JP3773921B2 - 蛍光により組織特性を測定する方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
この発明は誘導蛍光による組織の特性の測定方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
例えば動脈のような血管に光ファイバーを導入し、レーザー光で照射し、誘導蛍光を感知することは、本願に引用例として挙げる例えば米国特許第4,682,594号と第4,785,806号から公知である。またアテローム性動脈硬化症のプラークを検出することも可能であり、同じ光ファイバーを通じて強力レーザーエネルギーを照射することによってそのプラークを破壊して除くことができる。上記の特許は、ビームスプリッター、結合手段およびレーザー装置を含む励起、スペクトル分析および強力照射のための手段を開示している。
【0003】
ヨーロッパ特許公報第85905342.3号には、励起波長光で照射された試料が、ビームスプリット装置を通じて複数の像に影像化される影像化蛍光検出器が記載されているが、その像は、フィルターされ、次いでマトリックス検出器(CCD検出器)をヒットする。各像については、一組の対応する画素強度値が得られ、これら数値は演算処理されて、組合わせ画素値が得られる。この組合わせ画素値は、改善したコントラストの像を作るのに用いられる。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
組織を蛍光によって検査するために、異なる組織の蛍光挙動が利用される。いくつかの場合、ヘマトポルフィリン誘導体のような物質を投与することによってコントラストを強くすることができる。この場合の欠点は、患者が長期間にわたって太陽光に対して過敏になることである。したがってこの発明の目的は、必要な投与量を減らすために検出コントラストを増大することである。
【0005】
この発明の一般目的は、蛍光検出時に最大のコントラストが得られるようにすることである。
【0006】
またこの発明の目的は、例えばアテローム性動脈硬化症のプラークと種々の悪性腫瘍を検出するために、組織の種々の状態や変化を生体内で診断する場合の認識可能性を改善するにある。さらに他の目的は、治療前、治療中および治療後の可能性が改善された検査によって、照射によって組織を除去もしくは破壊する際の治療の可能性を改善することである。さらに他の目的は、無傷のままで残すべき組織が破壊されるのを回避できるようにすることである。
【0007】
この発明の特別の目的は血液の存在下でも検出ができるようにすることである。吸収剤として存在する血液は、蛍光照射の差動吸収剤として作用し、得られるコントラストを破壊して診断情報をひどくひずませる。この発明によれば、この妨害因子の影響を実質的に除去することができる。
【0008】
【課題を解決するための手段】
この発明の重要な態様によれば、この発明の目的は、蛍光励起を行うためのレーザー光源手段、光検出器、光ファイバーのごとき光導体、レーザー光を光導体の一端に入れ、光をそれから取出して検出器に導入する連結手段、および検出器に連結された組織測定手段を組合わせて、複数のスペクトルインターバルチャネルで蛍光を検査しそのチャネルを比較できるようにすることによって達成することができる。この組合わせは、同じ光ファイバーを通じてハイパワーで照射する手段、例えば破壊と除去を連続的な認識段階で組合わせることができてその除去を制御することができる手段で適切に完成することができる。レーザーのエネルギーを適宜調節することができれば、同じレーザーを、組織測定と、ハイパワーによる照射との両方に利用できる。
【0009】
この発明の他の態様によれば、そのシステムを影像システムに拡大することが可能で、その結果、多重画素システムは二次元影像化が可能になり、各画素について4つの信号が複数のスペクトル蛍光インターバルに対して得られる。
【0010】
本出願において、スペクトル蛍光インターバルとは、波長のインターバルと、時間のインターバルの両者からなることを意味する。後者の場合、蛍光を誘発する放射線が、短いパルスの形態を持っているか、または非常に短い時間インターバルで停止しうる少なくとも1つのイラディエーションをもっている。蛍光放射線が減少する時の分布の検出を行うことができ、この減少は、励起状態の異なる寿命によって起こり、その寿命は、異なる種類の組織に対して適正な各種の物質について特徴的なものである。
【0011】
この発明の特徴は、強度値について演算操作を利用することであり、その演算は割り算で構成されている。強度の次元を有する2つの値を割り算することによって、強度、距離、角、および他の方法では結果を誤り伝える他の変数の変動について大部分を補償する。正規化された値かまたは無次元値を得ることができる。
【0012】
時間のインターバルを用いる時は、パルスレーザー、または高速カットオフを有する少なくとも1つのレーザーを利用するのが好ましい。時間インターバル窓を使わずに検出する場合には連続レーザーを使用するが、その場合、スペクトル分解能の欠陥のためにスプーリアス放射線の除去を単純化するためにパルスレーザーを使うことは興味深いことである。
【0013】
本発明は、蛍光により組織特性を測定する方法において、500nm以下の波長のレーザーで組織を励起する段階と、複数の数字で表わした強度値を得るために、複数の予め切れられたスペクトルインターバルであって、少なくとも2つのスペクトルインターバルは血液中で等しい吸収値を有する波長に中心を行かれている複数の予め切れられたスペクトルインターバル内で蛍光の強度を検出する段階と、少なくとも一つの割り算操作を含む前記の数字で表わした強度値に算術演算を行う段階とからなる方法を提供する。
【0014】
好ましい実施形態において、前記の予め決められたスペクトルインターバルは波長のインターバルからなる。
【0015】
好ましい実施形態において、前記の予め決められたスペクトルインターバルは、時間のインターバルからなり、前記レーザーからのパルスの持続期間の終了に対して予め決められた関係で開始し終了する。
【0016】
好ましい実施形態において、前記の予め決められたスペクトルインターバルは複数の波長インターバルからなり、その各波長インターバルは、予め決められた時間インターバルで検出され、前記レーザーからのパルスの持続期間の終了にたいして予め決められた関係で開始し終了する。
【0017】
好ましい実施形態においては、400nm以下の波長のレーザーで組織を励起する
【0018】
【発明の実施の形態】
この発明を、実施例と、図に示す態様を参照して説明する。
【0019】
第1図aは、大きな分子中での蛍光の機構を図式的に示す。照射された試料は放射線を吸収し、各種のレベルが励起される。この状態のいくつかが、ほぼ前の状態に戻る(弾性散乱)が、いくつかは内部転換、衝突およびその外の損失機構で失われる。しかしいくつかは蛍光放射線を発する。これは、状態の分布によって、第1図a下部の図式的強度スペクトルに見られるように広い波長分布を与える。
【0020】
ヘマトポルフィリン誘導体のようないくつかの有用な腫瘍指標剤は、特に405nmまわりのソレットバンド(Soretband)で励起されると第1図bのようなより明確な構造を有する蛍光スペクトルを与える。この蛍光スペクトルは、約630nmと690nmに代表的なピークを示し、実際には、明確でない組織の自己蛍光に重なっている。このような薬剤には外にも公知の例がある。第2図は、DHE(ジヘマトポルフィリンエーテル/エステル)、HP(ヘマトポルフィリン)、PHE(ポリヘマトポルフィリンエステル)およびTSPC(テトラスルホン化フタロシアニン)に337nm(N2レーザー)を照射した時の蛍光スペクトルを示す。
【0021】
異なる組織の波長スペクトルにおける差を示す他の例を第3図に示す。第3図では、扁桃腺癌のスペクトルが、内在性ポルフィリン類のために、正常な粘膜のスペクトルとは明らかに異なっている。
【0022】
【実施例】
実施例I
モード同期アルゴンイオンレーザー(Coherent Radiation CR-12)を、キャビティダンパー(Cavitydumper)を有するCoherentRadiation色素レーザーを同時にポンプするのに用いた。この色素レーザーは、約3MHzの繰返し率で、640nmに6ps長のパルスを提供した。その平均パワーは約10mWであった。レッドパルスが、約0.5%の周波数ダブリングの効率で、KD*P結晶中、320nmに周波数ダブリングを行った。蛍光光線は、干渉フィルタとともに0.5mの分光計で選択された波長を有し、マイクロチャネルブレートの光電子像倍管(Hamamatsu1564U)で検出された。電子機器は、開始パルスチャネルと適切な信号増幅器を備え、一定フラクションの弁別器と時間−振幅変換器を使用した。時間ヒストグラムを多重チャネルアナライザ内に設置し、データ分析をIBM−コンパチブルパーソナルコンピュータのプログラムパッケージで実施した。この装置の時間応答関数は散乱光で測定しFWHM=250psであることが分かった。この値は、蛍光信号のコンピュータによるデコンボリューション(deconvolution)処理に用いた。
【0023】
データは、正常な血管壁から始まりアテローム性動脈硬化症のプラーク領域を通過させる操作によって記録した。試料を、マイクロメーターで制御されたスレッジ上にのせて移動させ、異なる蛍光波長で時間分解記録走査で試料を再現可能な位置ぎめを行った。一般に崩壊曲線は2分間、約1000Hzのカウントレートで記録した。正常な血管壁とプラークの代表的な時間積分蛍光構造を第4図に示す。
【0024】
400nmにおける試料蛍光の時間分解記録をプラークと正常組織壁について第5図に示す。時間的挙動の明らかな差異を観察できる。約8ns、2nsおよび200psより短い3つの異なる寿命がプラークと正常血管の両者に見られる。
【0025】
プラーク、石灰化プラークおよび正常血管壁から得たデータを第6図に示す。モノクロメータを、2つの特徴的な波長に相当する400nmと480nmに設 定した。400nmと480nmにおける蛍光強度をそれぞれaおよびcで表わす。5ns〜15nsで積分された信号を崩壊の最初の5nsから得た信号で割り算する。速い崩壊に対しては、この比率は数値が明らかに低いが、一方高い比率は遅い崩壊を示す。a−信号を測定した時1.6:1のプラークデマーケー ション比が得られ、c−信号を測定した時のプラークデマーケーション比の方が低い。この特徴は、適切なデマーケーションの基準に含めることができる。この時間挙動を、時間積分量の代わりに無次元デマーケーション関数a(5−15ns)/c(0−5ns)を形成するのに用いる場合は、1.6のデマーケーションが改善される。プラーク領域のスキャンは、時間積分と時間分解のデマーケーション基準について第7図に示したが、2.8〜4.5のデマーケーションの改善を示している。
【0026】
この実施例は、組織の差の分解能を高めるために、蛍光検出の2次元(波長と時間)の分解値を示している。
【0027】
第8図は、20%濃度の食塩水で希釈した動脈血(上図)と静脈血(下図)の0.2mm厚層を通過した透過スペクトルを示す。生体内の試験では常に存在するかような吸収物を通過する蛍光スペクトル写真を作製する場合(一時的に他の液体で置換されるときを除く)、大変な困難が生じる。それ故この発明のひとつの態様では、試料の検出に用いる、同じ吸収因子を有する少なくとも一対の異なる波長が選択される。図面には2対の波長を示してある。
【0028】
実施例 II
5クラスの病理学的に確認されたプラークの試料(0印:正常な動脈壁、I〜IV:番号順に進行した症状のもの)を、異なる波長の蛍光について測定した。その強度を各波長対毎に分けて第9図に示した。相関度が波長の選択によって著しく変動することが第9図から明らかである。F1〜F4は血液の再吸収に影響を受けているが、F5とF6は受けていない。F5とF6は、これらの組織の種類間に真のスペクトル差があり、血液の変動がないことを示している。相対不確定性(1標準偏差で示す)が、血液で補償された対のF5とF6については小さい。
【0029】
実施例 III
蛍光は、寿命が充分長いので400nmにおいて”初期”と”後期”の蛍光を識別するのに二重チャネルボックスカー積分器(Stanford Instruments社SR250型)と連結して短パルス窒素レーザー(PRALN250型、Δtp=3ns)を用いることができた。励起は337nmで行った。HamamatsuR105型の光電子増倍器を用いた。1つの検出チャネルを0〜5nsに時間を合わせた。一方第2の検出チャネルは、第10図に示すように5〜15nsをカバーした。第10図には、このピコ秒システムで得た崩壊曲線を挿入してある。ボックスカーシステムでは、”後期”と”初期”の蛍光の比率(無次元量の全ての特徴を有する)が形成され、ストリップチャート記録計に表示される。第10図には、図式的に示した光ファイバーのプローブが、プラーク領域を示す動脈試料を点から点へと移動する時の信号を示す。図から分かるように、プラークの基準が満たされ、プラークの切除レーザーに対するステアリング信号を提供できるしきい値を確立できる。
【0030】
第10図のデータは、血液を洗い落してアテローム性動脈硬化領域と正常壁部分を明確に眼で検査できるようにした試料から得た。血液領域を通じての記録を取った2つの選択された代表的なスポットで第2の試験を行った。得られた結果を第11図に示す。やはり後期/初期蛍光比を記録した。図から分かるようにその比は一定のままであり、0.3mmの血液層厚(60μmの未稀釈血液)まで互いに分離している。厚い方の層については、個々の信号が非常に小さいので有用なSN比は得られなかった。第11図の右の部分に、血液なしの正常血管壁の個々のボックスカー信号を示した。400nmでのこれらの信号は、未稀釈血液の層の厚みが数拾マイクロメーターより大きいと、非常に弱くなるということは第8図から明らかである。したがってこの光診断法は、試料に密接したファイバーによらねばならないか、または観察領域は閉塞された末梢動脈においては塩水でフラッシュしなければならない。両方の場合、診断システムは、信号が低すぎる時でも明確に示さねばならない。他方では、上記原理で作製されたシステムは、ファイバーの先端を動脈壁の充分近くにもっていきシステムをそれ自体データ記録モードにスイッチが入ると、血液には無関係の信頼性のある案内が得られる。
【0031】
上記の実施例は、複数のスペクトル蛍光インターバル、すなわち(1)ゼロ差吸収波長対および/または(2)2つの時間スペクトルインターバルを用いることによって、血液が存在していても動脈の信頼性のある診断が可能なことを示している。
【0032】
この発明を、空間については単一チャネルの態様で、すなわち1画素の態様で説明した。しかし同じ原理は、空間分解のための多重画素の態様にも用いることができる。
【0033】
実施例 IV
第12図は、ヨーロッパ特許公告第85905342.3号に記載され公知の装置の概略図を示す。オブジェクトプレーン1内の試料をパルス紫外線光源2から照射される。試料をミラー3によって像をつくる。このミラーは、異なる角度方向に分割されているが、これによって、4つの別個の像6A〜6Dを、カセグレンミラー4で反射させた後、計算機7に連結されたイメージ増倍CCDカメラ6に作る。ミラー3の各セグメントヘの放射線は、4つのフィルター5A〜5Dを通じて導入される。それ故に像6A〜6Dは4つの異なる波長バンドの像を示す。検出器は、最新のマイクロチャネルプレートイメージ増倍管である。この増倍管は少なくとも5nsまでゲートで制御できる。
【0034】
第13〜15図に、ラットの悪性腫瘍についての実施例の結果を示す。第13図は、波長470、600、630および690nmにおける4つの”単色”像を示す。これらの波長の有意性は、この種の腫瘍からの蛍光に関する第15図のスペクトルから明らかである。モニター(図示せず)上の偽カラー像には4色がついた。その像が見えるようにスケッチで第14図に示した。影像領域の実際の大きさは10mmであった。
【0035】
この実施例では、デリーデルティ(Delli-Delti)イメージ増倍CCDカメラシステムと、データ翻訳DT7020型ベクタープロセッサ付きIBM互換性計算機を用いた。
【0036】
腫瘍性組織の630nm蛍光バンド(ポルフィリンによる)は、第16図に示すように同じ波長のバックグランドの蛍光よりもはるかに寿命が長いことが実験によって観察された。プラークと正常血管の時間的差異については、第5図と第10図によってすでに考察した。すでに述べたカメラの増倍管のゲート設備を用い、“後期”蛍光像を“初期”蛍光像で割り算することによって、影像設備の検出効率をさらに増大さすことができることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図1】 第1図aと第1図bは、蛍光放射線の機構を示す。
【図2】 第2図は、いくつかの腫瘍のマーキング剤に対する波長スペクトルを示す。
【図3】 第3図は、癌組織と健康な組織間の波長蛍光スペクトルの差を示す。
【図4】 第4図は、プラークを有する血管とプラークなしの血管の波長蛍光スペクトルの差を示す。
【図5】 第5図は、正常血管とプラークを有する血管に対し選択され波長に対する時間スペクトルの差を示す。
【図6】 第6図は、プラークと健康な血管に対して等しい波長光を照射した時の時間スペクトル信号を割り算した結果を示す。
【図7】 第7図は、時間スペクトル分析ありおよびなしの場合の2つの波長についての割り算の結果を示す。
【図8】 第8図は、血液の吸収スペクトルを示す。
【図9】 第9図は、正常血管(0)と、4種の次第に損傷の度合いが増大しているアテローム性動脈硬化症の血管(I−IV)とを区別する際の各種波長の選択の効力を示す。
【図10】 第10図は、選択された波長に対する時間スペクトルにおける分離の可能性を示す。
【図11】 第11図は、選択された波長について、時間的分析法(後期蛍光と初期蛍光間の比率)を用いた時に血液による妨害がなくなったことを示す。
【図12】 第12図は、この発明の影像化の態様を示す。
【図13】 癌の影像化検出法を示す。
【図14】 癌の影像化検出法を示す。
【図15】 癌の影像化検出法を示す。
【図16】 第16図は、正常組織と悪性腫瘍組織における異なる時間的スペクトルの挙動を示す。
【符号の説明】
1…オブジェクトプレーン、2…パルス紫外線光源、3…個別に調節可能なミラーセグメント、4…カセグレンミラー、5…バンドパスフィルタ、6…イメージ増倍CCDカメラ、7…計算機
Claims (2)
- 妨害性の吸収性物質の存在下で組織特性を測定するための蛍光撮像装置であって:
レーザー照射源と;
少なくとも2つの異なった時間インターバルで、該レーザー照射源により照射されたサンプルからの蛍光を検出するための検出器であって、該検出が、該妨害性の吸収性物質において同じ吸収値を有する少なくとも2つの異なる蛍光波長で行われて、少なくとも2つの積分された強度値を得、該積分された強度値の各々は、異なった時間インターバルで記録される、検出器と;
該少なくとも2つの積分された強度値に対して、少なくとも一つの割り算操作を含む演算を行って該サンプルの該組織特性に特徴的な数値を得るための算術/論理手段と
該割り算操作の結果を表示するためのディスプレーとを具備する装置。 - 請求項1に記載の撮像装置であって、前記検出器は二重チャンネルインテグレータを含み、各チャンネルは異なった時間インターバルにおける蛍光を記録する装置。
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