JP3801565B2 - 肥満を治療または抑制する組成物 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

〔背景技術〕
〔１．技術分野〕
社会が先進化するにつれ、摂取する食べ物の質や量、それから遺伝的、 環境的、心理的な要因によって誘発される肥満は、体内の様々な組織に、特に脂肪組織に脂肪が蓄積されることによって発生する病理現象である。肥満は、糖尿病、高血圧などの心血関係の疾患、寿命短縮などの直接・間接的な原因になるため、多くの病気のもととみなされており、さらに美容の観点かれも幸福かつ健康な生涯のために、その予防及び治療は重要な問題である。

〔２．従来技術の説明〕
多くの研究を通じて、食餌療法及び運動による肥満の減少が、これらの危険因子をかなり減らすことができるということが証明された。しかし、不幸にもこのような治療は失敗率が非常に高く成功し難い。このような失敗は、段々増える食欲および高カロリー食べ物に対する好み、減っている身体活動及び増える脂質生成代謝に寄与する遺伝的な因子と密接な関係がある。特に、遺伝的に肥満の特質を受け継いだ人々は、大きな努力にもかかわらず、肥満を治し難い問題がある。従って、この脂肪過多症の障害患者などの肥満を治すことのできる薬効物質が必要である。

肥っていない体を保つために食餌療法や運動などを行うことも可能であるが、長い目で見ると、結局は本来の肥満状態に戻ることになる。従って、比較的に簡単な方法で長期的に肥満を予防或いは治療するために、ワクチン或いはタンパク質治療剤、遺伝子治療剤の形態で応用されうるポリペプチド性タンパク質を発明した。

本発明者は一連の生化学、分子生物学的研究を進めてきながら、重要な試薬であるポリクローナル抗体を、抗原アジュバント(Ａｄｊｕｖａｎｔ)を混合した混濁液を白ウサギの皮下に約２〜４回、４週〜６週にかけて注射し、血液を採取することにして作製してきた。このような一連の過程中に、我々は特定のポリペプチド性タンパク質(以下、「ＳｙｎＬｅｐｔｉｎ」と称する)が、ウサギの体重を２０％以上著しく減らすことを見出し、体重減少が主に体脂肪組織、特に腹部脂肪の生成抑制を通じて成ることを見出した。従って、このポリペプチドは、肥満予防のワクチン或いは肥満治療剤として使用されうる。

本発明が属する技術は肥満の生物学的治療剤であって、この分野の従来の肥満治療技術は、肥満抑制ホルモンのレプチン(Ｌｅｐｔｉｎ)タンパク質、食餌療法、運動などがある。本発明は、体内で脂肪組織の生成を抑えることによって肥満を抑制できる革新的な抑制剤に関する発明であり、詳しくは７２或いは８６個のアミノ酸からなるタンパク質を抗体形成に必要なアジュバントと混ぜて皮下に注射することによって、脂肪組織の形成を抑える效果を持つタンパク質に関する発明である。７１個或いは８６個のアミノ酸からなる部分的なタット(Ｔａｔ)ポリペプチドの切片が抗肥満效果を見せることから、１０１個のタットタンパク質も抗肥満效果を持つと予想される。本発明は、タットタンパク質が体内脂肪を少なくするという世界最初の発見に基づいて、エイズ患者の場合、やせた体型を見せる現象がおそらくタットタンパク質によることを示唆する。これらのタット及びそれから誘導されたタンパク質は、肥満予防或いは治療ワクチン、タンパク質或いは遺伝子治療剤として使用されうる。
〔発明の要旨〕
本発明は、上述した問題点を解決し、上記の必要性より案出されたものであり、本発明の目的は肥満治療に效果的な生物学的製剤を提供することにある。

上記の課題を解決するために、本発明は、配列情報２または３に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドの少なくとも一方を含み、肥満を治療または抑制する組成物を提供する。

本発明において、配列情報１のポリペプチドは一般的な１０１個のアミノ酸からなるタットを意味し、配列情報２のポリペプチドはタットのうちＮ末端から８６個のアミノ酸を意味し、配列情報３のポリペプチドはタットのうちＮ末端から７１個のアミノ酸を意味する。しかし、本発明の脂肪組織形成の抑制効果があるポリペプチドは、上記のタットポリペプチド又はその様々な突然変異型(自然的に多様な変異が存在)であり、その一部または全部を含む。

また、本発明は上記のポリペプチドをコーディングする配列情報２、３のＤＮＡ塩基配列及び上記の遺伝子を含む再組合せベクトルｐｃＤＮＡ３.０ ＳｙｎＬｅｐｔｉｎ-１及び-２またはｐＧＥＸ４Ｔ ＳｙｎＬｅｐｔｉｎ-１及び-２を提供する。

本発明のポリペプチドは、多様な薬製学的形態で、肥満予防ワクチン或いは肥満タンパク質治療剤、遺伝子治療剤として使用されうる。
〔好ましい実施形態の詳細な説明〕
以下、本発明を詳しく説明する。

肥満は、上述べた理由のように体内の様々な組織、特に脂肪組織に脂肪が蓄積されることによって発生する病理現象である。肥満は糖尿病、高血圧などの心血関係の疾患、寿命短縮などの直接・間接的な原因になり、数多くの病気のもととみなされている。体重の約５％のみを減らしても、上述した疾患から急激に好転すると報告されている。

高等脊椎動物は、正確に脂肪組織の大きさを調節している。脂肪組織が拡張され体重が増えると、体重調節物質(Ｌｅｐｔｉｎ)が血液内で増え、脳下垂体に存在する受容体に作用して、メラニン細胞刺激ホルモン分泌の増加、メラノコルチン-４受容体の増加を誘発して、体重を減らそうとする一連の過程が起こるようになる。この結果、食欲の低下による食べ物の摂取減少、エネルギー放出の増加、交感神経系の刺激の増加などが起こる。逆に、脂肪組織が縮小されて体重が減ると、体重調節物質が血液内で減り、これが脳下垂体に感知されて神経ペプチドＹ、Ｙ-受容体の増加を誘発して体重を増やそうとする一連の過程が起こるようになる。即ち、食欲増進による食べ物の摂取増加、エネルギー消費の減少、生殖能力の減少、体温の低下、副交感神経系の刺激の増加などが起こる。従って、肥満組織の量及びそれによる体重調節は、このように非常に正確なフィードバック(ｆｅｅｄｂａｃｋ)調節メカニズムによってなされている。

このような調節に核心的な役割を担当するホルモン遺伝子がＯｂｅｓｅ(ｏｂ) Ｄｉａｂｅｔｅｓ(ｄｂ)、ａｇｏｕｔｉなどである。特に、ｏｂの場合は、脂肪組織から生産されて血液に漂う分子量１６ｋＤのポリペプチド(Ｌｅｐｔｉｎと言う)である。これらの遺伝子の発現及び機能に変異が生じたり、或いはこのホルモンを認識する細胞の表面受容体の数及び機能に異常が発生すると、脂肪組織の大きさが激しく増え、これによって体重が増える。

従って、肥満治療の目的でｏｂポリペプチド(Ｌｅｐｔｉｎ)を血液内に注入することによって、実験動物から明らかな效果が観察されていることが報告されており、人間に適用するために臨床試験が進んでいる。現在の臨床結果は、様々な肥満人の場合、７.１Kgの体重減少效果を見せるが、ある対象からは体重減少效果が出てこないため、部分的な成功を見せている。これは、肥満に至る過程がｏｂ以外にもｏｂ受容体の異常をはじめとして多様の遺伝的な欠陥によって現われる綜合的な結果であることとみなされる。
また、ネズミを用いた実験から体重とは関係なく、ｏｂポリペプチドが、ブドウ糖の代謝を増加させることによって第２型糖尿病の治療可能性まで提示している。

本発明の目的は、各種難治性疾患の原因になる肥満を体脂肪組織の蓄積を抑制することによって效果的に肥満を予防或いは治療することにある。また、本発明のタンパク質は、Ｌｅｐｔｉｎに抵抗性を示す肥満患者の場合でも治療可能性が高い。なぜならば、Ｌｅｐｔｉｎの場合、必ず受容体を通じてその機能を発揮するが、ＳｙｎＬｅｐｔｉｎ-１及び-２の場合にはＰＴＤ(Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ，タンパク質透過能)ドメインを持ち細胞膜透過性を持つため、受容体の数や機能に問題がある場合でも、效果的に脂肪組織生成を抑制できる。実際に、ｏｂ受容体(Ｄｂ遺伝子)の壊れたＺＤＦ白鼠に対する動物実験は、体重減少効果があることを見せている。

さらに、Ｌｅｐｔｉｎの場合は、血管内にタンパク質を供給しなければならないが、ＳｙｎＬｅｐｔｉｎ-１及び-２の場合、ＰＴＤドメインが存在することで、２〜３回程皮下組織に注射して長期間徐々に放出されるようにすることによって、肥満治療剤として使用するとき遥かに簡便な投薬経路を使用できるようになる。

肥満の予防及び治療のために多様な方法、即ち食餌療法(Ｄｉｅｔ)、運動、薬物治療など様々な方法が行われているが、中断すると本来の状態に戻るため究極的な治療方法がない。本発明の産物であるＳｙｎＬｅｐｔｉｎは、このような肥満予防に上述した問題点を解決し、上記の必要によって案出されたものであり、優れた脂肪組織生成の抑制機能を通じた肥満予防及び治療效果を持っている。

以下、非限定的な実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。

〔実施例１〕ｐＧＥＸ４Ｔ-３-ＳｙｎＬｅｐｔｉｎ-1及び-２発現プラスミド製造及びＳｙｎＬｅｐｔｉｎ-１及び-２タンパク質の生産
ＳｙｎＬｅｐｔｉｎ-２のＰＣＲは、センス方向プライマーのＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＣＡＧＴＡＡＡＴＣＣＴＡＧＣＣＴＡＧと、アンチセンス方向プライマーのＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＴＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＣＴＴＧＡＴＧとを用いて実施した。ＰＣＲの条件は、鋳型のＨＩＶ-１ウイルスのタットｃＤＮＡを９４度で５分間変性させた後、３０サイクルの増幅反応(９４度３０秒、６０度３０秒、 ７２度３０秒)と、最終的に７２度で５分間反応させることであった。得られたＰＣＲ産物を２.０％のアガロースゼルから分離、精製し、制限酵素のＢａｍＨ１とＥｃｏＲ１で切断した。タンパク質発現ベクトルであるｐＧＥＸ４Ｔ-３(Ｐｈａｒｍａｃｉａ社)を同一の制限酵素(ＢａｍＨ１及びＥｃｏＲ１)にて切断し、これをＳｙｎＬｅｐｔｉｎ-２ ｃＤＮＡのＢａｍＨ１-ＥｃｏＲ１切片とともにＴ４ ＤＮＡリガーゼで接合させ、E．ｃｏｌｉ ＢＬ２１(ＤＥ３)に、形質転換方法により導入させた。

８６個のアミノ酸のタットを含むｐＧＥＸ４Ｔ-３-ＳｙｎＬｅｐｔｉｎ-１発現プラスミド(ｐｌａｓｍｉｄ)製造及びＳｙｎＬｅｐｔｉｎ-１タンパク質の生産のために、ＨＩＶ-１ウイルスのタット ｃＤＮＡを利用、ＰＣＲはセンス方向プライマーのＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＣＡＧＴＡＣＣＴＡＧＡＣＴＡＧＡＧＣと、アンチセンス方向プライマーのＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＧＧＧＴＣＣＣＣＴとを用いて、上と同じ条件で実施した。上述した同様の方法を用いてｐＧＥＸ４Ｔ-３-ＳｙｎＬｅｐｔｉｎ-１を製造した。

形質転換されてｐＧＥＸ４Ｔ-３-ＳｙｎＬｅｐｔｉｎ-１または-２が入った菌(Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＤＥ３)をＴＹ液体培地(ａｍｐｈｉｃｉｌｌｉｎ添加、１００μｇ/ml)に接種し一晩育てて用意した後、１００mlのＴＹ液体培養液(ａｍｐｈｉｃｉｌｌｉｎ添加、１００μｇ/ml)に１/１００ボリュームの量で入れ１時間３０分間育てたのち、０.２mMのＩＰＴＧで３０℃で１０時間融合タンパク質合成を誘導した。ＳｙｎＬｅｐｔｉｎ-１及び-２タンパク質は、ＧＳＴ-Ａｇａｒｏｓｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙクロマトグラフィー方法を用いて分離・精製した。

哺乳動物細胞に発現できるように、発現再組合せベクトルｐｃＤＮＡ３．０ ＳｙｎＬｅｐｔｉｎ-１及び-２らは、次のように製造した。ｐｃＤＮＡ３．０(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社)プラスミドを制限酵素のＢａｍＨ１-ＥｃｏＲ１(約２２０bp)で処理した。これを、上述したＳｙｎＬｅｐｔｉｎ ｃＤＮＡ-１または-２遺伝子のＢａｍＨ１-ＥｃｏＲ１切片とともに、Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼで接合させ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換方法により導入させて、アルカリ-リーシス方法でプラスミドを製造した。

〔実施例２〕脂肪組織生成の抑制による体重減少の動物実験
約１.２kgの白ウサギ４匹を２グループに分けて、２匹は対照群に２匹は実験群に用いた。精製されたＳｙｎＬｅｐｔｉｎ-１または-２タンパク質(５００〜７００μｇ)或いは生理食塩水を、アジュバント２ml(Ｓｉｇｍａ)と混ぜてウサギの皮下組織の４部位に注射した。２週後に２次で同量のタンパク質-アジュバント混合液を注射した。また、２週後に３次で皮下注射を実施した。以降１０日経て、体重減少を測定した。その結果、対照群では２匹のウサギの体重が各々２.５kg、２.４５kg(平均２.４８kg)であり、ＳｙｎＬｅｐｔｉｎ-１で処理した実験群のウサギは１.８kg、２.０８kg(平均１.９４kg)であった。対照群に比べて実験群では、約２２％の体重減少があった(図１参照)。Ｌｅｐｔｉｎ受容体が壊れた遺伝子を持つＺＤＦネズミを対象としたＳｙｎＬｅｐｔｉｎ-１及び-２を用いた実験では、約３０日間にわたって、対照群では処理前より８.５％ほどの体重が増加し、ＳｙｎＬｅｐｔｉｎ-1によっては体重が３.５％増加して体重増加が明らかに減少し、ＳｙｎＬｅｐｔｉｎ-２を処理した場合は４.３％の体重減少が観察された（図２参照）。

〔実施例３〕実験動物の剖検
このような体重減少がいかなる原因から起因されたかを剖検と病理学的な検査を通じて確認した。剖検前のウサギは、実験群及び対照群共に正常的な活動の様子を見せた。ウサギを犠牲させ腹部を開けて臓器を調べた結果、臓器の形態など病理的な異常が観察されなかった。しかし、多様な臓器の周り及び皮下脂肪組織、腹部の脂肪組織に極めて明らかに脂肪が減少されていることが観察できた。特に、腹部脂肪の大部分を占める腹部脂肪組織が明らかに減少したことがわかった(図３参照)。

〔産業上の利用可能性〕
本発明によって導出されたタンパク質は、優れた脂肪組織の生成抑制機能を通じた肥満予防及び治療效果を持っているため、肥満予防ワクチン或いは肥満治療剤として使用されうる。また、同じ目的でタンパク質製剤または遺伝子治療剤(ＤＮＡワクチンの形態で)としても使用され肥満が治せる。

図１は、ウサギを用いた脂肪組織生成抑制による体重減少の動物実験結果を見せる図面である。対照群に比べて、本発明のＳｙｎＬｅｐｔｉｎ-１ポリペプチドを処理した場合、２０％ほどの体重が減少したことを見せており、これは脂肪組織の生成抑制によることである(図３参照)。 図２は、Ｌｅｐｔｉｎ受容体が壊れた生後１２週が経ったＺＦＤネズミから、ＳｙｎＬｅｐｔｉｎ-１又は-２ポリペプチドを２週おきで２回皮下注射して観察される体重減少の動物実験結果を見せる図面である。対照群(生理食塩水処理)に比べて、本発明のＳｙｎＬｅｐｔｉｎ-１または-２ポリペプチドを処理した場合、約３０日が経った時点で、対照群では処理前より８.５％ほどの体重が増える反面、ＳｙｎＬｅｐｔｉｎ-１によっては３.５％増えて体重増加が著しく減少しており、ＳｙｎＬｅｐｔｉｎ-２を処理した場合は、むしろ４.３％の体重減少が観察された。 図３は、実験動物の剖検結果を見せる写真である。図３のＡは、本発明のＳｙｎＬｅｐｔｉｎ-１ポリペプチド-Ａｄｊｕｖａｎｔ混合液を２週間おきで３回皮下注射した実験群のウサギの内蔵の脂肪組織分布を矢印で示し、Ｂは対照群であって、生理食塩水-Ａｄｊｕｖａｎｔ混合液を３回皮下注射した実験群のウサギの内蔵の脂肪組織分布を矢印で示した。写真から分かるように本発明のポリペプチドを処理したとき、明らかに脂肪組織が減少したことが見られる。

Claims (1)

1. 配列情報２または３に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドの少なくとも一方を含み、肥満を治療または抑制する組成物。