PL167058B1 - Sposób wytwarzania polipeptydu stanowiącego fragment ludzkiego białka C zdolnego do produkcji przeciwciał reagujących specyficznie z ludzkim białkiem C oraz z tym polipeptydem i/lub reagującego specyficznie z przeciwciałami dla tego polipeptydu - Google Patents

Abstract

1 . Sposób wytwarzania polipeptydu stanowiącego fragment białka C, zdolnego do i przeciwciał reagujących specyficznie z ludzkim białkiem C oraz z tym poilpeptydem i/lub reagującego specyficznie z przeciwciałami dla tego polipeptydu, znamienny tym, że zrekombinowanym wektorem zawierającym DNA kodujący polipeptyd o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b transformuje się komórki gospodarza bakteryjnego, które hoduje się i wyodrębnia z nich białko o wzorze (Y)a-(H)c-A-(Z)b, które ewentualnie rozbija się na fragmenty o wzorach (Y)a-(X)c- oraz -A-(Z)b, przy czym w powyższych wzorach Y oznacza białko nośnikowe kodowane przez fragment wektora, korzystnieMet 1 -Val 444 β-galaktozydazy i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, korzystnie Gln, Gly, Leu, Glu; a oznacza 0 lub 1, X oznacza peptyd łączący, korzystnie Phe, Asp, Pro; c oznacza 0 lub 1, A oznacza sekwencję odpowiadającą fragmentowi ludzkiego białka C, obejmującemu aminokwasy w pozycji 56 -119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C, a mianowicie: - Met-Asp-Glu-Ser-Lys 61: -Lys-Leu-Leu-Val-Arg-Leu-Gly-Glu-Tyr-Asp 71: -Leu-Arg-Arg-Trp-Glu-Lys-Trp-Glu-Leu-Asp 81: -Leu-Asp-Ile-Lys-Glu-Val-Phe-Val-His-Pro 91: -Asn-Tyr-Ser-Lys-Ser-Thr-Thr-Asp-Asn-Asp 101: -Ile-Ala-Leu-Leu-His-Leu-Ala-Gln-Pro-Ala 111: -Thr-Leu-Ser-GIn-Thr-Ile-Val-Pro-Ile-, Z oznacza sekwencję uzupełniającą, korzystnie Met i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, b oznacza 0 lub 1.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania polipeptydu stanowiącego fragment ludzkiego białka C, zdolnego do produkcji przeciwciał reagujących specyficznie z ludzkim białkiem C oraz z tym polipeptydem i/lub reagującego specyficznie z przeciwciałami dla ludzkiego białka C oraz z przeciwciałami dla tego polipeptydu.

Białko C należy do rodziny białek zależnych od witaminy K. Aktywne białko Cjest silnym czynnikiem antykoagulacyjnym działającym na poziomie czynników Va i VIII podczas klepnięcia. Ma także swój udział w procesie fibrynolizy skrzepu poprzez wpływ na poziom aktywatora plazminogenu we krwi (P.C.Comp, R.R.Nixon, C.T.Esmon, Blood, 63, 1984, 15 21).

167 058

Niedobór białka C zaobserwowano w przypadkach głębokiej zakrzepicy żylnej i tętniczej, zatoru płucnego, zawału mięśnia sercowego, zespołu rozsianego krzepnięcia śródnaczyniowego i innych (R.A.Malar, Seminars in Thromb. Hemost., 11, nr 4,1985,389-392).

Poziom białka C oznacza się kilkoma metodami, które podzielić można na trzy grupy. Do pierwszej grupy należą metody wykorzystujące antykoagulacyjne właściwości białka. Jedna z nich polega na oznaczaniu białka C przy użyciu trombomoduliny z płuc królika do hamowania aktywności prokoagulacyjnej trombiny i jednoczesnego stymulowania aktywności białka C. Tak zaktywowane białko C wpływa na czas tworzenia skrzepu przy udziale tromboplastyny aktywowanej kaoliną i kefaliną (Kaolin-cephalin activated Partia! Thromboplastin Time - PTT, R.B.Francis, Thromb. Res., 37,1986,337-340). Różne odmiany tej metody wykorzystują wpływ aktywnego białka C na tworzenie się skrzepu po aktywacji trombinowej (H.Yinazzer, U. Pengraz, Thromb.Res., 46,1987,1-8), gdzie do aktywacji trombiny używa się różnych czynników, takich jak kaolina, cefaloplastyna, aktyna czy Pathrombin. Bada się także udział białka C w tworzeniu skrzepu pod wpływem protrombiny i prokonwertyny (Prothrombin-prokonvertin time, P-P, R.B.Francis, Thromb. Res., 37, 1986, 337-340). Zauważono również, że białko C powoduje zmniejszenie liczby miejsc receptorowych dla czynnika Xa i wpływa na zdolność płytek do przekształcania protrombiny (Platelet Promthrombin-Converting Activity, P.C. Comp,

C.T.Esmon, Blood, 54, nr 6, 1979, 1272-1281). W wymienionych metodach ilość aktywnego białka C w próbie badanej odczytuje się z krzywych kalibracyjnych.

Druga grupa metod oznaczania białka C wykorzystuje jego właściwości amidolityczne. Aktywne białko C powoduje rozkład substratu barwnego, co można badać spektrofotometrycznie. Jako substraty służą tu: pGlu-Pro-Arg-MNA, S-2222, S-2238, S-2251, S-2266, S2302, S-2314, S-2366, S-2444 (H.Vinazzer, U.Pengraz, Thromb.Res., 46, 1987, 1-8). W tej grupie metod do aktywacji białka C używa się kompleksu trombina-trombomodulina (P.C.Comp, Blood, 23, 1987, 86-92), albo pewnych frakcji otrzymywanych z jadów węży (H. Yinazzer, U.Pengraz, Thromb.Res., 46, 1987,1-8) oraz (W. Kisiel, Clin.Invest., 4,1979,761 - 769).

Wśród stosowanych metod immunologicznych oznaczania poziomu białka C jako antygenu wyróżnia się kilka rodzajów. Należą do nich metoda radioimmunologiczna polegająca na wiązaniu białka C z przeciwciałami znakowanymi radioaktywnym jodem (R. M. Bertina, A.W. Broeckmans,, et al., Thromb.Haemost., 1982), metodą innunoradiometryczna (R.M. Bertina,

A.W. Broeckmans, et al., Thromb.Haemost., 57, nr 1, 1987, 112-117), oraz testy enzymoimmunologiczne (H.Vinazzer, U. Pengraz, Thromb.Res., 46,1987,1-8), czy metody immunoblotingu (M.Heeb, P.Schwartz, Thromb.Res., 52,1988,33-43).

Białko C stosowane w wymienionych metodach służące do immunizacji, a dalej do uzyskania przeciwciał na ogół izoluje się z plazmy ludzkiej za pomocą absorpcji na cytrynianie baru, elucji, frakcjonowaniu w siarczanie amonu, chromatografii, a następnie elektroforezy preparatywnej w żelu poliakryloamidowym. Wydajność metody wynosi 5 mg białka z 15 litrów plazmy, a stężenie białka na poszczególnych etapach oczyszczania oznacza się metodą aktywacji trombinowej (PTT) (W.Kisiel, J. Clin. Invest., 64 1979,761-769).

Dopisana wyżej metoda otrzymywania białka C jest czasochłonna, skomplikowana i kosztowna, co w znacznym stopniu zawyża koszt całego testu. Otrzymywanie całej cząsteczki białka metodą biotechnologiczną jest także trudne do przeprowadzenie i kosztowne.

Wynalazek pozwala na oznaczanie ilościowe ludzkiego białka C z dużą dokładnością w oparciu o metodę, w której stosuje się fragment polipeptydowy otrzymany sposobem według wynalazku. Stwierdzono, że można wykorzystać pełną reakcję krzyżową w teście immunologicznym przeciwciał otrzymanych dla fragmentu białka oraz dla całej cząsteczki białka C.

W odróżnieniu od znanych metod, wytwarzany sposobem według wynalazku, fragment polipeptydowy a nie całe białko, służy do produkcji swoistych przeciwciał rozpoznających w ten sam sposób zarówno ten fragment jak i rodzime białko C. Fragment ten również stosuje się do uzyskania krzywej wzorcowej oraz do oznaczania przeciwciał dla ludzkiego białka C.

Sposób wytwarzania polipeptydu zdolnego do produkcji przeciwciał reagujących specyficznie z ludzkim białkiem C oraz z tym polipeptydem i/lub reagującego specyficznie z przeciwciałami dla ludzkiego białka C oraz z przeciwciałami dla tego polipeptydu według wynalazku polega na tym, że zrekombinowanym wektorem zawierającym DNA kodujący

167 058 polipeptyd o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b transformuje się komórki gospodarza bakteryjnego, które hoduje się i wyodrębnia z nich białko o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, które ewentualnie rozbija się na fragmenty o wzorach (Y)a-(X)e- oraz -A-(Z)b, przy czym w powyższych wzorach Y oznacza białko nośnikowe kodowane przez fragment wektora, korzystnie Met 1 -Val 444 β-galaktozydazy i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, korzystnie Gln, Gly, Leu, Glu; a oznacza 0 lub 1, X oznacza peptyd łączący, korzystnie Phe, Asp, Pro; c oznacza 0 lub 1, A oznacza sekwencję odpowiadającą fragmentowi ludzkiego białka C, obejmującemu aminokwasy w pozycji 56 -119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C a mianowicie:

-Met-Asp-Glu-Ser-Lys 61: -Lys-Leu-Leu-Val-Arg-Leu-Gly-Glu-Tyr-Asp 71: -Leu-Arg-Arg-Trp-Glu-Lys-Trp-Glu-Leu-Asp 81: -Leu-Asp-Ile-Lys-Glu-Val-Phe-Val-His-Pro 91: -Asn-Tyr-Ser-Lys-Ser-Thr-Thr-Asp-Asn-Asp 101 :-Ile-Ala-Leu-Leu-His-Leu-Ala-Gln-Pro-Ala 111: -Thr-Leu-Ser-Gln-Thr-Ile-Val-Pro-Ile-,

Z oznacza sekwencję uzupełniającą, korzystnie Met i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, b oznacza 0 lub 1.

Zgodnie z wynalazkiem stosuje się zrekombinowany wektor zawierający DNA kodujący polipeptyd o wzorze jak wyżej.

Korzystnie stosuje się wektor zawierający zsyntetyzowany chemicznie DNA odpowiadający cDNA o sekwencji:

AA TTC GAT CCA ATG GAC GAG TCC AAG AAG AAG CTC CTT GTC CGC CTT GGA GAG TAT GAC CTG CGG CGC TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTC GAC ATC AAG GAG GTC TTC GTC CAC CCC AAC TAC AGC ACC ACC GAC AAT GAC AAT GAC ATC GCA CTG CTG CAC CTG GCC CAG CCC GCC ACC CTC TCG CAG ACC ATA GTG CCC ATC ATG TA Stosowany w sposobie według wynalazku, zrekombinowany wektor do klonowania i/lub ekspresji w komórkach gospodarza, otrzymuje się łącząc znanymi metodami wektor z fragmentem DNA kodującym polipeptyd o wzorze (X)c-A-(Z)b, w którym symbole mają wymienione wyżej znaczenie.

Sposobem według wynalazku korzystnie wytwarza się fragment polipeptydowy o dużej hydrofilowości, obejmujący aminokwasy w pozycjach 56-119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C o sekwencji określonej symbolem A.

Ze względu na powierzchniowe ułożenie, region ten może zawierać determinaty antygenowe. Jest to także obszar o specyficznej sekwencji aminokwasowej, w odróżnieniu od pozostałych obszarów, które wykazują znaczne podobieństwo do innych białek z grupy zależnych od witaminy K.

Charakterystyczne dla centrum aktywnego proteaz serynowych są aminokwasy: His 54, Asp 100 i Ser 203 łańcucha ciężkiego (G.Plutzki et al., Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 83, 1984, 546-556). Otrzymany fragment stanowi część centrum katalitycznego.

Sekwencja nukleotydów cDNA dla białka C jest znana (R.J.Beckman et al.,Nucleic Acid Res., 13, nr 14 1985, 5233-5247).

W sposobie według wynalazku, gen kodujący polipetyd o wyżej określonym wzorze (X)c -A-(Z)b można skonstruować z fragmentów oligonnukleotydowych zsyntetyzowanych chemicznie. Fragmenty oligonukleotydowe można zsyntetyzować chemicznie na nośniku poprzez kolejne przyłączanie nukleozydów z zablokowanymi grupami czynnymi. Korzystnie do ochrony funkcji aminowej stosuje się grupę izopropoksyacetylową, co przedstawiono w opisie patentowym nr 157 777. Fragmenty oligonukleotydowe zsyntetyzowane chemicznie poddaje się enzymatycznej reakcji kinazowania, w trakcie której wprowadza się fosforan na końcach 5’ za pomocą kinazy polinukleotydowej i ATP. Kinazowane oligonukleotydy liguje się in vitro w dwuniciowe odcinki organiczne sekwencjami rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne, korzystnie Eco RI i Hind III. Zligowane odcinki namnaża się w wektorze do klonowania, stosując właściwe miejsce restrykcyjne polilinkera. Stosować można różne wektory, np. plazmidowe, fagowe, przy czym korzystne są plazmidy, np. plazmid pUC-19. Sklonowane wektory z

167 058 odcinkami DNA namnaża się w komórkach gospodarza, którymi mogą być bakterie, drożdże itp. Wektory z wklonowanymi odcinkami izoluje się, a następnie odcinki odzyskuje się przez trawienie restrykazami i rozdzielenie otrzymanych odcinków elektroforetycznie. Odzyskane odcinki włącza się do wektora ekspresyjnego po uprzednim strawieniu go odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Na tym etapie stosuje się różne wektory ekspresyjne, np. plazmidowe, fagowe i inne. Przykładowo plazmid pWR 450.1 zawiera gen kodujący β-galaktozydazę i gen oporności na ampicylinę.

Komórki gospodarza, np. bakterii, transformowane zrekombinowanym wektorem, są po namnożeniu źródłem polipeptydu o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, albo fragmentu ludzkiego białka C. Fragment ewentualnie odcina się od polipeptydu.

Wytworzony sposobem według wynalazku fragment białka C, ewentualnie w połączeniu z fragmentem białka nośnikowego, np. β-galaktozydazy, można stosować do otrzymania przeciwciał różnymi znanymi metodami, a także do wykreślania krzywej wzorcowej niezbędnej do ilościowego oznaczania białka C.

Stosując polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku można wytworzyć przeciwciała poliklonalne reagujące specyficznie z białkiem C, w ten sposób, że immunizuje się zwierzęta polipeptydem o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, albo polipeptydem o wzorze A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, pobiera się krew i izoluje przeciwciała.

Wytworzone w ten sposób przeciwciała można zastosować do oznaczania ludzkiego białka C jako antygenu oraz przeciwciał dla tego białka oraz do wytworzenia testów do ich oznaczania.

Sposób oznaczania ludzkiego białka C jako antygenu polega na tym, że badaną próbkę, np. materiału biologicznego kontaktuje się z przeciwciałami dla polipeptydu o wzorze (Y)a-(X)eA-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, albo z przeciwciałami dla polipeptydu o wzorze A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, po czym oznacza się wytworzony kompleks antygen-przeciwciało.

W alternatywnej metodzie najpierw wytwarza się kompleks dwuskładnikowy antygenu z pierwszym przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem, po czym wytwarza się kompleks trójskładnikowy przez skontaktowanie kompleksu dwuskładnikowego z drugim przeciwciałem zdolnym do reagowania ze wspomnianym antygenem, przy czym jako jedne z tych przeciwciał stosuje się przeciwciała dla polipeptydu o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, albo przeciwciała dla polipeptydu o wzorze A-(Z)b. Obecność kompleksu trójskładnikowego wykrywa się za pomocą sygnału tworzonego przez odczynnik dający się oznaczyć analitycznie lub znakowanego izotopowo przeciwciała immunolobulinowego. Badaną próbkę, w której wykrywa się i oznacza antygen, tj. ludzkie białko C, kontaktuje się i inkubuje z przeciwciałami reagującymi specyficznie z tym antygenem. Wytworzenie kompleksu dwuskładnikowego antygen-przeciwciało wykrywa się i oznacza za pomocą środka wykrywającego i sygnalizującego reakcję immunologiczną, korzystnie przeciwciało reagujące specyficznie C znakowane odczynnikiem dającym się oznaczyć analitycznie. Środek wykrywający i sygnalizujący reakcję immunologiczną może być obecny podczas inkubowania antygenu z przeciwciałem. Można na przykład bezpośrednio wyznakować przeciwciała kontaktowane z badaną próbką i po przemyciu produktu reakcji uzyskać sygnał. Środkiem jest wówczas sam znacznik. Środek wykrywający można też dodać dopiero po wytworzeniu kompleksu dwuskładnikowego i usunięciu nieprzereagowanego materiału. Wykrywanie i oznaczanie prowadzi się wówczas następująco: dwuskładnikowy kompleks antygen-przeciwciało po odmyciu kontaktuje się z drugim przeciwciałem reagującym specyficznie z białkiem C, przy czym jako jedno z tych przeciwciał stosuje się przeciwciała dla polipeptydu o wzorze (Y)a-(X)e-(A)(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, albo przeciwciała dla polipeptydu o wzorze A-(Z)b o tym samym znaczeniu symboli. Pozostałym (pierwszym lub drugim) przeciwciałem może być na przykład przeciwciało dla całej cząsteczki białka C. Otrzymuje się wówczas kompleks trójskładnikowy przeciwciało-antygen-przeciwciało. Drugie przeciwciała mogą być znakowane odczynnikiem dającym się oznaczyć analitycznie. Alternatywnie,jako środek stosuje

167 058 się układ dwuskładnikowy zawierający drugie przeciwciała tworzące kompleks trójskładnikowy, który wykrywa się za pomocą przeciwciała przeciwimmunologlobulinowego.

Do znakowania można stosować enzym, biotynę, izotop promieniotwórczy, korzystnie ¹²⁵J lub inne znane odczynniki.

Wykrywanie i oznaczanie prowadzi się za pomocą sygnału wytwarzanego przez znacznik. Badaną próbkę, oznaczany antygen lub jedno z przeciwciał, korzystnie pierwsze, unieruchamia się na stałym nośniku, takim jak bibuła nitrocelulozowa lub płyta plastikowa i inne.

Wykrywanie i oznaczanie dogodnie prowadzi się za pomocą testu diagnostycznego, który zawiera przeciwciała dla polipeptydu o wzorze (Y)a-(X)e-A- (Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, albo przeciwciała dla polipeptydu o wzorze A-(Z)b o tym samym znaczeniu symboli, ewentualnie unieruchomione na stałym nośniku lub rozpuszczone w fazie ciekłej. Przeciwciała są związane z odczynnikiem dającym się oznaczyć analitycznie.

Alternatywnie test może zawierać pierwsze przeciwciała reagujące specyficznie z ludzkim białkiem C oraz układ do wykrywania kompleksu antygen-przeciwciało zawierający drugie przeciwciała zdolne do specyficznego reagowania z ludzkim białkiem C i ewentualnie przeciwciała przeciwimmunoglobulinowe, przy czym jedne z tych przeciwciał stanowią przeciwciała dla polipeptydu o wzorze (Y)a-(X)c-A-(7)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, albo przeciwciała dla polipeptydu o wzorze A-(Z)b o tym samym znaczeniu symboli. Korzystnie przeciwciała są związane z fazą stałą lub ciekłą. Test może dodatkowo zawierać nośnik stały i ciekły dla związania próbki zawierającej antygen.

Układ do wykrywania kompleksu antygen-przeciwciało zawiera drugie przeciwciała bezpośrednio związane z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie, albo też układ ten zawiera trzecie przeciwciała przeciwimmunoglobulinowe związane ze znacznikiem.

W sposobie i testach do oznaczania ludzkiego białka C można stosować przeciwciała otrzymane dotychczas znanymi metodami. Sposób wykrywania przeciwciał dla białka C w badanej próbce, na przykład w materiale biologicznym, polega na tym, że polipeptyd o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, w którym symbole mają wyżej podane znaczenie, kontaktuje się z badaną próbką aż do związania przeciwciał, po czym wykrywa się produkt reakcji immunologicznej. Korzystnie reakcję prowadzi się w roztworze. Dogodnie jest stosować test do wykrywania przeciwciał anty-białko C zawierający polipeptyd o określonym wyżej wzorze. Polipeptyd jest związany z odczynnikiem dającym się wykryć analitycznie. Do znakowania można stosować znane metody.

Celem uproszczenia, w opisie i przykładach używane są następujące skróty:

A: adenina C: cytozyna G: guanina T: tymina

Ala: alanina Arg: arginina Asn: asparagina ASP: kwas asparaginowy Gin: glutamina Glu: kwas glutaminowy His: histydyna

Ile: izoleucyna Leu: leucyna Lys: lizyna Met: metionina Phe: fenyloalanina Pro: prolina Ser: seryna Thr: treonina Trp: tryptofan Tyr: tyrozyna

167 058

Val: walina

DNA: kwas deoksyrybonukleinowy ATP: trójfosforan adenozyny

EDTA: kwas etylenodwuaminoczterooctowy SDS: siarczan dodecylu sodu

Bufor Eco RI:	100 mM Tris-HCl pH 7,5 1 M NaCl 10 mM β-merkaptoetanol
bufor do kinazowania:	0,7 M Tris-HCl pH 7,6 0,1 mMgCk 50 mM ditiotreitol
bufor ligacyjny:	0,66 M Tris-HCl pH 7,6 50 mM MgCl2 50 mM ditiotreitol lOmMATP
bufor do ekstrakcji:	50 mM Tris-HCl pH 8,0 300 mM octanu sodu 0,2% SDS 4 mM EDTA
Pożywka LB:	10 g bacto trypton 5 g ekstrakt drożdży 5 g NaCl rozpuszczone w 11H2O
bufor TE:	10 mM Tris-HCl pH 8,0 1 mM EDTA bufor z SDS: 10 g Tris-HCl pH 8,0 77 g glicyny lg SDS rozpuszczone w 11H2O
bufor do lizy komórek:	150 mg Tris 400 mg SDS 1 ml β-merkaptoetanol 2 ml glicerolu, 7 ml wody
bufor RI:	50 mM glukoza 10 mM EDTA 25 mM Tris-HCl pH 8,0 4 mg/ml lizozym
bufor RII:	0,2 M NaOH 1% SDS
bufor RUI:	60 ml 5 M kwasu octowego
PMSF:	fluorek kwasu fenylometylosulfonowego

167 058

PBS: 167,5 ml 0,1 Na₂HPO4

82,5 ml 0,2 M NaH₂PO₄ w 510,9% NaCl

DTT: d^^io^^iiitol

ELISA: test immunoenzymatyczny

EDTA: wersenaan sodowy.

Na załączonych rysunkach fig. 1 przedstawia wykres hydrofobowości łańcucha polipeptydowego białka C, fig. 2 przedstawia sekwencję fragmentu genu ludzkiego białka C rozłożoną na fragmenty syntetyzowane chemicznie, fig. 3 i fig. 4 podają schematy konstrukcji genu dla białka C sklonowanego w wektorze rekombinacyjnym pUC 19 i ekspresyjnym pWR 450.1, fig. 5 przedstawia rozdział elektroforetyczny w żelu poliakryloamidowym z SDS ekstraktów białkowych otrzymanych z komórek E. coli oraz oczyszczonego kompleksu β-galaktozydazabiałko C: 1) ciałka inkluzyjne rozpuszczone w zbuforowanym 6M roztworze mocznika, 2) oczyszczone białko hybrydowe β-galaktozydaza-białko C, fig. 6 przedstawia schemat rozbicia kompleksu białkowego o wzorze (Y)a-(X)c-A-(Z)b, i oczyszczenia fragmentu peptydowego o wzorze A-(Z)b. Produkty degradacji kompleksu beta-galaktozydaza-białko C stanowią mieszaninę peptydów o długości 3 do 125 aminokwasów. Fragment białka C składa się z 65 aminokwasów i izoluje się go przy pomocy HPLC.

Wynalazek jest bliżej wyjaśniony w przykładach wykonania.

Przykład I.

Etap 1. Synteza oligonukleotydów.

Syntezę chemiczną oligonukleotydów przeprowadza się stosując metodę amidofosforynową syntezy na stałym nośniku (M.Gait, Oligonucieotides synthesis - a practical approach, IRL Press, 1984). lako nośnik użyto szkło o kontrolowanej porowatości typu LCA-CPG ze związaną pierwszą jednostką nukleozydową. Jednostka ma przyłączoną na końcu 5'-OH rybozy blokującą grupę kwasolabilną - dimetoksytrityl (DMT, którą usuwa się w środowisku kwaśnym). Odsłonięta w ten sposób grupa 5' -OH jednostki nukleozydowej przyłącza prekursor kolejnej jednostki: amidofosforyn. Przy udziale jodu w obecności wody dokonuje się utlenienia grupy fosforynowej do fosforanu. Kolejnym etapem jest usunięcie DMT z przyłączonej jednostki, tym samym cykl rozpoczyna się na nowo. Ponieważ wydajność poszczególnych etapów fosforylowania wynosi 99,7%, w celu usunięcia pozostałych 0,3% jednostek z wolnymi grupami 5’-Oh stosuje się tzw. capping tj. zablokowanie pomyłkowych sekwencji przez acetylowanie bezwodnikiem octowym w obecności aktywatorów. Po utworzeniu żądanego oligonukleotydu odcina się go od złoża 29% amoniakiem, oczyszcza elektroforetycznie, następnie odsala metodą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (Waters C-18 RP, 10 pm). Oligonukleotydy przechowuje się w porcjach po około 0,5 OD.

Etap 2. Konstrukcja wektora rekombinacyjnego i wektora ekspresyjnego.

A. Kinazowanie i ligacja odcinków DNA.

Fragmenty oligonukleotydowe C1-C10 rozpuszcza się w wodzie tak, aby w 5 pl roztworu znajdowało się 2 pg kwasu. Miesza się po 4 pl fragmentów C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9 i C10 (fig. 2) i do mieszaniny dodaje się po 5 pl 20 mM ATP, 2 pl buforu do kinazowania, 2 pl wody i 1 pl ligazy polinukleotydowej, inkubuje przez 2 godziny w temperaturze 37°C, następnie podgrzewa do temperatury 65°C przez 10 minut, a potem ochładza. Po fosforylacji dodaje się 3 pg PUC trawionego uprzednio enzymami Eco RI i Hind III, 0,5 pl ligazy faga T4 i zostawia na 12 godzin w temperaturze 4°C.

W celu sprawdzenia czy fragmenty genów połączyły się z plazmidem, mieszaninę ligacyjną z barwnikiem nanosi się na 6% żel poliakryloamidowy i rozdziela elektroforetycznie. Po wybarwieniu bromkiem etydyny wycina się odpowiednie pasmo w celu wyizolowania plazmidu rekombinacyjnego. Izolowany plazmid poddaje się hydrolizie enzymatycznej.

B. Hydroliza enzymami.

Do rozpuszczonego DNA (80 pl) dodaje się 10 x 10 pl stężonego buforu EcoRI, 2U restryktazy EcoRI (firmy Pharmacia) oraz wody do objętości 100 pl. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Po tym czasie DNA strąca się etanolem, dodając 3 objętości alkoholu etylowego (99,8%), wymraża się w -20°C przez 5 minut, a następnie odwirowuje się

167 058 przy 15 tys.obr. przez 5 minut. Osad rozpuszcza się w 20 μ! buforu TE. Postępuje się w identyczny sposób trawiąc restryktazą Hind III.

C. Rozdział elektroforetyczny.

W celu sprawdzenia czy zligowane fragmenty DNA mają odpowiednią długość, rozdziela się je w 8% żelu poliakryloamidowym z SDS w TBE. Rozdział prowadzi się przy napięciu 130 V w ciągu 3 godzin. Żel wybarwia się bromkiem etydyny (0,5 μg/ml - firmy Serva) przez 20 minut w temperaturze pokojowej, następnie płucze dwukrotnie w wodzie destylowanej. Rozdzielone produkty obserwuje się po krótkim naświetlaniu lampą UV. Dla oceny wielkości fragmentów DNA, podczas elektroforezy używa się następujących wzorców: PUC 19 trawiony Msp i PUC 19 trawiony Bsp RI. Jeśli zligowane fragmenty posiadają oczekiwaną długość, po elektroforezie sprawdzającej wykonuje się elektroforezę preparatywną i odzyskuje się odcinek DNA, który następnie liguje się z plazmidem pWR 450.1 trawionym Eco RI i Hind II.

D. Sprawdzenie sekwencji klonowanych fragmentów.

W celu upewnienia się czy sekwencja sklonowanego fragmentu jest prawidłowa, fragment sekwencjonuje się metodą Maxama i Gilberta (Methods in Enzymology 65,499,560,1989).

E. Ligacja zrekombinowanego DNA z plazmidem ekspresyjnym pWR 450.1.

Odcinek DNA odzyskany w etapie 2.C dodaje się do 3 μg pWR 450.1 uprzednio trawionego enzymami Eco RI i Hund III, 0,5 μl ligazy faga T4 i zostawia się na 12 godzin w temperaturze 4°C. Po inkubacji część mieszaniny rozdziela się elektroforetycznie. Po sprawdzeniu, że odcinek DNA połączył się z plazmidem, resztę mieszaniny używa się do transformacji komórek. Uzyskuje się w ten sposób zrekombinowany plazmid pW-b.C.

Etap 3. Hodowla komórek transformowanych plazmidem PWR 450.1.

A. Przygotowanie kompetentnych komórek.

Z płytki z posianymi bakteriami DH5, pobiera się jedną kolonię, którą szczepi się na 5 ml pożywki LB. Bakterie hoduje się w temperaturze 37°C przez 18 godzin. Do 100 ml pożywki LB dodaje się 2 ml otrzymanej zawiesiny i prowadzi się hodowlę do gęstości optycznej Od 600=0,3. Zawiesię bakterii odwirowuje się (5 tys. obr., 20 min, a osad bakteryjny ochładza, zawiesza w 50 ml buforu SB i umieszcza w temperaturze ok. 0°C. Zawirowuje się jak wyżej, a osad zawiesza w 1^ objętości wyjściowej buforem SB. Przeprowadza się 20 minutowe inkubację w temperaturze 0°C. Po tym czasie z zawieszonych komórek pobiera się do sterylnych probówek po 200 μl zawiesiny komórek i inkubuje przez 30 minut w 0°C, a następnie dodaje się 7 μl DTT i plazmidy (20 μθ. Inkubuje się w lodzie (0°C) przez 30 minut, a następnie 45 sekund w 45°C. Ochładza się w lodzie i dodaje 800 μl pożywki LB. Po 1 godzinnej inkubacji w 37°C, komórki bakteryjne posiewa się na płytki: wylewa się 200 μl mieszaniny ligacyjnej na płytkę i inkubuje w temperaturze 37°C przez 18 godzin.

B. Analiza otrzymanych transformantów.

Po 18 godzinach hodowli na płytce z wysianą mieszaniną transformacyjną obserwuje się pojedyncze kolonie. Do dalszej analizy wybiera się 10 kolonii. 5 ml pożywki szczepi się pojedynczymi koloniami i hoduje w 37°C przez 18 godzin, a następnie izoluje plazmidowym DNA. Preparatyka plazmidowego DNA z 5 ml pożywki przebiega w następujący sposób.: Bakterie odwirowuje się (5 tys.obr. 5 min.). Osad bakteryjny zawiesza się w 200 μί buforu RI i przetrzymuje przez 5 minut w temperaturze 0°C, a następnie dodaje 400 μl RII i 300 μl RIII (O°C). Całość odwirowuje się (15 tys. obr., 5 min.),supernatant przenosi się znad osadu do nowej probówki i dodaje 2,5 objętości izopropanolu. Wymraża się w -20°C, odwirowywuje, osad płucze 70% etanolem i suszy w próżni. Osad rozpuszcza się w 200 μl i dodaje 20 μl roztworu RNazy o stężeniu 1 mg/ml. Inkubuje się 30 minut w 37°C. Dodaje się 200 μl fenolu. Zbiera się fazę wodną i dodaje 200 μl mieszaniny chloroform/alkohol izoamylowy w proporcjach 24:1.

Odwirowuje się ponownie, zbiera supernatant, czynność powtarza się jeszcze raz. Do fazy wodnej dodaje się 0,1 objętości 3M octanu sodu (pH 5,2) oraz 2,5 objętości etanolu i wymraża 30 minut w temperaturze -20°C, a następnie odwirowuje (15 tys.obr., 15 min.), osad przemywa 70% etanolem i suszy. Osad plazmidowy DNA rozpuszcza się w 40 μl buforu TE. W ceiu wybrania zawierającego plazmid pUC 19 z wklonowanym fragmentem, przeprowadza się analizę otrzymanych DNa plazmidowych przy użyciu enzymów restrykcyjnych EcoRl i Hind

167 058

III, a produkty trawienia rozdziela się w żelu poliakryloamidowym. Trawienie przeprowadza się jak w punkcie B, rozdział elektroforetyczny jak w punkcie C.

C. Oczyszczanie ciałek inkluzyjnych.

Po 18 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C zawiesinę komórek bakteryjnych chłodzi się w lodzie, wiruje przez 10 minut/4000 obr., osad przemywa 0,1 M roztworem CaCl2. Odwirowany osad zawiesza się w 100 mM buforze fosforanowym pH 6,2, dodaje 1 M glicerol, 1% lizozym i ogrzewa się do temperatury pokojowej. Dodaje się 0,5 M EDTA pH 8,0 i schładza do 0°C, następnie poddaje się szokowi termicznemu w temperaturze 42°C przez 1 minutę. Zawiesinę wiruje się przy 4500 obr. przez 15 minut, osad zawiesza w 100 mM tris-Cl pH 8,0 z 10 mM EDTA i 1 mM PMSF. Po kolejnym wirowaniu (4500 obr., 15 min.), osad zawiesza się w 100 mM Tris-Cl pH 8,0 z 10 mM EDTA, 1 mM PMSF, 100 mM beta-ME, 1% Triton Χ-100 i poddaje tkiahmiu ullrackwięków 10 rray po 30 sekund. Miesz^iinę wiruje się w buforze Tris-Cl pH=8,0 z 10 mM EDTA (20000 obr., 20 min.), osad zawiesza w buforze Tris-Cl pH 7,4 i znów wiruje. Pozostały osad zawiesza się w 9 M moczniku buforowym Tris-Cl pH 7,4, dializuje wobec 6 M mocznika buforowego Tris-Cl pH 7,4 odwirowywuje i supematant nanosi się na kolumnę z DEAE 52 zrównoważoną buforem startowym: 6M mocznik, Tris-Cl pH 7,4, zawierającym ImM PMSF. Kompleks galaktozydaza-białko C eluuje się 0,2 M NaCl w powyższym buforze. Czystość frakcji chromatograficznych sprawdza się slskrrofoaetycznie.

D. Rozbicie kompleksu na drodze reakcji chemicznej.

Oczyszczone białko hybrydowe beta-galaktozydaza-białko C dializuje się wobec buforu 10 mM Tris-HCL pH 7,4 w celu usunięcia mocznika, następnie liofilizuje. Rozbicie kompleksu przeprowadza się stosując 1 mg/ml CNBr w 80% kwasie mrówkowym, który hydrolizuje wiązania Met-X (G. Bauw et.al. Methods in Protein Seguence Analysis, Springer^erlag, str 220-233,1988). Reakcję przeprowadza się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, po czym kwas usuwa się w wyparce próżniowej, a hydrolizat rozpuszcza się w 0,1 % kwasie trójfluorooctowym. Produkty powstałe w wyniku tej reakcji analizuje się po przeprowadzeniu elektroforezy w żelu poliakryloamidowym, a następnie wyodrębnia się fragment białka C Met 56-Ile 119.

E. Sposób wyodrębnia polipeptydu odpowiadającego fragmentowi Met 56-Ile 119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC).

Rozdział chromatograficzny przeprowadzono np. na kolumnie ssmrprepaaarywnej TSK G3000 SW firmy LKB, Szwecja.

Etap 4. Otrzymywanie przeciwciał poliklonalnych.

A. Immunizacja zwierząt.

W celu uzyskania przeciwciał poliklonalnych dla fragmentu białka C po 50 gg antygenu rozpuszczonego w 0,5 ml PBS z dodatkiem 0,5 ml kompletnego adjuwantu Freunda podaje się królikom śródskórnie, co trzy tygodnie. Po 7 dniach od każdego szczepienia pobiera się krew z żyły usznej królika w celu sprawdzenia poziomu przeciwciał. Po wykipieniu w temperaturze 37°C przez 0,5-1,0 godziny, skrzep oddziela się od ścianek próbówki i całość pozostawia w temperaturze 4°C przez 12-24 godzin. Następnie surowicę odciąga się do jałowych próbówek wirówkowych i wiruje przy 300 obr. przez 20 minut. Obecny dopełniacz w surowicach inaktywuje się podczas inkubacji przez 30 minut w temperaturze 56°C. Miano poszczególnych próbek surowicy określa się metodą aadioimmusologiczsą, oznaczając ich zdolność do wiązania znakowanego antygenu. Próby o najwyższym mianie przeciwciał przechowuje się w temperaturze -20°C.

B. Oczyszczanie przeciwciał.

Przeciwciała dla fragmentu białka C izoluje się z surowicy odpornościowej metodą chromatografii powinowactwa. Immunoadsorbent otrzymuje się poprzez związanie fragmentu białka C ze złożem CNEr-Sepharose: 1 g złoża przemywa się 1 mM HCl i zawiesza w buforze boranowym pH 8,0. Natychmiast dodaje się 20 mg antygenu w PBS i lekko miesza w temperaturze 4°C, następnie wiruje (4000 obr. przez 10 minut) i sprawdza stężenie białka w supernancie. Złoże następnie zawiesza się w buforze boranowym pH 8,3 z 2M glicyny, inkubuje 'przez 1 godzinę i wiruje. Osad przemywa się trzykrotnie buforem boranowym pH. 8,3, 1 raz wodą destylowaną i 2 razy buforem boranowym pH 8,3. Na tak przygotowane złoże nanosi się 15 ml

167 058 surowicy dla fragmentu białka C i miesza w temperaturze 4°C przez 12-14 godzin. Do mieszaniny dodaje się PMSF i chlorek benzamidyny do stężenia końcowego 1 mM. Po odwirowaniu (3000 obr., 10 minut) złoże przemywa się 4 razy buforem PBS z 1% Tween, a następnie 4 razy buforem 1 M NaCl z 1% Tween w PBS. Po każdym wirowaniu sprawdza się zawartość białka w supernatancie przez pomiar absorpcji przy 280 nm. Złoże umieszcza się w kolumnie 0,7 x 10 cm. Przeciwciała specyficznie związane z unieruchomionym na złożu antygenem eluuje się 0,5 M kwasem octowym do próbówek zawierających 100 μ! 2 M Tris. Frakcje o dużej zawartości białka łączy się i dializuje wobec PBS przez 24 godziny w temperaturze 0°C.

C. Sprzęganie przeciwciał z peroksydazą.

Uzyskane w ten sposób przeciwciała dla fragmentu białka C sprzęga się z peroksydazą. W tym celu rozpuszcza się 5 mg HRPO w 1ml 0,3 M kwaśnego węglanu sodu o pH 8,1, następnie dodaje się 0,1 ml 1 % EDNB (1 -fluoro-2,4-dwunitrofluorobenzen) w etanolu absolutnym i delikatnie wytrząsa w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie dodaje się 40 - 80 mM NaJO4 rozpuszczonego w wodzie destylowanej i lekko miesza przez 30 minut. Po zmianie barwy na zielono-żółtą dodaje się 1 ml 0,16 M glikolu etylenowego i miesza przez godzinę, a następnie dializuje wobec 0,01 M węglanu sodu pH 9,5 w temperaturze 4°C. Do 3 ml tak przygotowanego roztworu aldehydu peroksydazy (HRPO) dodaje się 5 mg IgG rozpuszczone w 1 ml buforu węglanowego lub w postaci zliofilizowanego proszku wolnego od soli, lekko miesza przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej, następnie dodaje 5 mg NaBH4 i pozostawia w 4°C przez 3 do 12 godzin. Po inkubacji mieszaninę dializuje się w 4°C wobec PBS, ewentualny osad usuwa się przez wirowanie. Próbkę nanosi się na kolumnę 85 x 1,5 cm Sephadex G-100, zrównoważoną PBS. Zbiera się frakcje po 1,5 ml, poziom białka mierzy się spektrofotometrycznie. Frakcja IgG sprzężonych z peroksydazą ' schodzi w pierwszym szczycie.

Roztwory koniugatu przechowuje się w 10 mg/ml albuminy w temperaturze 20°C.

Etap 5. Oznaczenie białka C jako antygenu w badanej próbce za pomocą przeciwciał dla fragmentu w wzorze -A-, tj. fragmentu 56-119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C.

Do roztworu antygenu w badanej próbce dodaje się wyznakowane np. peroksydazą przeciwciała dla fragmentu 56-119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C i inkubuje się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Do wywołania reakcji enzymatycznej stosuje się roztwór substratu: ortofenylodwuaminę w 0,05 M buforze cytrynianowym, pH 5,0, zawierającym 0,01 % nadtlenku wodoru. Po 6 minutach inkubacji pojawia się zabarwienie i reakcję hamuje się przez dodanie 3M kwasu siarkowego. Absorbancję mierzy się przy 490 nm. Wynik odczytuje się z krzywej wzorcowej wykreślonej dla standardowego roztworu białka C.

Etap 6. Wykonanie testu ELISA.

Studzienki w płytce do testu ELISA (firmy Plastomed) opłaszcza się przeciwciałami dla polipeptydu o wzorze -A-, w którym symbol A ma wyżej wymienione znaczenie, zawieszonymi w 50 mM buforze fosforanowym pH 7,5. Testowane próbki osocza rozcieńcza się przed oznaczeniem 50 mM buforem fosforanowym, pH 7,5 zawierającym 0,15 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,1% Tween 20 i 1% BSA, dodaje się po 200 μl na studzienkę i inkubuje przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji płytki 5-krotnie przemywa się 0,15 M NaCl zawierającym 0,1% Tween 20. Następnie dodaje się 200 μl koniugatu IgG-HRP (przeciwciała dla całej cząsteczki białka C sprzęgnięte z peroksydazą) o stężeniu 5 pl/ml. Po 2 godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej ponownie 5-krotnie przemywa się, po czym, w celu wywołania reakcji enzymatycznej dodaje się 200 pl roztworu substratu (0,4 mg/ml ortofenylodiaminy w 0,05M buforze cytrynianowym, pH 5,0, zawierającym 0,02% H2O2). Po 6 min. inkubacji pojawia się zabarwienie i reakcję hamuje się przez dodanie 50 pl 3M kwasu sialowego. Absorbancję mierzy się przy 490 nm. Równocześnie wykonuje się oznaczenia z szeregiem rozcieńczeń fragmentu C aby uzyskać krzywą wzorcową.

Etap 7. Zastosowanie fragmentu Met 56-Ile 119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C do oznaczania poziomu przeciwciał dla białka C w badanej próbce.

Fragment polipeptydowy odpowiadający odcinkowi Met 56 - Ile 119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C znakuje się izotopem jodu ^l25J. Do 10Ό pl radioznakowanego ligandu (ok. 60000 cpm) dodaje się 100 pl badanej próbki (np. rozcieńczonej surowicy) i inkubuje się 12-16 godzin w temperaturze 4°C. Następnie dodaje się przeciwciała przeciwimmunoglobulinowe (np.

IgG królicze przeciw IgG ludzkim). Po 2-godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej zwirowywuje się immunoprecypitat i przemywa go zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej. Radioaktywność osadów mierzy się licznikiem gamma. Poziom przeciwciał dla białka C odczytuje się z krzywej wzorcowej.

Test do oznaczania poziomu ludzkiego białka C składa się z : pojemnika zawierającego zbuforowany roztwór soli fizjologicznej (PBS) z EDTA i Tween 20, pojemnika z albuminą surowiczą, pojemnika z przeciwciałami dla fragmentu białka C, pojemnika z wyznakowanymi peroksydazą przeciwciałami dla białka C, pojemnika z substratem (ortodwufenyloaminą), pojemnika z buforem cytrynianowym o pH 5,0 i pojemnika z 3 M kwasem sjalowym.

Przykład II. Postępując sposobem analogicznym jak w przykładzie I, z wyjątkiem etapu 3D i 3E, otrzymano przeciwciała dla kompleksu (Y)a-(X)c-A-(Z)b, w którym Y oznacza fragment 1 Met - 444 Val beta-galaktozydazy, X oznacza peptyd łączący: Phe, Asp, Pro, A ma wyżej podane znaczenie, Z oznacza Met. Przeciwciała te stosowano analogicznie jak w przykładzie I etap 5 i 6.

167 058

Współczynnik HydrofohowoSci

FIG.1

1^'7058

Cl: AA TTC GAT CCA ATG GAC GAG TTC AAG AAG CTC CTT GTC CGC CT

C2: T GGA GAG TAT GAC CTG CGG CGC TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG

C3: GAC ATC AAG GAG GTC TTC GTC CAC CCC AAC TAC AGC AAG AG

C4: C ACC ACC GAC AAT GAC ATC GCA CTG CTG CAC CTG

C5: GCC CAG CCC GCC ACG CTC TCG CAG ACC ATA GTG CCC ATC ATG TA

C6: GTC GGG CGG TGG GAG AGC GTC TGG TAT CAC GGG TAG TAC ATT CGA

C7: TCG TGG TGG CTG TT A CTG TAG CGT GAC GAC GTG GAC CGG

C8: GAC CTG TAG TTC CTC CAG AAG CAG GTG GGG TTG ATG TCG TTC

C9: CTC ATA CTG GAC GCC GCG ACC CTC TTC ACC CTC GAC CTG

CIO: G CTA GGT TAC CTG CTC AGG TTC TTC GAG GAA CAG GCG GAA CCT

FIG.2

1. Phe Asp Pro, Net Asp Glu Ser Lys Lys Leu Leu Yal Arg Leu Gly

2. AA TTC GAT CCA ATG GAC GAG TCC AAG AAG CTC CTT GTC CGC CTT GGA

3. G CTA GGT TAC CTG CTC AGG TTC TTC GAG G&A CAG GCG GAA CCT

1. Glu Tyr Asp Leu Arg Arg Trp Glu Lys Trp Glu Leu Asp Leu Asp

2. GAG TAT GAC CTG CGG CGC TOG GAG AAG TOG GAG CTG GAC CTG GAC

3. CTC ATA CTG GAC GCC GCG ACC CTC TTC ACC CTC GAC CTG GAC CTG

1. Ile Lys Glu Yal Phe Val His Pro Asa Tyr Ser Lys Ser Thr Thr

2. ATC AAG GAG GTC TTC GTC CAC CCC AAC TAC AGC AAG AGC ACC ACC

3. TAG TTC CTC CAG AAG CAG GTG GGG TTG ATG TCG TTC TCG TGG TGG

1. Asp Asa Asp He Ala Leu Leu His Leu Ala Gla Pro Ala Thr Leu

2. GAC UT GAC ATC GCA CTG CTG CAC CTG GCC CAG CCC GCC ACC CTC

3. CTG TTA CTG TAG CGT GAC GAC GTG GAC CGG GTC GGG CGG TGG GAG

1. Ser Gin Thr Ile Yal Pro Ile Met ŁU. Ala

2. TCG CAG ACC ATA GTG CCC ATC ATG TA

3. AGC GTC TGG TAT CAC GGG TAG TAC ATT CGA

FSG.3

EcoRl

Hind III

FIG. 4

167 058

FIG. 5

167 058

BETA-GALAKTOZYDAZA: BIAŁKO C

produkty degradacji białko C

oczyszczanie produktów hydrolizy

FIG.6

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,00 zł.

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania polipeptydu stanowiącego fragment ludzkiego białka C, zdolnego do produkcji przeciwciał reagujących specyficznie z ludzkim białkiem C oraz z tym polipeptydem i/lub reagującego specyficznie z przeciwciałami dla tego polipeptydu, znamienny tym, że zrekombinowanym wektorem zawierającym DNA kodujący polipeptyd o wzorze (Y)a-(X)o-A(Z)b transformuje się komórki gospodarza bakteryjnego, które hoduje się i wyodrębnia z nich białko o wzorze (Y)a-(H)c-A-(Z)b, które ewentualnie rozbija się na fragmenty o wzorach (Y)a-(X)c- oraz -A-(Z)b, przy czym w powyższych wzorach Y oznacza białko nośnikowe kodowane przez fragment wektora, korzystnie Met 1-Val 444 β-galaktozydazy i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, korzystnie Gln, Gly, Leu, Glu; a oznacza 0 lub 1, X oznacza peptyd łączący, korzystnie Phe, Asp, Pro; c oznacza 0 lub 1, A oznacza sekwencję odpowiadającą fragmentowi ludzkiego białka C, obejmującemu aminokwasy w pozycji 56 -119 łańcucha ciężkiego ludzkiego białka C, a mianowicie:

   - Met-Asp-Glu-Ser-Lys 61: -Lys-Leu-Leu-Val-Arg-Leu-Gly-Glu-Tyr-Asp 71: -Leu-Arg-Arg-Trp-Glu-Lys-Trp-Glu-Leu-Asp 81: -Leu-Asp-Ile-Lys-Glu-Val-Phe-Val-His-Pro 91: -Asn-Tyr-Ser-Lys-Ser-Thr-Thr-Asp-Asn-Asp 101: -Ile-Ala-Leu-Leu-His-Leu-Ala-Gln-Pro-Ala 111: -Thr-Leu-Ser-Gln-Thr-Ile-Val-Pro-Ile-,

   Z oznacza sekwencję uzupełniającą, korzystnie Met i/lub sekwencję kodowaną przez fragment polilinkera, b oznacza 0 lub 1.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się zrekombinowany wektor zawierający DNA odpowiadający cDNA o sekwencji:

   AA TTC GAT CCA ATG GAC GAG TCC AAG AAG CTC CTT GTC CGC CTT GGA GAG TAT GAC CTG CGG CGC TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG GAC ATC AAG GAG GTC TTC GTC CAC CCC AAC TAC AGC ACC ACC GAC AAT GAC AAT GAC ATC GCA CTG CTG CAC CTG GCC CAG CCC GCC ACC CTC TCG CAG ACC ATA GTG CCC ATC ATG TA
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się zrekombinowany wektor zawierający DNA odpowiadający cDNA o sekwencji wyżej wymienionej, zsyntetyzowany chemicznie.