ｖａｌ Ａｒｇ−Ｇｌｙ Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｖａｌ− Ｖａｌ−ＣＯＯＨ 抗体特異性を評価し、 特異性がＡα１７〜２ アミノ酸配列にあることを証明するために用いられる特
異性プローベは次を包含する。

ＨＪ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−ＧｌｙＧｌｕ−Ｇｌｙ
−Ａｓｐ−Ｐｈｅ Ｌｅｕ−Ａｌａ Ｇｌｕ １ｙ ｃｔｙ−ｃｔｙ Ｖａｌ−＾ｒｇ−Ｇｌｙ Ｐｒ。

Ａｒｇ Ｖａｌ− ＣＯＯＨ ■２Ｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ Ｇｌｕ−Ｇｌｙ Ｇｌｙ ｃｔｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ Ｖａｔ−Ｖａｌ ＣＯＯＨ Ｇｌｕ−Ｇｌｙ １ｙ Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒ。

Ａｒｇ ｈＮ Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖ
ａｌ−ＡｒｇＧｌｙ−Ｐｒｏ− ＾ｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＣＯＯＨ ＨＪ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ ＩＳＩ Ｖａｌ Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒ。

Ａｒｇ Ｖａｌ Ｖａｌ− ＣＯＯＨ ＨＪ−Ｇｌｙ−、Ｖａｌ 八ｒｇ Ｇｌｙ−Ｐｒ。

ＡＲｇ−Ｖａｌ Ｖａｌ−ＣＯＯ）１ Ｈ２Ｎ−Ｖａｔ−八ｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇａｌ Ｖａｌ−ＣＯＯＨ ＨＪ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌｏｏ１ １（２Ｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｖａｔ−Ｖａｌ０
ＮＨ２ １ｕ Ｇｔｙ−ｃｔｙ Ｇｌｙ−Ｖａｔ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｒ。

０Ｏ１１ ＨＪ−Ａｌａ 八ｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐ
ｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈ２Ｎ−Ａｌａ−Ａｓｐ−３ｅ
ｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−八ｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ
−ＡｌａＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＧＩｙ−Ｖａｌ−Ａ
ｒｇ−ＣＯＯＨ検定プローベの放射性ヨウ素化は、クロ
ラミンＴと反応させて行なった。ペプチドプローブを水
で濃度２２０　ｍｇ／　＋ｎｊ！に熔解した。この溶液
（１１■含有）５０１容量を０．５　Ｍリン酸塩（Ｋ＋
）緩衝液１０ｍ１に加えた後’　”ＩＮａ　２　ｍＣｉ
　と新しく調製した水中クロラミンＴ１０ｎｌ　（０，
１■／ｍ７りと混合した。この混合液を３０秒間反応さ
せ、１■／　ｍＩ　ＮａＩと１■／１チオ硫酸ナトリウ
ム１０ｆｆ１Ｎで反応を停止させた。放射性ヨウ素化プ
ローブを５ｕｐｅｌｃｏＣ−８カラム（０，４Ｘ２５ｃ
ｍ）を用いてＨＰＬＣで精製した。ヨウ素化プローブを
流速１　ｍ１１分で９０％溶離液Ａ−１０％？容雛液Ｂ
〜３０　％ン容離液Ａ　−７０％？容離ン夜Ｂの３０分
２％／分勾配により）容量した。溶離液Ａは、水中０．
１％トリフルオロ酢酸からなり、溶離液Ｂはアセトニト
リル中０．１％トリフルオロ酢酸からなる。

この検定は、０．１％ゼラチン、０．０１％チメラソル
及び１．０ｍＭＥＤＴＡで補足した全’ｉ３００ｍｊ＋
のダルベツコのカルシウム及びマグネシウムを含まない
リン酸塩緩衝食塩水で行なった。緩衝液又は試料１００
ｎ１に抗血清各１００ｍ１を加え、放射性プローブを同
じ緩衝液で希釈した。放射性プローブの希釈度は各試料
又は対照に１５．０００〜２０、　ＯＯＯｃｐｍが加え
られるように調製した。この検定を４℃で一晩温置し、
０．３％デキストラン被覆木炭を加えて終結させた。木
炭を遠心分離で沈降させた後、上澄み液を傾瀉し、放射
能を測定した。

抗血清力価は１００ｎｌ容量に加えられる抗血清の希釈
度を変えることによるプロトコールで測定した。競合実
験で用いられる抗体希釈度は放射性プローブの約３０％
の結合を得るように選択された。抗体感受性はＡα１〜
２１ペプチドの異なる既知量を含む試料を用いて測定し
た。特異性はＡα１〜２１ペプチドによって生じた置き
換えた曲線と推定の交差反応性ペプチドによって生じた
ものと比較して決定した。未知試料中のペプチドの濃度
は、試料の存在下で得られたプローブの制御抗体結合％
を既知濃度のペプチドを用いて生じた標準曲線に関係さ
せて決定した。

実施例１の抗原に対して最も活性なウサギ抗血清、実施
例４、の抗体価をラジオイムノア・ノセイを用いて測定
した。抗血清を検定緩衝液、実施例６参照、でｌｏｏｍ
＃当り１　：　３．０００〜１　：　３０，０００の範
囲で希釈した。この希釈抗体を適当な抗原ペプチド配列
、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−＾ｒｇ−Ｖａｔ−ＶａＬ　　Ｌ　Ｏ
Ｏｍεを含むＡα１〜２１放射性標識プローブ、実施例
３参照と接触させた。放射性プローベを１００ｍｆのア
リコート当り約１３，０００　ｃｐｍを得るように検定
緩衝液で希釈した。この検定容量は検定緩衝液１００ｍ
Ｊを加えて３００ｍ１に調製した。測定は全て２回の実
験で行なった。

４℃で一晩温置した後、非結合プローブをデキストラン
被覆木炭に吸着させて抗体結合及び非結合放射性プロー
ブを分離した。デキストラン被覆木炭ハ、活性炭ＵＳＰ
を０．２５　％　Ｗ／Ｖ　Ｔ−７０デキストラン平均分
子ｉ７０．０００　　（ファーマシア）を含む１０ｍＭ
リン酸塩緩衝液、ｐＨ７，５に３％訂Ｖの濃度で懸濁さ
せて調製した。混合液を一晩放置し、遠心分離で沈降さ
せ、上述のデキストラン含有リン酸塩緩衝液で１回洗浄
した後デキストラン含有検定緩衝液で３％濃度に再懸濁
させた。検定に使用する直前にデキストラン被覆木炭を
ダルベツコのＰＢＳで１０倍に希釈し、１　ｍ（ｌを各
々の検定試験管に加えた。氷／水スラリー中で３０分間
インキュベートした後、木炭を３．０００　ｘｇで１０
分間遠心分離で沈降させ、上澄み液を傾瀉し、ガンマ計
数管で計数した。この検定には、全カウント数を測定す
るためにＰＢＳｌｍｆを加えた木炭を含まない対照及び
非特異性結合を測定するために抗体を含まないコントロ
ールを包含した。抗血清の各希釈度に於ける特異性結合
％は、抗体結合の各数値から抗体を含まない又は非特異
性結合値を引いてこれをこの系の全カウント数で割るこ
とによって決定した。

表−」− 背１１」■目側九に ３．０００ ”’Ｉ−ＣＰＭ ３．７００ ３．８２８ ２６．５ 八％ １５．０００ １．１３４ １．１０９ ６．５ ３０．０００ ３．７ 全量 １２．９８０ １３．４５４ 非特異性 最終希釈度１　：　　３０００の隘２０を示すウサギ抗
血清は、２６％の全放射性プローベを結合する。この抗
体濃度は特異的切断ペプチドの存在を決定するために非
常に充分である。

抗体感受性は、種々の濃度の無標識プローブの放射性で
標識したプローブへの結合阻止能を評価することによっ
て定量した。実施例４の抗血清を実施例６の検定緩衝液
で１　：　　１，０００の濃度に希釈し、１ＯＯＩＩ１
１を検定の各試料に使用した。Ａα１〜２１の無標識プ
ローブを検定緩衝液で希釈して１００ｍ４７当り最終濃
度１．０．０．１．０．０１ピコモルを得た。放射性プ
ローブ１２５Ｉ−チロシル−Ａα１〜２１を検定緩衝液
で希釈して１００ｍ１当り約１０，０００　ｃｐｍを生
成した。この検定は、全量３００ｎｌで行なわれこの容
量は検定緩衝液を用いて必要なところで調製された。こ
の検定は、非特異性結合を決定するために抗体を含まな
い対照及びプローブ結合の制御レベルを決定するために
抗体と特異性プローベを加えていないプローベを含むコ
ントロールを包含した。定量は全て２回の実験で行なわ
れた。この検定試料及び対照は実施例７で記載した通り
処理し、計数した。制御結合％は、特異性プローブの各
濃度に於て、２回の実験試料の平均ｃｐｍを計算し、平
均非特異−結合ｃｐｍを引き、この結果を抗体のみのカ
ウント数で割ることによって決定した。この結果を次の
表に示す。

凛ニー１ 無標識ブ叶プの量（ピコ干ル） １．０ １０．５ ０．１ １．３９３ ５７．１ ０．０１ ２．２４３ ２．１５８ ９５．８ 抗体のみ ２．１８６ ２．３９０ 非特異性 全ｃｐｍ ９．５６４ 感受性検定は放射性標識プローブの結合を５０％阻害す
ることができるＡα１〜２１ペプチドの量が約０．１ピ
コモルであることを示す。

抗体特異性は、長さの異なる無標識ペプチド、特異性プ
ローブ、実施例６参照、のＡα１〜２１放射性プローブ
結合能を評価することによって決定した。実施例２で記
載したＡα１７〜２１免疫原に対して調製したウサギ抗
血清を検定緩衝液実施例６参照、で希釈度１　：　　１
，０００に希釈した。実施例５の特異性ペプチドは検定
緩衝液で１．６×１０−”　Ｍ〜Ｉ　Ｘ　１０−’Ｍの
濃度に希釈した。各希釈液１００　ｍｌを抗血清１００
ｍｆｆと放射性プローブ１００ｎ１に加えた。これは検
定で用いられる１００ｍ１のアリコート中０．０１６ピ
コモル〜１．０ナノモルの濃度の特異性プローブペプチ
ドを示す。放射性プローブ１２５Ｉ−チロシル−Ａａ１
〜２１、実施例５を検定緩衝液で希釈してｔ試料又はコ
ントロール当り用いられる量である１００ｍ１ｌのアリ
コート当り約２０．０００　ｃｐｍを生成した。

この検定は３００ｍ１の容量で行なわれ、この容量は検
定緩衝液で必要なところで調製した。この検定は非特異
性結合を決定するために用いられる抗体を含まない対照
及びプローブ結合の制御レベルを定量するために抗体と
プローブを含むコントロールを包含する。定量は全て２
回の実験で行なわれた。４℃で一晩インキユベートした
後、非抗体結合放射性プローブを実施例７で記載した通
りデキストラ゛ン被覆活性炭に吸着させて抗体結合放射
性プローブから分離した。この検定には、全カウント数
を決定するためにＰＢＳｌｍＪを加えた木炭を含まない
対照を包含する。

抗体を含まないコントロール及びゼロペプチド抗体対照
は、各Ｏ％結合及び１００％結合値を決定するために計
数される。ガンマ計数管と当業界で既知の標準手法を用
いて放射能を測定した。次いで試験ペプチドを含む試料
を計数し、抗体を含まない対照と関係する放射能量を各
々から引いた。

得られた正味のカウントを抗体のみの対照の正味のカウ
ントで割ってペプチドの容量の存在下で結合した％を決
定した。次の表は、標識プローベの抗体結合を５０％阻
害するのに必要な各特異性プローベ量を示す。

表−一影 抗ゴＬＬ選−件 八ａ　　１−２１ Ａａ　　２−２１ Ａａ　　９−２１ Ａａ　　１２−２１ Ａａ　　１４−２１ Ａａ　　１５−２１ Ａａ　　１？−２１ Ａａ　　１７−２ｌ−ＮＨｚ Ａａ　　１−２２ Ａａ　　１−２０ Ａａ　　１−１９ 八ａ　　１−１８ ウサギ（１１２０） ０．１ ０．１ ０．１ ０、ｌ ０．２ １．６ ＞　ｔｏｏｏ、。

＞　１ｏｏｏ、。

６００．０ ｓｏｏ、。

＞　ｔｏｏｏ、。

モルモット（＃３） ０．１ この表は放射性プローブ結合を５０％の阻害濃度で阻害
するために必要とされる各ペプチドの量を列挙する。Ａ
α１７〜２１カルボキシル配列全部を有する特異性ペプ
チドだけが標識プローブＡα１〜２１と交差反応する。

Ａａ１７〜２１のアミノ化ｆｆ（１物が交差反応しない
ことは注目すべきである。

実１１殊上」− 未知試料に於けるＡα１７〜２１エピトープ含有ペプチ
ド濃度の定量のためのイムノアッセイプロトコール ラジオイムノアッセイを全１３０Ｏｎ＋１で行ない希釈
はすべて実施例６の検定緩衝液で行なった。

標準溶液は検定で用いられる１００ｍ１のアリコート中
０．０１〜２．０ピコモルのペプチド量を表わすＩ　Ｘ
　１０−’°〜２Ｘ１０−’Ｍの濃度で調製した。

この検定は非特異性結合を測定するために抗体を含まな
い対照及びペプチド結合の制御レベルを定量するために
標準試料又は未知試料を加えない抗体とプローブを含む
コントロールを包含した。緩衝液１００ｍｊ！に標【坊
又は未知試料を加え、実施例２及び７で得た特異性抗血
清１００ｍｊｌ！を検定緩衝液で１　：　　１，０００
に希釈した。これに放射性プローブ１２５■−チロシル
−Ａα１−２１フイブリノ一ゲンペプチド１００ｍｆの
添加を続け、検定緩衝液で希釈して１００ｍＡのアリコ
ート当り約１５、ＯＯＯ〜２０，０００　ｃｐｍを生成
した。この検定を４°Ｃで一晩温置し、非抗体結合放射
性プローブをデキストラン被覆゛活性炭、実施例７参照
、に吸着させて抗体結合プローブから分離した。各検定
は、全カウントを決定するためにＰＩ３３１ｍｌを加え
た木炭を含まないコントロールを包含した。ガンマ計数
管及び当業界で既知の標準手法を用いて放射能を測定し
た。

抗体を含まないコントロールとゼロペプチド抗体コント
ロールを各々０％結合及び１００％結合値を決定するた
めに計数した。次いで検定標準を計数し、抗体対照で割
って結合％を求め標準曲線を生成した。結合％を標準の
ペプチド量の対数の関数としてプロットしたとき８０％
結合と２０％結合の限度で直線に近いＳ状曲線ができる
。未知のものを計数し、制御％を計算し、標準曲線と比
較して試料中に存在するペプチド量を決定する。

制御結合８０％〜２０％の数値を含む未知のものだけが
有効と考えられる。

ヒト血液に於けるペプチドＡα１７〜２１を含む切断ペ
プチドの試験管内生産、イオン透過担体濃度の影響 ヒト全血１　ｍｌ当り５０μを含む新しく採血したヘパ
リン化ハキュテーナーの２つの１．０＋ｎｊ２アリコー
トを２００ｍＭ以下の濃度でカルシウムイオノフオアＡ
２３１８７を存在させて３７°Ｃで１５分間温直間た。

カルシウムイオノフオアをジメチルスルホキシド（ＤＭ
ＳＯ）に溶解し、血液中のＤ　Ｍ　Ｓ　Ｏ濃度を０．２
％に一定にした。温置後、アリコートを氷に置き、遠心
分離し、血漿を集めた。

血漿アリコート　（４００ｍＪ２）を取り除き、１２×
７５論ガラス管に入れ、冷却エタノール１２００ｍｆｆ
１を加えてタンパク質を沈降させた。この試料を遠心分
離し、上澄み液８００ｍｆｆを取り除き５ｐｅｅｄ−Ｖ
ａｃコンセントレータ−で蒸発乾固した。

この試料を蒸留水２００ｍｊ２で元の血漿容量に再構成
した。２つの１００ｍ／！アリコートを本実施例で記載
した通りＡα１７〜２１含有ペプチド（Ａα１〜２１）
に対して検定した。次の表は、種々のイオン透過担体量
に応じて生産されたＡα１７〜２１エピトープ含有ペプ
チドの量を示す。

表−一史 ヒト全血からのＡα１７〜２１エピト−プ含有ペプチド
のイオン゛　　　　゛　　化 イオノフオア濃度 （ｍＭ） 含有するＡα１７〜２１エピ ト　−ブ　（ピコモル／ｍｅ　血液） １゜２ １．６ ２．６ ２．８ ４．０ ４．１ ３．８ １５０ｍＭのカルシウムイオン透過↑旦体Ａ２３１８７
で刺激することによりＡα１７〜２１エピトープ含有ペ
プチドの最適生産が生じた。

イオノフオア温置■ロ カルシウムイオンｌ担体Ａ２３１８７を前述した新しく
採血したヘパリン化全血のくり返し１、Ｑｍｊ２アリコ
ートに最’ｄ？Ｍ度１５０ｍＭまで加えた。血液のほか
の対照アリコートは０．２％の４度でＤＭＳＯをカロえ
た。この血漿アリコートを６０分以下の種々の時間３７
“Ｃで温間した。温置後、血脩を調製し、前記の通り処
理し検定した。この結果を次の表に示す。

、表１」− イオン透過担体Ａ２３１８７による全血からＡα１７〜
２１エピトープ１　ペプチドの 温置時間 分 Ａα１７〜２１エピトープ （ピコモル／ｍｌ血漿） 〈１．０ ２．５ ７．５ １０．０ １５．０ ２０．０ ２５．０ ３０．０ ４０．０ ５０．０ ６０、Ｏ ０，７ ２，３ ２，８ ３，５ ３，７ ３，７ ３，８ ３，８ ３，６ ３、１ ３，２ 時間と共に増加し、１０〜４０分で最高濃度３．５〜４
．０ｍＭに達する。ＤＭＳＯだけを含む対照はペプチド
産生を生じない。インキュベーション時間２５分が今後
の実験のために選択された。

血皇股藍皿月 他の公知の膜賦活剤をヒト血液のエピトープ含有切断ペ
プチドＡα１７〜２１の試験管内産生を評価するために
使用した。新しく採血したヘパリン化全血のアリコート
を５■／ｌＩ＋１サイトカラシンＢあるいは２０ｍＭ以
下の濃度のホルボール１２−ミリステート−１３−アセ
テート（ＰＭＡ）を存在させるか５■／ｍｌサイトカラ
シンＢと２０ｍＭ以下の濃度のｎ−ｎ−ホルミル−し−
ノルロイシル−Ｌ−口イシル−Ｌ−フェニルアラニン（
ＦＮＬＰ）の組み合わを存在させて３７℃で２５分間イ
ンキニーベートした。血脩を集め、前述の通り調製し検
定した。結果を次の表に示す。

Ａα１７〜２１エピトープ含有ペプチドの濃度は２表」
」− 暑」−影 ヒト全血中に含有するＡα１７〜２１エピトープのＰＭ
ＡとサイトカラシンＢ　　　生 ヒト全血からＡα１７〜２１エピトープ含有ペプチドの
ＦＮＬＰ　　びサイトカラシンＢ ＭＡ ｍモル ０．００３ ０．０１０ ０．０３ ０．１０ ０．３０ １．０ ３．０ １０．０ ２０．０ 産生されたＡα１７〜２１１ビトーブ 含有ペプチド　　（ピコモル／ｍｎ　　血鼎→Ｆ　Ｎ　
Ｌ　Ｐ ｍモル 産生されたＡα１７〜２１エピトープ 含有ベブチＦ　　（ピゴモル／ｍＬ血３ｉ）０．０ ０．３ ０．３ ０．４ ０．９ １．５ ２．６ ３．０ ３．７ ０．００１ ０．００３ ０．０１０ ０．０３ ０．１ ０．３ １．０ ３．０ １０．０ ２０．０ ０．０ ０．０ ０．０ Ｏ９４ ０，９ １，１ １，１ １，３ １，２ １，３ ス新ｍ上 Ａα１７〜２１エピトープ含有ペプチドラジオイムノア
ソセイの 以下の記述は、フィブリノーゲンペブチドイムノアフセ
イがヒト血液中のヒト白血球エラスターゼの有効な活性
を監視するために使用することができることを示すもの
である。

正常なヒトの血液に於けるフィブリノーゲン切断ペプチ
ドのカルシウムイオン透過担体Ａ　２３１８７刺ヘパリ
ン化静脈血を５週間に３度１７人の正常で健康な志願者
から採血した。各場合にカルシウムイオン透過担体Ａ２
３１８７を新しく採血した血液のくり返しアリコートに
最終温度１５０ｍＭまで加えた。この血液を３７°で２
５分間インキユヘートし、血漿を集め、切断ペプチドに
対して検定した。結果の代表例を次の表に示す。

旨 マー０ト工 ０へ−ＯＣ 正常な個人は本検定で定量された場合−数量のフィブリ
ノーゲン切断ペプチドを産生じた。破線はその時に個体
から試料が得られなかったことを示す。

正常なヒトの血液に於けるフィブリノーゲン切断ペプチ
ドのカルシウムイオン透過担体Ａ２３１８７刺について
エース　−ゼ　　　の カルシウムイオン透過担体Ａ　２３１８７　誘発フィブ
リノーゲン切断ペプチド産生によるエラスターゼ阻害剤
３−アセトキシメチル−１α−メトキシ−６−オキソ−
５−チア−ニーアザビシクロ［４，２，０］オクト−２
−エン−２−（２−（Ｓ）カルボキシピロリジンカルボ
キサミド）５，５ジオキシド（化合物１）の作用を評価
した。新しく採血したヘパリン化ヒト全血のくり返しの
２ｍｌアリコートを１００ｎｊ！／ｍｌまでの濃度の化
合物１で調製した。３７℃で５分子め温間した後、最終
濃度１５０ｍＭまでカルシウムイオン透過担体Ａ２３１
８７を加えた。イオン透過担体を含まない血液とイオン
透過担体のみ（阻害剤を含まない）のコントロールを阻
害されないペプチド生成の程度を測定するために包含し
た。全アリコートを３７℃で２５分間インキュベートし
た後、血漿を集め、前述の通り、フィブリノーゲン切断
ペプチドを検定した。結果を次の表に示す。

ス」＝１ エース　−ゼ　−　ゝ エラスターゼ阻害剤 ■／ｌｌｌ１ 産生じた切断産物 ピコモル／ｍｌｌ 阻害％ ２．４ ２．３ １．６ １、６ １．５ １．２ ０、８ ０．４ この結果は、公知のエラスターゼ阻害剤がヒト血液に於
てエラスターゼ切断産物のイオノフオア誘発生成を阻害
できることを証明する。これはヒト全血をカルシウムイ
オノフオアＡ２３１８７と反応させることが好中球エラ
スターゼを放出させてエラスターゼ切断産物を生ずる観
察と一致する。

霊長動物血液に於けるフィブリノーゲン切断ペプチドの
カルシウムイオン透過担体Ａ２３１８７刺生についてエ
ラスターゼ　害　の　用 ２匹のチンパンジーに麻酔をかけ、血液を集めるために
静脈カテーテルを取り付けた。エラスターゼ阻害剤を投
与する前に６０分おきに各動物から血液を集めた。全血
液試料をヘパリン中に集めた。最初の６０分後１匹の動
物にエラスターゼ阻害剤化合物１の１０■／ｋｇを静脈
注射し、別の動物に等価量の普通の食塩水を与えた。別
のヘパリン化血液試料を両動物から次の６０分で定期的
に採取した。ヘパリン化チンパンジー全血の各新しく採
血した試料を４つのアリコートに分けた。カルシウムイ
オン透過担体Ａ２３１８７をアリコートの２つに最終濃
度１５０ｍＭで加え、ＤＭＳ○賦形剤の等価量を別の２
つに加えた。全ての血液試料を３７℃で２５分間インキ
ュベートし、血漿を集め、前述の通り検定した。結果を
次の表に示す。

茎１５− エラスターゼ阻害剤処理及び対照動物から得たチン／Ｘ
Ｉンジー血液に於けるＡα１７〜２１エピトープ含有ペ
プチドのイオン透過担体誘発産生 産生されたＡα１〜２１ペプチド （ピコモル／ｌｌ１１血漿） 時間（分）　　　　処　理　　　　　コントロール６０
．０　　　　　２．７０　　　　　　　　０．８０４５
．０　　　　　３．５０　　　　　　　１．００３０．
０　　　　　３．１０　　　　　　　　０．８１１５．
０　　　　　３．００　　　　　　　０．９５０．０　
　　　　３．００　　　　　　　　０．９８１．０　　
　　　１．１０　　　　　　　１．２０２．５　　　　
　１．３０　　　　　　　１．１０５．０　　　　　１
．６０　　　　　　　０゜９７７、５　　　　　２．０
０　　　　　　　　１．　ｌ　０１０．０　　　　　１
．８０　　　　　　　　１．２０１２．５　　　　　　
　＋、７０　　　　　　　　１．１０１５．０　　　　
　０．９８　　　　　　　　１．５０２０．０　　　　
　１．９０　　　　　　　　１．５０３０．０　　　　
　２．２０　　　　　　　１．２０４０．０　　　　　
３．１０　　　　　　　１．５０５０．０　　　　　２
．６０　　　　　　　　１．２０６０、０　　　　　２
．５０　　　　　　　　０．９６エラスターゼ阻害剤を
時間Ｏに於て処理動物に注入した。

エラスターゼ阻害剤の注入後処理チンパンジーから採取
した血液試料はカルシウムイオノフオアＡ２３１８７に
反応して著しく低いレベルのフィブリノーゲンペプチド
を産生じた。いずれの動物からの非イオン透過担体処理
動物試料にもフィブリノーゲン切断ペプチドは検出され
なかった。３０〜４０分の経過中新しく採取した試料中
のイオン透過担体刺激ペプチド産生の量は前処理レベル
に徐々に戻った。未処理動物には時間中一致した変化は
観察されなかった。

α−１プロテイナーゼの欠乏したヒトの血液に於けるフ
ィブリノーゲン切断ペプチドのカルシウムイオン　゛　
　Ａ２３１８７ ヘパリン化静脈血をα−１ブロテイナーセ阻害剤の欠乏
したＰｉＺＺ表現型全現型る４人から採増した。更に２
人の正常の志願者から血液を集めた。カルシウムイオン
透過担体Ａ２３１８７を新しく採取した血液のくり返し
のアリコートに最終）ノ：度１５０ｍＭまで加えた。こ
の血液を３７°で２５分間ｆＡ装し、血脩を集め切断ペ
プチドを検定した。結果を次の表に示す。

表」−腫 カルシウムイオン透過担体の存在下ＰｉＺＺ及び正常な
個体の全血・に於けるＡα１７〜２１エピトープ含有ペ
プチドの　生 」を 正常 正常 ｉＺＺ ｉＺＺ ｉＺＺ １ＺＺ −）■モー 〈０．４ 〈０．５ ＜０．７ 〈０．６ 〈０．５ ＜０．４ ４．２ ４．６ ８．４ ２６．５ ２０．５ １７．８ ４人から誘導した血液試料は正常な志願者から誘導され
たものより多量のペプチドを産生じた。基礎的条件下で
はフィブリノーゲン切断産物はいかなる供血者の血液中
にも検出されなかった。

出　願　人　：　メルク インク エント　カムバニ ポレーテソト 女 井 幸 数値は、血漿１ｍｌ！当り産生されるｐＭＡα１７〜２
１エピトープ含有ペプチドとして表わされる。

α−１プロテイナーゼ阻害剤が遺伝的に欠乏した「−系
−、ｒネ市　［Ｗ已　；−） （方式） （１）別紙の通り 明ａ　ＵＳ　’通を提出致します。

モ成１年／り月を日 特＋ｉ１１？長官　、１ｉ ［ｒｌ 文 毅 殿 ■ ・１＞ｆｌの全車 中成１年特、；）願第１４５５２９号 ２、発明の名称 ユニークなエラスターゼ誘発フイフリノーゲン切断部位
抗原 ３、袖１１−をする者 ・１絆（どの関係 ０１作出願人 インコーボレーテット ４、代 理 人 氏 名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、特異性抗体を含み、該抗体の検出に特異性プローブ
   として作用することができるヒト白血球エラスターゼ切
   断ヒトフィブリノーゲンの一次切断産物のカルボキシル
   末端を有する末端アミノ酸配列を含むエピトープを包含
   しているペプチド。 ２、特異性抗体を含み、該抗体の検出に特異性プローブ
   として作用することができるヒト白血球エラスターゼ切
   断ヒトフィブリノーゲンの一次切断産物のカルボキシル
   末端を包含し、ペプチド抗原が Ａα鎖アミノ酸残基【遺伝子配列があります。】Ａα鎖
   アミノ酸残基【遺伝子配列があります。】Ａα鎖アミノ
   酸残基【遺伝子配列があります。】Ａα鎖アミノ酸残基
   【遺伝子配列があります。】Ａα鎖アミノ酸残基【遺伝
   子配列があります。】Ａα鎖アミノ酸残基【遺伝子配列
   があります。】γ鎖アミノ酸残基【遺伝子配列がありま
   す。】γ鎖アミノ酸残基【遺伝子配列があります。】γ
   鎖アミノ酸残基【遺伝子配列があります。】又はその酸
   付加塩 からなる群から選択される特異性エピトープを有するペ
   プチド。 ３、特異性抗体を含み、該抗体の検定に特異性プローブ
   として作用することができるヒト白血球エラスターゼ切
   断ヒトフィブリノーゲンの一次切断産物のアミノ末端を
   有する末端アミノ酸配列を含むエピトープを包含してい
   るペプチド。 ４、特異性抗体を含み、該抗体の検定に特異性プローブ
   として作用することができるヒト白血球エラスターゼ切
   断ヒトフィブリノーゲンの一次切断産物のアミノ末端を
   包含し、ペプチド抗原が Ａα鎖アミノ酸残基【遺伝子配列があります。】Ａα鎖
   アミノ酸残基【遺伝子配列があります。】Ａα鎖アミノ
   酸残基【遺伝子配列があります。】Ａα鎖アミノ酸残基
   【遺伝子配列があります。】Ａα鎖アミノ酸残基【遺伝
   子配列があります。】Ａα鎖アミノ酸残基【遺伝子配列
   があります。】γ鎖アミノ酸残基【遺伝子配列がありま
   す。】γ鎖アミノ酸残基【遺伝子配列があります。】γ
   鎖アミノ酸残基【遺伝子配列があります。】又はそのア
   ミド又は酸付加塩 からなる群から選択される特異性エピトープを有するペ
   プチド。 ５、アミノ酸配列Ｈ＿２Ｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−
   Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＣＯＯＨ又はその酸付加塩を有するペ
   プチドエピトープ。 ６、リンキング及び標識アミノ酸がペプチドエピトープ
   のアミノ末端アミノ酸残基に付着しており、リンキング
   アミノ酸あるいは標識アミノ酸がアミノ末端アミノ酸残
   基と担体タンパク質に付着したリンキングアミノ酸に直
   接付着している必要な場合のリンキングアミノ酸と標識
   アミノ酸に結合した請求項１、２及び５記載のいずれか
   のペプチドを包含しているペプチド免疫原。 ７、リンキング及び標識アミノ酸がペプチドエピトープ
   のカルボキシル末端アミノ酸残基に付着しており、リン
   キングアミノ酸あるいは標識アミノ酸がアミノ末端アミ
   ノ酸残基と担体タンパク質に付着したリンキングアミノ
   酸に直接付着している必要な場合のリンキングアミノ酸
   と標識アミノ酸に結合した請求項３及び４記載のいずれ
   かのペプチドを包含しているペプチド免疫原。 ８、特異性がエピトープのカルボキシル末端のアミノ酸
   配列によって決定される請求項１、２及び５記載のいず
   れかのペプチド。 ９、特異性がエピトープのアミノ末端のアミノ酸配列に
   よって決定される請求項３及び４記載のいずれかのペプ
   チド。 １０、アミノ酸がシステインである請求項６記載のリン
   キングアミノ酸。 １１、アミノ酸がノルロイシンである請求項７記載の標
   識アミノ酸。 １２、請求項１〜５項記載のいずれかのペプチドエピト
   ープに対して生じた単一特異性抗体。 １３、抗体が特異性免疫原で免疫した動物の血液から得
   られる請求項１２記載の単一特異性抗体。 １４、アミノ末端アミノ酸にリンカーアミノ酸を付着さ
   せて標識物質が付着する請求項１記載のプローブペプチ
   ド。 １５、アミノ酸がチロシンである請求項１４記載のリン
   カーアミノ酸。 １６、次の段階 ａ）試料を抗凝血物質と混合し、 ｂ）試料を白血球膜賦活剤と白血球からエラスターゼを
   充分放出させ且つフィブリノーゲンを充分切断する時間
   インキュベートし、 ｃ）フィブリノーゲン切断産物エピトープ含有ペプチド
   を遠心分離し、血漿を集めることにより分離し、 ｄ）エピトープ含有血漿試料を少なくとも１種の単一特
   異性特にエラスターゼ誘発フィブリノーゲン切断産物エ
   ピトープと反応性の抗体と接触させてエピトープ−抗体
   混合物を生成し、 ｅ）反応の程度を血清学的又は免疫学的検定によって測
   定して数値を決定し、 ｆ）実験試料の数値と標準値とを比較する ことを包含している全血試料又は白血球含有体液試料中
   の白血球エラスターゼ誘発フィブリノーゲン切断エピト
   ープ含有ペプチドの存在を検出する方法。 １７、次の段階 ａ）血液試料を抗凝固剤と混合し、 ｂ）血液試料を白血球膜賦活剤と白血球からエラスター
   ゼを充分放出させ且つフィブリノーゲンを充分切断する
   時間インキュベートし、 ｃ）フィブリノーゲン切断産物エピトープ含有ペプチド
   を遠心分離し、血漿を集めることにより分離し、 ｄ）アルコールで処理して血漿タンパク質を沈降させ遠
   心分離し、上澄み液を蒸発乾固し、 ｅ）血漿上澄み液を再構成させ、 ｆ）再構成血漿タンパク質を少なくとも１種の単一特異
   性特にエラスターゼ誘発フィブリノーゲン切断産物エピ
   トープと反応性の抗体と接触させてエピトープ−抗体混
   合物を生成し、 ｇ）反応の程度を血清学的又は免疫学的分析によって測
   定して数値を決定し、 ｈ）実験試料の数値を標準値と比較する ことを包含している全血試料又は白血球含有体液試料中
   の白血球エラスターゼ誘発フィブリノーゲン切断エピト
   ープ含有ペプチドの存在を検出する方法。 １８、次の段階 ａ）試料に白血球又は白血球エラスターゼを加え、 ｂ）白血球を加える場合、試料を白血球膜賦活剤と白血
   球からエラスターゼを充分放出させ且つフィブリノーゲ
   ンを充分切断する時間インキュベートし、 ｃ）試料からフィブリノーゲン切断生成物エピトープ含
   有ペプチドを分離し、 ｄ）エラスターゼ含有血漿試料を少なくとも１種の単一
   特異性特にエラスターゼ誘発フィブリノーゲン切断産物
   エピトープと反応性の抗体と接触させてエピトープ−抗
   体混合物を生成し、 ｅ）反応の程度を血清学的又は免疫学的検定によって測
   定して数値を決定し、 ｆ）実験試料の数値を標準値と比較する ことを包含しているフィブリノーゲンを含むが白血球を
   含まない体液中の白血球エラスターゼ誘発フィブリノー
   ゲン切断産物エピトープの存在を検出する方法。 １９、該膜賦活剤がザイモン、抗原−抗体複合物、補体
   Ｃ５ａ、Ｎ−ホルミル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−ロイシル
   −Ｌ−フェニルアラニンとサイトカラシンＢ、ホルボー
   ル−１２−ミリステート−１３−アセテートとサイトカ
   ラシンＢ、ｎ−ホルミル−Ｌ−ノルロイシル−Ｌ−ロイ
   シル−Ｌ−フェニルアラニンとサイトカラシンＢ又はカ
   ルシウムイオン泳動Ａ２３１８７からなる群から選択さ
   れる請求項１６〜１８、段階ｂ記載のいずれかの方法。 ２０、膜賦活剤がカルシウムイオン泳動Ａ２３１８７で
   ある請求項１９記載の方法。 ２１、抗体が請求項１〜５記載のいずれかの特異性エピ
   トープと反応性である請求項１６〜１８、段階ｄのいず
   れかの方法。 ２２、検定が次の段階 ａ）エピトープ−抗体混合物を特異性抗体に相補的な標
   識プローベと接触させ、 ｂ）エピトープ−抗体−プローベ混合物をインキュベー
   トし、 ｃ）抗体結合プローベを非抗体結合プローベから分離し
   て抗体結合プローブの数値を決 定する ことを包含する請求項１６〜１８、段階ｅのいずれかの
   方法。 ２３、温置が約４℃で約１０〜２０時間又は約３７０で
   約１０分から約２時間である請求項２２、段階ｂ記載の
   方法。 ２４、非抗体結合プローブを分離する方法がクロマトグ
   ラフィー、沈降、免疫沈降又は吸着手法による請求項２
   ２、段階ｃ記載の方法。 ２５、非抗体結合プローブを分離する方法がデキストラ
   ン被覆活性炭の吸着による請求項２４記載の方法。 ２６、患者を１種以上の白血球エラスターゼ阻害剤で治
   療し、患者の全血又は体液のエラスターゼ誘発フィブリ
   ノーゲン切断産物エピトープの存在を請求項１６〜１８
   記載のいずれかの検定によって検出することを特徴とす
   るヒト白血球エラスターゼ阻害剤の効能を評価する方法
   。 ２７、患者を１種以上の白血球エラスターゼ阻害剤で治
   療し、患者の全血又は体液中のエラスターゼ誘発フィブ
   リノーゲン切断産物エピトープの存在を請求項１６〜１
   ８記載のいずれかの検定によって検出することを特徴と
   するヒト白血球エラスターゼ阻害剤の効能を評価する方
   法。 ２８、アミノ末端アミノ酸にリンカーアミノ酸を付着さ
   せて標識物質が付着する請求項３記載のプローブペプチ
   ド。 ２９、アミノ酸がチロシンである請求項２８記載のリン
   カーアミノ酸。