PL164338B1 - Sposób i test do oznaczania antygenu ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu PL PL PL - Google Patents

Sposób i test do oznaczania antygenu ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu PL PL PL

Info

Publication number
PL164338B1
PL164338B1 PL29977389A PL29977389A PL164338B1 PL 164338 B1 PL164338 B1 PL 164338B1 PL 29977389 A PL29977389 A PL 29977389A PL 29977389 A PL29977389 A PL 29977389A PL 164338 B1 PL164338 B1 PL 164338B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
antibodies
cys
antigen
human tissue
plasminogen activator
Prior art date
Application number
PL29977389A
Other languages
English (en)
Inventor
Tadeusz Pietrucha
Czeslaw Czerniewski
Andrzej Plucienniczak
Maria Koziolkiewicz
Andrzej Grajkowski
Genowefa Goss
Andrzej Wilk
Wojciech J Stec
Andrzej Okruszek
Bogdan Uznanski
Original Assignee
Akad Medyczna
Pan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Akad Medyczna, Pan filed Critical Akad Medyczna
Priority to PL29977389A priority Critical patent/PL164338B1/pl
Publication of PL164338B1 publication Critical patent/PL164338B1/pl

Links

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

1. Sposób oznaczania antygenu ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu w próbce zawierajacej ten antygen, z zastosowaniem przeciwcial i odczynnika dajacego sie oznaczyc analitycznie, znamienny tym, ze badana próbke kontaktuje sie z przeciwcialem dla polipeptydu odpowiadajacego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, po czym oznacza sie wytworzony kompleks antygeno-prze- ciwcialo. 5. Sposób oznaczania antygenu ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu w próbce zawierajacej ten antygen, przez wytworzenie kompleksu dwuskladnikowego antygenu w próbce z pierwszym przeciwcialem zdolnym do reagowania z tym antygenem, wytworzenie kompleksu trójskladnikowego przez skontaktowania kompleksu dwuskladnikowego z drugim przeciwcialem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem i wykrywanie obecnosci kompleksu trójskladnikowego za pomoca sygnalu tworzonego przez odczynnik dajacy sie oznaczyc analitycznie lub wyznakowane przeciwciala przeciwimmunoglogulinowe, znamienny tym, ze jako jedne z tych przeciwcial stosuje sie przeciwciala dla polipeptydu odpowiadajacego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu. 9. Test diagnostyczny do oznaczania antygenu ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu z zastosowaniem przeciwcial, znamienny tym, ze zawiera przeciwciala dla polipeptydu odpowiadajacego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu ewentualnie unieruchomione na stalym nosniku lub rozpuszczone w fazie cieklej. 14. Test diagnostyczny do oznaczania antygenu ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu z zastosowaniem przeciwcial, znamienny tym, ze zawiera pierwsze przeciwciala reagujace specyficznie z bialkiem ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu oraz uklad do wykrywania kompleksu antygen- przeciwcialo zawierajacy drugie przeciwciala zdolne do specyficznego reagowania z ludzkim tkankowym aktywatorem plazminogenu oraz ewentualnie przeciwciala przeciwimmunoglobulinowe, przy czym jedne z tych przeciwcial stanowia przeciwciala dla polipeptydu odpowiadajacego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu. PL PL PL

Description

Przedmiotem wymlrz^ jest sposób i test do oaascasncs sntygenu ludzkiego tkrnkowego rktywrton pdszyiaogenu.
Tkrnkowy skrnwsror odszminogenu /t-PA/ pełni kluczowr rolę w sktywscjc oaoczowwgo systemu fcDtnaolirncznego powodując specyficzne ptzekaarsacence niesktnwnego pdszycnogenu w plsayiaę mwiicr fibrynowe skrzepy, będące przyczyną powsżnych askłóceń w funkcjonowrniu ukłrdu krwionośnego. Specyficzność dacrłsair t-PA, w odróżnieniu od innych skrnws4
164 338 torów plazminogenu , takich jak urokinaza czy streptokinaza, polega na tym, ze aktywacja przebiega selektywnie - wyłącznie w miejscach występowania złogów fibrynowych. Otrzymanie po raz pierwszy w 1983 r. aktywnego t-PA metodami inżynierii genetycznej umożliwiło pełniejsze zbadanie charakterystycznych własności tego białka. Okazało się, że t-PA jest najskuteczniejszym środkiem likwidującym skutki zawału serca oraz innych chorób układu krążenia o podłożu zakrzepowym.
Oznaczanie zarówno poziomu jak i aktywności tkankowego aktywatora plazminogenu jest niezbędne podczas monitorowania procesu terapii fibrynolitycznej /zwłaszcza w przypadku zawałów mięśnia sercowego lub wykrzepiania sródnaczyniowego/. Może ono również służyć jako marker wczesnych zmian fizjologicznych w organiźmie /proces nowotworzenza/ jak i zaburzeń hemostazy.
Znane dotychczas sposoby oznaczania ludzkiego t-PA obejmuję dwie główne metody postępowania, wykorzystujące odpowiednio własności enzymologiczne i immunologiczne tego białka.
Pierwsza grupa metod oznaczania stężenia t-PA w osoczu krwi wykorzystuje swoistśsć enzymatyczną tego białka w stosunku do niskoczęsteczkowych substratów syntetycznych, np. S-2288 lub S-2252 /Soeda S. i wsp., Chem. Phar.Bull. 1989, /3/37/ lub plazminogenu. Inny sposób w tej samej grupie metod opiera się na zdolności t-PA do wywołania konwersji plazminogenu w plazminę i oznaczenie jego aktywności poprzez aktywność powstałej plazminy.
Znany sposób wykorzystujący własności immunologiczne uwzględnia zastosowania: a/ radiojodowanych cząsteczek t-PA lub przeciwciał t-PA w metodzie radioimmunologicznej wykonywanej w fazie ciekłej lub stałej, bądź b/ koniugatów przeciwciał dla t-PA z peroksydazą chrzanu w teście typu ELISA /Amiral J. i wsp., Thr. Res., 1988, Suppl. VIII/. Ten ostatni test jest najczęściej stosowany w celu detekcji t-PA. Sposób ten składa się z następujących zasadniczych etapów:
a/ opłaszczenze powierzchni studzienek w płytkach plastikowych przeciwciałami dla t-PA, b/ inkubacja opłaszczonych płytek z materiałem biologicznym lub oznaczanym roztworem t-PA, c/ po dokładnym odmyciu nieswoiście związanych białek, inkubacja płytek z przeciwciałami dla t-PA kowalencyjnie związanymi z peroksydazą chrzanową, d/ wywołanie reakcji enzymatycznej z substratem dla peroksydazy z ocena na podstawie intensywności barwy ilości cząsteczek t-PA związanych z opłaszczoną powierzchnią płytek.
Wszystkie te metody wymagają zastosowania rodzimego białka t-PA, które dotychczas uzyskzwano :
a/ na drodze izolowania z osocza krwi, b/ hodowli komórek nowotworu czerniaka /melanoma/ i izolowania t-PA z płynu hodowlanego, do którego przedostaje się w czasie wzrostu hodowli, c/ przez zastosowanie metody biotechnologicznej polegającej na wyodrębnieniu naturalnego genu kodującego t-PA, ligowemu z wektorem ekspresyjnym z transformowaniu komórek gospodarza.
Wszystkie te metody otrzymania rodzimego t-PA są niezwykle skomplikowane, pracochłonne z kosztowne, co zawyża w znacznym stopniu koszty całego testu oznaczania t-PA.
Nieoczekiwanie okazało się, ze możliwe jest oznaczanie białka rodzimego t-PA w oparciu o metodę, w której stosuje się fragment peptydowy o odpowiedniej domenie wskazanej w sposobie według wynalazku. Stwierdzono, ze można wykorzystać pełną reakcję krzyżową w teście immunologicznym przeciwciał otrzymanych dla fragmentu białka z rodzimej cząsteczki t-PA.
Nieoczekiwanie okazało się, ze w odróżnieniu od znanych metod oznaczania t-PA, przy pomocy wskazanego w sposobie według wynalazku polipeptydu, fragment peptydowy, a nie całe białko może służyć do produkcji swoistych przeciwciał rozpoznających tak samo zarówno fragment peptydowy, jak i rodzime białko. Fragment ten stosuje szę również do uzyskania krzywej wzorcowej.
Sposób oznaczania antygenu ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu polega według wynalazku na tym, ze badaną próbkę, korzystnie materiału biologicznego kontaktuje się z przeciwciałami dla polipeptydu odpowiadającego domlnil podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, po czym oznacza się wytworzony kompleks antygen-przeciwciało.
164 338
W alternatywnej metodzie oznaczania najpierw wytwarza się kompleks dwuskładnikowy antygenu t-PA w próbce z pierwszym przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem, po czym wytwarza się kompleks trójskładnikowy przez skontaktowanie kompleksu dwuskładnikowego z drugim przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem, przy czym jako jedno z tych przeciwciał stosuje się przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu. Obecność kompleksu trójskładnikowego wykrywa się za pomocą sygnału tworzonego przez odczynnik dający się oznaczyć analitycznie lub wyznakowanego przeciwciała przeciwmmunoglobulinowego·
W sposobie według wynalazku stosuje się przeciwciała poliklonalne reagujące specyficznie z białkiem ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu otrzymane przez immunizację zwierząt, polipeptydem odpowiadającym domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, a następnie pobranie krwi i odzyskanie przeciwciał.
Korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje się przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego o sekwencji:
Pro-Val-Lys-Ser-Cys-Ser-Glu-Pro-Arg-Cys-Phe-Asn-Gly-Gly-Thr-Cys-Gln-Gln-Ala-Leu-Tyr-Phe-SerAsp-Pne-Val-Cys-Gln-Cys-Pro-Glu-Gly-Pne-Aia-Gly-Lys-Cys-Cys-Glu-Ile-Asp.
w sposobie według wynalazku stosuje się przeciwciała dla otrzymanego przez ekspresję zrekombinowanego DNa polipeptydu odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu zdolnego do produkcji przeciwciał reagujących specyficznie z białkiem ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu oraz z tym polipeptydem i/lub reagującego specyficznie z przeciwciałami dla tego polipeptydu.
W sposobie według wynalazku, korzystnie stosuje się przeciwciała dla polipeptydu otrzymanego przez ekspresję zsyntetyzowanego cnemicznie ONA o sekwencji:
/X/n CCGG TCAAAAGTTGCAGCGAACCACGA TGTTTCAACGGAGGA
ACCTGCCAGCAGGCACTGTACTTCTCAGATTTCGTGTGCCAGTGT
CCAGAAGGATTTGCTGGAAAATGTTGTGAAATAGAT/y/ n , gdzie X oznacza AATTCATGAGTGAGGAT, Y oznacza CTGGAGAGTCAGGGATAATAAGCT, a n przyjmuje wartość 1 lub 0.
Stosowane w sposobie według wynalazku przeciwciała rozpoznają fragmenty polipeptydowe zawierające epitopy antygenowe również w rodzimej cząsteczce t-PA.
W procesie według wynalazku, korzystnie stosuje się przeciwciała rozpoznające fragment polipeptydowy odpowiadający domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu otrzymane z oligonukleotydowych fragmentów ligowanych in vitro.
Oligonukleotydowe fragmenty można zsyntetyzować chemicznie na nośniku poprzez kolejne przyłączanie nukleozydów z zablokowanymi grupami czynnymi. Korzystnie do ochrony funkcji aminowej stosuje się grupę izopropoksyacetylową, co przedstawiono w opisie patentowym RP nr 159 234.
Fragmenty oligonukleotydowe zsyntetyzowane chemicznie poddają się enzymatycznej reakcji kinazowania, w trakcie której wprowadza się fosforan na końcach 5' za pomocą kinazy polinukleotydowej i ATP. Kinazowane oligonukleotydy liguje się in vitro w dwuniciowe odcinki ograniczone sekwencjami rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne. Zligowane odcinki klonuje się w wektorze pomocniczym. Poprawność sekwencji produktów ligowania i klonowania tych fragmentów sprawdza się poprzez sekwencjonowanie metodą Maxama-Gilberta. Można stosować różne wektory pomocnicze, np pucl9. Sklonowane w wektorze odcinki ONA namnaża się w komórkach gospodarza, którymi mogą być bakterie, drożdże i inne. Wektory z wklonowanymi odcinkami izoluje się, a następnie odcinki odzyskuje się po trawieniu restryktazami na drodze elektroforezy w żelu poliakryloamidowym. Odzyskane odcinki włącza się do wektora ekspresyjnego po trawieniu odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Na tym etapie stosuje się różne wektory ekspresyjne, korzystnie plazmidowe lub fagowe. Przykładowo plazmid ekspresyjny pWR 450.1. zawiera gen kodujący β-galaktozydazę. Komórki gospodarza, korzystnie bakterii transformowane zrekombinowanym wektorem, są po namnożeniu źródłem fragmentu białka ludzkiego t-PA.
164 338
Wytworzony w ten sposób fragment białka t-PA można stosować do otrzymywania przeciwciał różnymi znanymi metodami, oraz do wykreślenia krzywej wzorcowej niezbędnej do ilościowego oznaczania t-PA.
Otrzymane w ten sposób przeciwciała można zastosować do oznaczania antygenu ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu poosbbem wddług wyailazku, orzz oo otrzmaania testu diagnostycznego do oznaczania tego antygenu według wynalazku.
Badaną próbkę, w której wykrywa się i oznacza antygen t-PA kontaktuje się i inkubuje z przeciwciałami reagującymi specyficznie z tym antygenem. Utworzenie kompleksu dwuskładnikowego antygen-przeciwciało wykrywa się i oznacza za pomocą środka wykrywającego i sygnalizującego reakcję immunologiczną, ja k na orzykła d ο^θοινοιθΙο reguująca seeyyficzme z t-PA znakowane odczynnikiem dającym się oznaczyć analitycznie.
Śoodek wykrawający i sygnalizujący reakcję immunologiczną może być obecny podczas inkubowania antygenu z przeciwciałem. Na przykład można bezpośrednio wyznakować przeciwciała kontaktowane z badaną próbką i po przemyciu produktu reakcji uzyskać sygnał. Środkiem jest wówczas sam znacznik. Środek wykrywający można tez dodać dopiero po wytworzeniu kompleksu dwuskładnikowego i usunięciu alepozerragowanrgo materiału. Wykrywanie i oznaczanie sposobem według wynalazku prowadzi się wówczas następująco: dwuskładnikowy kompleks antygenpozeciwciało po odmyciu kontaktuje się z drugim przeciwciałem reagującym specyficznie z t-PA, przy czym jako jedno z tych przeciwciał stosuje się przeciwciało dla polipeptydu odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu. Pozostałym /pierwszym lub drugim/ przeciwciałem może być przeciwciało dla całej cząsteczki t-PA. Otrzymuje się wówczas kompleks trójskładnikowy przeciwciało-antygen-przeciwciało. Drugie przeciwciała mogą być bezpośrednio znakowane odczynnikiem dającym się oznaczyć analitycznie. Alternatywnie, stosuje się układ dwuskładnikowy zawierający drugie przeciwciała tworzące kompleks trójskładnikowy, który wykrywa się za pomocą przeciwciała prreciwlmmunoglobulinowego.
Do znakowania można stosować enzym biotynę, izotop promieniotwórczy, przykładowo lub inne znane odczynniki. Wykrywanie i oznaczanie prowadzi się za pomocą sygnału wytwarzanego przez znacznik.
W tak prowadzonym procesie oznaczania lub wykrywania badaną próbkę, oznaczany antygen lub jedno z przeciwciał, korzystnie pierwsze, uairruchαmia się na stałym nośniku takim jak płytka plastikowa, bibuła nitrocelulozowa lub inne.
Wykrywanie i oznaczanie dogodnie jest prowadzić za pomocą testu diagnostycznego.
Test diagnostyczny według wynalazku zawiera przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazmiaogenu, ewentualnie unieruchomione na stałym nośniku lub rozpuszczone w fazie ciekłej.
Przeciwciała są związane z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie.
Alternatywnie test diagnostyczny według wynalazku zawiera pierwsze przeciwciała reagujące specyficznie z białkiem ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, oraz układ do wykrywania kompleksu antygen-przeciwciało zawierający drugie przeciwciała zdolne do specyficznego reagowania z ludzkim aktywatorem plJzminogrnu i ewentualnie przeciwciała porrclwlmmuaoglobullaowr| pozy czym jedne z tych przeciwciał stanowią przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plaminogenu. Korzystnie pierwsze przeciwciała są związane z fazą stałą lub ciekłą.
Test może dodatkowo zawierać nośnik stały lub ciekły dla związania próbki zawierającej antygen.
Układ do wykrywania kompleksu antygen-przeciwciało zawiera, korzystnie drugie przeciwciała bezpośrednio związane z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie albo też układ ten zawiera trzecie przeciwciała poreclwimmuaoglobulinowr związane ze znacznikiem.
W sposobie i testach do ludzkiego tkankowego aktywatora g^^^ogmu, można stosować przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego jego domenie podobnej do EGF wytworzone różnymi metodami.
164 338
Przeciwciała dla t-PA w badanej próbce, korzystnie w materiale biologicznym, można wykrywać w ten sposób, ze polipeptyd odpowiadający domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu kontaktuje się z badaną próbkę aż do związania przeciwciał, po czym wykrywa się produkt reakcji immunologicznej.
Reakcję, korzystnie prowadzi się w roztworze.
Dogodnie jest stosować test diagnostyczny do wykrywania antygenu t-PA zawierający przeciwciała rozpoznające polipeptyd odpowiadający domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, związanym z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie.
Do znakowania można stosować znane metody.
W opisie i przykładach używane są następujące skróty:
A: adenina C : cytozyna B : guanina T: tymina
Ala: alanina
Arg: arginina
Asn : asparagina
Asp : kwas asparaginowy
Cys : cysteina
Gin : glutamina
Glu: kwas glutaminowy
Gly: glicyna
His : histydyna
Ile : izoleucyna
Leu : leucyna
Lys: lizyna
Met : metionina
Phe: fenyloalanina
Pro : prolina
Ser : seryna
Thr: treonina
Trp : tryptofan
Tyr : tyrozyna
Val: walina
DNA: kwas dezoksyrybonukleinowy cDNA: komplementarny DNA
Tris-HCl: chlorowodorek trójhydroksymetyloaminometanu EDTA: kwas etylenodwuaminoczterooctowy
10xbufor Eco R1
10xbufor do kinazowania
100 mM Tris-HCl pH 7,5 1 M NaCl mM /3-merkaptoetanol
0,7 M Tru HCl pH 7,6
0,1 M MgCl2 mM ditiotreitol
10xbufor ligacyjny:
Bufor do ekstrakcji
660 mM Tris-HCl pH 7,6
50 mM MgCl2
50 mM. . ditiotreitol
10 mM ATP
50 mM Tris-HCl pH 8,1
300 mM octan sodu
4 mM EDTA
164 338
Pożywka LB 10 S bacto trypton
5 S Yoast Exzract
5 S NaCl
na 1 lizr roztworu
Bufor TE 10 mMI Tris-HCl pH fi
1 mM EDTA
Bufor z SDS 10 S Tris-HCl pH Θ,Ο
77 g glicyny
1 S SDS
na 1 litr roztworu
Bufor do lizy komórek 150 mg Tris
400 mg SDS
1 ml /-morkaptegtanel
2 ml glicerolu
7 ml wody
Bufor R I 55 mM glukoza
10 mM EDTA
25 mM Tris-HCl pH 8,0
4 mg/ml lnzozymu /Pharmacia/
Bufor R II 0 ,2 M NaOH
1 % SDS
Bufor R III 60 ml 5 M octan ppozau
11.5 ml kwas octewy lodowaty
28.5 ml H2O
DTT : dmot reitol
SDS: siarczan dodecyln sodu
PBS: zbuforowany roztwón soln ^ιΙο^ιμοΙ
ATP : trójfostoran adenozyny
HPLC: wysokociśnieruowa chromatogafia cieczowa.
Na załączonych rysunkach fig. 1 przedstawia wykres hydrofobowo^i łańcucha polnpobZydowego t-PA do wytwarzania przeciwciał użytych w sposobie według wynalazku. Fig. 2 przedstawia sekwencję fasgoentu gnnu luZkigeoo t-PA odZzieloną aa fasgeenty tyzgztzeownne chemicznie. Fig. 3 przedstawia schemat konstrukcji fragmentu gonu dla t-PA sklonowanego a oeZo-rzo ^kombinacyjnym pUC-19 oraz ekspresyjnym pUR 450. Fig.4 przedstawia elektroforezę w zolu pelnakrtlergldewyg zawierającym SDS ekstraktów białkowych otrzymanych z komórek E.coli oraz oczyszczonego kompleksu białkowego z-PA z /-salaktozydazą: 1,2- ciałka iykluzylyo rozpuszczono w 6 gol.geczyiku, 3-cryuty komusat /^-galakzozydaza-II domena t-PA/ po usunięciu mocznika /dializa wobec zbuSereuαygse roztworu soli fizjologicznej, B.Iggunobloznng sprawdzający czysty preparat. Fig. 5 przedstawia schemat rozbicia kompleksu białkowego i oczyszczania domeny z-PA o budowie podobnej do EGF.
Wynalazek jest bliżej wylalnneyy w przykładach wykonania nio ograniczających jogo zak rosu.
Przykład 1.
Etap 1.
Ao Synteza elngenuklgeJydów.
Syntezę 18 olisonuklgezydewych fragmentów /fis. 2/ przeprowadza się mozodą agndeSesforynową na stałym nośniku. Jako nośnik szesulo się szkło o kontrolowanej porowatości, zypu
164 338
LCA-CPG, ze związaną pierwszą jednostką nukleozydową. Jednostka ta ma przyłączoną na końcu 5'-OH dezoksyrybozy blokującą grupę kwasolabilną - dimetoksytrityl /DMT/, która usuwa się w środowisku kwaśnym. Odsłonięta w ten sposób grupa 5'-OH jednostki nukleozydowej przyłącza prekursor kolejnej jednostki: 3'-amidofosforyn odpowiedniego nukleozydu. Za pomocą jodu w obecności wody dokonuje się utlenienia grupy fosforynowej do fosforanu. Następnie usuwa się DMT z przyłączonej jednostki - tym samym cykl rozpoczyna się na nowo. W celu usunięcia nllprzlrlagowanych jednostek z wolnymi grupami 5*-OH stosuje się t.zw. capping, tj. zablokowanie pomyłkowych sekwencji przez acltylowanil bezwodnikiem octowym w obecności aktywatorów. Po utworzeniu żądanego oligonukleotydu odcina się go od złoża i usuwa inne grupy wodnym roztworem amoniaku, oczyszcza llektroforetycznll, następnie odsala metodą HPLC. /Waters C-18 RP, 10 pm/. Oligonukleotydy przechowuje się w porcjach po ok. 0,5 OD.
3. Proces kinazowania i ligacji.
Poszczególne fragmenty nzcz DNA rozpuszcza się w wodzze destylowanej, tak aby w 5 pl znajdował się 1 pg fragmentu. Miesza się po 5 pl roztworu fragmentów od 1 do 9 /I nic DNA/ i od 10 do 18 /II nic CNA/. Do mieszaniny fragmentów dodaje się 0,1 objętości buforu do kinazowania /50 mM Trzs-HCl, 5 μΜ MgClg/, 5 pl 20 mM ATP, 1 pl kinazy polinukleotydowej 8 /T4 polinukllotidl kinase/. Reakcję prowadzi szę przez 4 godziny w temperaturze 37°C. Miesza się obie nici i inkubuje przez 20 minut w temperaturze 100°C. Po powolnym ostudzeniu dodaje się do każdej próbki po 0,1 objętości buforu do ligacji, po 1 pl 200 mM ATP, pl ligazy T4. Po dokładnym wymieszaniu reakcję prowadzi się 12 godzin w temperaturze 4°C. C. Hydroliza enzymami.
Do rozpuszczonego DNA /80 pl/ dodaje się 10xbuforu EcoRZ, 20 restryktazy EcoRI /firmy Pharmacia / oraz wody ao objętości 100 pl. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Po tym czasie DNA stręca się etanolem, dodając 3 objętości alkoholu etylowego /99,8%/, wymraża się w -20°C przez 5 minut, a następnie odwirowuje się przy 15 tys. obr., przez 5 minut. Osad rozpuszcza się w 20 pl buforu TE. W ten sam sposób postępuje szę podczas hydrolizy restryktazy Hind III.
O. Rozdział ellktroforltyczny.
W celu sprawdzenia czy zligowane fragmenty DNA maję odpowiednią długość, rozdziela szęje 3% żelu poliakryloamidowym z SDS w TBE. Rozdział prowadzi się przy napięciu 130V w czągu 3 godzin. Żel zabarwia się bromkiem etydyny /0,5 pg/ml - firmy Serva/ przez 20 minut w temperaturze pokojowej , następnie płucze się 2 x woda destylowaną. Rozdzielone produkty obserwuje się pod lampą uv. W celu oceny wielkości fragmentów DNA podczas elektroforezy używa się następujących wzorców; pUC 19 trawiony Msp, pUC 19 trawiony Bsp RI. Zligowane fragmenty posiadają oczekiwaną długość. Po elektroforezie sprawdzającej wykonuje się elektroforezę preparatywną i uzyskuje się tą droga fragment, który następnie liguje szę z plazmidem pUC 19 trawionym Eco RI i Hind III w sposób wyżej opisany.
E. Przygotowanie kompetentnych komórek.
Z płytki z wysianymi bakteriami DHS, pobiera się jedną kolonzę, którą szczepi się na 5 ml pożywkę LB. Bakterie hoduje się w temperaturze 37°C przez 18 godzin. Do 100 ml pożywkz LB dodaje się 2 ml otrzymanej hodowli i prowadzi się hodowlę do gęstości optycznej OD 600=0,3. Zawiesinę bakterii zwirowuje się /5 tys. obr. 20 min./, a osad bakteryjny schładza się z zawiesza w 50 ml buforu SB i umieszcza w temperaturze 0°C. Zwzrowuje szę jak wyżej, a osad zawiesza w 1/12 objętości wyjściowej buforem SB. Inkubuje się 20 minut w temperaturze 0°C. Po tym czasze z zawieszonych komórek pobiera się do sterylnych probówek po 200 pl zawiesiny komórek i inkubuje 30 minut w 0°C. Dodaje się 7 pl DTT i plazmidy /20 pl/. Inkubuje szę w lodzie /0°C/ 30 minut, a następnie 45 sekund w 45°C. Ochładza się w lodzie i dodaje 800 pl pożywki LB, a następnie inkubuje 1 godzinę w 37°c. Po tym czasze posiewa szę na płytki. Wylewa się 200 pl mieszaniny ligacyjnej na płytkę z inkubuje szę w 37°C przez 18 godzin.
164 338
F. Analiza otrzymanych transformantów.
Po 18 godzinach na płytce z wysianą mieszaniną transformacyjną obserwuje się pojedyńcze kolonie. Do dalszej analizy wybiera się 10 kolonii. 5 ml pożywki szczepi się pojedyńczymi koloniami i hoduje w 37°C przez 18 godzin, a następnie izoluje plazmidowy DNA. Preparatyka plazmidowego DNA z 5 ml pożywki przebiega w następujący sposób: Bakterie zwirowuje się /5 minut 5 obr./min./. Osad bakteryjny zawiesza się w 200 ul buforu RI i przetrzymuje 5 minut w temperaturze 0°C. Dodaje się 400 pl RII /0°C/, a następnie 300 pl RIII /0°C/. Całość zwirowuje się /15 tys. obr./min., 5 minut/. Supernatant przenosi się znad osadu do nowej probówki i dodaje się 2,5 objętości izopropanolu. Wymraża się w -20°C, zwirowuje, osad płucze 70% etanolem i suszy pod próżnią. Osad rozpuszcza się w 200 pl TE i dodaje 20 pl roztworu RNazy o stężeniu 1 mg/ml. Inkubuje się 30 minut w 37°C. Dodaje się 200 pl fenolu. Zbiera się fazę wodną i dodaje 200 pl mieszaniny chloroform/alkohol izoamylowy /24il, v/v/. Zwirowuje się, zbiera supernatant, czynność powtarza się jeszcze raz. Do fazy wodnej dodaje się 0,1 objętości 3 P octanu sodu /pH=5,2/ oraz 2,5 objętości etanolu i wymraza 30 minut w -20°C. Zwirowuje się /15 tys. obr./min./, a osad przemywa 70% etanolem i suszy. Osad plazmidowego DNA rozpuszcza się w 40 pl buforu TE.
W celu wybrania klonu zawierającego plazmid pUC 19 z wklonowanym dwuniciowym fragmentem, przeprowadza się analizę otrzymanych DNA plazmidowych przy użyciu enzymów restrykcyjnych EcoRI i Hind III, a produkty trawienia rozdziela się w żelu poliakryloamidowym. Trawienie przeprowadza się jak w punkcie C, a rozdział elektroforetyczny jak w D.
G. Sprawdzenie sekwencji klonowanych fragmentów.
W celu upewnienia się czy sekwencja sklonowanego fragmentu jest prawidłowa, fragmenty sekwencjonuje się metodą Maxama i Gilberta /Maxam Gilbert, Methods in Enzymology,
1980, 65/.
H. Konstrukcja wektora ekspresyjnego.
Sprawdzony, dwuniciowy fragment DNA kodujący polipeptyd odpowiadający domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu liguje się z wektorem ekspresyjnym pWR 450.1 trawionym enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Hind III. Uzyskuje się w ten sposób zrekombinowany plazmid ekspresyjny pW-t-PA. Transformowania tego wektora do komórek bakteryjnych odbywa się w sposób opisany w punkcie E.
I. Oczyszczanie ciałek inkluzyjnych.
Bakterie z kolonii bakteryjnej zawierającej zrekombinowany plazmid przenosi się do probówki zawierającej 1 ml pożywki LB + 5 pl ampicyliny o stężeniu 100 pg/ml i inkubuje przez 2-5 godzin w temperaturze 37°C, z ciągłym wytrząsaniem. Zawiesinę bakterii namnożonych w tej probówce przenosi się do kolby zawierającej 1 l pożywki LB + 1 ml ampicyliny o stężżniu 100 pg/ml. Hodowlą ppowaddi się 11 goozin, w ternppraaurze 37°C z ciąąłym wyyrzęsaniem. Następnie bakterie zaiooauje się /15 min., 5000 ob^/min./ i osad zawiesza się w 200 ml 0,1 P CaCl^ /buforowanym Trisem, pH=7,5/. Po inkubacji przez 20 minut w łaźni lodowej, zawiesinę wiruje się przez 20 minut przy 12000 obr^mic. w temperaturze +4°C/ i osad ponownie zawiesza się w 200 ml 0,1 M CaC^. Po kolejnej inkubacji przez 2 godz. w łaźni lodowej zawiesinę wiruje się /w dwóch probówkach wi^wniczy^/ j.w. Osad zawiesza się w 20 ml /do obu probówek dodaje się po 20 ml/ buforu fosforanowego, pH 6,2, a następnie dodaje się po 200 pl 1 M glicerolu i 400 pl 1% glicerolu do obu probówek. Ogrzewa się je do temperatury pokojowej, dodaje po 40 pl 0,5 M EDTA, pH 8,0 i po krótkiej inkubacji schładza w łaźni lodowej do tPHeaaętar y ok . 0°C . Zoętępnl e rrbbówk i wstawi a n ę na 1 nnut ę do łaźni o temperaturze 42°C /szok termiczny/. Wiruje jak wyżej.
Osad po schłodzeniu zawiesza się w 100 ml 100 mM Tois-HCI, pH 8,0, zawierającym 10 pM EDTA, inkuDuje przez 5 iiut t h tρperaętarel 0°H i dalaΓawuJθ. Oad l zwii^ai nę h 5 l ml 100 mM Tril-HCl, 10 pm ETTA , 10H ml B-ME . l ml PMSF , IH rnoni X1iOO , Hi 0,. . oddaae i nę go działaniu ultradźwięków - 10 razy po 30 sek., po czym odwirowuje się /20 000 obr/Pli.,
164 338 min., temp. +4°C/ otrzymując w ten sposób osad ciałek inkluzyjnych, które następnie przemywa się zawieszając je w 35 ml buforu 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA. Po ponownym ich zwirowaniu rozpuszcza się je w 9 M moczniku. W celu pozbycia się reszty zanieczyszczeń /nierozpuszczonych ciałek inkluzyjnych/ zawiesinę ponownie wiruje się /20 000 obr./min., 30 min., temp. +4°C/. W supernatancie winna znajdować się główna część białka. Dalsze oczyszczania koniugatu zawierającego II domenę t-PA przeprowadza się na kolumnie chromatograficznej DEAE-Sephacel.
8iałka zawarte w ciałkach inkluzyjnych rozpuszczone w 9 M moczniku dializuje się do roztworu 6 M mocznika, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, zawierającego 10 mM EDTA, 1 mM PMSF. Tym samym buforem równoważy się dwie kolumny wypełnione złozem DEAE-Sephacel /o wymiarach 2,5 x 10 cm/ Na jedną z nich nanosi się roztwór białek. Część białka, która po przejściu przez kolumnę nie zwiąże się ze złożem, nanosi się /po 2-3 krotnym rozcieńczeniu/tym samym buforem na drugą kolumnę. Czysty koniugat wymywa się ze złoża 0,1 M NaCl.
J. Rozbicie kompleksu na drodze reakcji chemicznej.
Oczyszczone białko hybrydowe złożone z fragmentu β-galaktozydazy oraz II domeny t-PA dializuje się wobec buforu 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 w celu usunięcia mocznika, a następnie liofilizuje. Rozszczepienie wiązania Asp-Pro następuje w środowisku 75% kwasu mrówkowego.
Zliofilizowany koniugat rozpuszcza się w kwasie mrówkowym /ok. 1 mg białka na 1 ml kwasu/ i nastawia się 16-godzinną inkubację w temperaturze pokojowej. Następnie usuwa się kwas w wyparce próżniowej i hydrolizat rozpuszcza się w 0,1% TFA /kwas trifluorooctowy/. Rozbicie koniugatu sprawdzono elektroforetycznie. Produkty powstałe w wyniku tej reakcji analizuje się w żelu poliakryloamidowym po elektroforezie.
K. Sposób wyodrębniania domeny podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu za pomocą HPLC.
Fragment polipeptydowy odpowiadający domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu izoluje się z hydrolizatu otrzymanego w sposób jak opisano w punkcie H za pomocą HPLC. Rozdział chromatograficzny przeprowadzono na kolumnie semipreparatywnej TSK G3000SW firmy LKB, Szwecja.
Etap 2.
A. Otrzymanie przeciwciał
W celu otrzymania surowicy poliklonalnej dla fragmentu białka ludzkiego t-PA immunizuje się tym białkiem króliki. Sródskórnie podaje się na drodze 30 - 40 injekcji dawki 50 μg antygenu w 0,5 ml PBS i wymieszanego z 0,5 ml kompletnego adiuwantu Freuda. Po 7 dniach od każdego szczepienia pobiera się krew z żyły usznej królików. Po wykrzepieniu w temperaturze 37°C przez 0,5 - 1,0 godziny, skrzep oddziela się od ścianek probówki i całość pozostawia w temperaturze 4°C na 12 - 24 godziny. Następnie surowicę odciąga się do jałowych probówek wirówkowych i wiruje przy 3 000 obr/min. przez 20 minut. Surowicę inaktywuje się podczas inkubacji przez 30 minut w temperaturze 56OC. Miano poszczególnych próbek surowic określa się metodą radioimmunologiczną, oznaczając ich zdolność do wiązania znakowanego anty genu. Surowice o najwyższym mianie przeciwciał przechowuje się w temperaturze -20°C.
B. Oczyszczanie przeciwciał i ich skoniugowanie z peroksydazą.
Przeciwciała dla fragmentu t-PA oczyszcza się z surowicy odpornościowej za pomocą chromatografii powinowactwa.
Immunoadsorbent zawiera fragment ciałka t-PA związany ze złożem CNBr-Sepharose 4B /Pharmacia/. W celu przygotowania immunoadsorbentu 1 g złoża przemywa się 200 ml roztworu 0,001 mo1/1 HCl i następnie zawiesza w buforze boranowym /pH 8,3/. Natychmiast dodaje się 20 mg fragmentu białka t-PA rozpuszczonego w PBS i delikatnie miesza w temperaturze 4°c przez 2 godz. Po odwirowaniu sprawdza się stężenie białka w supernatancie. Złoże zawiesza
164 338 się następnie w roztworze glicyny /2 mol/l/ w buforze beraneuym o pH 8.3. Po 1-gedznnnoj inkubacji odwirowuję się jo /10 min. 4 000 edr/miy/ i przemywa się jo 3x buforom borayeuyg /pH 8,3/, 1x wodę destylowaną, 3x buforom doranouym /pH 8,3/. Z otrzymanym w zon sposób złożom nnkubujg się 15 ml surowicy otrzymanej po immunizacji fragmentom białka z-PA, delikatnie mieszając przez 12 - 14 godzin w temperaturze 4°C. Do mnouzryiyy dodaje się 1 mM PMSF /Sigma/ oraz 1 mM chlorku doyzαmidyyy /Biochogncal/. Po odwirowaniu /10 min., 3.000 edr/mnn/ złoże przemywa się buforom /PBS z 1% Twoon 20/, a następnie 4x buforom /1 M/l NaCl z 1%
Twoon 20 w PBS/. Po każdym wnrowrynu sprawdza się zawartość białek w supornanzaycię poprzez pomiar adsorpcji światła przy 280 nm. Następnie złożę umieszcza się w kolumnie /0,7 x 10 cm/ Przeciwciała specyficznie związano z unieruchomionym na złożu białkiem gluujo się roztworom 0,5 mol/l kwasu octowego i zbiera się do probówek zawierających 100 pl rozzworu 2 mol/l Tris. Frakcjo o dużoj zawartości białka łączy się i dializuję wobec PSS przez 24 godziny w 4°C.
C. Sprzęganie przeciwciał z poroksydazą.
Uzyskano w zon sposób przeciwciała dla fragmentu białka z-PA sprzęga się z porokuydrzę.
W zym celu rozpuszcza się 5 mg HRPO w 1 ml świeżo przygotowanego 0,3 M kwaśnego węglanu sodu /NaHCO3/, PH 8,1. Następnie dodaje się 0,1 ml 1% FDNB w alkoholu absolutnym. Delikatnie wytrząsa się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dodaje 0,04 - 0,08 M NaJl^ /rozpuszcz w wodzię doszyl./, delikatnie miesza przez 30 min. w temperaturze pokojowej. Kolor togo roztworu winien szac się zielonożółty. Następnie dodaje się 1,0 ml 0,16 M glikolu etylenowego /rozp. w wodzie dosz./ i delikatnie miesza w temperaturze pokojowej przoz 1 godzinę.
Po zakończeniu inkubacji roztwór dializuję się wobec 0,01 M węglanu sodu, pH 9,5, temperatura 4°C /co najmniej 3 ^litrowo zmiany/. Do 3 ml roztworu zak przygotowanego aldehydu poroksydazy /HRPO/ dodaje się 5 mg IgG i delikatnie miesza przez 2-3 godzin w temperaturze pokojowej. IgG rozpuszcza się w 1 ml bufin węglanowego przed zmieszaniem lub dodaje w postaci zlnofnlizeuayęgo proszku wolnego od soli. Po dodaniu IgG wprowadza się 5 mg NaBH^ i bezouzrwia w 4°C od 3 do 12 godzin. Następnie roztwór dializuje się w 4°C wobec PBS. Oośli powstajo brocypnzati usuwa się go przoz wirowanio. Próbkę nanosi się na kolumnę /85 x 1,5 cm/, Sophadox G-100, zrównoważoną PBS. Zbiera się frakcję po 1,5 ml i peznom białka w poszczególnych akcjach oznacza spektrofotomet^cnie. Frakcja IgG znakowanych HRPO schodzi w pierwszym szczycie. Roztwory jogo keniusαzu przechowuje się w obecności albuminy surowicy wołowej o stężeniu 10 mg/ml w temperaturze -20°C.
Etap 3.
Detekcja antygenu z-PA w badanej próbce zo pomocą przeciwciał dla fragmentu belnpopzydowogo odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora blazmnnegęnu.
Do roztworu antygenu w badanej próbce dodaje się wyznakowano boroksydazę przeciwciała dla fragmentu polnbępzydewęso odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywazora plrzgnnogoyu i nnkuduję się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Do wywołania reakcji enzymatycznej uteuuJo się roztwór subst^tu - ortoSoyylodnamnny w 0,05 M buforze cytrynianoNym, pH 5,0, zawierającym 0,02% H2O2. Po 6 min. inkubacji pojawia się zabarwienie i reakcję hamuję się przoz dodanie 3 M kwasu siarkowego. AdsorbancJy mierzy się przy 492 nm. Wynik odczytuje się z krzywej wzorcowej wykreślonej dla standardowego roztworu z-PA.
Przykład II.
Wykonanie toszu ELISA zypu kanapkowego przy wykorzystaniu przeciwciał szosowanego w sposobie według wynalazku.
Studzionki w płytce do tostu ELISA opłaszcza się przeciwciałami boliklonalnygn dla fragmentu bolipoptydeuose odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora blazmnnosoyu o stężeniu 10 pg/ml, zawieszonymi w 50 mM buforze fosforanowym o pH 7.5. Nięzunązryo białko odmywa się, a powierzchnio studzienek opłaszcza albuminą su164 338 rowiczą. Testowane próbkz osocza rozcieńcza szę przed oznaczeniem 50 mM buforem fosforanowym, pH 7,5, zawierającym 0,15 M NACI, 10 mM EDTA, 1% Tween 20 z 1% BSA Z dodaje się po 200 pl/dołek. Inkubuje szę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji płytkz 5-krotnze przemywa się 0,15 M NaCl zawierającym 0,1% Tween 20. Następnie dodaje się 200 pl koniugatu IgG-HRP /przeciwciała polzklonalne dla t-PA związane z peroksydazą/ o stężeniu 5 pg/ml. Inkubuje 2 godziny w temperaturze pokojowej i ponownie 5-krotnze przemywa. W celu wywołania reakcji enzymatycznej dodaje się po 200 pl roztworu substratu /0,4 mg/ml ortofenylodiamzny w 0,05 M buforze cytrynzanowym, pH 5,0, zawierającym 0,02% Hgl^/.
Po 15 minutach inkubacji pojawia szę zabarwienie i reakcję hamuje się przez dodanie 50 μΐ 3 M kwasu siarkowego. Adsorbancję mierzy szę przy 492 nm. Wynik odczytuje się z krzywej wzorcowej wykreślonej dla standardowego roztworu t-PA w analogiczny sposób jak wyżej.
Przykład III.
Zastosowanie fragmentu polipeptydowego odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminoganu, do oznaczania poziomu przeciwciał dla t-PA w badanej próbce, stosowanych w sposobie według wynalazku.
Fragment polipeptydowy odpowiadający domenze podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu znakuje się izotopem jodu olqq radioznakowanego ligandu /ok. 60 000 cpm/ dodaje się 100 pl badanej próbki /np. rozcieńczonej surowicy/ i znkubuje się 12 - 16 godzzn w 4°C. Następnie dodaje szę przeciwciała przeczwzmmunogloOulznowl /np.
IgG królicze przeciw IgG ludzkim/. Po 2-goαzinneJ inkubacji w temperaturze pokojowej zwzrowuje się immunoprecypztat z przemywa szę zbuforowanym roztworem solz fizjologicznej. Radioaktywność osadów mierzy szę licznikiem gamna. Pozzom przeciwciał dla t-PA odczytuje się na podstawie radioaktywności z krzywej wzorcowej dla standartowych przeciwciał dla t-PA w sposób analogiczny jak wyżej opisany.
Przykład IV.
Zestaw testowy dla oznaczania poziomu ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu składa się z: pojemnika zawierającego zbuforowany roztwór solz fizjologicznej /PBS/, pH 7,5, EDTA, Tween 20; pojemniczka z albuminą surownzcząj pojemniczka z przeciwciałami dla fragmentu polipeptydowlgo odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu; pojemniczka z wyznakowanymi peroksydazą przeciwciałami dla t-PA; pojemnzczka z substratem /ortofenyloαiaminę/; pojemniczka z buforem cytrynzanowym, pH 5,0 i pojemnzczka z 3 M kwasem siarkowym.
164 338
ΑΑ1TGATGAGTCAGGA7CCGGTCAAAAGTTGCAGCGAACCACGATGTTTCAACGGAGGA GTAC1CAGTCGTAGGCCAGTTTTCAACGTCGCTTGGTGCTACAAAGTTGCCTCCT
AGC1GGGAGGAGGCAGTG7ACTTCTCAGATTTCGTGTGCCAGTGTCCAGAAGGATTTGC 1GGAGGGTCG7CCG7GAGATGAAGAGTCTAAAGCACACGGTCACAGGTCTTCCTAAACG
1GGAAAA7 G1 TG TPAAATAGA7 CTGGAGAG 7CAGGGA 7 AATA
ALGI 1 1 IAGAAGAG7I1 A7C7AGACG7G7CAG7CCCTATTATTCGA
5'
X. GlAG7GAGIGCTAGGCCAG
2. 7TTIGAAGG7CGCΓ dolna nić
3- TGG7GCTACAAAGTTGCCrc
4. C7TGGACGGTGGTC
5. CGTGACATGAAGAGTCTAAA
b. GGAGAGGGTCACAG
7. G7CTTCCTAAACGACCTTT7A
Θ. CAAGACTT1ATCTAG
9. ACCTCTCAGTCCCTATTATTCGA
10. ATAATAGGGACTGAGA
11. GGIGTAGATAAAGTGTTGTAA górna nić
12. AAGGTCGΓΤΤAGGAA
13. GACCTGTGACCGTGTGCTTT
14. AGACTCTTCATGTC
15. ACGGACGACCGTCCAAGGAG
16. GCAACTT1G7AGCA
17. CCAAGCGACGTTGAAAACTG
1Θ. GCCTAGGACTGAGTAGTTAA

Claims (19)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób oznaczenia antygenu ludzkiego tkankowego aktywatora plazminagenu w próbce zawierającej ten antygen, z zastosowaniem przeciwciał i odczynnika dającego się oznaczyć analitycznie, znamienny tym, że badaną próbkę kontaktuje się z przeciwciałem dla polipeptydu odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, po czym oznacza się wytworzony kompleks antygen-przeciwciało.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje się przeciwciało dla fragmentu polipeptydowego o sekwencji:
    Pro-Val-Lys-Ser-Cys-Ser-Glu-Pro-Arg-Cys-Phe-Asn-Gly-Gly-Thr-Cys-Gln-Gln-Ala-Leu-T yr-Phg-Ser-Asp-Phe-Val-Cys-Gln-Cys-Pro-Glu-Gl.y-Phe-Ala-Gly-Lys-Cys-Cys-Glu-Ile-Asp.
  3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego otrzymanego przez ekspresję zrekombinowanego DNA.
  4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się zsyntetyzowany chemicznie DNA o sekwencji:
    /X/nCCGGTCAAAAGTTGCAGCGAACCACGATGTTTCAACGGAGGA
    ACCTGCCAGCAGGCACTGTACTTCTCAGATTTCGTGTGCCAGTGT
    CCAGAAGGATTTGCTGGAAAATG TTGTGAAATAGAT/ y/ n , gdzie x oznacza AATTCATGAGTCAGGAT, y oznacza CTGGAGAGTCAGGGATAATAAGCT, a n przyjmuje wartość 1 lub 0.
  5. 5. Sposób oznaczania antygenu ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu w próbce zawierającej ten antygen, przez wytworzenie kompleksu dwuskładnikowego antygenu w próbce z pierwszym przeciwciałem zdolnym do reagowania z tym antygenem, wytworzenie kompleksu trójskładnikowego przez skontaktowanie kompleksu dwuskładnikowego z drugim przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem i wykrywanie obecności kompleksu trójskładnikowego za pomocą sygnału tworzonego przez odczynnik dający się oznaczyć analitycznie lub wyzna kowanie przeciwciała przeciwimmunoglogulinowe, znamienny tym, że jako jedne z tych przeciwciał stosuje się przeciwciała dla polipeptydu odpowiadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu*
  6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, ze stosuje się przeciwciała dla fragmentu polipeptydowego o sekwencji:
    Pro-Val-Lys-Ser-Cys-Ser-Glu-Pro-Arg-Cys-Phe-Asn-Gly-Gly-Thr-Cys-Gln-Gln-Ala-Leu-Tyr-Phe-Ser-Asp-Phe-Val-Cys-Gln-Cys-Pro-Glu-Gly-Phe-Ala-Gly-Lys-Cys-Cys-Glu-Ile-Asp
  7. 7. Sposób według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, ze stosuje się przeciwciało dla fragmentu polipeptydowego otrzymanego przez ekspresję zrekombinowanego DNA.
    6. Sposób wódług zustrz.7 , znzmienny t ym, ze stosuje się ziyntetyzawazo chemicznie DNA o sekwencji:
    /X/ n CCGGTCAAAAGTTGCAGCGAACCACGATGTTTCAACGGAGGA
    ACCTGCCAGCAGGCACTGTACTTCTCAGATTTCGTGTGCCAGTGT
    CCAGAAGGATTTGCTGGAAAATGTTGTGAAATAGAT/y/n, gdzie X oznacza AATTCATGAGTCAGGAT, y oznacza CTGGAGAGTCAGGGATAATAAGCT, a n przyjmuje wartość 1 lub 0.
  8. 9. Test Osznnossyeuzy Zn ndonem^ nntnanty Ondnliezo oSełZowygo eStnast^a elanblazgonu, z zastouewayiom przeciwciał, znamienny tym, ze zawiera przeciwciała dla pollpopJyds odpowiadającego domenie podobnej de EGF ludzkiego tkankowego aktywatora plazminosonu ewentualnie unieruchomione na stałym nośniku lub rozpuszczano w fazie ciekłej.
    164 338
  9. 10. Test według zastrz. 9, znamienny tym , ze zawiera przeciwciała związa ne z odczynnikiem dającym scę oznaczyć rnrlctycznce.
  10. 11. Test według rastzz. 9, nnarnienn y t 9 m, zz icwirra peccicwraołd ila fragmentu pnlcpeptydowego o sekwencji:
    P to-Vrl-Lys-S5et-Cys-^et-Glu-Pto—Atg-Cya-Phe-jAan—JlyMGly-Tne-Cya-Gln^ln-Alr-Leu-Tyt-Phe-Ser-Aaa-Phe-Vrl-Cys-Gln-Cys-Pro-Glu-Gly-Phe-Ala-Gly-Lys-Cys-Cys-Glu-Ile-Asp.
  11. 12. Test według zastrz. 9, znamienny tmm» za zawerra pzzcc lwc^ła (Ha fergmentu aolcpeatydowego otrzymrnego przez ekspresję zrekombcnowrnego DNA.
  12. 13. Test według 2artr^. 12 a znamienny t y 9, ze zawiera zsyntetyzowany chemccznce DNA o sekwencji:
    /X/ n CCGGTCAAAAGTTGCAGCGAACCACGATGTTTCAACGGAGGA
    ACCTGCCAGCAGGCACTGTACTTCTCAGATTTCGTGTGCCAGTGT
    CCAGAAGGATTTGCTGGAAAATGTTGTGAAATAGAT/y/n, gdzie X oznacza AATTCATGAGTCAGGAT, Y ozmczr CTGGAGAGTCAGGGATAAfAAGCT , r n przyjmuje wrrtość 1 lub 0.
  13. 14. Test dirgnostyczny do oznaczrnia rntygenu ludzkiego tkankowwgo aktywatora plezmino· genu z zaatoaowancwm arzwciwciał, znrmienny tym, że zawCwra pierwsze przeciw· cirar rwagujące specyficznie z bir^iem ludzkiego tkankowwgo ^^ϋηη alazmCnogwnu orrz ukłrd do wykrywania kompleksu antygen-ρtzwccwccało zawCwrający drugie przwccwccała zdolne do specyficznego tesgowsnis z ludzkim tkankowym ^tyn^rem alazmcnogenu orrz ewentuslnie ptzwciwciała arzwccwcmmunoglobulinowβ, przy czym jedne z tych przeciwciał strnowię przeccwcci^ dlr polipeptydu odpowcadającego domenie podobnej do EGF ludzkiego tkankowego rkty utoń plrzminogenu.
  14. 15. Test według zassrr. 14, znamienny ty ma że zawiera przeciwdara zrne z odczynnikiem drjącym się oanscayć snslitycance.
  15. 16. Test według z astre. 14, znamienny t y 9, że zawiera p rz e c iw ciał o (Ha f^gm^^ polipeptydowego o sekwencji:
    Pto-Vrl-Lys-Set-Cys-Ser-Glu-Pto-Atg-Cys-Phθ-Asn-Gly—3ly-Thr-Cya·-Gln-Gln-Als-Leu-Tye-PhwSet-Asp-Phe-Vsl-Cys-Gln-Cys-Pro-Glu-Gly-Phe-Als-Gly-Lya-Cya-Cya-Glu-Ile-Aaaz
  16. 17. Test według zas^z. 14 , znameanny tym , w a rmm eaeθclwcsało dla ftsgmwntu polipeptydowego otrzymanego przez ekspresję zeekombinowsawgo DNA.
  17. 18. Test według zastrz. 17 , znamlaany tym , e e ηϋ^θ anyrtrnaolsnny he-micznie DNA o sekwencji:
    /X/aCCGGTCAAAAGTTGCAGCGAACCACGATGTTTCAACGGAGGA
    ACCTGCCAGCAGGCACTGTACTTCTCAGATTTCGTGTGCCAGTGT
    CCAGAAGGATTTGCTGGAAAATGTTGTGAAATAGAT/y/n, gdzie X oaasczr AATTCATGAGTCAGGAT, Y (^ιι^ι CTGGAGAGTCAGGGATAATAAGCT, s n przyjmuje wsttość 1 lub 0.
  18. 19. Test według zastrz. 44 , znamlaany t m m , ee ezeθdwdal a wwl-asne z frzą strai lub ciekłą.
  19. 20. Test według zastrz. 44 , zπamlanny tm<n , e e ^ι^τη ΟοΙπΟοοκ) nonmk s^ły lub ciekły dlr awclzsncs próbki aswietsjlcej m^sen.
PL29977389A 1989-12-29 1989-12-29 Sposób i test do oznaczania antygenu ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu PL PL PL PL164338B1 (pl)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL29977389A PL164338B1 (pl) 1989-12-29 1989-12-29 Sposób i test do oznaczania antygenu ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu PL PL PL

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL29977389A PL164338B1 (pl) 1989-12-29 1989-12-29 Sposób i test do oznaczania antygenu ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu PL PL PL

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL164338B1 true PL164338B1 (pl) 1994-07-29

Family

ID=20060546

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL29977389A PL164338B1 (pl) 1989-12-29 1989-12-29 Sposób i test do oznaczania antygenu ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu PL PL PL

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL164338B1 (pl)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Grinnell et al. Fibroblast adhesion to fibrinogen and fibrin substrata: requirement for cold-insoluble globulin (plasma fibronectin)
Pollard et al. Actin and myosin and cell movemen
JP2964439B2 (ja) プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質
KR870010189A (ko) HTLV-Ⅲgag/ env 유전자 단백질의 발현 및 정제
EP0422125B1 (en) Platelet blocking peptides
JP2002507424A (ja) ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒＪｅｊｕｎｉのリポポリサッカライドα２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびその使用
US5688659A (en) Streptolysin O peptide antigens and methods for the determination of streptolysin antibodies
US5457029A (en) Nuclear antigen La
ES2328306T3 (es) Anticuerpo monospecifico reactivo con friginogeno y fibrinopeptido b.
PL164338B1 (pl) Sposób i test do oznaczania antygenu ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu PL PL PL
Dardik et al. The structure of endothelial cell thrombospondin: Characterization of the heparin‐binding domains
PT98589A (pt) Processo de preparacao de um peptido derivado da alfa1-microglobulina humana e de anticorpos de determinacao da alfa1-microbulina humana num liquido e de producao de fita de teste
Goff [43] Coliphage-induced ADP-ribosylation of Escherichia coli RNA polymerase
Balleisen et al. Inhibition of collagen-induced platelet aggregation by antibodies to distinct types of collagens
PL164144B1 (en) Method for making polypeptides, recombined vector and method for its forming, method for making antibodies, method and test for determination of human tissue activator of plasminogen or antibodies for that protein
AU2006213411B2 (en) Antibody for assay of ADAMTS13 activity and method of activity assay
PL164564B1 (pl) Sposób wytwarzania przeciwcial po l i k lo n a l nych reagujacych specyficznie z bialkiem ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu PL
JP2634683B2 (ja) フイブリンに対する抗体；抗体の調製に適当な免疫原ペプチド、フイブリンを決定する方法および抗体に基づく製剤
PL164565B1 (pl) Sposób konstruowania zrekombinowanego wektora do klonowania i/lub ekspresjiw komórkach gospodarza bakteryjnego do wytwarzania polipeptydu zdolnego do produkcji przeciwcial reagujacych specyficznie z bialkiem ludzkiego tkankowego _______________________________aktywatora plazminogenu________________________ PL
PL165793B1 (pl) Sposób wytwarzania polipeptydu, zdolnego do produkcji przeciwciał reagujących specyficznie z białkiem ludzkiego inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu
PL164952B1 (pl) Sposób oznaczania i/lub wykrywania antygenu ludzkiego Inhibitora tkankowego aktywatora plazmlnogenu i test diagnostyczny do oznaczania l/lub wykrywania antygenu ludzkiego Inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu PL
Sumida et al. Inhibition of Ca2+ uptake into fragmented sarcoplasmic reticulum by antibodies against purified Ca2+, Mg2+-dependent ATPase
PL164991B1 (pl) Sposób wytwarzania przeciwcial poliklonalnych reagujacych specyficznie z bialkiem ludzkiego Inhibitora tkankowego aktywatora plazminogenu PL
AU696549B2 (en) Variant protein of human DNA topoisomerase I
PL164992B1 (pl) Sposób konstruowania zrekombinowanego wektora do klonowania i/lub ekspresji w komórkach gospodarza bakteryjnego do wytworzenia polipeptydu zdolnego do produkcji przeciwcial reagujacych specyficznie z bialkiem ludzkiego inhibitora tkankowegoaktywatora plazminogenu PL