JP3857166B2 - 新規光学系、及びその光学系を備える顕微鏡 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞膜上の分子反応を観察するために有用な蛍光観察などに使用される新規光学系、及びその光学系を備える顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生物の生命活動の多くは、細胞膜上に存在する膜タンパク質などの分子に担われているため、生きている細胞の細胞膜で実際に分子が働いている現場を観察することが、医学・細胞工学の基礎研究および応用開発において重要である。
【０００３】
このような細胞膜上の分子反応を観察する有用な方法の一つに、蛍光標識された分子に励起光を照射することによって発生する蛍光を蛍光顕微鏡にて観察する蛍光顕微鏡法がある。上記蛍光顕微鏡法としては、落斜照明法がよく用いられる。しかしながら、上記落斜照明法では、照明光が試料中の水溶液を通過するので、背景光が大きくなり、その背景光の中から微弱な蛍光を捕らえるのは非常に困難であるという問題点がある。
【０００４】
そこで近年、細胞膜上の分子反応の蛍光観察を行うための装置として、全反射型蛍光顕微鏡が注目されてきている。上記全反射型蛍光顕微鏡は、エバネッセント光を、試料に照射する光として利用している。上記エバネッセント光とは、後述するように、カバーグラスと細胞との界面などにおいて、入射光の入射角を臨界角よりも大きくすることによって生ずる入射光の全反射現象で得られる、カバーグラスを通過する光である。上記エバネッセント光の光強度は、界面から急激に減衰し、界面より数百ｎｍの範囲までしか届かないため、水溶液からのラマン散乱などによる背景光を抑えることができる。
【０００５】
そのため、上記エバネッセント光で細胞膜上の分子を標識している蛍光色素を励起させる全反射型蛍光顕微鏡によれば、非常に高いコントラストの画像を得ることができる。従って、全反射型蛍光顕微鏡は、微弱な蛍光を捕らえることが可能となり、蛍光１分子をも観察することができる。
【０００６】
上記全反射型蛍光顕微鏡の一例である対物レンズ型全反射蛍光顕微鏡が、文献「Biochemical and Biophysical Research Communications ：1997 Jun 9；235(1)：47-53 ：Tokunaga M, Kitamura K, Saito K, Iwane AH, Yanagida T.」に記載されている。この対物レンズ型全反射蛍光顕微鏡において、試料にエバネッセント光を照射するための光学系の構成を図２を用いて説明する。
【０００７】
図２に示すように、上記対物レンズ型全反射蛍光顕微鏡の光学系は、レーザー光を発生させる光源であるレーザー発振器２０、光路を変更するためのミラーＭ２１、可動ミラーＭ２２、レンズＬ２１、対物レンズ２３などにより構成される。レーザー発振器２０より放出されたレーザー光は、先ずミラーＭ２１によって反射され、光路を変更し、レンズＬ２１へ入射する。レンズＬ２１を通過したレーザー光は、続いて可動ミラーＭ２２によって反射され、対物レンズ２３へ入射する。
【０００８】
上記可動ミラーＭ２２は、図２中の矢印Ｅに示すように位置を変化させることができる。これに伴い、対物レンズ２３へ入射するレーザー光は矢印Ｆに示すように、対物レンズ２３の光軸と平行を保ちながら、上記光軸と上記レーザー光の光路との間隔を変化させることができる。対物レンズ２３を通過するレーザー光は、上述のように対物レンズ２３の光軸とレーザー光の光路との間隔を変化させることよって、カバーグラスの配された試料面への入射角を矢印Ｇに示すように変化させ、エバネッセント光を発生させることができる。カバーグラスの先にある蛍光標識された分子は、このエバネッセント光が照射されることによって、励起され蛍光を発する。
【０００９】
このような光学系を備えることにより、上記対物レンズ型蛍光顕微鏡は、背景光を抑え、微弱な蛍光観察を行うことができる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記光学系では、細胞膜のような曲面状の界面においては、場所による入射角の違いのため、エバネッセント光を局所的にしか発生させることができないので、試料全面に渡って良好な画像を得ることができないという問題点がある。
【００１１】
例えば、上記光学系を用いて、カバーグラス上に培養した細胞に照射するレーザー光の入射角を大きくしていくと、まず、図３（ａ）に示すように、細胞の一部で入射角が臨界角に達しエバネッセント光が発生する。しかし、入射角が臨界角以下の部分も同時に存在し、ここからレーザー光が溶液側に抜けてゆくので背景光が大きくなってしまう。この部分でエバネッセント光を発生させるために、図３（ｂ）に示すように、さらにレーザー光の入射角を大きくすると、最初にエバネッセント場が発生した部分では入射角が大きくなり過ぎて、エバネッセント光は非常に弱くなってしまう。これは、エバネッセント光の減衰長が、入射角が臨界角のときにもっとも長く、入射角が大きくなるに従って急激に短くなってゆく、という性質によるものである。
【００１２】
従って、上記光学系においては、細胞の腹側、即ちカバーグラスに面している側の細胞膜の蛍光観察を行うことは可能であるが、細胞の背側、即ちカバーグラスから離れている側の細胞膜の蛍光観察は不可能である。しかしながら、多くの細胞においては、上記腹側および上記背側の細胞膜は構成要素、機能とも異なっており、生理的に重要な分子が背側にのみ発現している例も多い。
【００１３】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、細胞全体にわたって蛍光観察を行えるような光学系、および、この光学系を用いた顕微鏡を提供することを目的としている。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明に係る光学系は、光源より発生するレーザー光を対物レンズへ入射させ、上記対物レンズを通過した上記レーザー光を入射角が臨界角以上となるように対象物へ入射させることによって、エバネッセント光を発生させる光学系において、上記光学系は、上記レーザー光を２つの経路に分割して異なる位置から対物レンズへ入射させる分光手段を備え、
前記２つの経路を有するレーザー光を、対物レンズの光軸を挟む別々の位置から同時に前記対象物に入射させることを特徴としている。
【００１５】
すなわち、上記光学系は、顕微鏡などを用いて、対象物である試料を観察する際に、その試料を照射するために、レーザー光を試料まで導く光学系であり、光源より発生したレーザー光を、対物レンズを通過させて試料へ照射するものである。そして、上記光学系は、上記レーザー光を上記対物レンズへ入射させる前に、２つ経路を有するレーザー光に分割する分光器などの分光手段を備えることによって、上記レーザー光を上記対物レンズへ異なる２つの位置から入射させる。
【００１６】
上記の構成によれば、異なる入射角で対象物に２つのレーザー光を照射することができる。従って、例えば全反射蛍型光顕微鏡を用いて、蛍光標識された細胞膜を観察する場合に、従来の１つのレーザー光のみを試料に照射する光学系に比べて、広範囲にエバネッセント光を照射することができる。そのため、細胞全体にわたって、ムラなく背景光を抑えた良好な画像を得ることができる。
【００１７】
上記光学系はさらに、上記分光手段により分割された２つのレーザー光を対物レンズへ導く導光手段を備え、上記導光手段は、上記２つの経路を有するレーザー光を、上記対物レンズの光軸に対して平行に入射させる構成としてもよい。
【００１８】
上記の構成によれば、上記２つの経路を有するレーザー光は、上記対物レンズの光軸と平行を保ちながら上記対物レンズに入射するため、焦点を含む対象物の面を通過する上記２つの経路を有するレーザー光の中心位置を変化させることなく、上記２つのレーザー光の入射角を変化させることができる。即ち、上記２つの経路を有するレーザー光の各経路の中心位置を、上記対物レンズの焦点へ集めるため、目的とする対象物面へずれることなく上記２つのレーザー光を照射することができる。
【００１９】
上記光学系における上記導光手段は、上記対物レンズに対して上記２つの経路を有するレーザー光を反射させる１つの反射体と、上記２つの経路を有するレーザー光を経路ごとに受光して上記反射体へ照射する２つの中継光学部とを有し、前記中継光学部は、前記反射体に対する前記２つの経路を有するレーザー光の照射位置をそれぞれ独立して移動させることができる可動型光学部である構成としてもよい。
【００２０】
上記の構成によれば、上記２つの中継光学部の位置を適宜変更させることによって、上記２つの経路を有するレーザー光の照射位置を移動させることができる。これによれば、対物レンズを通過し、対象物へ照射されるレーザー光の入射角を変更することができるため、各対象物に適した入射角を有するレーザー光を照射させることができる。従って、対象物によって屈折率が異なる場合にも、レーザー光の入射角を適宜調節することによって、例えば、蛍光観察に最適なエバネッセント光を発生させることができる。
【００２１】
上記光学系において、上記可動型光学部は、レーザー光を受光する中継レンズと、上記中継レンズを通過したレーザー光を上記反射体に照射する中継ミラーとを有し、上記中継レンズと上記中継ミラーとが、常に同じ距離を保ちながら、上記対物レンズの光軸に対して平行に移動するような構成としてもよい。
【００２２】
上記の構成によれば、上記中継レンズと上記対物レンズとの距離を一定に保つことができ、上記対物レンズへ入射するレーザー光の収束度が変化することを防止できる。
【００２３】
なお、上記中継レンズと上記対物レンズとの距離は、両レンズによって導かれるレーザー光の光路長が、上記両レンズの焦点距離の和に等しくなる位置に配されることが好ましい。上記のような光学系を全反射型蛍光顕微鏡に用いれば、収束度の変化によるレーザー光の強度変化、全反射条件を満たさない入射光の混入および、光散乱の増加による背景光の増大を防ぐことができる。
【００２４】
また、上記光学系においては、上記反射体の断面が直角二等辺三角形の形状を有し、かつ上記直角二等辺三角形の等辺を含む２つの面が少なくとも反射面であり、上記２つの中継光学部は、上記２つの経路を有するレーザー光を、経路ごとに上記２つの面にそれぞれ照射する位置関係となるように配置される構成としてもよい。
【００２５】
ここで、上記反射体の「断面」とは、上記中継ミラーによって反射されたレーザー光が上記反射体によって反射される場合に、レーザー光の光路が取り得る面によって上記反射体を切断したときに得られる断面のことを意味する。従って、上記反射体は、上述のような断面を有するものであれば特に限定されるものではないが、例えば、三角柱や、四角錐のような形態を有するものであることが好ましい。
【００２６】
上記の構成によれば、少なくとも２つの反射面を有する１つの反射体によって、上記２つの中継光学部より導かれた２つの経路を有するレーザー光を、上記対物レンズへ異なる位置から入射させることができる。また、上記の構成によれば、上記２つの中継光学部が可動型光学部である場合に、上記２つの可動型光学部を上記反射体を挟んで向き合うように配置することができるため、可動範囲を大きくすることができる。
【００２７】
さらに、上記光学系は、上記直角二等辺三角形の頂点が、上記対物レンズの光軸上に配される構成としてもよい。
【００２８】
上記の構成によれば、上記２つの中継光学部が位置を変えることで、上記対物レンズの中心位置（光軸の位置）から、あらゆる距離を持たせて、上記２つの可動型光学部からのレーザー光を対物レンズへ入射させることができる。従って、上記対象物への入射角をさらに自由に変化させることができる。さらに、上記の構成によれば、上記２つの経路を有するレーザー光の各経路を共に、上記直角二等辺三角形の頂点の部分に導けば、１つのレーザー光を対象物へ照射することも可能であり、上記光学系の利用範囲を広げることができる。
【００２９】
また、上記光学系は、上記レーザー光の光路の上記対象物への入射角が臨界角となったときの、上記対物レンズ上での上記レーザー光の光路と上記対物レンズの光軸との距離をｄとし、上記対物レンズの径をＤとしたときに、上記反射体の直角二等辺三角形の断面における底辺の長さｌは、２ｄ≦ｌ≦Ｄを満たすことが好ましい。
【００３０】
２ｄ≦ｌとは、上記直角二等辺三角形の底辺の長さｌが、上記レーザー光の中心位置の光路と上記光軸との距離ｄの２倍以上であるということを意味する。従って、これによれば、上記レーザー光の対象物への入射角を、光軸上の０度からエバネッセント光が起こる臨界角まで、自由に変化させることができる。
【００３１】
また、ｌ≦Ｄとは、上記直角二等辺三角形の底辺の長さｌが、上記対物レンズの径Ｄ以下であることを意味する。なお、ここで言う対物レンズの径Ｄとは、光軸を中心として上記レーザー光が入射する位置の方向における、対物レンズの一方の端から他方の端までの長さのことである。これによれば、上記反射体によって反射された上記２つのレーザー光を、ともに対物レンズから外れることなく確実に入射させることができる。
【００３２】
さらに、上記光学系は、上記分光手段が、上記レーザー光を偏光の異なる２つの直線偏光、あるいは、回転方向の異なる２つの円偏光に分割する構成としてもよい。
【００３３】
同一光源から発生したレーザー光を単純に２つのレーザー光に分割し、対象物に入射すると、上記２つのレーザー光間に干渉が起こり、均一な照明を得ることができない。上記の構成によれば、異なる偏光を有する２つのレーザー光に分割するため、上述のような干渉を防ぐことができる。さらに、レーザー光を分割する際、あるいは、統合する際（一つの対象物に照射する際）の光量の浪費を防ぐことできるため、有用である。
【００３４】
また、本発明には、上記光学系を備えた顕微鏡も含まれる。そして、上記顕微鏡は、光学顕微鏡あるいは蛍光顕微鏡であることが好ましい。
【００３５】
上記の構成によれば、一つの光学系のみで、２つのレーザー光を対象物へ照射することができるため、例えば、複数のレーザー光を必要とする光学顕微鏡において、光源の数を減らすことができる。また、上記の構成によれば、照明光の角度を自由に変化させることができるため、多目的に使用することができる。
【００３６】
そして、上記構成の蛍光顕微鏡によれば、全反射法によって広範囲にエバネッセント光を照射できるため、例えば細胞を観察する際などに、細胞全体にムラなく背景光を抑えた良好な画像を得ることができる。
【００３７】
【発明の実施の形態】
本発明の一実施の形態について、図面に基づいて以下に説明する。なお、本発明は、以下の記載に限定されるものではない。
【００３８】
まず、本発明に係る光学系として、全反射型蛍光顕微鏡に接続して用いられる光学系を例に挙げて説明する。蛍光顕微鏡は、観察対象となる試料中の分子（例えば、細胞膜上に存在する膜タンパク質など）を蛍光標識し、励起光を照射して得られる蛍光画像を観察するために用いられるものである。そして、上記全反射型蛍光顕微鏡は、光の全反射現象を利用して蛍光観察を行う。従って、上記光学系は、光の全反射現象によって得られる励起光を試料に照射するために用いられる。
【００３９】
全反射型蛍光顕微鏡に利用される上記励起光は、エバネッセント光と称される。上記エバネッセント光について、以下に説明する。
【００４０】
光は、屈折率の異なる２つの透明な媒質間を通過するとき、その境界面において屈折する。例えば、第１媒質、第２媒質の屈折率をそれぞれｎ1、ｎ2（ｎ1＞ｎ2）とし、境界面への光の入射角をθとすると、図４（ａ）に示すように、θが小さいとき（即ち、θが臨界角より小さいとき）、光は境界面で屈折して進む。しかし、θが大きくなるに従って屈折角は９０°に近づき、図４（ｂ）に示すように、ｓｉｎθ＝ｎ1／ｎ2のとき、屈折角は９０°になる。このときの入射角を、臨界角という。さらに、θを大きくする（即ち、θを臨界角より大きくする）と、図４（ｃ）に示すように、光は境界面で全て反射する。この現象を全反射と呼ぶ。
【００４１】
そして、入射角が臨界角以上の場合、光は第２媒質中に全く入射しないわけではなく、第２媒質中には境界面からの距離に比例して、指数関数的に急激に強度が減衰する光波が存在する。このような光波が、エバネッセント光と呼ばれるものである。上述のように、エバネッセント光は、微弱な光であるため、背景光を抑えたい蛍光観察などには、好適に用いられる。なお、上述のような光の全反射現象により発生するエバネッセント光を利用する方法を、全反射法（全反射蛍光顕微鏡法）と称する。
【００４２】
続いて、上記光学系の構成について図１を用いて説明する。図１に示すように、上記光学系は、レーザー光を発生させる光源であるレーザー発振器１０、光路を変更するためのミラーＭ２・Ｍ３、分光手段である偏光ビームスプリッター１４、中継ミラーＭ１および中継レンズＬ１によって構成される第１可動型光学部１８、中継ミラーＭ１’および中継レンズＬ１’によって構成される第２可動型光学部１９、反射体である直角反射プリズム１５、対物レンズ１３などを含んで構成される。さらに上記光学系は、レーザー光の偏光を変換する偏光板として、３つのλ／４板１１・１２・１２’を有している。なお、上記第１可動型光学部、上記第２可動型光学部および上記直角反射プリズムを併せた部分が導光手段である。
【００４３】
上記光学系における各構成部品の配置について、以下に説明する。レーザー発振器１０とミラーＭ２との間に、λ／４板１１が配されている。λ／４板１１は、レーザー発振器１０より出された直線偏光のレーザー光を円偏光に変換する。また、ミラーＭ２とミラーＭ３との間に偏光ビームスプリッター１４が配されている。上記偏光ビームスプリッター１４は、入射したレーザー光をレーザー発振器１０より出されたレーザー光と同方向の偏光と、上記レーザー光に対して垂直方向の偏光とに分割させるような位置に配されている。
【００４４】
λ／４板１２および第１可動型光学部１８は、上記垂直方向の偏光を有するレーザー光が入射するような位置に配されている。すなわち、第１可動型光学部１８内の中継レンズＬ１は、その光軸上を上記垂直方向の偏光を有するレーザー光が通過するような位置に配されている。
【００４５】
また、λ／４板１２’および第２可動型光学部１９は、上記同方向の偏光を有するレーザー光が、ミラーＭ３に反射された後に入射するような位置に配されている。すなわち、第２可動型光学部１９内の中継レンズＬ１’は、その光軸上を上記同方向の偏光を有するレーザー光が通過するような位置に配されている。
【００４６】
さらに、２つの中継光学部、第１可動型光学部１８・第２可動型光学部１９は、図１に示すように、直角反射プリズム１５を挟んで対称な位置に配されている。即ち、直角反射プリズム１５は、上記２つの可動型光学部の中間の位置に配されている。
【００４７】
上記直角反射プリズム１５は、その断面が直角二等辺三角形の形状を有する三角柱である。そして、上記三角柱の断面である二等辺三角形の等辺のうちの一辺を含む面と平行な位置に、第１可動型光学部１８内の中継ミラーＭ１は配されている。また、上記三角柱の断面である二等辺三角形の等辺のうちの他の一辺を含む面と平行な位置に、第２可動型光学部１９内の中継ミラーＭ１’は配されている。なお、上記直角反射プリズム１５の断面の直角二等辺三角形の頂点は、対物レンズ１３の光軸が通過するような位置に配されている。
【００４８】
そして、上記第１可動型光学部１８・第２可動型光学部１９は、それぞれ矢印Ａあるいは矢印Ａ’に示すように、対物レンズ１３の光軸と平行に独立して移動することができる。これにより、偏光ビームスプリッター１４によって偏光された２つの経路を有するレーザー光を、対物レンズ１３の光軸と平行を保ちながら、上記２つの経路を有するレーザー光を矢印ＢあるいはＢ’のように光軸からの距離を変更することができる。従って、対物レンズ１３を通過した上記２つの経路を有するレーザー光は、試料面における入射角を矢印ＣあるいはＣ’のように変化させることができる。
【００４９】
さらに、上記第１可動型光学部１８内の中継レンズＬ１および中継ミラーＭ１、あるいは、上記第２可動型光学部１９内の中継レンズＬ１’および中継ミラーＭ１’は、常に一定の距離を保ちながら移動する。これにより、中継レンズＬ１あるいはＬ１’から対物レンズ１３までの光路長を常に一定にすることができる。
【００５０】
続いて、上記光学系において、レーザー光を試料まで照射する方法について説明する。先ず、レーザー発振器１０は、所定の方向の直線偏光（これをＰ偏光と称する）であるレーザー光を発生させる。続いて、λ／４板１１が、上記Ｐ偏光のレーザー光を円偏光に変換する。λ／４板１１を通過した円偏光のレーザー光は、ミラーＭ２によって反射され、光路を変更し、偏光ビームスプリッター１４へ入射する。上記ミラーＭ２は、光軸調整を行うために適宜角度を変更することができる。これにより、レーザー発振器１０自体を動かして光軸調整を行う手間を省くことができる。
【００５１】
偏光ビームスプリッター１４では、上記円偏光のレーザー光を２つの直線偏光、即ちＰ偏光と上記Ｐ偏光と垂直に交差する方向の直線偏光であるＳ偏光とに分割する。次に、上記Ｓ偏光のレーザー光は、偏光方向による反射率の違いの影響を避けるために、λ／４板１２で再び円偏光に変換され、第１可動型光学部１８へ入射する。一方、上記Ｐ偏光のレーザー光は、ミラーＭ３によって光路を変更された後、λ／４板１２’で再び円偏光に変換され、第２可動型光学部１９へ入射する。なお、上記λ／４板１２・１２’によって変換された２つの円偏光は、互いに逆回りの円偏光を有している。これによって、２つのレーザー光間の干渉を防ぐことができ、観察する試料に含まれる蛍光色素を偏りなく励起することができる。
【００５２】
第１可動型光学部１８へ入射したレーザー光は、中継レンズＬ１を通過した後、中継ミラーＭ１によって反射され、直角反射プリズム１５の一つの反射面へ入射する。第２可動型光学部１９へ入射したレーザー光は、中継レンズＬ１’を通過した後、中継ミラーＭ１’によって反射され、直角反射プリズム１５の他の反射面へ入射する。
【００５３】
上記直角反射プリズム１５へ入射した各経路のレーザー光は、それぞれ反射され、上述のように対物レンズ１３の光軸と平行を保ちながら、対物レンズ１３の異なる位置へ入射する。
【００５４】
上述のような方法で、本実施形態の光学系は、上記２つのレーザー光を、対物レンズ１３の光軸から離れた別々の位置から入射させることができる。そのため、試料面の広範囲に渡って全反射現象を生ずるような入射角を有して、試料に入射することが可能であり、試料の全体にエバネッセント光を照射することができる。さらに、上記光学系は、試料面への入射角を適宜変更することができるため、エバネッセント光が発生するような入射角となるように、各試料の屈折率に応じて入射角を変えることができる。従って、確実に蛍光観察を行うことができる。
【００５５】
即ち、上記のような構成によって、本光学系は、図５に示すように２つに分割されたレーザー光を、異なる位置からカバーグラスを通して、試料となる細胞へ照射することができる。そして、対物レンズ１３の光軸からの距離を自由に調節することができるため、試料への入射角を調節することが可能となる。従って、細胞の全体にわたって全反射条件を満たすようなレーザー光を照射でき、エバネッセント光を発生させることができる。なお、図５においては、比較的細いレーザー光を使用した場合の様子を示しているが、より太いレーザー光を使用することによって、細胞全体にエバネッセント光を照射することが可能である。
【００５６】
また、本光学系を用いた蛍光顕微鏡は、観察対象となる試料として、細胞に限らず、屈折率の異なる材料が湾曲した界面で接している部分を全反射法で観察する場合にも、好適に用いることができる。
【００５７】
そして、本実施形態においては、上記反射体の一例として、直角反射プリズム１５を用いている。この構成によれば、直角反射プリズム１５の先端にレーザー光の２つの経路を導くことによって、光軸とレーザーの光路が重なり入射角が０度になるまで２本のレーザーの間隔を小さくすることができる。これは通常の落斜型蛍光顕微鏡と同じ状態であり、本発明の利用範囲を広げるものである。即ち、本実施の形態に係る光学系は、落斜照明法による蛍光観察にも使用することができる。また、上記直角反射プリズム１５を用いることによって、上記光学系は、上記２つのレーザー光と上記光軸との間隔を小さくすることもできるため、瞳の大きさが制限される蛍光顕微鏡の入射光学系に好適に用いることができる。
【００５８】
さらに、上記直角反射プリズムにおいて、レーザー光の光路が取り得る面である二等辺三角形の断面の底辺の長さをｌとすると、上記ｌは、次のような条件を満たすことが好ましい。
【００５９】
第１に、試料面への入射角が臨界角以上になるような位置から、対物レンズ１３へ入射できることが好ましい。つまり、対物レンズ１３への入射時に、レーザー光の光路が、対物レンズ１３の光軸位置と、試料面への入射角が臨界角となる程度に離れていなければ、上記レーザー光が試料面を照射した場合に、エバネッセント光を効率よく発生させることができない。従って、レーザー光における光路の試料面への入射角が臨界角となったときの、対物レンズ１３上におけるレーザー光の中心と対物レンズ１３上の光軸位置との距離をｄとすると、ｌとｄとの間で、ｄ≦ｌ／２という関係を満たすことが好ましい。
【００６０】
即ち、上記直角反射プリズムの一つの反射面に対する底辺の長さ、即ち底辺ｌの半分の長さに相当するｌ／２が、距離ｄ以上となることによって、第１可動型光学部１８より反射されたレーザー光は、上記入射角を臨界角以上とすることができる。また、第２可動型光学部１９より反射されたレーザー光においても同様のことが言えるため、結果として、底辺ｌ長さは、２ｄ≦ｌを満たすことが好ましい。なお、レーザー光が取り得る光路と対物レンズ１３の光軸とは、互いに平行な関係にあるため、上記距離ｄは上記光路と上記光軸との距離とも言える。
【００６１】
第２に、対物レンズ１３の径をＤとしたときに、上記２つの可動型光学部１８・１９からの２つのレーザー光を、ともに対物レンズ１３へ外れることなく確実に入射させるために、底辺ｌは径Ｄ以下であることが好ましい。即ち、底辺ｌの長さが、ｌ≦Ｄを満たすことが好ましい。
【００６２】
以上をまとめると、結果として、上記直角二等辺三角形の底辺ｌの長さは、２ｄ≦ｌ≦Ｄを満たすことが好ましい。
【００６３】
また、本実施の形態においては、ミラーＭ２およびλ／４板１２・１２’を備えた構成としているが、本発明に係る光学系は、上記の構成を省いてもよい。また、本実施の形態において用いられる分光手段としての上記偏光ビームスプリッター１４は、各々逆回りの円偏光に分割するようなものであってもよい。これによれば、分割されたレーザー光を、λ／４板１２・１２’を使用することなく、直接２つの可動型光学部１８・１９へ入射させることができる。
【００６４】
なお、本発明の実施の他の形態として、上記光学系は、図６に示すように、直角反射プリズム１５と対物レンズ１３との間に、さらに２つのレンズ１６・１７を有する構成としてもよい。上記の構成によれば、上記光学系を蛍光観察などに用いた場合に、試料面へのレーザー光の入射角をより調節しやすくすることができる。
【００６５】
すなわち、第１可動型光学部１８の移動距離をＫとし、上記第１可動型光学部１８を通過して対物レンズ１３へ入射するレーザー光の移動距離をｋとすると、図１に示す光学系の場合、各移動距離Ｋおよびｋは等しくなる（即ち、Ｋ＝ｋ）。一方、図６に示す光学系のように、レンズ１６・１７を備える構成の場合、レンズ１６および１７に異なる焦点距離のレンズを選択することによって、上記第１可動型光学部１８の移動距離Ｋと上記レーザー光の移動距離ｋとの間に比例関係が成立する（即ち、Ｋ＝ａｋ）。
【００６６】
レンズ１６と１７との焦点距離を、それぞれｆ16、ｆ17とすると、ａ＝ｆ17／ｆ16となる。従って、例えば、ｆ16＜ｆ17とすると、ａ＞１となるため、上記レーザー光の移動距離ｋは上記第１可動型光学部１８の移動距離Ｋよりも大きくなる（即ち、Ｋ＜ｋ）。つまり、第１可動型光学部１８を少し動かしただけで、対物レンズ１３へ入射するレーザー光の光路を大きく移動させることができる。また、逆にｆ16＞ｆ17とすると、ａ＜１となり、上記レーザー光の移動距離ｋを上記第１可動型光学部１８の移動距離Ｋよりも小さくすることができるため、入射角の微妙な調整が可能となる。なお、上記の構成によれば、第２可動型光学部１９を通過したレーザー光についても、上記第１可動型光学部１８を通過したレーザー光と同様に、試料面への入射角を調節しやすくすることができる。
【００６７】
本実施の形態においては、全反射型蛍光顕微鏡に接続して使用する光学系を例に挙げている。しかしながら、本発明に係る光学系はこれに限らず、例えば、複数の入射光を必要とする光学顕微鏡、より具体的には、スタンディングウェーブ顕微鏡やＣＡＲＳ顕微鏡などに使用することができる。上記の構成によれば、一つの光源によって、２つの入射光を得ることができるため、用いる光学系の数を減らすことができる。
【００６８】
また、本発明に係る光学系は、入射光の角度を変化させることが必要な暗視野顕微鏡、低角照明顕微鏡、光トモグラフィー顕微鏡などにも利用することができる。上記の構成によれば、入射光の角度を自由に変化させることが可能であるため、試料の広範囲に良好な入射光を照射することができるようになり、有用である。
【００６９】
【発明の効果】
以上のように、本発明に係る光学系は、光源より発生するレーザー光を対物レンズへ入射させ、上記対物レンズを通過した上記レーザー光を対象物へ照射する光学系において、上記光学系は、上記レーザー光を２つの経路に分割し、異なる位置から対物レンズへ入射させる分光手段を備える構成である。
【００７０】
また、本発明に係る顕微鏡は、上記各構成の光学系を備えた構成であり、具体的には、上記各構成の光学系を備える光学顕微鏡または蛍光顕微鏡を挙げることができる。
【００７１】
それゆえ、本発明では、異なる入射角で対象物に２つのレーザー光を個別の経路で照射することができる。従って、１つの経路のみで対象物にレーザー光を照射する従来の光学系に比べて、広範囲にレーザー光を照射することができる。そのため対象物を良好に照射することができるという効果を奏する。
【００７２】
特に、例えば全反射蛍光顕微鏡法を用いて、蛍光標識された細胞膜を観察する場合に、従来の光学系に比べて広範囲にエバネッセント光を照射することができる。そのため、全ての膜内在性分子および、細胞内外から膜と相互作用する分子の蛍光観察に利用することも可能であり、非常に広範囲に及ぶ研究に利用できるという効果を奏する。
【００７３】
さらに、上記光学系は、細胞膜の観察という生物学的研究に利用するだけでなく、屈折率の異なる材料が湾曲した界面で接しているような物を試料として全反射法により蛍光観察する場合にも利用することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の一形態に係る光学系の構成を示す模式図である。
【図２】従来の対物レンズ型全反射蛍光顕微鏡の光学系の構成を示す模式図である。
【図３】図２に示す光学系によって、カバーグラスを通して試料となる細胞にレーザー光が照射された場合に、発生するエバネッセント光の様子を示した模式図である。（ａ）は、入射角が小さい場合の、また、（ｂ）は、入射角を大きくした場合の試料に照射されるエバネッセント光の様子を示した模式図である。
【図４】屈折率の異なる２つの透明媒質の界面における光の性質を示した模式図である。なお、（ａ）は、光の入射角が臨界角よりも小さい場合、（ｂ）は、光の入射角が臨界角と等しい場合、（ｃ）は、光の入射角が臨界角よりも大きい場合を示す。
【図５】図１に示す光学系によって、細胞を含む試料にレーザー光が照射された場合の様子を示す模式図である。
【図６】本発明の実施の他の形態に係る光学系の構成を示す模式図である。
【符号の説明】
１０ レーザー発振器（光源）
１３ 対物レンズ
１４ 偏光ビームスプリッター（分光手段）
１５ 直角反射プリズム（反射体）
１６・１７ レンズ
１８ 第１可動型光学部（中継光学部、又は可動型光学部）
１９ 第２可動型光学部（中継光学部、又は可動型光学部）
Ｌ１・Ｌ１’ 中継レンズ
Ｍ１・Ｍ１’ 中継ミラー
Ｍ２・Ｍ３ ミラー
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞膜上の分子反応を観察するために有用な蛍光観察などに使用される新規光学系、及びその光学系を備える顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生物の生命活動の多くは、細胞膜上に存在する膜タンパク質などの分子に担われているため、生きている細胞の細胞膜で実際に分子が働いている現場を観察することが、医学・細胞工学の基礎研究および応用開発において重要である。
【０００３】
このような細胞膜上の分子反応を観察する有用な方法の一つに、蛍光標識された分子に励起光を照射することによって発生する蛍光を蛍光顕微鏡にて観察する蛍光顕微鏡法がある。上記蛍光顕微鏡法としては、落斜照明法がよく用いられる。しかしながら、上記落斜照明法では、照明光が試料中の水溶液を通過するので、背景光が大きくなり、その背景光の中から微弱な蛍光を捕らえるのは非常に困難であるという問題点がある。
【０００４】
そこで近年、細胞膜上の分子反応の蛍光観察を行うための装置として、全反射型蛍光顕微鏡が注目されてきている。上記全反射型蛍光顕微鏡は、エバネッセント光を、試料に照射する光として利用している。上記エバネッセント光とは、後述するように、カバーグラスと細胞との界面などにおいて、入射光の入射角を臨界角よりも大きくすることによって生ずる入射光の全反射現象で得られる、カバーグラスを通過する光である。上記エバネッセント光の光強度は、界面から急激に減衰し、界面より数百ｎｍの範囲までしか届かないため、水溶液からのラマン散乱などによる背景光を抑えることができる。
【０００５】
そのため、上記エバネッセント光で細胞膜上の分子を標識している蛍光色素を励起させる全反射型蛍光顕微鏡によれば、非常に高いコントラストの画像を得ることができる。従って、全反射型蛍光顕微鏡は、微弱な蛍光を捕らえることが可能となり、蛍光１分子をも観察することができる。
【０００６】
上記全反射型蛍光顕微鏡の一例である対物レンズ型全反射蛍光顕微鏡が、文献「Biochemical and Biophysical Research Communications ：1997 Jun 9；235(1)：47-53 ：Tokunaga M, Kitamura K, Saito K, Iwane AH, Yanagida T.」に記載されている。この対物レンズ型全反射蛍光顕微鏡において、試料にエバネッセント光を照射するための光学系の構成を図２を用いて説明する。
【０００７】
図２に示すように、上記対物レンズ型全反射蛍光顕微鏡の光学系は、レーザー光を発生させる光源であるレーザー発振器２０、光路を変更するためのミラーＭ２１、可動ミラーＭ２２、レンズＬ２１、対物レンズ２３などにより構成される。レーザー発振器２０より放出されたレーザー光は、先ずミラーＭ２１によって反射され、光路を変更し、レンズＬ２１へ入射する。レンズＬ２１を通過したレーザー光は、続いて可動ミラーＭ２２によって反射され、対物レンズ２３へ入射する。
【０００８】
上記可動ミラーＭ２２は、図２中の矢印Ｅに示すように位置を変化させることができる。これに伴い、対物レンズ２３へ入射するレーザー光は矢印Ｆに示すように、対物レンズ２３の光軸と平行を保ちながら、上記光軸と上記レーザー光の光路との間隔を変化させることができる。対物レンズ２３を通過するレーザー光は、上述のように対物レンズ２３の光軸とレーザー光の光路との間隔を変化させることよって、カバーグラスの配された試料面への入射角を矢印Ｇに示すように変化させ、エバネッセント光を発生させることができる。カバーグラスの先にある蛍光標識された分子は、このエバネッセント光が照射されることによって、励起され蛍光を発する。
【０００９】
このような光学系を備えることにより、上記対物レンズ型蛍光顕微鏡は、背景光を抑え、微弱な蛍光観察を行うことができる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記光学系では、細胞膜のような曲面状の界面においては、場所による入射角の違いのため、エバネッセント光を局所的にしか発生させることができないので、試料全面に渡って良好な画像を得ることができないという問題点がある。
【００１１】
例えば、上記光学系を用いて、カバーグラス上に培養した細胞に照射するレーザー光の入射角を大きくしていくと、まず、図３（ａ）に示すように、細胞の一部で入射角が臨界角に達しエバネッセント光が発生する。しかし、入射角が臨界角以下の部分も同時に存在し、ここからレーザー光が溶液側に抜けてゆくので背景光が大きくなってしまう。この部分でエバネッセント光を発生させるために、図３（ｂ）に示すように、さらにレーザー光の入射角を大きくすると、最初にエバネッセント場が発生した部分では入射角が大きくなり過ぎて、エバネッセント光は非常に弱くなってしまう。これは、エバネッセント光の減衰長が、入射角が臨界角のときにもっとも長く、入射角が大きくなるに従って急激に短くなってゆく、という性質によるものである。
【００１２】
従って、上記光学系においては、細胞の腹側、即ちカバーグラスに面している側の細胞膜の蛍光観察を行うことは可能であるが、細胞の背側、即ちカバーグラスから離れている側の細胞膜の蛍光観察は不可能である。しかしながら、多くの細胞においては、上記腹側および上記背側の細胞膜は構成要素、機能とも異なっており、生理的に重要な分子が背側にのみ発現している例も多い。
【００１３】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、細胞全体にわたって蛍光観察を行えるような光学系、および、この光学系を用いた顕微鏡を提供することを目的としている。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明に係る光学系は、光源より発生するレーザー光を対物レンズへ入射させ、上記対物レンズを通過した上記レーザー光を入射角が臨界角以上となるように対象物へ入射させることによって、エバネッセント光を発生させる光学系において、上記光学系は、上記レーザー光を２つの経路に分割して異なる位置から対物レンズへ入射させる分光手段を備え、
前記２つの経路を有するレーザー光を、対物レンズの光軸を挟む別々の位置から同時に前記対象物に入射させることを特徴としている。
【００１５】
すなわち、上記光学系は、顕微鏡などを用いて、対象物である試料を観察する際に、その試料を照射するために、レーザー光を試料まで導く光学系であり、光源より発生したレーザー光を、対物レンズを通過させて試料へ照射するものである。そして、上記光学系は、上記レーザー光を上記対物レンズへ入射させる前に、２つ経路を有するレーザー光に分割する分光器などの分光手段を備えることによって、上記レーザー光を上記対物レンズへ異なる２つの位置から入射させる。
【００１６】
上記の構成によれば、異なる入射角で対象物に２つのレーザー光を照射することができる。従って、例えば全反射蛍型光顕微鏡を用いて、蛍光標識された細胞膜を観察する場合に、従来の１つのレーザー光のみを試料に照射する光学系に比べて、広範囲にエバネッセント光を照射することができる。そのため、細胞全体にわたって、ムラなく背景光を抑えた良好な画像を得ることができる。
【００１７】
上記光学系はさらに、上記分光手段により分割された２つのレーザー光を対物レンズへ導く導光手段を備え、上記導光手段は、上記２つの経路を有するレーザー光を、上記対物レンズの光軸に対して平行に入射させる構成としてもよい。
【００１８】
上記の構成によれば、上記２つの経路を有するレーザー光は、上記対物レンズの光軸と平行を保ちながら上記対物レンズに入射するため、焦点を含む対象物の面を通過する上記２つの経路を有するレーザー光の中心位置を変化させることなく、上記２つのレーザー光の入射角を変化させることができる。即ち、上記２つの経路を有するレーザー光の各経路の中心位置を、上記対物レンズの焦点へ集めるため、目的とする対象物面へずれることなく上記２つのレーザー光を照射することができる。
【００１９】
上記光学系における上記導光手段は、上記対物レンズに対して上記２つの経路を有するレーザー光を反射させる１つの反射体と、上記２つの経路を有するレーザー光を経路ごとに受光して上記反射体へ照射する２つの中継光学部とを有し、前記中継光学部は、前記反射体に対する前記２つの経路を有するレーザー光の照射位置をそれぞれ独立して移動させることができる可動型光学部である構成としてもよい。
【００２０】
上記の構成によれば、上記２つの中継光学部の位置を適宜変更させることによって、上記２つの経路を有するレーザー光の照射位置を移動させることができる。これによれば、対物レンズを通過し、対象物へ照射されるレーザー光の入射角を変更することができるため、各対象物に適した入射角を有するレーザー光を照射させることができる。従って、対象物によって屈折率が異なる場合にも、レーザー光の入射角を適宜調節することによって、例えば、蛍光観察に最適なエバネッセント光を発生させることができる。
【００２１】
上記光学系において、上記可動型光学部は、レーザー光を受光する中継レンズと、上記中継レンズを通過したレーザー光を上記反射体に照射する中継ミラーとを有し、上記中継レンズと上記中継ミラーとが、常に同じ距離を保ちながら、上記対物レンズの光軸に対して平行に移動するような構成としてもよい。
【００２２】
上記の構成によれば、上記中継レンズと上記対物レンズとの距離を一定に保つことができ、上記対物レンズへ入射するレーザー光の収束度が変化することを防止できる。
【００２３】
なお、上記中継レンズと上記対物レンズとの距離は、両レンズによって導かれるレーザー光の光路長が、上記両レンズの焦点距離の和に等しくなる位置に配されることが好ましい。上記のような光学系を全反射型蛍光顕微鏡に用いれば、収束度の変化によるレーザー光の強度変化、全反射条件を満たさない入射光の混入および、光散乱の増加による背景光の増大を防ぐことができる。
【００２４】
また、上記光学系においては、上記反射体の断面が直角二等辺三角形の形状を有し、かつ上記直角二等辺三角形の等辺を含む２つの面が少なくとも反射面であり、上記２つの中継光学部は、上記２つの経路を有するレーザー光を、経路ごとに上記２つの面にそれぞれ照射する位置関係となるように配置される構成としてもよい。
【００２５】
ここで、上記反射体の「断面」とは、上記中継ミラーによって反射されたレーザー光が上記反射体によって反射される場合に、レーザー光の光路が取り得る面によって上記反射体を切断したときに得られる断面のことを意味する。従って、上記反射体は、上述のような断面を有するものであれば特に限定されるものではないが、例えば、三角柱や、四角錐のような形態を有するものであることが好ましい。
【００２６】
上記の構成によれば、少なくとも２つの反射面を有する１つの反射体によって、上記２つの中継光学部より導かれた２つの経路を有するレーザー光を、上記対物レンズへ異なる位置から入射させることができる。また、上記の構成によれば、上記２つの中継光学部が可動型光学部である場合に、上記２つの可動型光学部を上記反射体を挟んで向き合うように配置することができるため、可動範囲を大きくすることができる。
【００２７】
さらに、上記光学系は、上記直角二等辺三角形の頂点が、上記対物レンズの光軸上に配される構成としてもよい。
【００２８】
上記の構成によれば、上記２つの中継光学部が位置を変えることで、上記対物レンズの中心位置（光軸の位置）から、あらゆる距離を持たせて、上記２つの可動型光学部からのレーザー光を対物レンズへ入射させることができる。従って、上記対象物への入射角をさらに自由に変化させることができる。さらに、上記の構成によれば、上記２つの経路を有するレーザー光の各経路を共に、上記直角二等辺三角形の頂点の部分に導けば、１つのレーザー光を対象物へ照射することも可能であり、上記光学系の利用範囲を広げることができる。
【００２９】
また、上記光学系は、上記レーザー光の光路の上記対象物への入射角が臨界角となったときの、上記対物レンズ上での上記レーザー光の光路と上記対物レンズの光軸との距離をｄとし、上記対物レンズの径をＤとしたときに、上記反射体の直角二等辺三角形の断面における底辺の長さｌは、２ｄ≦ｌ≦Ｄを満たすことが好ましい。
【００３０】
２ｄ≦ｌとは、上記直角二等辺三角形の底辺の長さｌが、上記レーザー光の中心位置の光路と上記光軸との距離ｄの２倍以上であるということを意味する。従って、これによれば、上記レーザー光の対象物への入射角を、光軸上の０度からエバネッセント光が起こる臨界角まで、自由に変化させることができる。
【００３１】
また、ｌ≦Ｄとは、上記直角二等辺三角形の底辺の長さｌが、上記対物レンズの径Ｄ以下であることを意味する。なお、ここで言う対物レンズの径Ｄとは、光軸を中心として上記レーザー光が入射する位置の方向における、対物レンズの一方の端から他方の端までの長さのことである。これによれば、上記反射体によって反射された上記２つのレーザー光を、ともに対物レンズから外れることなく確実に入射させることができる。
【００３２】
さらに、上記光学系は、上記分光手段が、上記レーザー光を偏光の異なる２つの直線偏光、あるいは、回転方向の異なる２つの円偏光に分割する構成としてもよい。
【００３３】
同一光源から発生したレーザー光を単純に２つのレーザー光に分割し、対象物に入射すると、上記２つのレーザー光間に干渉が起こり、均一な照明を得ることができない。上記の構成によれば、異なる偏光を有する２つのレーザー光に分割するため、上述のような干渉を防ぐことができる。さらに、レーザー光を分割する際、あるいは、統合する際（一つの対象物に照射する際）の光量の浪費を防ぐことできるため、有用である。
【００３４】
また、本発明には、上記光学系を備えた顕微鏡も含まれる。そして、上記顕微鏡は、光学顕微鏡あるいは蛍光顕微鏡であることが好ましい。
【００３５】
上記の構成によれば、一つの光学系のみで、２つのレーザー光を対象物へ照射することができるため、例えば、複数のレーザー光を必要とする光学顕微鏡において、光源の数を減らすことができる。また、上記の構成によれば、照明光の角度を自由に変化させることができるため、多目的に使用することができる。
【００３６】
そして、上記構成の蛍光顕微鏡によれば、全反射法によって広範囲にエバネッセント光を照射できるため、例えば細胞を観察する際などに、細胞全体にムラなく背景光を抑えた良好な画像を得ることができる。
【００３７】
【発明の実施の形態】
本発明の一実施の形態について、図面に基づいて以下に説明する。なお、本発明は、以下の記載に限定されるものではない。
【００３８】
まず、本発明に係る光学系として、全反射型蛍光顕微鏡に接続して用いられる光学系を例に挙げて説明する。蛍光顕微鏡は、観察対象となる試料中の分子（例えば、細胞膜上に存在する膜タンパク質など）を蛍光標識し、励起光を照射して得られる蛍光画像を観察するために用いられるものである。そして、上記全反射型蛍光顕微鏡は、光の全反射現象を利用して蛍光観察を行う。従って、上記光学系は、光の全反射現象によって得られる励起光を試料に照射するために用いられる。
【００３９】
全反射型蛍光顕微鏡に利用される上記励起光は、エバネッセント光と称される。上記エバネッセント光について、以下に説明する。
【００４０】
光は、屈折率の異なる２つの透明な媒質間を通過するとき、その境界面において屈折する。例えば、第１媒質、第２媒質の屈折率をそれぞれｎ1、ｎ2（ｎ1＞ｎ2）とし、境界面への光の入射角をθとすると、図４（ａ）に示すように、θが小さいとき（即ち、θが臨界角より小さいとき）、光は境界面で屈折して進む。しかし、θが大きくなるに従って屈折角は９０°に近づき、図４（ｂ）に示すように、ｓｉｎθ＝ｎ1／ｎ2のとき、屈折角は９０°になる。このときの入射角を、臨界角という。さらに、θを大きくする（即ち、θを臨界角より大きくする）と、図４（ｃ）に示すように、光は境界面で全て反射する。この現象を全反射と呼ぶ。
【００４１】
そして、入射角が臨界角以上の場合、光は第２媒質中に全く入射しないわけではなく、第２媒質中には境界面からの距離に比例して、指数関数的に急激に強度が減衰する光波が存在する。このような光波が、エバネッセント光と呼ばれるものである。上述のように、エバネッセント光は、微弱な光であるため、背景光を抑えたい蛍光観察などには、好適に用いられる。なお、上述のような光の全反射現象により発生するエバネッセント光を利用する方法を、全反射法（全反射蛍光顕微鏡法）と称する。
【００４２】
続いて、上記光学系の構成について図１を用いて説明する。図１に示すように、上記光学系は、レーザー光を発生させる光源であるレーザー発振器１０、光路を変更するためのミラーＭ２・Ｍ３、分光手段である偏光ビームスプリッター１４、中継ミラーＭ１および中継レンズＬ１によって構成される第１可動型光学部１８、中継ミラーＭ１’および中継レンズＬ１’によって構成される第２可動型光学部１９、反射体である直角反射プリズム１５、対物レンズ１３などを含んで構成される。さらに上記光学系は、レーザー光の偏光を変換する偏光板として、３つのλ／４板１１・１２・１２’を有している。なお、上記第１可動型光学部、上記第２可動型光学部および上記直角反射プリズムを併せた部分が導光手段である。
【００４３】
上記光学系における各構成部品の配置について、以下に説明する。レーザー発振器１０とミラーＭ２との間に、λ／４板１１が配されている。λ／４板１１は、レーザー発振器１０より出された直線偏光のレーザー光を円偏光に変換する。また、ミラーＭ２とミラーＭ３との間に偏光ビームスプリッター１４が配されている。上記偏光ビームスプリッター１４は、入射したレーザー光をレーザー発振器１０より出されたレーザー光と同方向の偏光と、上記レーザー光に対して垂直方向の偏光とに分割させるような位置に配されている。
【００４４】
λ／４板１２および第１可動型光学部１８は、上記垂直方向の偏光を有するレーザー光が入射するような位置に配されている。すなわち、第１可動型光学部１８内の中継レンズＬ１は、その光軸上を上記垂直方向の偏光を有するレーザー光が通過するような位置に配されている。
【００４５】
また、λ／４板１２’および第２可動型光学部１９は、上記同方向の偏光を有するレーザー光が、ミラーＭ３に反射された後に入射するような位置に配されている。すなわち、第２可動型光学部１９内の中継レンズＬ１’は、その光軸上を上記同方向の偏光を有するレーザー光が通過するような位置に配されている。
【００４６】
さらに、２つの中継光学部、第１可動型光学部１８・第２可動型光学部１９は、図１に示すように、直角反射プリズム１５を挟んで対称な位置に配されている。即ち、直角反射プリズム１５は、上記２つの可動型光学部の中間の位置に配されている。
【００４７】
上記直角反射プリズム１５は、その断面が直角二等辺三角形の形状を有する三角柱である。そして、上記三角柱の断面である二等辺三角形の等辺のうちの一辺を含む面と平行な位置に、第１可動型光学部１８内の中継ミラーＭ１は配されている。また、上記三角柱の断面である二等辺三角形の等辺のうちの他の一辺を含む面と平行な位置に、第２可動型光学部１９内の中継ミラーＭ１’は配されている。なお、上記直角反射プリズム１５の断面の直角二等辺三角形の頂点は、対物レンズ１３の光軸が通過するような位置に配されている。
【００４８】
そして、上記第１可動型光学部１８・第２可動型光学部１９は、それぞれ矢印Ａあるいは矢印Ａ’に示すように、対物レンズ１３の光軸と平行に独立して移動することができる。これにより、偏光ビームスプリッター１４によって偏光された２つの経路を有するレーザー光を、対物レンズ１３の光軸と平行を保ちながら、上記２つの経路を有するレーザー光を矢印ＢあるいはＢ’のように光軸からの距離を変更することができる。従って、対物レンズ１３を通過した上記２つの経路を有するレーザー光は、試料面における入射角を矢印ＣあるいはＣ’のように変化させることができる。
【００４９】
さらに、上記第１可動型光学部１８内の中継レンズＬ１および中継ミラーＭ１、あるいは、上記第２可動型光学部１９内の中継レンズＬ１’および中継ミラーＭ１’は、常に一定の距離を保ちながら移動する。これにより、中継レンズＬ１あるいはＬ１’から対物レンズ１３までの光路長を常に一定にすることができる。
【００５０】
続いて、上記光学系において、レーザー光を試料まで照射する方法について説明する。先ず、レーザー発振器１０は、所定の方向の直線偏光（これをＰ偏光と称する）であるレーザー光を発生させる。続いて、λ／４板１１が、上記Ｐ偏光のレーザー光を円偏光に変換する。λ／４板１１を通過した円偏光のレーザー光は、ミラーＭ２によって反射され、光路を変更し、偏光ビームスプリッター１４へ入射する。上記ミラーＭ２は、光軸調整を行うために適宜角度を変更することができる。これにより、レーザー発振器１０自体を動かして光軸調整を行う手間を省くことができる。
【００５１】
偏光ビームスプリッター１４では、上記円偏光のレーザー光を２つの直線偏光、即ちＰ偏光と上記Ｐ偏光と垂直に交差する方向の直線偏光であるＳ偏光とに分割する。次に、上記Ｓ偏光のレーザー光は、偏光方向による反射率の違いの影響を避けるために、λ／４板１２で再び円偏光に変換され、第１可動型光学部１８へ入射する。一方、上記Ｐ偏光のレーザー光は、ミラーＭ３によって光路を変更された後、λ／４板１２’で再び円偏光に変換され、第２可動型光学部１９へ入射する。なお、上記λ／４板１２・１２’によって変換された２つの円偏光は、互いに逆回りの円偏光を有している。これによって、２つのレーザー光間の干渉を防ぐことができ、観察する試料に含まれる蛍光色素を偏りなく励起することができる。
【００５２】
第１可動型光学部１８へ入射したレーザー光は、中継レンズＬ１を通過した後、中継ミラーＭ１によって反射され、直角反射プリズム１５の一つの反射面へ入射する。第２可動型光学部１９へ入射したレーザー光は、中継レンズＬ１’を通過した後、中継ミラーＭ１’によって反射され、直角反射プリズム１５の他の反射面へ入射する。
【００５３】
上記直角反射プリズム１５へ入射した各経路のレーザー光は、それぞれ反射され、上述のように対物レンズ１３の光軸と平行を保ちながら、対物レンズ１３の異なる位置へ入射する。
【００５４】
上述のような方法で、本実施形態の光学系は、上記２つのレーザー光を、対物レンズ１３の光軸から離れた別々の位置から入射させることができる。そのため、試料面の広範囲に渡って全反射現象を生ずるような入射角を有して、試料に入射することが可能であり、試料の全体にエバネッセント光を照射することができる。さらに、上記光学系は、試料面への入射角を適宜変更することができるため、エバネッセント光が発生するような入射角となるように、各試料の屈折率に応じて入射角を変えることができる。従って、確実に蛍光観察を行うことができる。
【００５５】
即ち、上記のような構成によって、本光学系は、図５に示すように２つに分割されたレーザー光を、異なる位置からカバーグラスを通して、試料となる細胞へ照射することができる。そして、対物レンズ１３の光軸からの距離を自由に調節することができるため、試料への入射角を調節することが可能となる。従って、細胞の全体にわたって全反射条件を満たすようなレーザー光を照射でき、エバネッセント光を発生させることができる。なお、図５においては、比較的細いレーザー光を使用した場合の様子を示しているが、より太いレーザー光を使用することによって、細胞全体にエバネッセント光を照射することが可能である。
【００５６】
また、本光学系を用いた蛍光顕微鏡は、観察対象となる試料として、細胞に限らず、屈折率の異なる材料が湾曲した界面で接している部分を全反射法で観察する場合にも、好適に用いることができる。
【００５７】
そして、本実施形態においては、上記反射体の一例として、直角反射プリズム１５を用いている。この構成によれば、直角反射プリズム１５の先端にレーザー光の２つの経路を導くことによって、光軸とレーザーの光路が重なり入射角が０度になるまで２本のレーザーの間隔を小さくすることができる。これは通常の落斜型蛍光顕微鏡と同じ状態であり、本発明の利用範囲を広げるものである。即ち、本実施の形態に係る光学系は、落斜照明法による蛍光観察にも使用することができる。また、上記直角反射プリズム１５を用いることによって、上記光学系は、上記２つのレーザー光と上記光軸との間隔を小さくすることもできるため、瞳の大きさが制限される蛍光顕微鏡の入射光学系に好適に用いることができる。
【００５８】
さらに、上記直角反射プリズムにおいて、レーザー光の光路が取り得る面である二等辺三角形の断面の底辺の長さをｌとすると、上記ｌは、次のような条件を満たすことが好ましい。
【００５９】
第１に、試料面への入射角が臨界角以上になるような位置から、対物レンズ１３へ入射できることが好ましい。つまり、対物レンズ１３への入射時に、レーザー光の光路が、対物レンズ１３の光軸位置と、試料面への入射角が臨界角となる程度に離れていなければ、上記レーザー光が試料面を照射した場合に、エバネッセント光を効率よく発生させることができない。従って、レーザー光における光路の試料面への入射角が臨界角となったときの、対物レンズ１３上におけるレーザー光の中心と対物レンズ１３上の光軸位置との距離をｄとすると、ｌとｄとの間で、ｄ≦ｌ／２という関係を満たすことが好ましい。
【００６０】
即ち、上記直角反射プリズムの一つの反射面に対する底辺の長さ、即ち底辺ｌの半分の長さに相当するｌ／２が、距離ｄ以上となることによって、第１可動型光学部１８より反射されたレーザー光は、上記入射角を臨界角以上とすることができる。また、第２可動型光学部１９より反射されたレーザー光においても同様のことが言えるため、結果として、底辺ｌ長さは、２ｄ≦ｌを満たすことが好ましい。なお、レーザー光が取り得る光路と対物レンズ１３の光軸とは、互いに平行な関係にあるため、上記距離ｄは上記光路と上記光軸との距離とも言える。
【００６１】
第２に、対物レンズ１３の径をＤとしたときに、上記２つの可動型光学部１８・１９からの２つのレーザー光を、ともに対物レンズ１３へ外れることなく確実に入射させるために、底辺ｌは径Ｄ以下であることが好ましい。即ち、底辺ｌの長さが、ｌ≦Ｄを満たすことが好ましい。
【００６２】
以上をまとめると、結果として、上記直角二等辺三角形の底辺ｌの長さは、２ｄ≦ｌ≦Ｄを満たすことが好ましい。
【００６３】
また、本実施の形態においては、ミラーＭ２およびλ／４板１２・１２’を備えた構成としているが、本発明に係る光学系は、上記の構成を省いてもよい。また、本実施の形態において用いられる分光手段としての上記偏光ビームスプリッター１４は、各々逆回りの円偏光に分割するようなものであってもよい。これによれば、分割されたレーザー光を、λ／４板１２・１２’を使用することなく、直接２つの可動型光学部１８・１９へ入射させることができる。
【００６４】
なお、本発明の実施の他の形態として、上記光学系は、図６に示すように、直角反射プリズム１５と対物レンズ１３との間に、さらに２つのレンズ１６・１７を有する構成としてもよい。上記の構成によれば、上記光学系を蛍光観察などに用いた場合に、試料面へのレーザー光の入射角をより調節しやすくすることができる。
【００６５】
すなわち、第１可動型光学部１８の移動距離をＫとし、上記第１可動型光学部１８を通過して対物レンズ１３へ入射するレーザー光の移動距離をｋとすると、図１に示す光学系の場合、各移動距離Ｋおよびｋは等しくなる（即ち、Ｋ＝ｋ）。一方、図６に示す光学系のように、レンズ１６・１７を備える構成の場合、レンズ１６および１７に異なる焦点距離のレンズを選択することによって、上記第１可動型光学部１８の移動距離Ｋと上記レーザー光の移動距離ｋとの間に比例関係が成立する（即ち、Ｋ＝ａｋ）。
【００６６】
レンズ１６と１７との焦点距離を、それぞれｆ16、ｆ17とすると、ａ＝ｆ17／ｆ16となる。従って、例えば、ｆ16＜ｆ17とすると、ａ＞１となるため、上記レーザー光の移動距離ｋは上記第１可動型光学部１８の移動距離Ｋよりも大きくなる（即ち、Ｋ＜ｋ）。つまり、第１可動型光学部１８を少し動かしただけで、対物レンズ１３へ入射するレーザー光の光路を大きく移動させることができる。また、逆にｆ16＞ｆ17とすると、ａ＜１となり、上記レーザー光の移動距離ｋを上記第１可動型光学部１８の移動距離Ｋよりも小さくすることができるため、入射角の微妙な調整が可能となる。なお、上記の構成によれば、第２可動型光学部１９を通過したレーザー光についても、上記第１可動型光学部１８を通過したレーザー光と同様に、試料面への入射角を調節しやすくすることができる。
【００６７】
本実施の形態においては、全反射型蛍光顕微鏡に接続して使用する光学系を例に挙げている。しかしながら、本発明に係る光学系はこれに限らず、例えば、複数の入射光を必要とする光学顕微鏡、より具体的には、スタンディングウェーブ顕微鏡やＣＡＲＳ顕微鏡などに使用することができる。上記の構成によれば、一つの光源によって、２つの入射光を得ることができるため、用いる光学系の数を減らすことができる。
【００６８】
また、本発明に係る光学系は、入射光の角度を変化させることが必要な暗視野顕微鏡、低角照明顕微鏡、光トモグラフィー顕微鏡などにも利用することができる。上記の構成によれば、入射光の角度を自由に変化させることが可能であるため、試料の広範囲に良好な入射光を照射することができるようになり、有用である。
【００６９】
【発明の効果】
以上のように、本発明に係る光学系は、光源より発生するレーザー光を対物レンズへ入射させ、上記対物レンズを通過した上記レーザー光を対象物へ照射する光学系において、上記光学系は、上記レーザー光を２つの経路に分割し、異なる位置から対物レンズへ入射させる分光手段を備える構成である。
【００７０】
また、本発明に係る顕微鏡は、上記各構成の光学系を備えた構成であり、具体的には、上記各構成の光学系を備える光学顕微鏡または蛍光顕微鏡を挙げることができる。
【００７１】
それゆえ、本発明では、異なる入射角で対象物に２つのレーザー光を個別の経路で照射することができる。従って、１つの経路のみで対象物にレーザー光を照射する従来の光学系に比べて、広範囲にレーザー光を照射することができる。そのため対象物を良好に照射することができるという効果を奏する。
【００７２】
特に、例えば全反射蛍光顕微鏡法を用いて、蛍光標識された細胞膜を観察する場合に、従来の光学系に比べて広範囲にエバネッセント光を照射することができる。そのため、全ての膜内在性分子および、細胞内外から膜と相互作用する分子の蛍光観察に利用することも可能であり、非常に広範囲に及ぶ研究に利用できるという効果を奏する。
【００７３】
さらに、上記光学系は、細胞膜の観察という生物学的研究に利用するだけでなく、屈折率の異なる材料が湾曲した界面で接しているような物を試料として全反射法により蛍光観察する場合にも利用することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の一形態に係る光学系の構成を示す模式図である。
【図２】従来の対物レンズ型全反射蛍光顕微鏡の光学系の構成を示す模式図である。
【図３】図２に示す光学系によって、カバーグラスを通して試料となる細胞にレーザー光が照射された場合に、発生するエバネッセント光の様子を示した模式図である。（ａ）は、入射角が小さい場合の、また、（ｂ）は、入射角を大きくした場合の試料に照射されるエバネッセント光の様子を示した模式図である。
【図４】屈折率の異なる２つの透明媒質の界面における光の性質を示した模式図である。なお、（ａ）は、光の入射角が臨界角よりも小さい場合、（ｂ）は、光の入射角が臨界角と等しい場合、（ｃ）は、光の入射角が臨界角よりも大きい場合を示す。
【図５】図１に示す光学系によって、細胞を含む試料にレーザー光が照射された場合の様子を示す模式図である。
【図６】本発明の実施の他の形態に係る光学系の構成を示す模式図である。
【符号の説明】
１０ レーザー発振器（光源）
１３ 対物レンズ
１４ 偏光ビームスプリッター（分光手段）
１５ 直角反射プリズム（反射体）
１６・１７ レンズ
１８ 第１可動型光学部（中継光学部、又は可動型光学部）
１９ 第２可動型光学部（中継光学部、又は可動型光学部）
Ｌ１・Ｌ１’ 中継レンズ
Ｍ１・Ｍ１’ 中継ミラー
Ｍ２・Ｍ３ ミラー
Claims (10)
- 光源より発生するレーザー光を対物レンズへ入射させ、前記対物レンズを通過した前記レーザー光を入射角が臨界角以上となるように対象物へ入射させることによって、エバネッセント光を発生させる光学系において、
前記光学系は、前記光源より出された前記レーザー光を２つの経路に分割し、異なる位置から前記対物レンズへ入射させる分光手段を備え、
前記２つの経路を有するレーザー光を、対物レンズの光軸を挟む別々の位置から同時に前記対象物に入射させることを特徴とする光学系。 - 前記光学系はさらに、前記分光手段により分割された２つの経路を有するレーザー光を対物レンズへ導く導光手段を備え、
前記導光手段は、前記２つの経路を有するレーザー光を、前記対物レンズの光軸に対して平行に入射させることを特徴とする請求項１に記載の光学系。 - 前記導光手段は、前記対物レンズに対して前記２つの経路を有するレーザー光を反射させる１つの反射体と、前記２つの経路を有するレーザー光を経路ごとに受光して前記反射体へ照射する２つの中継光学部とを有し、
前記中継光学部は、前記反射体に対する前記２つの経路を有するレーザー光の照射位置をそれぞれ独立して移動させることができる可動型光学部であることを特徴とする請求項２に記載の光学系。 - 前記可動型光学部は、レーザー光を受光する中継レンズと、前記中継レンズを通過したレーザー光を前記反射体に照射する中継ミラーとを有し、
前記中継レンズと前記中継ミラーとが、常に同じ距離を保ちながら、前記対物レンズの光軸に対して平行に移動することを特徴とする請求項３に記載の光学系。 - 前記反射体は、断面が直角二等辺三角形の形状を有し、かつ前記直角二等辺三角形の等辺を含む２つの面が少なくとも反射面であり、
前記２つの中継光学部は、前記２つの経路を有するレーザー光を、経路ごとに前記２つの面にそれぞれ照射する位置関係となるように配置されることを特徴とする請求項３または４に記載の光学系。 - 前記直角二等辺三角形の頂点は、前記対物レンズの光軸上に配されることを特徴とする請求項５に記載の光学系。
- 前記２つの経路を有するレーザー光の光路の前記対象物への入射角が臨界角となったときの、前記対物レンズ上における前記レーザー光の光路と前記対物レンズの光軸との距離をｄとし、
前記対物レンズの径をＤとしたときに、
前記反射体の直角二等辺三角形の断面における底辺の長さｌは、
２ｄ≦ｌ≦Ｄを満たすことを特徴とする請求項５または６に記載の光学系。 - 前記分光手段は、前記レーザー光を異なる２つの直線偏光、あるいは、回転方向の異なる２つの円偏光に分割することを特徴とする請求項１ないし７の何れか１項に記載の光学系。
- 請求項１ないし８の何れか１項に記載の光学系を備えることを特徴とする顕微鏡。
- 前記顕微鏡が、光学顕微鏡または蛍光顕微鏡であることを特徴とする請求項９に記載の顕微鏡。
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