ES2208696T3 - Diagnostico del cancer por fluorescencia normalizada diferencial inducida por laser. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UN APARATO Y METODO PARA DIAGNOSTICAR CANCER IN VIVO. UN LASER (12) Y UN SISTEMA COLORANTE SINTONIZABLE (14) GENERAN UN HAZ DE SALIDA QUE ES TRANSPORTADO POR UN HAZ DE FIBRA OPTICA (18) A UN TEJIDO A EXAMINAR. LA FLUORESCENCIA INDUCIDA POR LASER EMITIDA POR EL TEJIDO ES SUMINISTRADA A TRAVES DEL HAZ (18) A UN SENSOR, QUE PUEDE INCLUIR UN ESPECTOGRAFO (24) Y UN DETECTOR DE MULTIPLES CANALES (26) PARA PRODUCIR UN ESPECTRO. EL ESPECTRO ES ANALIZADO POR UN ORDENADOR (28) QUE DIAGNOSTICA EL TEJIDO CANCEROSO UTILIZANDO FLUORESCENCIA NORMALIZADA DIFERENCIAL, EN DONDE LA INTENSIDAD EN CADA LONGITUD DE ONDA ES DIVIDIDA POR EL AREA INTEGRADA BAJO EL ESPECTRO Y COMPARADA CON UN ESPECTRO NORMALIZADO A PARTIR DE UNA MUESTRA DE TEJIDO NORMAL.

Description

Diagnóstico del cáncer por fluorescencia normalizada diferencial incluida por láser.

Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente a un aparato y a un procedimiento para la producción de una señal que representa la condición de una muestra de tejido.

Antecedentes de la invención

Los procedimientos in vivo y rápidos para el diagnóstico de tejido son importantes para la prevención eficaz del cáncer y su terapia. Como un ejemplo de un tipo de detección, se utiliza la endoscopia para detectar tejidos anormales en el esófago humano. Una vez se encuentra una anormalidad, se realizan biopsias para determinación de la histopatología.

Para el diagnóstico, una muestra de biopsia representa habitualmente un área muy pequeña. Los resultados de laboratorio generalmente no están disponibles hasta varios días después. De este modo, las técnicas de endoscopia conocidas no proporcionan una clasificación real in vivo en tiempo real del tipo de tejido.

Recientemente ha habido interés en utilizar la fluorescencia inducida por rayo láser (LIF) en el desarrollo del diagnóstico y de las herramientas terapéuticas. Un número de investigadores ha utilizado LIF como un procedimiento para discriminar tumores de tejidos normales. Por ejemplo, la técnica LIF se ha utilizado para distinguir pólipos adenomatosos de tejido de colon normal y pólipos hiperplásicos in vitro. Ver C.R. Kapadia et al. "Laser-Induced Fluorescence Spectroscopy of Human Colonic Mucosa-Detection of Adenomatous Transformation", Gastroenterology, 99: 150-157 (1990).

Aún así, otros han investigado la técnica LIF para distinguir tejidos adenomatosos de tejido de colon normal in vivo. Ver R.M. Cothren et al. “Gastrointestinal Tissue Diagnosis By Laser-Induced Fluorescence Spectroscopy at Endoscopy”, Gastrointestinal Endoscopy, 36: 105-111, (1990). Se han utilizado asimismo las técnicas de fluorescencia para caracterizar tejidos de mama normales y malignos, tejidos de pulmón, y para cuantificar los fármacos para terapia fotodinámica en tejidos de rata. Se ha utilizado un biosensor de fibra óptica LIF basado en anticuerpos del factor inhibidor de migración leucocitaria para detectar la modificación de ADN debida a productos químicos carcinogénicos en muestras de placenta humana.

Otros investigadores han utilizado el LIF y el análisis de regresión lineal multivariante para distinguir el tejido neoplásico del tejido no neoplásico. Ver K.T. Schomacker et al. “Ultraviolet Laser-Induced Fluorescence of Colonic Tissue: Basic Biology and Diagnostic Potential”, Lasers In Surgery and Medicine, 12: 63-68 (1992).

Los datos de Schomacker et al. sugieren que las mediciones de LIF detectaron cambios en la morfología del pólipo más que cambios en los fósforos específicos a pólipos, y fue este cambio en la morfología que lleva indirectamente a la discriminación de los pólipos. Schomacker et al. concluyó que la viabilidad para distinguir los grupos de células normales de las diplásicas mediante LIF está todavía sin demostrar.

La patente U.S. nº 4.930.516 de Alfano et al. describe un procedimiento para detectar tejido canceroso utilizando fluorescencia inducida por rayo láser. Se determinan las longitudes de onda a las cuales se consiguen las intensidades máximas para cada muestra de tejido y se comparan con los picos de las longitudes de onda específicas derivadas de tejidos no cancerosos conocidos.

La patente U.S. nº 5.131.398 de Alfano et al. describe un procedimiento para distinguir el tejido canceroso del tejido de tumor benigno que utiliza una fuente de luz que produce un haz de luz monocromático de 300 nm que está dirigido a la muestra a través de un endoscopio. La radiación de emisión producida por fluorescencia se mide a 340 y a 440 nm, y a continuación se calcula una proporción de las dos intensidades y se utiliza como base para determinar si el tejido es canceroso.

La solicitud PCT nº WO 90/12536 describe un aparato y un procedimiento para diagnosticar la condición del tejido gastrointestinal mediante el empleo de la fluorescencia inducida por rayo láser del tejido para detectar la presencia de tejido anormal dentro del cuerpo. El documento WO 90/12536 adopta una aproximación estadística utilizando valores promedio de proporciones de intensidad de fluorescencia a longitudes de onda particulares para correlacionar las características de los espectros de fluorescencia.

Se describe una técnica endoscópica adicional en la patente U.S. nº 5.261.410 de Alfano et al. que utiliza una fuente de luz monocromática infrarroja, y a continuación mide el cambio Raman en la radiación de emisión para establecer la condición de una muestra de tejido.

Las referencias y estudios anteriores detallados en la presente memoria indican que permanece una fuerte necesidad para desarrollar un aparato mejorado y un procedimiento de análisis de muestras de tejido para utilizar en el diagnóstico eficaz del cáncer.

Sumario de la invención

En consecuencia, un primer aspecto de la presente invención proporciona un aparato para producir una señal que representa la condición de una muestra de tejido que comprende:

medios para irradiar la muestra de tejido con una luz excitante monocromática que posee una longitud de onda determinada previamente;

medios para producir un espectro de fluorescencia inducida por rayo láser que posee una pluralidad de longitudes de onda con una intensidad en cada una de dicha pluralidad de longitudes de onda a partir de la radiación de emisión generada por la interacción de la luz excitante con la muestra de tejido;

caracterizado porque el aparato comprende además:

medios para calcular un área bajo el espectro de fluorescencia inducida por rayo láser para generar un área integrada;

medios para dividir la intensidad a cada longitud de onda del espectro de fluorescencia inducida por rayo láser por la área integrada bajo el espectro de fluorescencia inducida por rayo láser para producir un espectro normalizado; y

medios para correlacionar el espectro normalizado a una condición específica de la muestra de tejido para producir dicha señal que representa la condición.

Preferentemente, el aparato incluye una fuente de láser que produce un haz a 410 nm para el cáncer de esófago.

Un segundo aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento para la producción de una señal que representa la condición de una muestra de tejido que comprende las etapas siguientes:

irradiar la muestra de tejido con una luz excitante monocromática que posee una longitud de onda determinada previamente;

producir un espectro de fluorescencia inducida por rayo láser que posee una pluralidad de longitudes de onda con una intensidad en cada una de la pluralidad de longitudes de onda a partir de la emisión de radiación generada por la interacción de la luz excitante con la muestra de tejido;

caracterizado porque el procedimiento comprende adicionalmente:

calcular un área bajo el espectro de fluorescencia inducida por rayo láser para generar un área integrada;

dividir la intensidad de cada longitud de onda del espectro de fluorescencia inducida por rayo láser mediante la área integrada bajo el espectro de fluorescencia inducida por rayo láser para producir un espectro normalizado; y

correlacionar el espectro normalizado a una condición específica de la muestra de tejido para producir dicha señal que representa la condición.

De forma conveniente, el aparato y el procedimiento utilizan la fluorescencia inducida por rayo láser en la que los cambios espectrales dependen menos de la intensidad del espectro y de este modo son indicativos más fidedignos de una condición del tejido.

En consecuencia, pequeños cambios en las señales débiles de los tejidos malignos se amplifican por el procedimiento de normalización diferencial para mejorar el análisis.

Otros objetivos, ventajas y características relevantes de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada siguiente, tomada juntamente con los dibujos anexos, que describe las formas de realización preferidas de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una vista esquemática de un aparato para llevar a cabo un procedimiento de diagnóstico de fluorescencia normalizada diferencial de la presente invención;

La Figura 2 (a) y 2(b) son gráficos que muestran la emisión de fluorescencia de un tejido normal utilizando datos no normalizados, respectivamente;

La Figura 3 es un gráfico que muestra (a) DNF de una mucosa esofágica normal y (b) DNF de un adenocarcinoma esofágico, con la curva (b) que presenta un pico negativo a 475-480 nm que es característico del tejido maligno en el esófago;

La Figura 4 es un gráfico que presenta un índice normalizado diferencial a 480 nm, con los resultados de los ensayos de histopatología marcados en el gráfico para los tejidos normales y los tejidos malignos; y

La Figura 5 es un gráfico que presenta los valores promedio de fluorescencia normalizada diferencial a valores de 480 nm para diversos tejidos.

Descripción detallada de la invención

En referencia a la Figura 1, se puede establecer un instrumento 10 para llevar a cabo el diagnóstico de cáncer in vivo en una sala de operaciones de un hospital o en otra sala de examen adecuada. Una fuente 12 de luz excitante monocromática produce un haz pulsatorio que se modula a una longitud de onda específica mediante un cabezal cromador (DYE) 14. Preferentemente, para detectar y diferenciar tumores normales y malignos del esófago, la fuente 12 es un láser cromático, pulsatorio de bombeo óptico en el seno de nitrógeno (modelo LN300C Laser Photonics, Inc., Orlando, Florida, USA) modulado a 410 nm.

El haz pulsatorio de salida pasa a través de una lente de enfoque 16 a un haz de fibra óptica bifurcado 18. El haz 18 incluye, por ejemplo, siete fibras de 200 \mum de diámetro para la excitación y doce fibras de 200 \mum de diámetro para la emisión. El haz se diseña de forma que se pueda insertar en el canal de biopsia de un endoscopio 20. El extremo distal del haz se yuxtapone al tejido in vivo para el análisis, y preferentemente tocando el tejido (aunque no necesariamente).

La radiación de emisión en forma de fluorescencia inducida por rayo láser se envía a través del haz 18 a una lente de enfoque 22, que es opcional, y a continuación a un elemento sensor. El elemento sensor puede incluir un espectrógrafo (SPEC.) 24 y un detector multicanal (DET.) 26. En una forma de realización preferida, el detector 26 es un sistema fotodiódico intensificador (modelo OMA III, EG&G Princenton Applied Research, Princenton, Nueva Jersey, USA) equipado con un espectrógrafo (modelo 1.235 EG&G) para la dispersión espectral.

Alternativamente, se puede utilizar un policromador u otros detectores de luz.

La señal de salida del detector de luz se envía a un ordenador 28 que se suministra con un programa informático comercial de recogida de datos.

En una realización alternativa el detector puede ser un detector multicanal controlado operado en un modo de resolución en función del tiempo con un tiempo de retraso optimizado al tiempo de vida de los componentes fluorescentes de interés en los tejidos. La selección de la puerta apropiada y de los tiempos de retraso pueden aumentar adicionalmente las características espectrales.

Todavía en otra realización alternativa, la intensidad de láser excitante se puede modular y el detector se puede sincronizar en un modo de resolución en función del tiempo para mejorar la detección, la sensibilidad y la selectividad.

Procedimientos para las mediciones clínicas

Todas las mediciones se llevaron a cabo durante los exámenes endoscópicos gastrointestinales rutinarios de los pacientes. La sonda de fibra óptica se insertó en el canal de biopsia del endoscopio. El extremo distal de la sonda de fluorescencia se posiciona tocando suavemente en la superficie del tejido que va a ser monitorizado. Cada lectura de LIF correspondió a las mediciones de fluorescencia para diez impulsos excitadores. El sistema se programa para tomar fluorescencias para cada impulso de láser. Las lecturas de base se deducen de los datos acumulados y los espectros resultantes se almacenan en un archivo especial de datos. Se graban un mínimo de tres lecturas para cada sitio de tejido. Una pequeña fuente de luz situada próxima al monitor endoscópico envía destellos para cada impulso de láser que se envía al tejido. Estos destellos permiten al endoscopista determinar visualmente el lugar exacto de análisis y asegurar el contacto correcto de la sonda al tejido durante las mediciones de fluorescencia. La lectura se efectúa en aproximadamente 0,6 segundos para cada sitio de tejido.

En general, los espectros LIF de tejidos normales y malignos presentan ciertas diferencias a diferentes longitudes de onda. Sin embargo, es difícil observar diferencias sutiles pero consistentes en los datos de obtención directa porque estas diferencias están a menudo enmascaradas por grandes variaciones en intensidad.

Un ejemplo de la emisión de fluorescencia de un tejido normal y un tejido maligno se ilustra en la Figura 2(a). La longitud de onda de excitación del láser se seleccionó que fuera 410 nm. Para desarrollar una técnica eficaz capaz de diferenciar tejidos normales y malignos, es esencial investigar y seleccionar las condiciones y parámetros experimentales óptimos que afectan los resultados de las mediciones LIF. El primer tal parámetro es la longitud de onda de excitación del láser. Con un láser de nitrógeno, la longitud de onda de excitación más baja (la de energía más elevada) disponible es 337 nm. Las longitudes de onda más largas se podrían seleccionar para la excitación mediante la utilización del sistema cromático modulable 14 de la Figura 1.

En general, la utilización de longitudes de onda más cortas excitaría más componentes, mientras que la utilización de longitudes de onda más largas excitaría menos componentes en los tejidos. La elección de la longitud de onda excitante del láser es importante ya que, con un láser excitante fijado, no es posible excitar todos los componentes del tejido en una única medición. Una aproximación es excitar cuantos más componentes de tejidos como sea posible a las longitudes de onda en las que presenten la absorción más fuerte. Esta aproximación, sin embargo, no produce necesariamente los mejores resultados ya que ciertos cambios espectrales importantes pero sutiles se podrían enmascarar mediante unas bandas de absorción fuertes pero no específicas. Después de realizar un número de experimentos, se seleccionó para ciertos cánceres la longitud de onda de láser de 410 nm. Esta longitud de onda produce espectros de fluorescencia que poseen ciertas características espectrales específicas que son útiles para el desarrollo de la presente metodología de diagnóstico.

Los datos de la Figura 2(a) muestran que la intensidad de fluorescencia del tejido maligno (curva derecha) es mucho más débil que la del tejido normal (curva izquierda). Sin embargo, esta observación general basada en la intensidad es a menudo difícil de utilizar en la práctica porque la intensidad de las señales de fluorescencia grabadas no son siempre un parámetro consistente ya que depende de muchos factores incluyendo flujo sanguíneo, absorción de hemoglobina, morfología de la superficie del tejido, distancia entre la superficie de tejido y la sonda, etc. Para los propósitos comparativos, los dos espectros en la Figura 2(a) están representados en la misma escala de intensidad. Es de notar que generalmente es difícil la detección de estructuras espectrales pequeñas en la señal de fluorescencia débil del tumor maligno (Figura 2(a), curva derecha).

Mientras la intensidad de la fluorescencia no siempre es un parámetro consistente, la presente invención tiene en consideración que el perfil espectral de cada espectro contiene características específicas que son más consistentes. Basada en esta observación, la presente invención utiliza la fluorescencia normalizada diferencial (DNF) para aumentar las pequeñas pero consistentes diferencias espectrales entre los tejidos normales y malignos.

Para amplificar y comparar las características espectrales en los espectros de fluorescencia de tejidos normales y malignos, la presente invención utiliza un procedimiento de normalización que divide la intensidad a cada longitud de onda por la área integrada bajo el espectro total. La intensidad de fluorescencia normalizada I_{n} a la longitud de onda i para la muestra K, es decir, I_{n}(K)_{i}, viene dada por:

(1)I_{n} (K) _{i}= I(K) _{i}/\Sigma_{i} I(K)i

en la que I(K)_{i} es la fluorescencia a la longitud de onda i para la muestra K, y \Sigma_{i} corresponde al sumatorio de las intensidades de fluorescencia a todas las longitudes de onda i en todo el intervalo espectral investigado.

La Figura 2 (b) ilustra el efecto de este procedimiento para el mismo tejido esofágico normal (curva izquierda) y el mismo tejido esofágico maligno (curva derecha). Este procedimiento está diseñado para producir dos efectos importantes en los datos de fluorescencia. Primero, produce un efecto de "normalización". Debido a que cada espectro está normalizado con respecto a la intensidad integrada del espectro entero, el espectro que resulta llega a depender menos del factor intensidad.

Es de notar que la intensidad normalizada In_{i} posea un valor menos dimensionado ya que es la proporción de una intensidad (dimensión en fotones) dividida por una suma de intensidades \Sigma_{i} I(K)_{i}, (que asimismo posee una dimensión en fotones).

Otro efecto importante de este procedimiento de normalización es el aumento de características espectrales pequeñas en las señales de fluorescencia débiles. Este efecto único en el procedimiento de DNF es esencial para el diagnóstico de tejidos malignos, que presentan generalmente fluorescencia débil cuyas características pequeñas son difíciles de detectar. Como resultado de este procedimiento de normalización, las diferencias en las características espectrales entre los espectros de fluorescencia normalizados de tejidos normales y malignos llegan a ser detectadas más fácilmente (ver Figura 2(b) sección: comparar curva izquierda y derecha).

Como se muestra en la Figura 2 (b), las dos características notables fueron las características espectrales a 460-490 nm y 640-670 nm. Se puede observar un área vacía a aproximadamente 475-480 nm en los espectros de tejidos malignos. Este vacío espectral reflejó la deficiencia de ciertos componentes (o absorción por algún compuesto) en tejidos malignos, que normalmente fluorescen a 460-490 nm. Esta deficiencia espectral (es decir, "pico negativo") proporciona unos criterios importantes para el diagnóstico de tejido maligno. Por lo que sabemos, esta característica espectral importante no se ha publicado en ningún estudio previo.

Otra característica importante en los espectros de fluorescencia normalizados es que diversas bandas entre 640 y 670 nm en los espectros de fluorescencia de los tumores malignos son relativamente más intensas que las de los tejidos normales. Además existen asimismo características espectrales minoritarias que se pueden observar en la curva normalizada de los tejidos malignos (Figura 2(b)) a 590 y 625 nm.

Utilizando los espectros normalizados, hemos desarrollado una técnica de DNF diseñada para aprovechar estas diferencias espectrales entre los tejidos normales y los malignos. Observando que los espectros de fluorescencia normalizados de todos los tejidos normales poseen un perfil espectral similar, establecemos una "curva de línea base" para los tejidos normales. Esta curva de línea base se determinó como el promedio medio de los espectros de fluorescencia normalizados a partir de un conjunto de referencia de muestras de los tejidos normales. La intensidad de esta curva de línea base, I_{B}, a la longitud de onda i se da por:

(2)l_{Bi}=\frac{(1)}{n_{B}} x\Sigma_{B}l(B)_{i}

en la que \Sigma_{B} corresponde a un tejido normal B utilizado para el establecimiento de la línea base.

Es de notar que este procedimiento requiere la identificación de un conjunto de tejidos normales (y pacientes) a priori para establecer la curva de línea base. Los datos necesarios para la curva de línea base se pueden basar inicialmente en los datos de ensayo de histopatología. Una vez se establece la curva de línea base, se puede utilizar para todas las mediciones futuras, y se pueden comparar con esta curva de línea base las características de fluorescencia de cada tejido.

Después del establecimiento de la curva de fluorescencia de la línea base, se calculó la curva de DNF para una muestra de tejido específico de interés como la diferencia entre su espectro de fluorescencia normalizado I_{n} y la curva de línea base I_{B}. Este procedimiento implicó deducir la intensidad de la curva de línea base de la curva de intensidad normalizada de la muestra de interés. La intensidad de DNF de la muestra de tejido particular K a la longitud de onda I viene dada por:

(3)I_{DNF} (K) _{i} = I_{n} (K) _{i} - I_{B}

El espectro de DNF, es decir, el gráfico de intensidad I_{DNF}(K)_{i} en función de la longitud de onda i, se ilustra en la Figura 3. Esta figura muestra las curvas de DNF correspondientes a un tejido normal y a un tumor maligno en las secciones A y B, respectivamente, después de la deducción de la curva de línea base I_{Bi} como se describe en la Ecuación 3. Como se esperaba, la curva de DNF que corresponde a un tejido normal es una línea próxima a la línea base horizontal, ya que existe una pequeña diferencia entre el espectro de fluorescencia normalizada de un tejido normal dado y la media promedio de un conjunto de referencia de un tejido normal I_{Bi}. Por otro lado, uno espera observar algunas diferencias entre la fluorescencia normalizada de un tumor maligno e I_{Bi}. Los resultados del procedimiento de DNF confirmaron esta característica importante y mostraron claramente un pico negativo a 475-480 nm para los tejidos malignos como se ilustra en la Figura 3.

Los valores I_{DNF} 480 nm se muestran en la Figura 4 para un conjunto de muestras de una base de datos de 300 mediciones en un conjunto de 80 pacientes. Las biopsias de las muestras de tejido normal y maligno de pacientes investigados mediante fluorescencia inducida por rayo láser se analizaron asimismo histopatológicamente con resultados que se muestran en la Figura 4. Los tejidos normales se etiquetaron con un punto (.), y los tejidos malignos se etiquetaron con una cruz (+). Los resultados muestran que todos los 35 tumores malignos poseen un índice DNF-1 negativo con un valor menor de -7,5 \times 10^{-4}, que corresponde al pico negativo en una fluorescencia del tejido maligno discutida anteriormente en la Figura 2. Por otro lado, los valores del índice de DNF de todos los 79 tejidos normales, excepto las tres muestras, se distribuyen alrededor de cero (entre -5 \times 10^{-4} y 5 \times 10^{-4}) como se esperaba ya que vienen de la diferencia entre la curva de fluorescencia normalizada de un tejido normal y la curva de línea base de un conjunto de tejidos normales.

Clasificación de carcinoma y tejido normal

En un estudio utilizando la metodología de la presente invención, se pusieron a disposición de los investigadores los datos relacionados con los primeros 30 pacientes para compararlos con los datos de fluorescencia, para calcular la curva de línea base, y para desarrollar el modelo de DNF. Después de esta fase inicial, todas las mediciones fueron "pruebas ciegas" y el modelo de DNF se utilizó para "predecir" el diagnóstico de los tejidos para todos los otros pacientes. Para esta fase de prueba ciega, los resultados de la prueba de histopatología eran desconocidos a priori por los investigadores.

Como se muestra en la Figura 4, la clasificación de los tejidos malignos utilizando los índices DNF-1 concuerda perfectamente con los resultados histopatológicos para el conjunto de pacientes monitorizados en este estudio. En el conjunto de datos que se muestran en la Figura 4, todos los 35 tejidos malignos detectados por el procedimiento de DNF concuerdan perfectamente con los resultados de la biopsia. De 77 tejidos normales clasificados como normales según el procedimiento de DNF, sólo se encontró uno que era maligno mediante los ensayos histopatológicos. Aunque las causas exactas de esta clasificación errónea no se comprenden completamente, una posibilidad podría ser debida al hecho de que la área monitorizada por la técnica óptica no estuviera exactamente en el mismo sitio en el que se hizo la biopsia. Otras lecturas de DNF en esta patente están clasificadas correctamente.

Dos casos interesantes se muestran en la Figura 4 mediante dos asteriscos (*). Estas dos muestras, que se refieren al mismo paciente, fueron diagnosticadas primero como tejidos normales por el procedimiento de la biopsia convencional. Sin embargo, el procedimiento de DNF basado en láser clasificó estas muestras como malignas. Se decidió rediagnosticar este paciente utilizando un procedimiento independiente (a saber, tomografía computerizada CAT). Las mediciones por escaneo (CAT) de la tomografía computerizada revelaron que el cáncer de pulmón que padecía este paciente se había extendido a áreas subyacentes a la mucosa del esófago. Este ejemplo subraya la eficacia de la técnica de DNF óptica para diagnosticar los tejidos malignos que se podrían haber diagnosticado erróneamente mediante el procedimiento de biopsia convencional.

Es de notar que este estudio utiliza los espectros normalizados normales (es decir, orden 0) (Figuras 2b) y curvas de DNF de orden 0 (Figura 3). En ciertos casos, todas las características espectrales pequeñas en las curvas se pueden aumentar adicionalmente mediante la utilización de la curva derivada primera, derivada segunda o curvas derivadas enésimas.

Análisis del Esófago de Barrett

Además de los tejidos normales y malignos, existe un tipo de displasia, denominada esófago de Barrett, que es difícil de detectar mediante endoscopia convencional. La Figura 5 muestra los valores promedio del índice de DNF a 480 nm correspondientes a diversos tipos de tejidos: esófago normal, mucosa normal de Barrett (BAR.-N), displasia de grado bajo a moderado (BAR.LM), displasia de grado moderado a grave (BAR.MS), displasia grave (BAR.S) y carcinoma.

Para discutir los resultados de la Figura 5, es útil entender la naturaleza de los tejidos de Barrett. El esófago de Barrett, una metaplasia columnar progresiva del esófago inferior, es una condición maligna previa con un riesgo incrementado de adenocarcinoma. En este trabajo el procedimiento de diagnóstico para el esófago de Barrett es diferente del de los tejidos normales de carcinoma. Los tejidos de carcinoma son a menudo casos netamente definidos que el médico puede ver visualmente a través de su endoscopio. Por tanto, era posible realizar una medición LIF óptica sobre un área específica y más tarde realizar una biopsia sobre el mismo sitio. Con este procedimiento, es posible poseer una comparación precisa (uno a uno) entre los dos procedimientos para un tipo de tejido. Los tejidos de Barrett a menudo no corresponden a casos visualmente netamente definidos. En el esófago de Barrett, el revestimiento celular epitelial escamoso original del esófago se sustituye por un epitelio de tipo columnar metaplásico, a menudo se origina una mezcla de islas de tejido de epitelio columnar con un límite difuso.

Al probar las técnicas presentes, ocurrió primero la realización rápida de mediciones LIF y a continuación se tomaron las biopsias en las mismas áreas. Aproximadamente las 5-7 mediciones LIF en diferentes sitios se pueden tomar en el mismo tiempo requerido para una biopsia regular. Aunque se tomó gran cuidado para realizar las biopsias en las áreas previamente medidas por LIF, a menudo es difícil encontrar las localizaciones exactas de los tejidos de Barrett que se han analizado previamente con LIF. Por tanto, para los tejidos de esófago de Barrett, no es posible poseer una comparación precisa y exacta entre los resultados de DNF ópticos y los datos de biopsia.

El dato relacionado con el esófago de Barrett se presenta con los valores de DNF promedio de los tejidos de Barrett agrupados en las diferentes clasificaciones utilizadas por el patólogo, es decir, BAR.N, BAR.M-L, BAR.M-S, BAR S.

Los resultados de la Figura 5 indican que el índice de DNF a 480 nm muestra una tendencia general interesante: cuanto más grave es la displasia de Barrett, más negativo es el valor del índice de DNF promedio. Por ejemplo, los tejidos designados como normal de Barrett y de grado bajo a mediano de Barrett poseen valores de DNF promedio próximos a cero (es decir, tejidos similares a normales). Los tejidos designados por el patólogo como de grado mediano a severo de Barrett poseen un valor de DNF promedio de aproximadamente 7,5 \times 10^{-4}, mientras que los tejidos graves de Barrett poseen valores de DNF a aproximadamente 15 \times 10^{-4}. Los tejidos de carcinoma poseen un valor de DNF promedio a aproximadamente 17 \times 10^{-4}. Es de notar que estos resultados proporcionan una tendencia general que se podría utilizar para mejorar el diagnóstico de la displasia en el esófago de Barrett. Los procedimientos mejorados para diagnosticar la displasia de Barrett en el esófago están actualmente bajo investigación en nuestros laboratorios.

La presente invención proporciona una técnica única que puede proporcionar unos índices eficaces para diagnosticar tumores malignos en el esófago. Los índices de DNF, que se derivan de las mediciones de fluorescencia inducida por rayo láser in vivo, han proporcionado excelentes resultados en el diagnóstico de tumores malignos del esófago. Del total de 114 muestras estudiadas, existe sólo un caso en el que el resultado de DNF difiere de los datos de biopsia. Existen dos muestras en las que el procedimiento de DNF revela malignidad en los tejidos que no fueron detectados por el procedimiento de biopsia.

El procedimiento de DNF proporciona asimismo una tendencia general que corresponde a la gravedad de la displasia en el esófago de Barrett. De este modo, utilizando el procedimiento de DNF presente, uno puede proporcionar una rápida técnica in vivo para el diagnóstico del cáncer que no requiere biopsia, disminuyendo de este modo el tiempo y el coste de la prevención y tratamiento del cáncer.

Aunque se han elegido las realizaciones ventajosas para ilustrar la invención, los expertos en la materia apreciarán que se pueden realizar diversos cambios y modificaciones en la presente memoria sin apartarse del alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (19)

1. Aparato para producir una señal que representa la condición de una muestra de tejido, que comprende:

medios para irradiar (12) la muestra de tejido con una luz excitante monocromática que posee una longitud de onda determinada previamente;

medios para producir (18) un espectro de fluorescencia inducido por rayo láser que posee una pluralidad de longitudes de onda con una intensidad en cada una de dicha pluralidad de longitudes de onda de la radiación de emisión generada por la interacción de la luz excitante con la muestra de tejido;

caracterizado porque el aparato comprende además:

medios para calcular (28) un área bajo el espectro de fluorescencia inducido por rayo láser para generar un área integrada;

medios para dividir la intensidad a cada longitud de onda del espectro de fluorescencia inducido por rayo láser por la área integrada bajo el espectro de fluorescencia inducido por rayo láser para producir un espectro normalizado; y

medios para correlacionar (28) el espectro normalizado a una condición específica de la muestra de tejido para producir dicha señal que representa la condición.

2. Dispositivo según la reivindicación 1, que comprende además un medio para deducir (28) el espectro normalizado de un valor promedio de un conjunto de referencia de espectros armonizados de tejidos normales para producir una curva (DNF) de fluorescencia normalizada diferencial.

3. Dispositivo según la reivindicación 2, que comprende además un elemento para correlacionar el espectro normalizado diferencial a una condición específica de la muestra de tejido.

4. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el elemento irradiador (12) comprende un láser que posee una longitud de onda de aproximadamente 410 nm.

5. Dispositivo según la reivindicación 4, en el que el elemento irradiador (12) comprende además un endoscopio (20) y un haz de fibra óptica (18) para dirigir la luz excitante dentro del endoscopio (20) y detectar la radiación de emisión del tejido a través de otro haz de fibra óptica.

6. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que el elemento irradiador (12) comprende un láser pulsatorio y el medio de correlación es un fotodetector controlado (26) dispuesto para operar en un modo de resolución en función del tiempo.

7. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que el elemento irradiador (12) comprende un láser pulsatorio que posee una longitud de onda de aproximadamente 410 nm y el medio de correlación es un fotodetector controlado (26) dispuesto para operar en un modo de resolución en función del tiempo.

8. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que el elemento irradiador (12) comprende un láser modulado y el medio de correlación comprende un fotodetector sincronizado (26) dispuesto para operar en un modo de resolución en función del tiempo.

9. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que el elemento irradiador (12) comprende un láser que produce una luz modulada en amplitud a aproximadamente 410 nm, y el medio de correlación comprende un detector sincronizado (26) dispuesto para operar en un modo de resolución en función del tiempo.

10. Dispositivo según la reivindicación 4, en el que el medio de correlación (28) incluye un elemento para analizar el espectro normalizado a aproximadamente 480 nm.

11. Dispositivo según la reivindicación 4, en el que el medio de correlación (28) incluye un elemento para analizar el espectro normalizado a aproximadamente 660 nm.

12. Procedimiento para la producción de una señal que representa la condición de una muestra de tejido, que comprende las etapas siguientes:

irradiar la muestra de tejido con una luz excitante monocromática que posee una longitud de onda determinada previamente;

producir un espectro de fluorescencia inducido por rayo láser que posee una pluralidad de longitudes de onda con una intensidad en cada una de la pluralidad de longitudes de onda a partir de la emisión de radiación generada por la interacción de la luz excitante con la muestra de tejido;

caracterizado porque el procedimiento comprende además:

calcular un área bajo el espectro de fluorescencia inducido por rayo láser para generar un área integrada;

dividir la intensidad de cada longitud de onda del espectro de fluorescencia inducido por rayo láser mediante la área integrada bajo el espectro de fluorescencia inducido por rayo láser para producir un espectro normalizado; y

correlacionar el espectro normalizado a una condición específica de la muestra de tejido para producir dicha señal que representa la condición.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, que comprende además las etapas de deducir el espectro normalizado del valor promedio de un conjunto de referencia de espectros armonizados de tejidos normales, para producir una curva de fluorescencia normalizada diferencial (DNF).

14. Procedimiento según la reivindicación 13, que comprende además la etapa de correlacionar el espectro normalizado diferencial a una condición específica de la muestra de tejido.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que la etapa de correlacionar comprende la exposición de la muestra del tejido a una luz excitante monocromática que posee una longitud de onda de aproximadamente 410 nm.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que la etapa de correlacionar comprende la identificación de un conjunto de tejidos normales a priori para establecer una línea base, dividir la intensidad a cada longitud de onda del espectro por la área integrada bajo el espectro para producir un espectro normalizado, y comparar el espectro normalizado con la línea base.

17. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que la etapa de correlacionar comprende determinar una longitud de onda a la que el tejido normal fluoresce e identificar los vacíos en la fluorescencia del tejido normal.

18. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que la etapa de correlacionar comprende la comparación de las curvas primeras y/o segundas o derivadas enésimas de los espectros normalizados.

19. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que la etapa de correlacionar comprende la comparación de las curvas primeras y/o segundas o derivadas enésimas de los espectros de fluorescencia normalizados diferenciales.