JP3717939B2

JP3717939B2 - 血液中の白血球の鑑別式測定のための試薬及び方法

Info

Publication number: JP3717939B2
Application number: JP52286797A
Authority: JP
Inventors: リー，イ; ヤング，カロール; ベウレンズ，セルジオ，シー．
Original assignee: コールターインターナショナルコーポレイション
Priority date: 1995-12-18
Filing date: 1996-12-12
Publication date: 2005-11-16
Anticipated expiration: 2016-12-12
Also published as: JP2000502187A; DE69621459T2; WO1997022878A2; EP0874988B1; DE69621459D1; WO1997022878A8; EP0874988A2; WO1997022878A3; US5817518A

Description

発明の分野
本発明は溶解試薬及び適当な電子装置による血液サンプルの白血球サブ集団の鑑別のための方法に関する。
発明の背景
血液サンプルに由来する白血球サブ集団の分析は様々な病理学に関連する診断手順の必要不可欠な要素である。白血球のサブ集団である好酸球の測定はいくつかの病気の診断に重要である。例えば、好酸球の増大がHodgkin病、寄生虫病及びアレルギー病において認められている。
血液サンプルの伝統的な分析は顕微鏡スライド上への血液サンプルの塗布、それに次ぐスライドの目視分析を包括する。この手法は非常に時間がかかり、またスライドの個別分析の解釈に委ねられる。これらの要因はフローサイトメトリーを利用する自動式白血球分析の開発を導いた。自動式血液装置を利用する白血球分析における本質的な工程は赤血球の溶解である。かくして、全血液サンプルに利用するためのいくつかの溶解試薬が開発された。
米国特許第4,485,175号（Ledisら）には自動式細胞計測装置を利用する３つのサブ集団に至る鑑別式白血球測定を実施するための試薬系及び方法が記載されている。この試薬系は血液希釈試薬及び溶解試薬を含む。この溶解試薬は第四級アンモニウム界面活性剤の混合物を含んで成る。しかしながら、この試薬系は白血球の３つのサブ集団、即ち、リンパ球、単球及び顆粒球に至る鑑別を行う用途をもつ。この試薬系は３より多くのサブ集団への顆粒球の更なる鑑別をすることはできない。
米国特許第4,751,179号（Ledisら）は自動式細胞計測装置を利用して白血球の鑑別測定を実施するための試薬系及び方法を開示する。この試薬系は１）サポニンを含む単一溶解希釈剤又は予備希釈剤とサポニンを含む溶解試薬とより成る順次添加すべき２種類の溶液のいづれかを含んで成る溶解試薬；及び２）固定試薬としての活性架橋剤、例えばグルタルアルデヒドを含んで成る。この血液サンプル溶解試薬混合物を加熱し、そしてDC及び不透過性によりそれを分析すると、４種類の白血球サブ集団が決定し得る。これら４種のサブ集団はリンパ球、単球、好中球及び好酸球である。この方法は装置による測定の前にサンプル混合物を60℃〜75℃に加熱することを要する。
米国特許第5,155,044号（Ledisら）は全血液サンプルからの白血球の迅速な単離及び分析のための試薬系及び方法を開示しており、それは導電性（DC）、高周波（RF）及び光散乱（LS）測定の可能な自動式血液分析器を利用して５種類のサブ集団への自動鑑別を可能とする。この試薬系は水性溶解試薬より成り、それは酸、酸とサポニンとの混合物、及び水性塩クエンチ溶液を含んで成る。この方法は迅速であり、そして一段測定で全血液サンプルの５種類の白血球鑑別を供する。この一段測定は血液サンプルの一アリコートと、白血球の鑑別に用いるのと同じ溶解試薬系とで実施する。しかしながら、５種類のサブ集団への白血球の鑑別を達成するためのこの試薬及び方法の利用は複雑且つ高価なレーザー装置を要する。DC及びRF検定のみをこの試薬系に利用すると、顆粒球サブ集団は好塩基球、好酸球及び好中球サブ集団へと適切に鑑別されないであろう。
RF及びDC測定を利用して白血球を４又は５種のサブ集団へと鑑別する別の手法は複数の試薬及び複数の測定の利用である。特定のサブ集団を鑑別するために別々の試薬を利用する。典型的には、米国特許第5,116,539号（Hamaguchiら）及び米国特許第5,389,549号（Hamaguchiら）に開示のものの如き第一溶解試薬を、DC及びRF測定を利用する白血球の３種のサブ集団（即ち、単球、リンパ球及び顆粒球）への鑑別に利用する。
米国特許第5,116,539号において、好酸球サブ集団を得るために追加の溶解試薬を追加の測定と共に利用する。これはリンパ球、単球、好酸球及び残りの顆粒球の４種類の鑑別を可能にする。この溶解試薬はポリエチレン系非イオン界面活性剤と、溶液のpHを３−11の範囲内に調整するバッファーとより成る低張水性溶液である。溶解試薬は赤血球のみならず、白血球も溶解するが、但し好酸球は溶解せず、従って好酸球はその残留細胞容量に基づいて計測されうる。しかしながら、好酸球分別を達成するため、この溶解試薬を利用する方法はサンプル混合物を40℃で50秒インキュベーションすることを要する。この高温の要件は装置を必然的により複雑なものとし、なぜなら反応を恒温に管理しなければならないからである。更に、長時間は自動分析器の処理量を直接的に少なくする。
米国特許第5,389,549号において、５種類鑑別を供するよう好酸球及び好塩基サブ集団を得るのに２種類の追加の溶解試薬が必要とされ、且つ２通りの追加の測定が要求される。この開示内容において、個々の測定から得られた全好酸球及び好塩基球サブ集団を総顆粒球集団から差し引き、好中球サブ集団を得ている。
米国特許第5,196,346号（Lefevre）は、好塩基球を除き赤血球及び白血球の双方を含む全ての血液細胞を溶解することによる全血液サンプル中の好塩基球の自動測定のための溶解試薬及びその利用方法を開示する。この溶解試薬はポリオキシエチレンエーテル型界面活性剤、フタル酸／HCl混合物、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）及びブチル化ヒドロキシトルエン型抗酸化剤より成る。SDSは測定装置内の堆積物の形成を減少させるためのタンパク質変性剤として使用され、そして細胞の溶解を促進することも見い出された。この開示の方法は30〜40℃の恒温管理反応温度を要し、そして好塩基球の計測のみに制約される。
1995年６月８日出願の係属米国特許出願第08/488,630号はDC，RF及び光散乱測定装置を利用する白血球の５種類のサブ集団への自動鑑別のための溶解試薬系及び方法を開示する。この溶解試薬系はエトキシル化長鎖アミン化合物を含んで成る水性溶解試薬と高張アルカリ性試薬組成物を含んで成る安定化試薬とより成る。開示の溶解試薬系は、DC，RF及び光散乱測定を利用する場合、一回の測定を利用して５種類の白血球鑑別を供する。しかしながら、この溶解試薬系をDC及びRF測定装置しか装備されていない血液分析器に用いる、４種類のサブ集団、即ち、単球、リンパ球、好塩基球、及び好中球と好酸球との総数しか得られない。
更に、1995年６月29日出願の係属米国特許出願第08/496,469号はDC，RF及び光散乱測定装置を利用する白血球の５種類のサブ集団への自動鑑別のための溶解試薬系及び方法を開示する。この溶解試薬系はポリエチレン系界面活性剤と酸とを含んで成る水性溶解試薬と、高張アルカリ安定化試薬組成物とより成る。開示の溶解試薬系はDC，RF及び光散乱測定を利用した場合、一回の測定を利用して５種類の白血球鑑別をも供する。しかしながら、もしこの溶解試薬系をDC及びRF測定装置のみ装備された血液分析器に用いると、４種類のサブ集団、即ち、単球、リンパ球、好塩基球及び好中球と好酸球との総数しか得られない。
発明の概要
本発明は新規の溶解試薬組成物に関する。当該溶解試薬組成物は硫酸アルキルのアルカリ金属塩、好酸球溶解剤、非イオン界面活性剤及び生理塩を含んで成る酸性高張水性溶液である。この新規の溶解試薬組成物は赤血球を溶解でき、そして好酸球を選択的に収縮させることにより好酸球サブ集団に選択的に影響を及ぼし、且つその他の顆粒球サブ集団からそれらを分別することができる。これは少なくとも一種の白血球サブ集団の鑑別を可能にする。
当該溶解試薬組成物は全体的に室温で操作できる利点を供する。好酸球の適正な分別のためには、従来の溶解は高温、即ち30℃以上で操作されていた。この高温要件は反応を恒温管理しなくてはならないという理由により必然的に分析装置を有意に複雑なものとした。本発明は室温で最適に操作されるということにより恒温管理の必要性を解消する。
更に、本発明は血液中の白血球サブ集団を自動測定するための溶解試薬組成物を利用する方法に関する。本発明の方法は血液サンプルを溶解試薬組成物に曝露し、このサンプル混合物を室温に25秒以上インキュベーションし、そしてこのサンプル混合物を自動血液装置で分析することを含んで成る。界面活性剤の相乗効果は好酸球サブ集団に対する迅速且つ選択的な作用を供し、これは単独のDC及びRF測定による好酸球サブ集団のその他の白血球サブ集団からの迅速な分別を可能にする。更に、この方法は好酸球サブ集団を測定するための高価なレーザー装置の必要性をなくす利点を供する。
更にまた、本発明は当該新規の溶解試薬組成物を第二溶解試薬系と組合せて利用して、DC及びRF測定のみを利用する５種類以上の白血球の鑑別を得る方法に関連する。
【図面の簡単な説明】
図１ａ及び１ｂは実施例Ｉに記載の通りに処理した正常全血液サンプルの好酸球鑑別を示す。図１ａはDC対OP（不透明度、RFとDCとの関数）の二次元図を示し、そして図１ｂはRF、対、OPの図をそれぞれ示す。白血球サブ集団にはラベルで表示して示す。
図２は実施例Ｉに記載の通りに処理したが、但しフォーカスフロー法を利用してDC，RF及び光散乱装置の装備された実験室血液分析器で分析した全血液サンプルのDC対回転光散乱（RLS）図を示す。
図３ａ及び３ｂは本発明の溶解試薬組成物の例を利用して実施例IIに記載の通りにして処理した全血液サンプルの二次元図を示す。
図４は実施例IVに記載の第二溶解試薬の例及び実施例VIに記載の安定化試薬を利用し、そして実施例VIIに従って処理した全血液サンプルの二次元図を示す。各集団は表示の１又は複数の白血球サブ集団を示す。
発明の詳細な説明
本発明はDC及びRF測定による少なくとも一種の白血球サブ集団の迅速な鑑別のための水性溶解試薬組成物及び方法に関する。この溶解試薬組成物は赤血球を溶解し、そして他の顆粒球サブ集団と比べて好酸球サブ集団を選択的に収縮させる。更に、当該溶解試薬及びこの溶解試薬の利用方法は、当該溶解試薬に対する血液サンプルの曝露の後の容積の差に基づき、レーザー測定を利用することなく好酸球の鑑別及び数値化を可能にする。更に、DC及びRF測定のみを利用する少なくとも５種類の白血球サブ集団の鑑別のための方法を提供する。
本発明の第一の態様において、当該溶解試薬組成物は硫酸アルキルのアルカリ金属塩；酸；有機リン酸エステル、有機リン酸エステルのアルカリ金属塩、エトキシル化リン酸エステル、エトキシル化メルカプタン、エトキシル化ラノリンアルコール、エトキシル化アルキルフェノール、エトキシル化アルキルアルコール、エトキシル化アルケニルアルコール及びそれらの混合物より成る群から選ばれる好酸球サブ集団の選択的収縮を促進する好酸球溶解剤；好中球サブ集団を溶解から保護する非イオン性界面活性剤；並びに当該溶解試薬組成物の浸透圧を370〜720mOsmに調整するのに十分な生理塩を含んで成る。これらの膜活性化学品の相乗効果は溶解試薬が赤血球を迅速に溶解し、そして同時に好酸球を選択的に収縮してそれを白血球のその他のサブ集団から鑑別することを可能とする。
本発明の溶解試薬中の硫酸アルキルのアルカリ金属塩の機能は重要である。これは白血球の鑑別分析機会を供するよう赤血球を溶解する。更に、これは好酸球サブ集団細胞膜に影響を及ぼし、そして細胞容積を急速に収縮せしめる。硫酸アルキルのアルカリ塩のアルキル鎖長は10〜18個の炭素原子、好ましくは12〜14個の炭素原子である。硫酸アルキルのアルカリ塩の好適な例にはドデシル硫酸ナトリウム及びテトラデシル硫酸ナトリウムが含まれる。最も好ましくはドデシル硫酸ナトリウムを使用する。硫酸アルキルのアルカリ塩の濃度は約0.02％〜約0.16％、好ましくは約0.04％〜0.12％とする。
酸の機能は赤血球の選択的な溶解の補助及び好酸球サブ集団の選択的な収縮のための酸性環境の供与にある。好酸球サブ集団の選択的な収縮は酸性媒体のみに認められることがわかった。
本発明においては様々な酸が利用できうる。しかしながら、３未満のpKを有するものが好適に利用される。これらの酸は有機酸、無機酸又はそれらの混合物でありうる。本発明の溶解試薬中の適当な塩の例は酢酸、クエン酸、ギ酸、プロピオン酸、塩酸、リン酸、硫酸及びそれらの混合物である。
酸の量は、赤血球の迅速溶解に十分だが、その他の顆粒球サブ集団は損傷しない量としなくてはならない。当該溶解試薬のpHは約1.4〜約3.4、好ましくは約1.8〜約2.6の範囲内であり続けるべきである。
一群の界面活性剤は好酸球溶解剤として機能する。当該溶解試薬組成物におけるその存在は好酸球の収縮に役立ち、そしてまた鑑別分析のための独立した集団を形成するように好酸球を収縮するのにも役立つ。これらの好酸球溶解剤には有機リン酸エステル、有機リン酸エステルのアルカリ金属塩、エトキシル化リン酸エステル、エトキシル化メルカプタン、エトキシル化ラノリンアルコール、エトキシル化アルキルフェノール、エトキシル化アルキルアルコール、エトキシル化アルケニルアルコール及びその混合物が含まれる。
これらの界面活性剤の有意に相違する化学的性質を理由に、本発明の条件下でのその作用態様は現状理解されていない。一般に、非イオン性好酸球溶解剤は約15未満の親水性親油性バランス（HLB）を有する。非イオン好酸球溶解剤は広いpH域で強から中に至る赤血球溶解剤であることがわかっている。しかしながら、これは好酸球の細胞質膜に対するその選択的な作用及び好酸球サブ集団をその他の顆粒球サブ集団から鑑別するその能力の説明にはなっていない。好酸球溶解剤の濃度は使用する特定の化学品の能力に依存して0.05％〜0.8％に範囲し、それは経験的に決定し得る。
非イオン界面活性剤の別の群は白血球保護剤として機能する。この白血球保護剤は２通りの機能を有する。一の機能は選択的な赤血球溶解の補助である。第二の機能は白血球、特に好中球サブ集団を溶解反応の際に損傷から保護することにある。適切な例には16以上のHLBを有するエトキシル化アルキルアルコール又はエトキシル化アルケニルアルコール及びそれらの混合物が含まれる。
好中球サブ集団が分析の際に当該溶解試薬により影響されると、それらはサイズ収縮し、そして好酸球の分類の妨げとなるであろう。しかしながら、過剰量の白血球保護剤を使用すると、好酸球サブ集団分別は典型的に約45秒より長い反応時間でしか実施されず、又は事実上達成されないこととなるであろう。従って、経験的に決定できる白血球保護剤の適切な濃度が所望される。エトキシル化アルキルアルコール又はエトキシル化アルケニルアルコールの濃度は約0.5〜約３％、好ましくは約0.8％〜約２％である。
当該溶解試薬組成物の浸透圧の調整のために生理塩を使用する。本発明者により、好酸球は約370〜720mOsm、そして好ましくは約400〜570mOsmの範囲における高張環境でのみ収縮することが見い出された。好適な態様において、塩化物及び硫酸塩のアルカリ金属塩がこの目的のために利用できる。塩化物及び硫酸塩のアルカリ金属塩の適当な組合せにより、好酸球の収縮は迅速に起こり、そして収縮した好酸球は独立の集団を成す。
生理塩の適当な例には塩化ナトリウム又はカリウム及び硫酸ナトリウム又はカリウムが含まれる。塩化物のアルカリ金属塩の濃度は約0.1〜約1.2％、好ましくは約0.3％〜約1.0％に範囲する。硫酸塩のアルカリ金属塩の濃度は約0.4％〜約２％、好ましくは約0.6％〜約1.5％に範囲する。
任意的にポリオキシエチレン及びポリオキシプロピレンコポリマーが赤血球残がいを溶解するのに及び当該残がいより発生するノイズを減少させるのに役立つように利用されうる。更に、これらのコポリマーは好酸球サブ集団が独立の集団となるのを補助することが見い出された。本発明の好適な態様はPluronicコポリマー（BASF Corporation, Parsippany, New Jerseyにより製造）、例えばPluronic 10R5及びPluronic Ｌ35を利用する。
更なる任意的な添加剤を当該溶解試薬組成物の中に、その存在がこの溶解試薬組成物の第一機能成分に匹敵するほどの濃度で含ませてもよい。これらの添加剤はとりわけ当該組成物の棚寿命を延期し、且つ抗微生物特性を有する保存剤である。抗酸化特性を有する保存剤には、限定することなく、EDTA及びブチルメチルフェノールが含まれる。抗微生物活性を有する保存剤には、限定することなく、ジメチロールジメチルヒンダトイン及びイソチオゾロン誘導体が含まれる。
本発明の第二の態様において、血液サンプル中の赤血球の溶解のための方法及び残留白血球サブ集団の分析を提供する。この方法は下記の工程を含んで成る：工程１）血液サンプルを溶解試薬組成物に、赤血球を溶解せしめ、且つこの血液サンプル中の少なくとも一種の白血球サブ集団を分別するのに十分な時間曝露する、ここで当該溶解試薬は硫酸アルキルのアルカリ金属塩；酸；有機リン酸エステル、有機リン酸エステルのアルカリ金属塩、エトキシル化リン酸エステル、エトキシル化メルカプタン、エトキシル化ラノリンアルコール、エトキシル化アルキルフェノール、エトキシル化アルキルアルコール、エトキシル化アルケニルアルコール及びその混合物より成る群から選ばれる好酸球サブ集団の選択的収縮を促進する好酸球溶解剤；好中球を溶解から保護する非イオン界面活性剤；並びに当該溶解試薬組成物の浸透圧を370〜720mOsmに調整するに足りる生理塩を含んで成る；工程２）好酸球、リンパ球、単球及び好中球より成る群から選ばれる少なくとも一種の白血球サブ集団を鑑別する；そして工程３）前記鑑別の結果を報告する。
血液サンプルは赤血球を溶解し、且つこの血液サンプル中の少なくとも一種の白血球サブ集団を分別するのに十分な時間溶解試薬組成物に曝露する。血液サンプルはこの溶解試薬に、この溶解試薬と血液サンプルとを混合して血液サンプルが約45〜75倍に希釈されるようにして曝露する。この希釈サンプル混合物を室温でインキュベーションする。好ましくはこの温度は約15〜30℃の間であろう。インキュベーション時間は約10〜25秒、好ましくは18秒未満である。サンプル混合物を自動血液装置で分析する。この装置は少なくとも一種の白血球サブ集団、好ましくは好酸球又は好中球サブ集団、そして最も好ましくは好酸球サブ集団を鑑別する。
当該鑑別はDC，RF及び光散乱測定より成る群から選ばれる少なくとも２通りの測定を利用して実施する。好ましくはこの鑑別はDC及びRF測定のみを利用して実施する。このDC法は、サンプル混合物を狭い流路に通したときの粒子と流体媒体との間での導電率の差による電流において生ずる任意の変化を検出する。DC法において、検出されるシグナルの強度は本質的に粒子の容積に比例する。RF法においては、サンプル混合物を密接した電極間の流路に通し、そして粒子と流体媒体との間の誘電率の差による電極間の電気インピダンズにおいて生ずる変化を検出する。このRF法においては、検出されるシグナルの強度は粒子の構造及びその材質に関連する情報を反映する。DC及びRF検出の原理及び技術の詳細はCoulter Electronics, Inc.の米国特許第2,656,508号及びCoulter Electronics, Inc.の米国特許第4,298,836号に教示されている。
血液サンプルの白血球鑑別分析のために本発明の溶解試薬組成物を利用する方法は一種の溶解試薬を利用する迅速な方法を提供する。この溶解試薬組成物は赤血球を溶解し、且つ好酸球サブ集団の細胞質膜に選択的に影響を及ぼし、そして好酸球サブ集団細胞容積を収縮させる。好酸球以外の顆粒球は溶解反応の間本質的にそのままであり続ける。
実施例Iは白血球鑑別及び全血液サンプルの数値化のための開示の溶解試薬組成物の好適な態様の用途を示す。図１はDC及びRF測定に利用する実施例１記載の通りに処理した全血液サンプルの鑑別分析を示す。細胞を開口部に通し、そこでインピダンス測定装置は高周波及び直流に対する応答を記録する。電気シグナルを処理し、そして図１ａ及び１ｂのそれぞれに示すようにDC対不透過性又はRF対不透過度の二次元図としてプロットする。図示の通り、血液サンプルを本発明の溶解試薬組成物に曝露した後、好酸球サブ集団はその他の白血球集団から完全に分別される。本例は非フォーカスフロー装置で実施しているが、同じ結果が図２に示すようにフォーカスフローシステムを利用して得られるであろう。
好酸球のサイズは当該溶解試薬に対するその曝露を経て劇的に縮小するが、そのRFシグナルは有意に影響されないことに注目すべきである。DC及びRF検出技術を利用する好中球及び好酸球間の鑑別は主にそのサイズの著しい違い及び不透過度を介して達成される。図１ａ及び１ｂの双方に示す通り、好酸球サブ集団は不透過度において右方向にシフトし、そして好中球及びその他の白血球サブ集団から完全に分離する。
図２はフォーカスフロー法を利用するDC，RF及び光散乱装置の装備された実験室血液分析器に基づく実施例Ｉに記載の通りに処理した同じ血液サンプルを利用するDC対回転光散乱図による本発明の好酸球分類の確認を示す。DC、対、光散乱次元において、好酸球はそのサイズ及び光散乱差の双方により好中球から分別される。本発明の方法により分類された細胞の数は慣用の手動式方法により計測した好酸球の数と一致する。
本発明の第三の態様において、血液サンプル中の赤血球の溶解及び残留白血球サブ集団の少なくとも５種類の白血球サブ集団への分析のための方法を提供する。この方法は下記の工程を含んで成る：工程１）血液サンプルの第一アリコートを第一溶解試薬組成物により、赤血球を溶解し、且つこの血液サンプル中の少なくとも一種の白血球サブ集団を分別するに足りる時間処理する；工程２）前記血液サンプルを第二溶解試薬系により、赤血球を溶解し、且つこの血液サンプル中の４種類の白血球サブ集団を分別するのに足り時間処理する；工程３）前記処理血液の第一アリコートをDC及びRF測定を利用して分析する；工程４）前記処理血液の第二アリコートをDC及びRF測定を利用して分析する；そして工程５）少なくとも５種類の白血球サブ集団を報告する。
第一血液アリコートを処理する工程Ｉは本発明の第一態様に記載の溶解試薬組成物を利用して達成される。第一血液アリコートの分析に関する工程３は本発明の第二態様に記載の方法により達成される。
工程２は第二血液アリコートを第二溶解試薬系で、赤血球を溶解し、且つ血液サンプル中の４種類の白血球サブ集団を分別するのに十分に処理することにより達成される。この第二溶解試薬系は白血球をリンパ球、単球、好塩基球及び好塩基球サブ集団以外の顆粒球へと分別する。血液サンプルは第二溶解試薬に10秒未満曝露する。
この第二溶解試薬系は典型的には溶解試薬及び安定化試薬組成物を含むであろう。第二溶解試薬系の例は下記の一般式

（式中、Ｒは12〜22個の炭素原子を有するアルキル、アルケニル又はアルキニル基であり、ｍ及びｎはそれぞれ１以上であり、且つｍ＋ｎは20〜40である）により表されるエトキシル化長鎖アミン化合物；及び当該溶解試薬のpHを2.0〜3.6の範囲となるように調整する酸；及び高張アルカリ安定化試薬組成物を含んで成る。好ましくはＲは14〜20個の炭素原子を有するアルキル基である。更にpHを調整するために利用する酸は有機酸を含んで成ることが好ましい。最も好ましくはpHを調整するために利用する酸はギ酸と、酢酸、クエン酸、シュウ酸、グリコール酸、プロピオン酸、塩酸、硫酸及びリン酸並びにそれらの混合物との有効な混合物を含んで成る。
第二溶解試薬系のその他の例は下記の一般式
Ｒ₁−Ｒ₂−（CH₂CH₂O）_n−Ｈ
（式中、Ｒ₁は10〜22個の炭素原子を有するアルキル、アルケニル又はアルキニル基であり、Ｒ₂は−Ｏ−又は−COO−であり、そしてｎは20〜35である）により表されるポリオキシエチレン系界面活性剤を含んで成る溶解試薬；当該溶解試薬組成物のpHを2.0〜4.0の範囲に調整する酸；及び高張アルカリ安定化試薬組成物；を含んで成る。好ましくはＲは12〜20個の炭素原子を有するアルキル基である。更にpHを調整するために利用する酸は有機酸を含んで成ることが好ましい。最も好ましくはpHを調整するために利用する酸はギ酸と、酢酸、クエン酸、シュウ酸、グリコール酸、プロピオン酸、塩酸、硫酸及びリン酸並びにそれらの混合物との有効な混合物を含んで成る。
第二溶解試薬の例は実施例IV及びＶに示す。実施例IV及びＶの第二溶解試薬に利用する安定化試薬の例を実施例VIに示す。
工程４はDC及びRFを利用する溶解血液の第二アリコートの分析により達成される。図４は、実施例VIIの方法に記載の通りにして分析した血液サンプルからの実施例IVに記載の第二溶解試薬及び実施例VIに記載の安定化試薬組成物を利用して得られる４種類の白血球サブ集団を示す。図４に示す通り、リンパ球、単球、好塩基球及び好塩基球以外の顆粒球の４種類の白血球サブ集団がDC及びRF測定を利用して明確に分別された。
工程５は白血球の少なくとも５種類のサブ集団を報告する。前述の如き、リンパ球、単球、好塩基球は工程４で直接得られる。好中球サブ集団は工程３で得られた好酸球サブ集団を工程４で得られた好塩基球以外の顆粒球から差し引くことにより得られる。
当該試薬組成物、第二溶解試薬系又はそれらの組合せはそれぞれキットとして市販することができ、この場合溶解試薬は容器、例えばプラスチック容器の中に包装する。本発明に従ってこれらの成分をどのようにして利用するかの仕様書を容器の中又は上に含ませるのが好ましい。
本発明を以下の表限定的な実施例により更に説明する。
実施例Ｉ
溶解試薬組成物は下記の組成で配合される：
１．Ｔ−mulz 66Ｈ（Harcros Chemicals, Inc., 50％の有機リン酸エステルのカリウム塩） 5.0ｇ
２．ドデシル硫酸ナトリウム 1.0ｇ
３．Hetoxol STA30（へテレン、エトキシル化ステアリルアルコール） 10.0ｇ
４．Pluronic 10R5（BASF） 15.0ｇ
５．ギ酸 0.2ml
６．硫酸ナトリウム 9.0ｇ
７．塩化カリウム 6.0ｇ
８．BHT：エタノールに予め溶解 0.05ｇ
９．Proclin 300（Rohm & Haas Co.） 0.5ml
10．pH（４Ｍ HClにより調整） 2.2
11．脱イオン水１Ｌに至る
28mlのEDTA抗凝血処理した正常全血サンプルに1800mlの溶解試薬組成物を加え、そしてこの混合物を室温（約21℃）で９秒渦運動させることにより静かに混合し、そしてこの溶解試薬組成物の添加後約13秒で鑑別分析の用意が整った。この血液混合物を酸性（約pH2.2）及び484mOsmの浸透圧の高張条件に保った。鑑別分析は非フォーカスフロー技術を利用してDC及びRF装置の装備された実験室血液分析器で実施した。得られる二次元図を図１ａ及び１ｂに示す。図１ａの縦軸及び横軸はそれぞれDC及び不透過度であり、そして図１ｂの縦軸及び横軸はそれぞれRF及び不透過度である。好酸球集団を鑑別及び数値化し、そして絶対計算値として又は総白血球計測数に対して計算したときには％として報告する。
実施例II
下記の組成で配合した溶解試薬組成物を白血球のサブ集団の鑑別分析のために用いた。28mlのEDTA抗凝血処理正常全血液に1600mlの溶解試薬組成物を添加し、そしてこの混合物を室温（約21℃）で約８秒渦運動させることにより静かに混合し、そして溶解試薬組成物の添加の約12秒後に鑑別分析の用意が整った。図３ａ及び３ｂは２つのDC対不透過度の図を示す。図３ａは正常血液サンプルに対応し、そして図３ｂは高い好酸球（手動鑑別計測より12％）を有する血液サンプルに対応する。
１．Burco TME（Burlington Chemical Co. Inc., エトキシル化ドデシルメルカプタンHLB＝13.0） 1.5ｇ
２．ドデシル硫酸ナトリウム 1.0ｇ
３．Hetoxol STA30（ヘテレン、エトキシル化ステアリルアルコール） 8.0ｇ
４．Pluronic Ｌ35（BASF） 10.0ｇ
５．クエン酸 17.0ml
６．硫酸ナトリウム 9.0ｇ
７．塩化カリウム 6.0ｇ
８．脱イオン水１Ｌに調整
９．pH 2.2
実施例III
溶解試薬を下記の組成を利用して配合した。この試薬を白血球のサブ集団の鑑別分析のために用いた。28mlのEDTA抗凝血処理正常全血液サンプルに約1880mlの溶解試薬組成物を加え、そしてこの混合物を室温（約21℃）で11秒渦運動させることにより静かに混合し、そして溶解試薬組成物の添加の約15秒後に鑑別分析の用意が整った。その後このサンプルを実験室血液装置で分析した。
１．Tergitol NP−13（Union Carbide、エトキシル化ノニルフェノール） 1.0ｇ
２．テトラデシル硫酸ナトリウム 1.0ｇ
３．Hetoxol STA30（ヘテレン） 10.0ｇ
４．ギ酸 0.2ml
５．硫酸ナトリウム 9.0ｇ
６．塩化カリウム 5.0ｇ
７．Pluronic 10R5 15.0ｇ
８．脱イオン水１Ｌに調整
９．pH（４Ｍ HClにより調整） 2.2
実施例IV
第二溶解試薬の第一例
エトキシル化長鎖アミン化合物を含む溶解試薬組成物を下記の組成で配合した：次式を有するカチオンエトキシル化長鎖アミン化合物：

（式中、ｍ＋ｎは30の値である）を脱イオン水に20ｇ／Ｌの濃度で溶解する。ギ酸を用いてpHを3.2に調整した。更には下記の保存剤を添加した：0.2ｇ／ＬのEDTA，0.5ｇ／ＬのProclin 300（Rohm & Haas Co.）及び0.05ｇ／Ｌの２，６−ジ−tert−ブチル−４−メチルフェノール（エタノールに予め溶解）。
実施例Ｖ
第二溶解試薬の第二例
ポリオキシエチレン系界面活性剤を含む溶解試薬組成物を下記の組成で配合した：
次式を有するポリオキシエチレン系界面活性剤
C₁₈H₃₇O(CH₂CH₂O)_nH
（式中ｎは30である）を脱イオン水に20ｇ／Ｌの濃度で溶解した。0.8ｇ／Ｌのドデシル硫酸ナトリウム（SDS，Aldrich）を加えた。ギ酸を用いてpHを2.8に調整した。
第二溶解試薬を安定化試薬と一緒に利用して、白血球をリンパ球、単球、好塩基球及び好塩基球サブ集団以外の顆粒球へと分別する溶解試薬系を形成した。安定化試薬の例を実施例VIに示す。
実施例VI
第二溶解試薬のための安定化試薬
安定化試薬を上記の通りに配合し、そして14ｇ／ＬのNaCl，32ｇ／ＬのNa₂SO₄及び6.6ｇ／ＬのNa₂CO₃バッファーを含んで成り11.0のpHに調整されている。この試薬の浸透圧を約1080mOsmに示す。
実施例VII
血液サンプルの白血球集団の鑑別
28mlのEDTA抗凝血正常全血液サンプルに488mlの実施例IVの溶解試薬組成物を加え、そしてこの混合物を室温（約21℃）で４秒渦運動させることにより静かに混合した。この溶解反応を209μｌの実施例VIの安定化試薬の添加により阻止した。血液混合物を静かに混合し、そして安定化試薬の添加の約15秒後に鑑別分析の用意が整った。最終血液混合物を中性pH（約７）及び約445mOsmの浸透圧の高張条件に保った。図４はDC及びRFを利用する鑑別分析を示す。

Claims

水性溶解試薬組成物であって：
ａ）硫酸アルキルのアルカリ金属塩；
ｂ）赤血球の溶解を補助し、且つ好酸球サブ集団の収縮のための酸性環境を供与するのに有効な量の酸；
ｃ）有機リン酸エステル、有機リン酸エステルのアルカリ金属塩、エトキシル化リン酸エステル、エトキシル化メルカプタン、エトキシル化ラノリンアルコール、エトキシル化アルキルフェノール、エトキシル化アルキルアルコール、エトキシル化アルケニルアルコール及びそれらの混合物から成る群から選ばれる好酸球集団の選択的収縮を促進する15未満の親水性親油性バランスを有する好酸球溶解剤；
ｄ）白血球の好中球サブ集団を保護する16より高い親水性親油性バランスを有する非イオン性界面活性剤；並びに
ｅ）当該溶解試薬組成物の浸透圧を370〜720mOsmに調整するに足りる生理塩；
を含んで成る組成物。
前記硫酸アルキルのアルカリ金属塩のアルキル基が10〜18個の炭素原子を有する、請求項１記載の溶解試薬組成物。
前記溶解試薬組成物中の前記硫酸アルキルのアルカリ金属塩が約0.02（Ｗ／Ｖ）％〜約0.16（Ｗ／Ｖ）％の濃度となっている、請求項１又は２記載の溶解試薬組成物。
前記利用する酸が前記溶解試薬組成物のpHを約1.4〜約3.4に調整する、請求項１〜３のいずれか１項記載の溶解試薬組成物。
前記酸が有機酸、無機酸又はそれらの混合物を含んで成る、請求項１〜４のいずれか１項記載の溶解試薬組成物。
前記酸がクエン酸、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、塩酸、リン酸、硫酸及びそれらの混合物から成る群から選ばれる、請求項１〜５のいずれか１項記載の溶解試薬組成物。
前記好酸球溶解剤が約15未満の親水性親油性バランスを有する、請求項１〜６のいずれか１項記載の溶解試薬組成物。
前記好酸球溶解剤が0.05（Ｗ／Ｖ）％〜0.8（Ｗ／Ｖ）％に範囲する濃度を有する、請求項１〜７のいずれか１項記載の溶解試薬組成物。
前記白血球の好中球サブ集団を溶解から保護する非イオン性界面活性剤が16以上の親水性親油性バランスを有するエトキシル化アルキルアルコール、16以上の親水性親油性バランスを有するエトキシル化アルキレンアルコール又はそれらの混合物を含んで成る、請求項１〜８のいずれか１項記載の溶解試薬組成物。
前記非イオン性界面活性剤の濃度が約0.5〜3.0（Ｗ／Ｖ）％に範囲する、請求項９記載の溶解試薬組成物。
赤血球残がいの溶解を促進するに足りる量のポリオキシエチレン及びポリオキシプロピレンのコポリマーを更に含む、請求項１〜10のいずれか１項記載の溶解試薬組成物。
前記生理塩が塩化物のアルカリ金属塩、硫酸塩のアルカリ金属塩及びそれらの混合物を含んで成る、請求項１〜11のいずれか１項記載の溶解試薬組成物。
前記塩化物のアルカリ金属塩の濃度が約0.2％〜約1.3％である、請求項12記載の溶解試薬組成物。
前記硫酸塩のアルカリ金属塩の濃度が約0.4％〜約2.0％である、請求項12記載の溶解試薬組成物。
血液サンプル中の赤血球の溶解及び残留白血球サブ集団の分析のための方法であって：
ａ）血液サンプルを溶解試薬組成物に対し、赤血球を溶解せしめ、且つ前記血液サンプル中の少なくとも一種の白血球サブ集団を鑑別するのに十分な時間曝露する、ここで前記溶解試薬は：
１）硫酸アルキルのアルカリ金属塩；
２）赤血球の溶解を補助し、且つ好酸球サブ集団の収縮のための酸性環境を供与するのに有効な量の酸；
３）有機リン酸エステル、有機リン酸エステルのアルカリ金属塩、エトキシル化リン酸エステル、エトキシル化メルカプタン、エトキシル化ラノリンアルコール、エトキシル化アルキルフェノール、エトキシル化アルキルアルコール、エトキシル化アルケニルアルコール及びそれらの混合物から成る群から選ばれる好酸球サブ集団の選択的収縮を促進する15未満の親水性親油性バランスを有する好酸球溶解剤；
４）白血球の好中球サブ集団を溶解から保護する16より高い親水性親油性バランスを有する非イオン性界面活性剤；並びに
５）当該溶解試薬の浸透圧を370〜720mOsmに調整するに足りる生理塩；
を含んで成る；そして
ｂ）DC，RF及び光散乱測定から成る群から選ばれる２通り以上の測定を利用して好酸球、リンパ球、単球及び好中球から成る群から選ばれる少なくとも一種の白血球サブ集団を鑑別する；
ｃ）前記鑑別の結果を報告する、
ことを含んで成る方法。
赤血球を溶解せしめ、且つ前記血液サンプル中の少なくとも一種の白血球サブ集団を鑑別するのに足りる時間が約10〜25秒である、請求項15記載の方法。
赤血球の溶解及び前記血液サンプル中の少なくとも一種の白血球サブ集団の鑑別を室温で行う、請求項15又16記載の方法。
前記室温が約15〜30℃である、請求項17記載の方法。
前記白血球サブ集団が好酸球サブ集団である、請求項15〜18のいずれか１項記載の方法。
前記白血球サブ集団が好中球サブ集団である、請求項15〜18のいずれか１項記載の方法。
前記鑑別をDC及びRF測定により実施する、請求項15〜20のいずれか１項記載の方法。
血液サンプル中の赤血球の溶解及び残留白血球サブ集団の分析のための方法であって：
ａ）血液サンプルの第一アリコートを第一溶解試薬組成物により、赤血球を溶解し、且つ前記血液サンプル中の少なくとも一種の白血球サブ集団を検出するに足りる時間処理する；
ｂ）血液サンプルの第二アリコートを赤血球を溶解し、且つ前記血液サンプル中のリンパ球、単球、好塩基球及び好塩基球以外の顆粒球を含んで成る４種の白血球サブ集団を検出するのに十分な第二溶解試薬組成物により処理する；
ｃ）DC及びRF測定を利用して前記処理した血液の第一アリコートを分析して少なくとも一種の白血球サブ集団の検出値を得る；
ｄ）DC及びRF測定を利用して前記処理した血液の第二アリコートを分析してリンパ球、単球、好塩基球及び好塩基球以外の顆粒球を含んで成る４種の白血球サブ集団の検出値を得る；そして
ｅ）工程ｃ及びｄの結果を利用して白血球の少なくとも５種類のサブ集団を報告する；
ことを含んで成り、
ここで前記第一溶解試薬組成物が：
i）硫酸アルキルのアルカリ金属塩；
ii）赤血球の溶解を補助し、且つ好酸球サブ集団の収縮のための酸性環境を供与するのに有効な量の酸；
iii）有機リン酸エステル、有機リン酸エステルのアルカリ金属塩、エトキシル化リン酸エステル、エトキシル化メルカプタン、エトキシル化ラノリンアルコール、エトキシル化アルキルフェノール、エトキシル化アルキルアルコール、エトキシル化アルケニルアルコール及びそれらの混合物から成る群から選ばれる好酸球サブ集団の選択的収縮を促進する15未満の親水性親油性バランスを有する好酸球溶解剤；
iv）白血球の好中球サブ集団を溶解から保護する16より高い親水性親油性バランスを有する非イオン性界面活性剤；
v）前記溶解試薬組成物の浸透圧を370〜720mOsmに調整するに足りる生理塩；
を含んで成る方法。
赤血球を溶解し、且つ前記血液サンプルの前記第一アリコート中の少なくとも一種の白血球サブ集団を検出するに足りる時間が約10〜25秒である、請求項22記載の方法。
前記血液サンプル中の前記第二アリコート中の赤血球を溶解するに足り時間が約10秒である、請求項23記載の方法。
赤血球の溶解並びに前記血液サンプルの第一アリコート及び第二アリコート中の白血球サブ集団の検出を室温で行う、請求項22〜24のいずれか１項記載の方法。
前記室温が約15〜30℃である、請求項22〜25のいずれか１項記載の方法。
DC及びRF測定を利用する前記処理血液の第一アリコートの前記分析が好酸球サブ集団を鑑別する、請求項22〜26のいずれか１項記載の方法。
前記第二溶解試薬系が：
ａ）溶解試薬であって次の一般式

（式中、Ｒは12〜22個の炭素原子を有するアルキル、アルケニル又はアルキニルであり、ｍ及びｎは１以上であり、且つｍ＋ｎは20〜40である）で表されるエトキシル化長鎖アミン化合物及び当該溶解試薬のpHを2.0〜3.6の範囲内に調整する酸を含んで成る溶解試薬；並びに
ｂ）高張アルカリ安定化試薬組成物；
を含んで成る、請求項22〜27のいずれか１項記載の方法。
前記第二溶解試薬系が：
ａ）溶解試薬組成物であって次の一般式
Ｒ₁−Ｒ₂−（CH₂CH₂O）_n−Ｈ
（式中、Ｒ₁は10〜22個の炭素原子を有するアルキル、アルケニル又はアルキニルであり、Ｒ₂は−Ｏ−又は−COO−であり、そしてｎは20〜35である）により表される血液サンプル中のリンパ球、単球、好塩基球及び好塩基球以外の顆粒球を含んで成る少なくとも４種の白血球サブ集団の決定のためのポリオキシエチレン系界面活性剤及び当該溶解試薬組成物のpHを2.0〜4.0の範囲内に調整する酸を含んで成る溶解試薬組成物；並びに
ｂ）高張アルカリ安定化試薬組成物；
を含んで成る、請求項22〜28のいずれか１項記載の方法。
前記第二溶解試薬系が更に追加のドデシル硫酸ナトリウムを含んで成る、請求項29記載の方法。