KR20020082271A - 비만 억제 폴리펩타이드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 체내에서 지방 조직의 생성을 억제함으로서 비만을 억제할 수 있는 능력을 보유한 폴리펩타이드에 관한 발명으로, 이러한 폴리펩타이드는 비만 예방 백신 혹은 비만 치료제, 나아가 제2형 당뇨병의 치료에도 사용될 수 있다.

Description

비만 억제 폴리펩타이드{Anti-obesity polypeptides}

우리 사회가 선진화되면서 섭취하는 음식의 질이나 양, 그리고 유전적, 환경적, 심리적 요인에 의하여 유발되는 비만은 체내의 여러 조직에서 특히 지방 조직에서 지방이 축적됨으로서 발생하는 병리 현상이다. 비만은 당뇨병, 고혈압 등 심혈관계 질환, 수명 단축 등의 직접, 간접적인 원인이 되며 많은 병의 근원이라 여겨지고 있으며, 미용 목적 등 행복한 삶과 건강한 삶을 위하여 비만의 예방 및 치료는 중요한 문제이다.

많은 연구들을 통해 식이요법 및 운동에 의한 비만의 감소가 이들 위험 인자를 상당히 감소시킨다는 것이 증명되었다. 불행하게도 이러한 치료는 실패율이 매우 높아, 성공적이기가 어렵다. 이러한 실패는 그러한 상태가 증가하는 식욕, 고 칼로리 음식에 대한 선호, 감소된 신체 활동 및 증가된 지질생성 대사에 기여하는 유전적 인자와 밀접한 관계가 있다. 특히 유전적으로 비만의 특질을 물려받은 사람들은 많은 노력에도 불구하고, 비만을 치료하기가 어려운 문제가 있다. 따라서 이 지방과다증 장애 환자 등 비만을 치료 할 수 있는 약효 물질이 필요하다.

비만하지 않은 상태로 몸을 유지하기 위하여 식이요법, 운동 등을 실시 할 수 있으나 장기적으로 볼 때에 결국은 본래의 비만 상태로 복귀하게 된다. 따라서 우리는 비교적 간단한 방법을 사용하여 장기적으로 비만을 예방 혹은 치료하기 위하여 백신 혹은 단백질 치료제, 유전자 치료제 형태로 응용될 수 있는 폴리펩타이드성 단백질을 발명하였다.

우리는 일련의 생화학, 분자생물학적 연구를 진행하여 오면서, 중요시약인 폴리크로날 항체를, 항원과 Adjuvant를 혼합한 혼탁액을 백색 토끼의 피하에 약 2-4회 4주-6주에 걸쳐 주사하고 혈액을 채취함으로서 제작하여 왔다. 이러한 일련의 과정 중에 우리는 특정 폴리펩티드성 단백질(이하, "SynLeptin"라 함)이 토끼의 체중을 20% 이상 현저하게 감소시킬 수 있음을 발견하게 되었고, 체중 감소의 주된 원인이 체 지방 조직 특히 복부 지방 생성억제를 통하여 이루어 짐을 발견하게 되었다. 따라서 이 폴리펩타이드는 비만 예방 백신 혹은 비만 치료제로 사용될 수 있다.

본 발명이 속하는 기술은 비만 억제 생물학적 치료제이며 이 분야의 기존 비만 치료 기술은 비만 억제 호르몬 렙틴(Leptin) 단백질, 식이요법, 운동등이 있다. 본 발명은 체내에서 지방조직의 생성을 억제함으로서 비만을 억제할 수 있는 혁신적인 억제제에 관한 발명으로, 상세하게는 72 혹은 86개의 아미노산으로 구성된 단백질을 항체 형성에 필요한 adjuvant와 섞어서 피하에 주사함으로서 지방 조직 형성을 극적으로 억제하는 효과를 갖는 단백질에 관한 발명이다. 71개 혹은 86개의 아미노산으로 구성된 부분적인 Tat 폴리 펩타이드 조각이 항 비만 효과를 보이는 것으로 보아 101개의 Tat 단백질도 항 비만효과를 갖을 것으로 예상된다. 우리는 발명는 Tat 단백질이 체내지방을 낮춘다는 세계 최초의 발견에 근거를 두고 있으며, 에이즈 환자의 경우 마른 체형을 보이는 현상이 아마도 Tat 단백질에 의한 것임을 시사한다. 이들 Tat 및 그로부터 유도된 단백질은 비만 예방 혹은 치료 백신, 단백질 혹은 유전자 치료제로 사용될 수 있다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 비만 치료에 효과적인 생물학적 제제을 제공하는 것이다.

도 1은 토끼에서 지방조직 생성억제에 의한 체중 감소 동물시험 결과를 보여주는 그림. 대조군(Control)에 비하여 본 발명의 SynLeptin-1 폴리펩타이드 처리 시 20% 정도의 체중이 감소한 것을 볼 수 있고, 이는 지방조직의 생성 억제에 의한 것이다(도 3 참조).

도 2는 Leptin 수용체가 망가진 생 후 12주가 경과된 ZFD 쥐에서 SynLeptin-1 혹은 -2 폴리펩타이드를 2주간에 간격으로 2회 피하주사시 관찰되는 체중 감소 동물시험 결과를 보여주는 그림. 대조군(생리식염수 처리)에 비하여 본 발명의 SynLeptin -1 혹은 -2 폴리펩타이드 처리시 약 30일이 경과한 시점에서 대조군에서는 처리전보다 8.5% 정도의 체중이 증가하고 SynLeptin-1 에의하여 3.5% 증가하여 체중 증가가 현저히 줄어 들었으며, SynLeptin-2 처리시는 오히려 4.3%의 체중감소가 관찰되었다.

도 3은 실험 동물의 부검 결과를 보여주는 사진. 도 3의 A는 본 발명의 SynLeptin-1 폴리펩타이드-Adjuvant 혼합액을 2주간의 간격으로 3회 피하주사한 실험군 토끼의 내장의 지방조직 분포를 화살표로 표시하였고, B는 대조군으로 생리식염수-Adjuvant 혼합액을 3회 피하 주사한 실험군 토끼의 내장의 지방조직 분포를 화살표로 표시하였다. 사진에서 알 수 있는 것처럼 본 발명의 폴리펩타이드 처리시현저히 지방조직이 감소한 것을 볼 수 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열정보 1, 2, 3에 기재된 폴리펩타이드 또는 그의 제약적으로 허용된 염을 제공한다.

본 발명에서 서열정보 1의 폴리펩타이드는 일반적인 101개의 아미노산으로 구성된 Tat를 의미하고, 서열정보 2의 폴리펩타이드는 Tat 중 N말단에서 86개의 아미노산을 의미하고, 서열정보 3의 폴리펩타이드는 Tat 중 N말단에서 71개의 아미노산을 의미한다. 그러나 본 발명의 지방조직 형성 억제효과가 있는 폴리펩타이드는 상기의 Tat 폴리펩타이드 또는 그의 여러 돌연변이형(자연적으로 여러변이 존재)으로 그의 일부나 전부를 포함한다.

또, 본 발명은 상기의 폴리펩타이드를 코딩하는 서열정보 1,2,3의 단백질을 각각 코딩하는 서열정보 4∼6의 유전자 DNA 염기 서열 및 상기의 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pcDNA3.0 SynLeptin-1 및 -2 또는 pGEX4T SynLeptin-1 및 -2 를 제공한다.

본 발명의 폴리펩타이드는 다양한 약제학적 형태로 비만 예방 백신 혹은 비만 단백질 치료제, 유전자 치료제로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

비만은 위에서 기술한 이유로 체내의 여러 조직에서 특히 지방 조직에서 지방이 축적됨으로서 발생하는 병리 현상이다. 비만은 당뇨병, 고혈압 등 심혈관계 질환, 수명 단축 등의 직접, 간접적인 원인이 되며 많은 병의 근원이라 여겨지고 있다. 체중의 약 5%만 줄여도 위에서 기술된 질환으로부터 급격히 호전된다고 보고되고 있다.

고등 척추동물은 정확하게 지방조직의 크기를 조절하고 있다. 지방조직이 확장되어 체중이 증가하게 되면 체중조절 물질(Leptin)이 혈액 내에서 증가하고 뇌하수체에 존재하는 수용체에 작용하여 멜라노사이트 자극 호르몬 분비 증가, 멜라노코르틴-4 수용체 증가를 유발하여 체중을 줄이려는 일련의 과정이 일어나게 된다. 이러한 과정의 즉 식욕 저하에 따른 음식 섭취감소, 에너지 방출 증가, 교감신경계 자극들이 증가하게 된다. 반대로 지방조직이 축소되어 체중이 감소하게 되면 체중조절 물질이 혈액 내에서 감소하고 이것이 뇌하수체에 감지되어 뉴로펩타이드 Y, Y-수용체 증가를 유발하여 체중을 늘이려는 일련의 과정이 일어나게 된다. 즉 식욕 증진에 따른 음식 섭취증진, 에너지 소비 감소, 생식능력 감소, 체온저하, 부교감신경계 자극들이 증가하게 된다. 따라서 비만조직의 양 및 그에 따른 체중 조절은 이와 같이 매우 정확한 피이드백(feedback) 조절기전에 의하여 이루어지고 있다.

이러한 조절에는 핵심적인 역할을 담당하는 호르몬 유전자가 Obese(ob) Diabetes(db), agouti 등이다. 특히ob의 경우 지방조직에서 생산되어 혈액에 떠도는 분자량, 16 kD의 폴리펩타이드(Leptin라 부름)로 이들 유전자에 발현 및 기능에변이, 혹은 이 호르몬을 인식하는 세포 표면 수용체의 숫자 및 기능에 이상이 생기면 지방조직의 크기가 현격히 증가하고 이에 따라서 체중이 증가한다.

따라서 비만 치료의 목적으로ob폴리펩타이드(Leptin)를 혈액 내에 주입함으로서 실험동물에서 뚜렷한 효과를 관찰되고 있음이 보고되었으며, 인간에게 적용하기 위하여 임상 시험이 진행되고 있다. 현재 임상 결과는 여러 비만인의 경우 7.1Kg의 체중감소효과를 보이지만 어떤 대상에서는 체중 감소효과를 보여주지 못하여 부분적인 성공을 보여주고 있다. 이는 비만으로 이르는 과정이ob이외에도ob수용체의 이상을 비롯한 여러 유전적인 결함에 의하여 나타나는 종합적인 결과인 것으로 여겨진다.

또한 쥐를 이용한 실험에서 체중과는 무관하게ob폴리펩티이드는 포도당의 대사를 증가시킴으로서 제2형 당뇨병의 치료 가능성까지 제시하고 있다.

본 발명의 목적은 각종 난치성 질환의 원인이 되고 있는 비만을 체지방 조직의 축적을 억제함으로서 효과적으로 비만을 예방 혹은 치료함에 있다. 또한 우리의 발명 단백질은 Leptin에 저항성을 보이는 비만 환자의 경우에도 치료할 가능성이 높다. 왜냐하면, Leptin의 경우 반드시 수용체를 통하여 그 기능을 발휘하나, SynLeptin-1 및 -2의 경우에는 PTD(Protein transcduction domain, 단백질 투과능)도메인을 갖어 세포막 투과성이 있으므로 수용체의 숫자나 기능에 문제가 된 경우에도 효과적인 지방조직 생성을 억제할 수 있다. 실제로ob수용체(Db유전자)가 망가진 ZDF 백서에 대한 동물실험에서 체중 감소 효과가 있음을 보여주고 있다.

더욱 나아가 Leptin의 경우 혈관 내로 단백질을 공급하여야하나 SynLeptin-1및 -2의 경우 PTD-domain이 존재함으로서 2-3 회 정도의 피하조직에 주사하여 장기간 서서히 방출되게 함으로서 비만 치료제로서 사용 시 훨씬 간편한 투약 경로를 사용할 수 있게 된다.

비만의 예방 및 치료를 위하여 다양한 방법 즉 식이요법(Diet), 운동, 약물치료 등 다양한 방법이 행하여지고 있으나 중단 시 본래로 되돌아감으로 궁극적인 치료 방법이 없다. 본 발명의 산물인 SynLeptin은 본 비만 예방에 상기한 문제점을 해결하고, 상기의 필요에 의해서 디자인된 것으로서 탁월한 지방조직 생성 억제기능을 통한 비만 예방 및 치료 효과를 갖고 있다.

이하, 비한정적인 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

실시예 1: pGEX4T-3-SynLeptin-1 및 -2 발현 plasmid 제조 및 SynLeptin-1 및 -2 단백질 생산

SynLeptin-1의 PCR은 센스방향 GATCGGATCCACCATGGAGCCAGTAAATCCTAGCCTAG와 안티센스 방향 프라이머 GATCGAATTCCTTTGATAGAGAAACTTGATG 이용하여 실시하였다. PCR 조건은 94도에서 주형 HIV-1 바이러스의 Tat cDNA를 5분 변성시킨 후 30 사이클의 증폭 반응(94도 30초, 60도 30초, 72도 30초)과 최종적으로 72도에서 5분간의 반응이다. 얻어진 PCR 산물을 2.0% 아가로스 젤에서 분리, 정제하고 제한효소 BamHⅠ과 EcoRⅠ으로 절단한다. 단백질 발현벡터인 pGEX4T-3(Pharmacia 사)를 동일한 제한효소(BamH1및EcoRI)들로 절단하고 이를 Synleptin-1 cDNA BamH1-EcoR1 조각을 함께 T4 DNA 라이게이즈로 접합시키고,E. coliBL21(DE3)에 형질전환 과정을통하여 도입시켰다.

86개 짜리 아미노산의 Tat를 포함하는pGEX4T-3-SynLeptin-2 발현 plasmid 제조 및 SynLeptin-2 단백질 생산을 위하여, HIV-1 바이러스의 Tat cDNA를 이용, PCR은 센스방향 GATCGGATCCACCATGGAGCCAGTACCTAGACTAGAGC와 안티센스 방향 프라이머 GATCGAATTCTTCCTTCGGGCCTGTCGGGTCCCCT을 이용하여 위와 동일한 조건으로 실시하였다. 위에서 기술한 동일한 방법을 이용하여pGEX4T-3-SynLeptin-2 를 제조하였다.

형질전환되어 pGEX4T-3-SynLeptin-1 혹은 -2 이 들어간 균(E. coliBL21 DE3)을 TY액체 배지(앰피실린 첨가, 100 ㎍/ml)에 접종하여 밤새 키워 마련한 후 100㎖의 TY 액체 배양액(앰피실린 첨가, 100 ㎍/ml)에 1/100부피의 양으로 넣고 1시간 30분 키운 후 0.2mM의 IPTG로 30℃에서 10시간 동안 융합 단백질 합성을 유도하였다. SynLeptin-1, 및 -2 단백질은 GST-Agarose Affinity 크로마토그래피 방법을 이용하여 순수하게 분리하였다.

포유동물세포에서 발현시킬 수 있게 하기 위한 발현 재조합 벡터 pcDNA3.0 SynLeptin-1 및 -2 들은 다음과 같이 제조하였다. pcDNA3.0(Clontech사) 플라스미드를 제한효소 BamH1-EcoRI(약 220 bp) 으로 처리한다. 이를 위에서 기술한 SynLeptin cDNA-1 혹은 -2 유전자 BamH1-EcoR1 조각과 함께, T4 DNA 라이게이즈로 접합시키고,E. coliDH5α에 형질전환 과정을 통하여 도입시키고 알카리-lysis 방법으로 플라스미드를제조하였다.

실시예 2: 지방조직 생성억제에 의한 체중감소 동물 시험

우리는 약 1.2㎏의 백색 토끼 4 마리를 2 그룹으로 나누어 2 마리는 대조군으로 2 마리는 실험군으로 사용하였다. 정제된 SynLeptin-1 혹은 -2 단백질(500-700μg) 혹은 생리 식염수를 Adjuvant 2㎖(Sigma)과 섞어 토끼의 피하 조직 4 부위에 주사하였다. 2주 후에 2차로 동량의 단백질-Adjuvant 혼합액을 주사를 하였다. 또 2주 후에 3차로 피하 주사를 실시하였다. 이후 10일 이 경과 후, 체중 감소를 측정하였다. 그 결과 대조군에서는 2마리의 토끼가 체중이 각각 2.5, 2.45 kg(평균 2.48kg)을 보여주었고, SynLeptin-1으로 처리한 실험군의 토끼는 1.8, 2.08kg(평균 1.94 kg)이었다. 대조군에 비하여 시험군에서는 약 22%로 체중의 감소가 있었다(도 2 참조). Leptin 수용체가 망가진 유전자를 갖는 ZDF 쥐를 대상으로 한 SynLeptin-1 및 2 을 이용한 실험에서 약 30일간에 걸처서(출원시점에서 현재 진행중임), 대조군에서는 처리전보다 8.5% 정도의 체중이 증가하고 SynLeptin-1 에의하여 3.5% 증가하여 체중 증가가 현저히 줄어 들었으며, SynLeptin-2 처리시는 오히려 4.3%의 체중감소가 관찰되었다.

실시예 3: 실험 동물의 부검

우리는 이러한 체중 감소의 원인이 어떠한 원인에 의하여 기인되는가를 부검과 병리학적 검사를 통하여 확인하였다. 부검 이전의 토끼들은 실험군 및 대조군 공히 정상적인 활동 모습을 보여주었었다. 토끼들을 희생시킨 후 복부를 열어 장기를 조사한 결과, 장기들의 모양 등 병리적인 이상이 관찰되지 않았다. 그러나 여러 장기 주변 및 피하 지방조직, 복부 지방조직에 매우 뚜렷하게 지방이 감소되어있는 것을 관찰할 수 있었다. 특히 복부 지방의 대부분을 차지하는 복부 지방조직이 현저히 감소되었음을 발견하였다.(도 3 참조)

본 발명에 의하여 도출된 단백질은 탁월한 지방조직 생성 억제기능을 통한 비만 예방 및 치료 효과를 갖고 있다. 비만 예방 백신 혹은 비만 치료제로 사용될 수 있다. 아울러 같은 목적으로 단백질 제제 또는 유전자 치료제(DNA 백신 형태로)로도 사용되어 비만을 치료할 수 있다.

Claims (6)

1. 서열정보 1에 기재된 폴리펩타이드 또는 그의 제약적으로 허용되는 염으로서 지방조직 생성 억제 폴리펩타이드.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기의 폴리펩타이드는 N말단에서 86개의 아미노산 서열을 갖는 서열정보 2에 기재된 폴리펩타이드 또는 그의 제약적으로 허용되는 염으로서 지방조직 생성 억제 폴리펩타이드.
3. 제 1 항에 있어서,

   상기의 폴리펩타이드는 N말단에서 71개의 아미노산 서열을 갖는 서열정보 3에 기재된 폴리펩타이드 또는 그의 제약적으로 허용되는 염으로서 지방조직 생성 억제 폴리펩타이드.
4. 제 1 항 내지 제 항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기의 폴리펩타이드를 각각 코딩하는 서열정보 4∼6에 기재된 유전자 DNA 염기서열.
5. 제 4 항에 있어서,

   상기의 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pcDNA3.0 SynLeptin-1 및 -2 또는pGEX4T SynLeptin-1 및 -2.
6. 제 1 항 내지 3 항 중 임의의 한 항에 있어서,

   상기의 Tat 폴리펩타이드 또는 그의 여러 돌연변이형으로 그의 일부나 전부를 포함하는 지방조직 형성 억제 폴리펩타이드.