JP3706634B2 - 新規な合成ポリペプチド - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は新規なポリペプチドに関し、さらに詳しくは、魚類成長ホルモン様作用を示すポリペプチド、それをコードするDNA、該DNAを含むベクター、該ベクターで形質転換された微生物、該微生物を利用した上記ペプチドの製造方法、ならびに該ペプチドの魚類の生育促進および稚魚のへい死率の低減における利用に関する。
背景技術
哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類に共通して存在する成長ホルモンは脳下垂体から分泌されるポリペプチドであり、これまでに様々な研究グループによって単離され、それぞれ構造決定がなされ、報告されている。これらの成長ホルモンは遺伝子工学の進歩に伴って微生物内で大量に生産できるようになり、多くの家畜動物において利用されようとしている。しかし、魚類においては研究レベルでは利用されているものの、実用化はされていないというのが現状である。
魚類成長ホルモンは魚類の生育促進を担っていることから、養殖魚の飼育用餌料として利用できれば出荷までの期間が短くなり、コスト削減に役立つと考えられる。しかしながら、魚類から単離された天然の成長ホルモンは、ある程度の種特異性があり、例えば、試薬として市販されているマグロの成長ホルモンを他の魚類に経口投与した場合、若干の効果は期待することができるが、その効果は十分とは言えない。
そこで、本発明者らは多種の魚類に共通して使用することができ、しかも魚類に対して優れた生育促進効果を発揮する汎用性のある魚類成長ホルモン様作用を持つポリペプチドを開発すべく研究を行った。
発明の開示
その結果、今回、下記のアミノ酸配列（配列表の配列番号１）
で示されるポリペプチドが魚類成長ホルモン様作用を示し、各種の魚類に対して顕著な生育促進効果および稚魚のへい死率の低減効果を発揮することを見い出した。
かくして、本発明は、上記アミノ酸配列、又は上記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり且つ魚類成長ホルモン作用を示すポリペプチドを提供するものである。
本発明のポリペプチドは、それ自体既知の固相法又は液相法によって化学的に合成することができ、或いは本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを用いる遺伝子工学の手法によって生化学的に合成することもできる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のfGH遺伝子の構築の過程を示す工程図である。
図２は、fGHオペロンの作製の過程を示す工程図である。
図３は、大腸菌−ラン藻シャトルベクターpBAX18のマルチクローニングサイトへのfGHオペロンの組み込みの過程を示す工程図である。
図４は、試験例１におけるfGHポリペプチドの鯉稚魚に対する生育促進効果を示すグラフである。
図５は、試験例２におけるfGHポリペプチドおよびtunaGHの鯉稚魚に対する生育促進効果を示すグラフである。
図６は、試験例５におけるfGHポリペプチドのアーリーシクリッド稚魚に対する生育促進効果を示すグラフである。
図７は、試験例６におけるfGHポリペプチドのエンゼルフィッシュ稚魚に対する生育促進効果を示すグラフである。
発明を実施するための形態
以下、本発明のポリペプチドを遺伝子工学の手法によって生化学的に合成する場合について、実施例により具体的に説明する。
（１）オリゴヌクレオチドの合成
宿主として使用するラン藻のコドン使用頻度を考慮して、前記アミノ酸配列で示されるポリペプチド（以下、このポリペプチドを“fGHポリペプチド”という）をコードするDNA断片を設計する（以下、このDNAを“fGH遺伝子”という）。
設計したDNA断片の塩基配列（配列表の配列番号２）は次の通りである。
設計したDNAを幾つかのブロック、例えば約60塩基ごとの21個のブロックに分け（図１．（Ａ）参照）、各ブロックのオリゴヌクレオチドをホスホアミダイト法によってDNAシンセサイザーを用いて合成する。
（２）合成オリゴヌクレオチドのキナーゼによるリン酸化
合成した各オリゴヌクレオチド（No.1とNo.11は除く）3μgをTakara kination kit（オリゴヌクレオチド3μl、10×kination buffer 2μl、100mM ATP（ファルマシア社製）2μl、ポリヌクレオチドキナーゼ１μl（10ユニット）および滅菌水12μl）を用いて、37℃で90分間インキュベートする。反応後、90℃で5分間熱処理して酵素を失活させ、フェノール-クロロホルムおよびクロロホルム処理を行う。リン酸化したオリゴヌクレオチドをエタ沈メイト（ニッポンジーン社製）を用い、エタノール沈殿にて回収する。
（３）fGH遺伝子の作製
回収したリン酸化されたオリゴヌクレオチドを、3又は4個ずつのＩ〜ＶＩの6つのグループに分け（図１．(A)参照）、アニーリングした。それぞれのグループのオリゴヌクレオチドをT4 DNAリガーゼにより連結し、6個の断片Ｉ〜ＶＩを合成する。
すなわち、断片Ｉを構成するオリゴヌクレオチドのうち5'末端に位置するオリゴヌクレオチドの場合は1.5μgを、その他のオリゴヌクレオチドの場合は1.0μgをそれぞれ80μlのライゲーションバッファーに溶かす。この溶液を90℃で５分間加熱した後、２時間かけて4℃まで徐冷し、100mM DTTと10mM ATP（ファルマシア社製）を10μlずつ加え、さらにT4 DNAリガーゼ（宝酒造社製）2.5ユニットを添加して4℃で16時間インキュベートする。その後、反応液を等容のフェノール-クロロホルムおよびクロロホルムで処理し、DNAをエタノール沈殿して回収する。同様のライゲーション反応により各断片ＩＩ〜ＶＩを合成し、回収する。
次に、このようにして合成した断片Ｉ〜ＶＩを3つの断片a（Ｉ＋ＩＩ）、b（ＩＩＩ＋ＩＶ）およびc（Ｖ＋ＶＩ）として連結する（図１．(B)参照）。すなわち、Ｉ〜ＶＩの各断片2μgずつを40μlのライゲーションバッファーに溶かし、これを37℃で30分間インキュベートした後、30分かけて4℃まで徐冷し、100mM DTTと10mM ATP（ファルマシア社製）を5μlずつ加え、さらにT4 DNAリガーゼ（宝酒造（株）社製）10ユニットを添加して4℃で16時間インキュベートする。その後、反応液を等容のフェノール-クロロホルムおよびクロロホルムで処理し、DNAをエタノール沈殿して回収する。
最後に、得られた断片a〜cをそれぞれ2μgずつを40μlのライゲーションバッファーに溶かし、これを37℃で30分間インキュベートした後、30分かけて4℃まで徐冷し、100mM DTTと10mM ATP（ファルマシア社製）を5μlずつ加え、さらにT4 DNAリガーゼ（宝酒造（株）社製）10ユニットを添加して4℃で16時間インキュベートする。その後、反応液を等容のフェノール-クロロホルムおよびクロロホルムで処理し、DNAをエタノール沈殿して回収する。そのDNAをアガロース電気泳動にかけ、最初に設計したDNA断片と同じ大きさのバンドをゲルから切り出し、fGH遺伝子を回収する。
（４）プラスミドDNA（pUC18）のHindIII/BamHI消化および脱リン酸化
プラスミドDNA（pUC18）10μg（10μl）に、10×K buffer 2μl、HindIII 10ユニット（1μl）、BamHI 10ユニット（1μl）および滅菌水を加えて20μlとしたエッペンドルフチューブを37℃で1時間インキュベートする。その後、反応液をアガロース電気泳動にかけ、目的のバンドをゲルから切り出して回収する。回収したDNAを100μlの100mM Tris-HCl（pH8.0）に溶解し、アルカリフォスファターゼ5ユニット（1μl）を加え、37℃で60分間インキュベーションした後、もう一度アルカリフォスファターゼ5ユニット（1μl）を加え、65℃で15分間インキュベートする。反応液をフェノール-クロロホルムおよびクロロホルム処理し、DNAをエタノール沈殿して集め、5μlの100mM Tris-HCl（pH7.6）、（５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有）に溶解する。
（５）fGH遺伝子のpUC18への挿入
上記（３）で得たfGH遺伝子を100ng（2μl）と上記（４）で得たpUC18（HindIII/BamHI）200ng（3μl）をエッペンドルフチューブに入れ、タカラライゲーションキットA液を20μl加えよく混合する。この混合液に、タカラライゲーションキットB液を5μl加え、混合した後、16℃で90分間反応させる。
（６）大腸菌（JM109）の形質転換
氷上で融解したコンピテントセルJM109（ニッポンジーン社製）100μlに上記（５）で得たライゲーション溶液10μl加え、おだやかに混合する。混合液を氷上で30分間インキュベートした後、さらに42℃で45秒間、そしてもう一度、氷上で3分間インキュベートしてDNAを細胞中に取り込ませる。この懸濁液に400μlの培地（Hi-competence Broth）を加え37℃で60分間振盪培養した後、1.5％LB寒天培地（50μg/mlアンピシリン、40mg/l X gal、23.38mg/l IPTG）にプレートする。得られた白いコロニーからプラスミドを調製し、その一部をHIndIII、BamHIで消化しインサートの確認をして目的のプラスミドDNA（fGH遺伝子）を保持しているコロニーをスクリーニングする。スクリーニングしたコロニーを100mlのLB培地（50μg/mlアンピシリン）で培養し、プラスミドDNAをSDS-アルカリ法により大量に調製する。
（７）fGH遺伝子の大量調製
上記（６）に従い大量調製したプラスミドDNA（fGH遺伝子）10μg（10μl）に、10×K buffer 2μl、HIndIII 12ユニット（1μl）、BamHI 12ユニット（1μl）および滅菌水を加えて20μlとしたエッペンドルフチューブを37℃で2時間インキュベートする。反応後、フェノール-クロロホルムおよびクロロホルム処理し、DNAをエタノール沈殿して集め、10μlの滅菌水に溶解する。その後、1％アガロースゲル電気泳動により分離し、目的のDNA断片を切り出したゲルから電気的に溶出する。溶出液はブタノール濃縮し、フェノール-クロロホルムおよびクロロホルム処理した後、DNAをエタノール沈殿にて回収する。
（８）アナキスティス・ニジュランス（Anacystis nidulans）のRuBisCOプロモーターおよびターミネーター領域の大量調製
アナキスティス・ニジュランスのRuBisCOプロモーターおよびターミネーター領域をそれぞれ含むプラスミド（pARup18、pARut13）を保持する大腸菌（Takeshima, Y., Sugiura, M., and Hagiwara, H., 1994, A novel expression vector for the Cyanobacterium, Synechococcus PC C6301, DNA Research 1, 181-189）をcircle growth培地100mlで培養し、プラスミドDNAをSDS-アルカリ法により大量に調製する。pARup18はEcoRI、HindIIIで、pARut18はEcoRI、BamHIでそれぞれ消化する。反応後、3％アガロースゲル電気泳動により目的のDNA断片を分離し、さらにそのバンドを切り出し、電気的に溶出する。溶出液はブタノール濃縮し、フェノール-クロロホルムおよびクロロホルム処理した後、DNAをエタノール沈殿にて回収する。
（９）fGH遺伝子のEcoRIサイトのメチル化
fGH遺伝子5μl（5μg）に、500mM Tris-HCl（pH8.0）10μl、100mM DTT 1μl、EcoRI methylase30ユニット（0.5μl）、3.2mM S-アデノシルメチオニン2μlおよび滅菌水を31.5μl加えたエッペンドルフチューブを37℃で1時間インキュベートし、フェノール-クロロホルムおよびクロロホルム処理した後、DNAをエタノール沈殿にて回収する。沈殿は5μlの100mM Tris-HCl（pH7.6）、（５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有）に溶解する。
（１０）fGHオペロンの作製（図2参照）
上記（９）に従い大量に調製したfGH遺伝子（EcoRIサイトのメチル化済み）1μg（2μl）ならびに上記（８）で調製したアナキスティス・ニジュランスのRuBisCOプロモーターおよびターミネーター領域それぞれ1μg（2μl）ずつをエッペンドルフチューブにいれ、タカラライゲーションキットA液を24μl加えよく混合する。この混合液に、タカラライゲーションキットB液を6μl加え、混合した後、16℃で90分間反応させる。反応後、フェノール-クロロホルムおよびクロロホルム処理した後、DNAをエタノール沈殿にて回収する。そこに滅菌水17μl、10×H buffer 2μlおよびEcoRI 1μl加え、37℃で1時間インキュベートする。
（１１）プラスミドDNA（pBAX18）のEcoRI消化および脱リン酸化
プラスミドDNA（pBAX18−寄託番号 FERM BP-4639）10μg（10μl）に、10×H buffer 2μl、EcoRI 12ユニット（1μl）および滅菌水を加えて20μlとしたエッペンドルフチューブを37℃で1時間インキュベートする。その後、反応液をアガロース電気泳動にかけ、目的のバンドをゲルから切り出し回収する。回収したDNAを100μlの100mM Tris-HCl（pH8.0）に溶解し、アルカリフォスファターゼ5ユニット（1μl）を加え、37℃で60分間インキュベーションした後、もう一度アルカリフォスファターゼ5ユニット（1μl）を加え、65℃で15分間インキュベートする。反応液をフェノール-クロロホルムおよびクロロホルム処理し、DNAをエタノール沈殿して集め、5μlの100mM Tris-HCl（pH7.6）および5mM MgCl2に溶解する。
（１２）fGHオペロンとpBAX18（EcoRI消化、脱リン酸化済）のライゲーション（図３参照）
上記（１０）で得た精製したfGHオペロンと上記（１１）で得たプラスミドDNA（pBAX18）をそれぞれ1μg（2μl）ずづエッペンドルフチューブにいれ、タカラライゲーションキットA液を24μl加えよく混合する。この混合液に、タカラライゲーションキットB液を6μl加え、混合した後、16℃で90分間反応させる。
（１３）大腸菌（JM109）の形質転換
氷上で融解したコンピテントセルJM109（ニッポンジーン社製）100μlに上記（１２）で得たライゲーション溶液10μlを加え、おだやかに混合する。混合液を氷上で30分間インキュベートした後、さらに42℃で45秒間、そしてもう一度氷上で3分間インキュベートして、DNAを細胞中に取り込ませる。この懸濁液に400μlのHi-competence Brothを加え37℃で60分間振盪培養した後、1.5％LB寒天培地（50μg/mlアンピシリン、40mg/l X gal、23.38mg/l IPTG）にプレートする。得られた白いコロニーからプラスミドを調製し、その一部をEcoRIで消化しインサートの確認をして目的の発現ベクターDNA（pBAX18fGH）を保持しているコロニーをスクリーニングする。スクリーニングしたコロニーを100mlのLB培地（50μg/mlアンピシリン）で培養し、発現ベクターDNAをSDS-アルカリ法により大量に調製する。
（１４）fGH遺伝子のラン藻（アナキスティス・ニジュランスPCC6301 old株−寄託番号FERM BP-6267;ATCC 27144）による発現
100mlのBG-11液体培地で約1週間培養したアナキスティス・ニジュランスPCC6301 oldを8000rpmで5分間遠心して集め、10mlの新鮮な液体培地に懸濁した（108〜109cells/ml）。この細胞懸濁液を1mlずつポリプロピレンチューブに分注し、それぞれのチューブに上記（１３）で調製した発現ベクターDNAを0.1〜10μgの濃度で加える。これらのチューブをそれぞれアルミホイルで被い、25℃で一晩培養した後、被っていたアルミホイルをはずし、光照射下（光源：白色蛍光灯；1000〜2000ルクス）でさらに6時間培養する。これらの細胞懸濁液から100〜500μl取り、BG-11培地（1mMチオ硫酸ナトリウム、5μg/mlアンピシリン、1.5％寒天）にプレートする。これらのプレートを光照射下（光源：白色蛍光灯；1000〜2000ルクス）で4〜10日間培養する。
このようにして得られたコロニーを2mlのBG-11液体培地（10μg/mlアンピシリン）に移し、光照射下（光源：白色蛍光灯；1000〜2000ルクス）で10日間培養する。次に、この培養液を100mlのBG-11液体培地（50μg/mlアンピシリン）に移し、光照射下（光源：白色蛍光灯；1000〜2000ルクス）で10日間培養する。細胞を10,000rpm、4℃で10分間遠心して集め、10mM PBSに再懸濁し、もう一度遠心することによって洗浄する。洗浄後、細胞は使用時まで-20℃にて保存する。
（１５）PT-PCR法によるfGH遺伝子の発現確認
100ml BG-11培地で培養したアナキスティス・ニジュランス形質転換体および非形質転換体を遠心して回収し、それぞれ90mgずつを1mlのisogen（ニッポンジーン社製）に懸濁し、室温で10分間インキュベートする。それに0.2mlのクロロホルムを加え、15秒間激しく振盪した後、5分間室温でインキュベートする。その後、15,000rpm、4℃で15分間遠心し、水層を新しいチューブに移し、そこに0.5mlのイソプロパノールを加え、10分間室温でインキュベートする。その後、15,000rpm、4℃で15分間遠心し、上清を捨て、70％エタノールで洗ったら軽く乾かして、RNaseフリーの水に溶かし、これをトータルRNA画分とした。次に、このRNA画分とDefinitive RT-PCR KIT（Biotech International社製）を用いてRT-PCRを行う。PCR産物をアガロースゲル電気泳動した結果、予想された位置（約600bp）に形質転換体のバンドが確認できた。これにより、形質転換されたアナキスティス・ニジュランスにおいて導入した遺伝子が正確に発現していることが分かる。
（１６）SDS-PAGE（SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動）による本発明のfGHポリペプチドの発現確認
100ml BG-11培地で培養したアナキスティス・ニジュランス形質転換体および非形質転換体を遠心して回収し、これをLaemmliの方法に従いSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。泳動後クマシーブリリアントブルーにて染色し、予想された分子量約24,000の位置にポリペプチドのバンドを検出した。このバンドは非形質転換体をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動した場合には存在しなかった。さらにこのバンドをPVDF膜に転写し、アプライドバイオシステムズ社の477A/120A型気相シークエンサーによりアミノ酸配列を決定したところ、このバンドのポリペプチドのアミノ酸配列は前記の本発明のfGHポリペプチドのアミノ酸配列と完全に一致した。これにより、pBAX18fGHを保持するラン藻アナキスティス・ニジュランスは本発明のfGHポリペプチドを発現していることが分かる。
以上に述べた如くして製造される本発明のfGHポリペプチドは、後記の試験例に示すとおり、各種の魚類、殊に稚魚の生育促進およびへい死率の低減に顕著な効果を有しており、汎用の魚類成長ホルモン剤として、養殖魚（例えば、鯉、鮒、鰻、鱒、テラピア、などの淡水魚；鯛、ハマチ、マグロ、ヒラメ、カレイなどの海水魚）や観賞魚（例えば、金魚、グッピー、エンゼルフィッシュ、アーリーシクリッドなど）の生育促進および／または稚魚のへい死率の低減のために広く利用することができる。
投与すべき本発明のfGHポリペプチドは、単離、精製された形態のものであってもよいが、必ずしもその必要はなく、粗製の状態のものであってもよく、或いは培養した上記形質転換体のfGHポリペプチドを含む乾燥菌体そのものを用いることもできる。
使用に際して本発明のfGHポリペプチドは、例えば、これを含むラン藻を通常の魚類用の餌と混合し散布方式で魚類に摂取させることができ、また、通常の魚類用の餌と併行して魚類に与えることもできる。
試験例
以下、試験例により本発明のfGHポリペプチドの魚類生育促進および稚魚のへい死率低減効果についてさらに具体的に説明する。
試験例１：鯉の生育試験その１
孵化後２〜３ヶ月齢の鯉を水槽（60cm×30cm×30cm）に15匹ずつ入れ、通常は市販の鯉の餌を100mg/匹/回づつ１日３回与え、週に１回本発明のfGHポリペプチド（凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体1mg/匹、本発明のfGHポリペプチド1μg/匹相当）を混ぜた餌を与えた（fGHポリペプチド投与区）。また、対照区の鯉には市販の鯉の餌を100mg/匹/回づつ１日３回与え、週に１回凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old非形質転換体1mg/匹を混ぜた餌を与えた。飼育は24〜26℃の間で行った。第１回目の投与後２５日目の体重増加量（15匹の平均）の測定結果を下記表１に示す。また、図４に飼育期間中の体重増加割合（％）をプロットしたグラフを示す。
試験例２：鯉の生育試験その２
孵化後４〜５ヶ月齢の鯉を水槽（90cm×40cm×40cm）に５匹ずつ入れ、通常は市販の鯉の餌を0.5g/匹/回、１日３回与え、週に１回本発明のfGHポリペプチド（凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体１ｍｇ／匹、本発明のfGHポリペプチド1μg/匹相当）を混ぜた餌を与えた（fGHポリペプチド投与区）。また、tunaGH投与区の鯉には市販の鯉の餌を0.5g/匹/回づつ１日３回与え、週に１回凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old非形質転換体1mg/匹と市販のマグロの成長ホルモン（tunaGH；マルハコーポレーション製）１μg/匹を混ぜた餌を与えた。さらに、対照区の鯉には市販の鯉の餌を0.5g/匹/回づつ１日３回与え、週に１回凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old非形質転換体1mg/匹を混ぜた餌を与えた。飼育は24〜26℃の間で行った。第１回目の投与後４９日目の体重増加量（５匹の平均）の測定結果を下記表２に示す。また、図５に飼育期間中の体重増加割合（％）をプロットしたグラフを示す。
試験例３：グッピーの生育試験その１
孵化後約10〜20日のグッピーを水槽（60cm×30cm×30cm）に10匹ずつを入れ、本発明のfGHポリペプチド（凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体3mg/匹、本発明のfGHポリペプチド３μg/匹/日相当）を混ぜたグッピーの餌（後記餌の調製例２で調製したもの）を100mg/10匹/日与えた。対照区のグッピーの飼育は、アナキスティス・ニジュランスPCC6301old非形質転換体の代わりに非形質転換体を使用して行った。グッピーの飼育は２５〜２７℃の間で行った。第１回目の投与後３３日目の体長の度数分布表を下記表３に示す。
試験例４：グッピーの生育試験その２
孵化後約10〜20日のグッピーを水槽（60cm×30cm×30cm）に10匹ずつを入れ、本発明のfGHポリペプチド（凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体1mg/匹、本発明のfGHポリペプチド１μg/匹/日相当）を混ぜたグッピーの餌を100mg/10匹/日与えた。fGHポリペプチド入りの餌はグッピーフード（キョーリン(株)製）０．９ｇに凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体０．１ｇおよび水を加えよく練り、凍結乾燥後、乳鉢にて細かく砕くことによって作製した。対照区のグッピーの飼育は、アナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体の代わりに非形質転換体を使用して行った。作製した餌は１００ｍｇずつ分注し使用時まで−２０℃で保存した。グッピーの飼育は25〜27℃の間で行った。第１回目の投与後３５日目の体長の度数分布表を下記表４に示す。
試験例５：アーリーシクリッドの生育試験
孵化後約４〜５ケ月のアーリーシクリッド（Aulonocara）を水槽（60cm×30cm×30cm）に６匹ずつを入れ、本発明のfGHポリペプチド（凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体３mg/匹、本発明のfGHポリペプチド３μg/匹/日相当）を混ぜたディスカスの餌（テトラベルケ社製）を２００ｍｇ／匹／日与えた。対照区のアーリーシクリッドの飼育は、アナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体の代わりに非形質転換体を使用して行った。アーリーシクリッドの飼育は２５〜２７℃の間で行った。第１回目の投与後４２日目の体重増加量（６匹の平均）の測定結果を下記表５に示す。また、図６に飼育期間中の体重増加割合（％）をプロットしたグラフを示す。
試験例６：エンゼルフィッシュの生育試験
孵化後約３〜４ケ月のエンゼルフィッシュ（Pterophyllum）を水槽（60cm×30cm×30cm）に１５匹ずつを入れ、本発明のfGHポリペプチド（凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体１mg/匹、本発明のfGHポリペプチド１μg/匹/日相当）を混ぜたディスカスの餌（テトラベルケ社製）を１００ｍｇ／匹／日与えた。対照区のアーリーシクリッドの飼育は、アナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体の代わりに非形質転換体を使用して行った。アーリーシクリッドの飼育は２５〜２７℃の間で行った。第１回目の投与後７１日目の体重増加量（１５匹の平均）の測定結果を下記表６に示す。また、図７に飼育期間中の体重増加割合（％）をプロットしたグラフを示す。
試験例７：グッピーの生存試験その１
孵化後約１０日のグッピーを水槽（60cm×30cm×30cm）に４３匹ずつを入れ、本発明のfGHポリペプチド（凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体１mg/匹、本発明のfGHポリペプチド１μg/匹/日相当）を混ぜた市販のグッピーの餌を１０ｍｇ／匹／日与えた。対照区のグッピーの飼育は、アナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体の代わりに非形質転換体を使用して行った。グッピーの飼育は２５〜２７℃の間で行った。第１回目の投与から３５日目までの生存率を下記表７に示す。
試験例８：グッピーの生存試験その２
孵化後約１０日のグッピーを水槽（60cm×30cm×30cm）に２０匹ずつを入れ、本発明のfGHポリペプチド（凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体１mg/匹、本発明のfGHポリペプチド１μg/匹/日相当）を混ぜた市販のグッピーの餌を１０ｍｇ／匹／日与えた。対照区のグッピーの飼育は、アナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体の代わりに非形質転換体を使用して行った。グッピーの飼育は２５〜２７℃の間で行った。第１回目の投与から２３日目までの生存率を下記表８に示す。
餌の調製例１
fGHポリペプチドを発現しているラン藻（凍結乾燥体）１gと市販の餌（スイミー、マルキュー(株)社製）７gおよびグルテン（マルキュー（株）社製）２gを混ぜ合わせ、さらに水を加えてよく混合する。これを凍結乾燥機にて乾燥させる。乾燥したら乳鉢にて細かく砕き、チューブなどに分注して使用時まで−２０℃で保存する。
餌の調製例２
fGHポリペプチドを発現しているラン藻（凍結乾燥体）３ｇと市販の餌（熱帯魚飼料ひかりクレストグッピー、キョーリン(株)社製）７ｇとを混ぜ合わせ、さらに水を加えてよく混合する。これを凍結乾燥機にて乾燥させる。乾燥したら乳鉢にて細かく砕き、チューブなどに分注して使用時まで−２０℃で保存する。
餌の調製例３
fGHポリペプチドを発現しているラン藻（凍結乾燥体）０．１gと市販の餌（スイミー、マルキュー(株)社製）７．７gおよびグルテン（マルキュー(株)社製）２．２gを混ぜ合わせ、さらに水を加えてよく混合する。これを凍結乾燥機にて乾燥させる。乾燥したら乳鉢にて細かく砕き、チューブなどに分注して使用時まで−２０℃で保存する。
餌の調製例４
fGHポリペプチドを発現しているラン藻（凍結乾燥体）０．３gと市販の餌（熱帯魚飼料ひかりクレストグッピー、キョーリン(株)社製）２．７gとを混ぜ合わせ、さらに水を加えてよく混合する。これを凍結乾燥機にて乾燥させる。乾燥したら乳鉢にて細かく砕き、チューブなどに分注して使用時まで−２０℃で保存する。
餌の調製例５
fGHポリペプチド入りの餌はディスカスの餌（テトラベルケ社製）１９．７ｇに凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体０．３ｇおよび水を加えよく練り、凍結乾燥後、乳鉢にて細かく砕くことによって作製した。作製した餌はチューブなどに分注し使用時まで−２０℃で保存した。
餌の調製例６
fGHポリペプチド入りの餌はディスカスの餌（テトラベルケ社製）９．９ｇに凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体０．１ｇおよび水を加えよく練り、凍結乾燥後、乳鉢にて細かく砕くことによって作製した。作製した餌はチューブなどに分注し使用時まで−２０℃で保存した。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：１８７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
配列番号：２
配列の長さ：５６１
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列：
本発明は新規なポリペプチドに関し、さらに詳しくは、魚類成長ホルモン様作用を示すポリペプチド、それをコードするDNA、該DNAを含むベクター、該ベクターで形質転換された微生物、該微生物を利用した上記ペプチドの製造方法、ならびに該ペプチドの魚類の生育促進および稚魚のへい死率の低減における利用に関する。
背景技術
哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類に共通して存在する成長ホルモンは脳下垂体から分泌されるポリペプチドであり、これまでに様々な研究グループによって単離され、それぞれ構造決定がなされ、報告されている。これらの成長ホルモンは遺伝子工学の進歩に伴って微生物内で大量に生産できるようになり、多くの家畜動物において利用されようとしている。しかし、魚類においては研究レベルでは利用されているものの、実用化はされていないというのが現状である。
魚類成長ホルモンは魚類の生育促進を担っていることから、養殖魚の飼育用餌料として利用できれば出荷までの期間が短くなり、コスト削減に役立つと考えられる。しかしながら、魚類から単離された天然の成長ホルモンは、ある程度の種特異性があり、例えば、試薬として市販されているマグロの成長ホルモンを他の魚類に経口投与した場合、若干の効果は期待することができるが、その効果は十分とは言えない。
そこで、本発明者らは多種の魚類に共通して使用することができ、しかも魚類に対して優れた生育促進効果を発揮する汎用性のある魚類成長ホルモン様作用を持つポリペプチドを開発すべく研究を行った。
発明の開示
その結果、今回、下記のアミノ酸配列（配列表の配列番号１）
かくして、本発明は、上記アミノ酸配列、又は上記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり且つ魚類成長ホルモン作用を示すポリペプチドを提供するものである。
本発明のポリペプチドは、それ自体既知の固相法又は液相法によって化学的に合成することができ、或いは本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを用いる遺伝子工学の手法によって生化学的に合成することもできる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のfGH遺伝子の構築の過程を示す工程図である。
図２は、fGHオペロンの作製の過程を示す工程図である。
図３は、大腸菌−ラン藻シャトルベクターpBAX18のマルチクローニングサイトへのfGHオペロンの組み込みの過程を示す工程図である。
図４は、試験例１におけるfGHポリペプチドの鯉稚魚に対する生育促進効果を示すグラフである。
図５は、試験例２におけるfGHポリペプチドおよびtunaGHの鯉稚魚に対する生育促進効果を示すグラフである。
図６は、試験例５におけるfGHポリペプチドのアーリーシクリッド稚魚に対する生育促進効果を示すグラフである。
図７は、試験例６におけるfGHポリペプチドのエンゼルフィッシュ稚魚に対する生育促進効果を示すグラフである。
発明を実施するための形態
以下、本発明のポリペプチドを遺伝子工学の手法によって生化学的に合成する場合について、実施例により具体的に説明する。
（１）オリゴヌクレオチドの合成
宿主として使用するラン藻のコドン使用頻度を考慮して、前記アミノ酸配列で示されるポリペプチド（以下、このポリペプチドを“fGHポリペプチド”という）をコードするDNA断片を設計する（以下、このDNAを“fGH遺伝子”という）。
設計したDNA断片の塩基配列（配列表の配列番号２）は次の通りである。
（２）合成オリゴヌクレオチドのキナーゼによるリン酸化
合成した各オリゴヌクレオチド（No.1とNo.11は除く）3μgをTakara kination kit（オリゴヌクレオチド3μl、10×kination buffer 2μl、100mM ATP（ファルマシア社製）2μl、ポリヌクレオチドキナーゼ１μl（10ユニット）および滅菌水12μl）を用いて、37℃で90分間インキュベートする。反応後、90℃で5分間熱処理して酵素を失活させ、フェノール-クロロホルムおよびクロロホルム処理を行う。リン酸化したオリゴヌクレオチドをエタ沈メイト（ニッポンジーン社製）を用い、エタノール沈殿にて回収する。
（３）fGH遺伝子の作製
回収したリン酸化されたオリゴヌクレオチドを、3又は4個ずつのＩ〜ＶＩの6つのグループに分け（図１．(A)参照）、アニーリングした。それぞれのグループのオリゴヌクレオチドをT4 DNAリガーゼにより連結し、6個の断片Ｉ〜ＶＩを合成する。
すなわち、断片Ｉを構成するオリゴヌクレオチドのうち5'末端に位置するオリゴヌクレオチドの場合は1.5μgを、その他のオリゴヌクレオチドの場合は1.0μgをそれぞれ80μlのライゲーションバッファーに溶かす。この溶液を90℃で５分間加熱した後、２時間かけて4℃まで徐冷し、100mM DTTと10mM ATP（ファルマシア社製）を10μlずつ加え、さらにT4 DNAリガーゼ（宝酒造社製）2.5ユニットを添加して4℃で16時間インキュベートする。その後、反応液を等容のフェノール-クロロホルムおよびクロロホルムで処理し、DNAをエタノール沈殿して回収する。同様のライゲーション反応により各断片ＩＩ〜ＶＩを合成し、回収する。
次に、このようにして合成した断片Ｉ〜ＶＩを3つの断片a（Ｉ＋ＩＩ）、b（ＩＩＩ＋ＩＶ）およびc（Ｖ＋ＶＩ）として連結する（図１．(B)参照）。すなわち、Ｉ〜ＶＩの各断片2μgずつを40μlのライゲーションバッファーに溶かし、これを37℃で30分間インキュベートした後、30分かけて4℃まで徐冷し、100mM DTTと10mM ATP（ファルマシア社製）を5μlずつ加え、さらにT4 DNAリガーゼ（宝酒造（株）社製）10ユニットを添加して4℃で16時間インキュベートする。その後、反応液を等容のフェノール-クロロホルムおよびクロロホルムで処理し、DNAをエタノール沈殿して回収する。
最後に、得られた断片a〜cをそれぞれ2μgずつを40μlのライゲーションバッファーに溶かし、これを37℃で30分間インキュベートした後、30分かけて4℃まで徐冷し、100mM DTTと10mM ATP（ファルマシア社製）を5μlずつ加え、さらにT4 DNAリガーゼ（宝酒造（株）社製）10ユニットを添加して4℃で16時間インキュベートする。その後、反応液を等容のフェノール-クロロホルムおよびクロロホルムで処理し、DNAをエタノール沈殿して回収する。そのDNAをアガロース電気泳動にかけ、最初に設計したDNA断片と同じ大きさのバンドをゲルから切り出し、fGH遺伝子を回収する。
（４）プラスミドDNA（pUC18）のHindIII/BamHI消化および脱リン酸化
プラスミドDNA（pUC18）10μg（10μl）に、10×K buffer 2μl、HindIII 10ユニット（1μl）、BamHI 10ユニット（1μl）および滅菌水を加えて20μlとしたエッペンドルフチューブを37℃で1時間インキュベートする。その後、反応液をアガロース電気泳動にかけ、目的のバンドをゲルから切り出して回収する。回収したDNAを100μlの100mM Tris-HCl（pH8.0）に溶解し、アルカリフォスファターゼ5ユニット（1μl）を加え、37℃で60分間インキュベーションした後、もう一度アルカリフォスファターゼ5ユニット（1μl）を加え、65℃で15分間インキュベートする。反応液をフェノール-クロロホルムおよびクロロホルム処理し、DNAをエタノール沈殿して集め、5μlの100mM Tris-HCl（pH7.6）、（５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有）に溶解する。
（５）fGH遺伝子のpUC18への挿入
上記（３）で得たfGH遺伝子を100ng（2μl）と上記（４）で得たpUC18（HindIII/BamHI）200ng（3μl）をエッペンドルフチューブに入れ、タカラライゲーションキットA液を20μl加えよく混合する。この混合液に、タカラライゲーションキットB液を5μl加え、混合した後、16℃で90分間反応させる。
（６）大腸菌（JM109）の形質転換
氷上で融解したコンピテントセルJM109（ニッポンジーン社製）100μlに上記（５）で得たライゲーション溶液10μl加え、おだやかに混合する。混合液を氷上で30分間インキュベートした後、さらに42℃で45秒間、そしてもう一度、氷上で3分間インキュベートしてDNAを細胞中に取り込ませる。この懸濁液に400μlの培地（Hi-competence Broth）を加え37℃で60分間振盪培養した後、1.5％LB寒天培地（50μg/mlアンピシリン、40mg/l X gal、23.38mg/l IPTG）にプレートする。得られた白いコロニーからプラスミドを調製し、その一部をHIndIII、BamHIで消化しインサートの確認をして目的のプラスミドDNA（fGH遺伝子）を保持しているコロニーをスクリーニングする。スクリーニングしたコロニーを100mlのLB培地（50μg/mlアンピシリン）で培養し、プラスミドDNAをSDS-アルカリ法により大量に調製する。
（７）fGH遺伝子の大量調製
上記（６）に従い大量調製したプラスミドDNA（fGH遺伝子）10μg（10μl）に、10×K buffer 2μl、HIndIII 12ユニット（1μl）、BamHI 12ユニット（1μl）および滅菌水を加えて20μlとしたエッペンドルフチューブを37℃で2時間インキュベートする。反応後、フェノール-クロロホルムおよびクロロホルム処理し、DNAをエタノール沈殿して集め、10μlの滅菌水に溶解する。その後、1％アガロースゲル電気泳動により分離し、目的のDNA断片を切り出したゲルから電気的に溶出する。溶出液はブタノール濃縮し、フェノール-クロロホルムおよびクロロホルム処理した後、DNAをエタノール沈殿にて回収する。
（８）アナキスティス・ニジュランス（Anacystis nidulans）のRuBisCOプロモーターおよびターミネーター領域の大量調製
アナキスティス・ニジュランスのRuBisCOプロモーターおよびターミネーター領域をそれぞれ含むプラスミド（pARup18、pARut13）を保持する大腸菌（Takeshima, Y., Sugiura, M., and Hagiwara, H., 1994, A novel expression vector for the Cyanobacterium, Synechococcus PC C6301, DNA Research 1, 181-189）をcircle growth培地100mlで培養し、プラスミドDNAをSDS-アルカリ法により大量に調製する。pARup18はEcoRI、HindIIIで、pARut18はEcoRI、BamHIでそれぞれ消化する。反応後、3％アガロースゲル電気泳動により目的のDNA断片を分離し、さらにそのバンドを切り出し、電気的に溶出する。溶出液はブタノール濃縮し、フェノール-クロロホルムおよびクロロホルム処理した後、DNAをエタノール沈殿にて回収する。
（９）fGH遺伝子のEcoRIサイトのメチル化
fGH遺伝子5μl（5μg）に、500mM Tris-HCl（pH8.0）10μl、100mM DTT 1μl、EcoRI methylase30ユニット（0.5μl）、3.2mM S-アデノシルメチオニン2μlおよび滅菌水を31.5μl加えたエッペンドルフチューブを37℃で1時間インキュベートし、フェノール-クロロホルムおよびクロロホルム処理した後、DNAをエタノール沈殿にて回収する。沈殿は5μlの100mM Tris-HCl（pH7.6）、（５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有）に溶解する。
（１０）fGHオペロンの作製（図2参照）
上記（９）に従い大量に調製したfGH遺伝子（EcoRIサイトのメチル化済み）1μg（2μl）ならびに上記（８）で調製したアナキスティス・ニジュランスのRuBisCOプロモーターおよびターミネーター領域それぞれ1μg（2μl）ずつをエッペンドルフチューブにいれ、タカラライゲーションキットA液を24μl加えよく混合する。この混合液に、タカラライゲーションキットB液を6μl加え、混合した後、16℃で90分間反応させる。反応後、フェノール-クロロホルムおよびクロロホルム処理した後、DNAをエタノール沈殿にて回収する。そこに滅菌水17μl、10×H buffer 2μlおよびEcoRI 1μl加え、37℃で1時間インキュベートする。
（１１）プラスミドDNA（pBAX18）のEcoRI消化および脱リン酸化
プラスミドDNA（pBAX18−寄託番号 FERM BP-4639）10μg（10μl）に、10×H buffer 2μl、EcoRI 12ユニット（1μl）および滅菌水を加えて20μlとしたエッペンドルフチューブを37℃で1時間インキュベートする。その後、反応液をアガロース電気泳動にかけ、目的のバンドをゲルから切り出し回収する。回収したDNAを100μlの100mM Tris-HCl（pH8.0）に溶解し、アルカリフォスファターゼ5ユニット（1μl）を加え、37℃で60分間インキュベーションした後、もう一度アルカリフォスファターゼ5ユニット（1μl）を加え、65℃で15分間インキュベートする。反応液をフェノール-クロロホルムおよびクロロホルム処理し、DNAをエタノール沈殿して集め、5μlの100mM Tris-HCl（pH7.6）および5mM MgCl2に溶解する。
（１２）fGHオペロンとpBAX18（EcoRI消化、脱リン酸化済）のライゲーション（図３参照）
上記（１０）で得た精製したfGHオペロンと上記（１１）で得たプラスミドDNA（pBAX18）をそれぞれ1μg（2μl）ずづエッペンドルフチューブにいれ、タカラライゲーションキットA液を24μl加えよく混合する。この混合液に、タカラライゲーションキットB液を6μl加え、混合した後、16℃で90分間反応させる。
（１３）大腸菌（JM109）の形質転換
氷上で融解したコンピテントセルJM109（ニッポンジーン社製）100μlに上記（１２）で得たライゲーション溶液10μlを加え、おだやかに混合する。混合液を氷上で30分間インキュベートした後、さらに42℃で45秒間、そしてもう一度氷上で3分間インキュベートして、DNAを細胞中に取り込ませる。この懸濁液に400μlのHi-competence Brothを加え37℃で60分間振盪培養した後、1.5％LB寒天培地（50μg/mlアンピシリン、40mg/l X gal、23.38mg/l IPTG）にプレートする。得られた白いコロニーからプラスミドを調製し、その一部をEcoRIで消化しインサートの確認をして目的の発現ベクターDNA（pBAX18fGH）を保持しているコロニーをスクリーニングする。スクリーニングしたコロニーを100mlのLB培地（50μg/mlアンピシリン）で培養し、発現ベクターDNAをSDS-アルカリ法により大量に調製する。
（１４）fGH遺伝子のラン藻（アナキスティス・ニジュランスPCC6301 old株−寄託番号FERM BP-6267;ATCC 27144）による発現
100mlのBG-11液体培地で約1週間培養したアナキスティス・ニジュランスPCC6301 oldを8000rpmで5分間遠心して集め、10mlの新鮮な液体培地に懸濁した（108〜109cells/ml）。この細胞懸濁液を1mlずつポリプロピレンチューブに分注し、それぞれのチューブに上記（１３）で調製した発現ベクターDNAを0.1〜10μgの濃度で加える。これらのチューブをそれぞれアルミホイルで被い、25℃で一晩培養した後、被っていたアルミホイルをはずし、光照射下（光源：白色蛍光灯；1000〜2000ルクス）でさらに6時間培養する。これらの細胞懸濁液から100〜500μl取り、BG-11培地（1mMチオ硫酸ナトリウム、5μg/mlアンピシリン、1.5％寒天）にプレートする。これらのプレートを光照射下（光源：白色蛍光灯；1000〜2000ルクス）で4〜10日間培養する。
このようにして得られたコロニーを2mlのBG-11液体培地（10μg/mlアンピシリン）に移し、光照射下（光源：白色蛍光灯；1000〜2000ルクス）で10日間培養する。次に、この培養液を100mlのBG-11液体培地（50μg/mlアンピシリン）に移し、光照射下（光源：白色蛍光灯；1000〜2000ルクス）で10日間培養する。細胞を10,000rpm、4℃で10分間遠心して集め、10mM PBSに再懸濁し、もう一度遠心することによって洗浄する。洗浄後、細胞は使用時まで-20℃にて保存する。
（１５）PT-PCR法によるfGH遺伝子の発現確認
100ml BG-11培地で培養したアナキスティス・ニジュランス形質転換体および非形質転換体を遠心して回収し、それぞれ90mgずつを1mlのisogen（ニッポンジーン社製）に懸濁し、室温で10分間インキュベートする。それに0.2mlのクロロホルムを加え、15秒間激しく振盪した後、5分間室温でインキュベートする。その後、15,000rpm、4℃で15分間遠心し、水層を新しいチューブに移し、そこに0.5mlのイソプロパノールを加え、10分間室温でインキュベートする。その後、15,000rpm、4℃で15分間遠心し、上清を捨て、70％エタノールで洗ったら軽く乾かして、RNaseフリーの水に溶かし、これをトータルRNA画分とした。次に、このRNA画分とDefinitive RT-PCR KIT（Biotech International社製）を用いてRT-PCRを行う。PCR産物をアガロースゲル電気泳動した結果、予想された位置（約600bp）に形質転換体のバンドが確認できた。これにより、形質転換されたアナキスティス・ニジュランスにおいて導入した遺伝子が正確に発現していることが分かる。
（１６）SDS-PAGE（SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動）による本発明のfGHポリペプチドの発現確認
100ml BG-11培地で培養したアナキスティス・ニジュランス形質転換体および非形質転換体を遠心して回収し、これをLaemmliの方法に従いSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。泳動後クマシーブリリアントブルーにて染色し、予想された分子量約24,000の位置にポリペプチドのバンドを検出した。このバンドは非形質転換体をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動した場合には存在しなかった。さらにこのバンドをPVDF膜に転写し、アプライドバイオシステムズ社の477A/120A型気相シークエンサーによりアミノ酸配列を決定したところ、このバンドのポリペプチドのアミノ酸配列は前記の本発明のfGHポリペプチドのアミノ酸配列と完全に一致した。これにより、pBAX18fGHを保持するラン藻アナキスティス・ニジュランスは本発明のfGHポリペプチドを発現していることが分かる。
以上に述べた如くして製造される本発明のfGHポリペプチドは、後記の試験例に示すとおり、各種の魚類、殊に稚魚の生育促進およびへい死率の低減に顕著な効果を有しており、汎用の魚類成長ホルモン剤として、養殖魚（例えば、鯉、鮒、鰻、鱒、テラピア、などの淡水魚；鯛、ハマチ、マグロ、ヒラメ、カレイなどの海水魚）や観賞魚（例えば、金魚、グッピー、エンゼルフィッシュ、アーリーシクリッドなど）の生育促進および／または稚魚のへい死率の低減のために広く利用することができる。
投与すべき本発明のfGHポリペプチドは、単離、精製された形態のものであってもよいが、必ずしもその必要はなく、粗製の状態のものであってもよく、或いは培養した上記形質転換体のfGHポリペプチドを含む乾燥菌体そのものを用いることもできる。
使用に際して本発明のfGHポリペプチドは、例えば、これを含むラン藻を通常の魚類用の餌と混合し散布方式で魚類に摂取させることができ、また、通常の魚類用の餌と併行して魚類に与えることもできる。
試験例
以下、試験例により本発明のfGHポリペプチドの魚類生育促進および稚魚のへい死率低減効果についてさらに具体的に説明する。
試験例１：鯉の生育試験その１
孵化後２〜３ヶ月齢の鯉を水槽（60cm×30cm×30cm）に15匹ずつ入れ、通常は市販の鯉の餌を100mg/匹/回づつ１日３回与え、週に１回本発明のfGHポリペプチド（凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体1mg/匹、本発明のfGHポリペプチド1μg/匹相当）を混ぜた餌を与えた（fGHポリペプチド投与区）。また、対照区の鯉には市販の鯉の餌を100mg/匹/回づつ１日３回与え、週に１回凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old非形質転換体1mg/匹を混ぜた餌を与えた。飼育は24〜26℃の間で行った。第１回目の投与後２５日目の体重増加量（15匹の平均）の測定結果を下記表１に示す。また、図４に飼育期間中の体重増加割合（％）をプロットしたグラフを示す。
孵化後４〜５ヶ月齢の鯉を水槽（90cm×40cm×40cm）に５匹ずつ入れ、通常は市販の鯉の餌を0.5g/匹/回、１日３回与え、週に１回本発明のfGHポリペプチド（凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体１ｍｇ／匹、本発明のfGHポリペプチド1μg/匹相当）を混ぜた餌を与えた（fGHポリペプチド投与区）。また、tunaGH投与区の鯉には市販の鯉の餌を0.5g/匹/回づつ１日３回与え、週に１回凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old非形質転換体1mg/匹と市販のマグロの成長ホルモン（tunaGH；マルハコーポレーション製）１μg/匹を混ぜた餌を与えた。さらに、対照区の鯉には市販の鯉の餌を0.5g/匹/回づつ１日３回与え、週に１回凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old非形質転換体1mg/匹を混ぜた餌を与えた。飼育は24〜26℃の間で行った。第１回目の投与後４９日目の体重増加量（５匹の平均）の測定結果を下記表２に示す。また、図５に飼育期間中の体重増加割合（％）をプロットしたグラフを示す。
孵化後約10〜20日のグッピーを水槽（60cm×30cm×30cm）に10匹ずつを入れ、本発明のfGHポリペプチド（凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体3mg/匹、本発明のfGHポリペプチド３μg/匹/日相当）を混ぜたグッピーの餌（後記餌の調製例２で調製したもの）を100mg/10匹/日与えた。対照区のグッピーの飼育は、アナキスティス・ニジュランスPCC6301old非形質転換体の代わりに非形質転換体を使用して行った。グッピーの飼育は２５〜２７℃の間で行った。第１回目の投与後３３日目の体長の度数分布表を下記表３に示す。
孵化後約10〜20日のグッピーを水槽（60cm×30cm×30cm）に10匹ずつを入れ、本発明のfGHポリペプチド（凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体1mg/匹、本発明のfGHポリペプチド１μg/匹/日相当）を混ぜたグッピーの餌を100mg/10匹/日与えた。fGHポリペプチド入りの餌はグッピーフード（キョーリン(株)製）０．９ｇに凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体０．１ｇおよび水を加えよく練り、凍結乾燥後、乳鉢にて細かく砕くことによって作製した。対照区のグッピーの飼育は、アナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体の代わりに非形質転換体を使用して行った。作製した餌は１００ｍｇずつ分注し使用時まで−２０℃で保存した。グッピーの飼育は25〜27℃の間で行った。第１回目の投与後３５日目の体長の度数分布表を下記表４に示す。
孵化後約４〜５ケ月のアーリーシクリッド（Aulonocara）を水槽（60cm×30cm×30cm）に６匹ずつを入れ、本発明のfGHポリペプチド（凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体３mg/匹、本発明のfGHポリペプチド３μg/匹/日相当）を混ぜたディスカスの餌（テトラベルケ社製）を２００ｍｇ／匹／日与えた。対照区のアーリーシクリッドの飼育は、アナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体の代わりに非形質転換体を使用して行った。アーリーシクリッドの飼育は２５〜２７℃の間で行った。第１回目の投与後４２日目の体重増加量（６匹の平均）の測定結果を下記表５に示す。また、図６に飼育期間中の体重増加割合（％）をプロットしたグラフを示す。
孵化後約３〜４ケ月のエンゼルフィッシュ（Pterophyllum）を水槽（60cm×30cm×30cm）に１５匹ずつを入れ、本発明のfGHポリペプチド（凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体１mg/匹、本発明のfGHポリペプチド１μg/匹/日相当）を混ぜたディスカスの餌（テトラベルケ社製）を１００ｍｇ／匹／日与えた。対照区のアーリーシクリッドの飼育は、アナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体の代わりに非形質転換体を使用して行った。アーリーシクリッドの飼育は２５〜２７℃の間で行った。第１回目の投与後７１日目の体重増加量（１５匹の平均）の測定結果を下記表６に示す。また、図７に飼育期間中の体重増加割合（％）をプロットしたグラフを示す。
孵化後約１０日のグッピーを水槽（60cm×30cm×30cm）に４３匹ずつを入れ、本発明のfGHポリペプチド（凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体１mg/匹、本発明のfGHポリペプチド１μg/匹/日相当）を混ぜた市販のグッピーの餌を１０ｍｇ／匹／日与えた。対照区のグッピーの飼育は、アナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体の代わりに非形質転換体を使用して行った。グッピーの飼育は２５〜２７℃の間で行った。第１回目の投与から３５日目までの生存率を下記表７に示す。
孵化後約１０日のグッピーを水槽（60cm×30cm×30cm）に２０匹ずつを入れ、本発明のfGHポリペプチド（凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体１mg/匹、本発明のfGHポリペプチド１μg/匹/日相当）を混ぜた市販のグッピーの餌を１０ｍｇ／匹／日与えた。対照区のグッピーの飼育は、アナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体の代わりに非形質転換体を使用して行った。グッピーの飼育は２５〜２７℃の間で行った。第１回目の投与から２３日目までの生存率を下記表８に示す。
fGHポリペプチドを発現しているラン藻（凍結乾燥体）１gと市販の餌（スイミー、マルキュー(株)社製）７gおよびグルテン（マルキュー（株）社製）２gを混ぜ合わせ、さらに水を加えてよく混合する。これを凍結乾燥機にて乾燥させる。乾燥したら乳鉢にて細かく砕き、チューブなどに分注して使用時まで−２０℃で保存する。
餌の調製例２
fGHポリペプチドを発現しているラン藻（凍結乾燥体）３ｇと市販の餌（熱帯魚飼料ひかりクレストグッピー、キョーリン(株)社製）７ｇとを混ぜ合わせ、さらに水を加えてよく混合する。これを凍結乾燥機にて乾燥させる。乾燥したら乳鉢にて細かく砕き、チューブなどに分注して使用時まで−２０℃で保存する。
餌の調製例３
fGHポリペプチドを発現しているラン藻（凍結乾燥体）０．１gと市販の餌（スイミー、マルキュー(株)社製）７．７gおよびグルテン（マルキュー(株)社製）２．２gを混ぜ合わせ、さらに水を加えてよく混合する。これを凍結乾燥機にて乾燥させる。乾燥したら乳鉢にて細かく砕き、チューブなどに分注して使用時まで−２０℃で保存する。
餌の調製例４
fGHポリペプチドを発現しているラン藻（凍結乾燥体）０．３gと市販の餌（熱帯魚飼料ひかりクレストグッピー、キョーリン(株)社製）２．７gとを混ぜ合わせ、さらに水を加えてよく混合する。これを凍結乾燥機にて乾燥させる。乾燥したら乳鉢にて細かく砕き、チューブなどに分注して使用時まで−２０℃で保存する。
餌の調製例５
fGHポリペプチド入りの餌はディスカスの餌（テトラベルケ社製）１９．７ｇに凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体０．３ｇおよび水を加えよく練り、凍結乾燥後、乳鉢にて細かく砕くことによって作製した。作製した餌はチューブなどに分注し使用時まで−２０℃で保存した。
餌の調製例６
fGHポリペプチド入りの餌はディスカスの餌（テトラベルケ社製）９．９ｇに凍結乾燥したアナキスティス・ニジュランスPCC6301old形質転換体０．１ｇおよび水を加えよく練り、凍結乾燥後、乳鉢にて細かく砕くことによって作製した。作製した餌はチューブなどに分注し使用時まで−２０℃で保存した。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：１８７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
配列の長さ：５６１
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列：
Claims (8)
- 下記のアミノ酸配列（配列表の配列番号１）
からなり且つ魚類成長ホルモン様作用を示すポリペプチド。 - 請求の範囲第１項記載のポリペプチドをコードするDNA。
- 下記の塩基配列（配列表の配列番号２）
からなる請求の範囲第２項記載のDNA。 - 請求の範囲第３項記載のDNAを含むことを特徴とする請求の範囲第１項記載のポリペプチドを発現しうるベクター。
- 請求の範囲第４項記載の発現ベクターで形質転換されたアナキスティス・ニジュランスPCC6301old株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６７）。
- 請求の範囲第１項記載のポリペプチドを発現した請求の範囲第５項記載の形質転換されたアナキスティス・ニシュランスPCC6301old株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６７）の乾燥菌体。
- 請求の範囲第１項記載のポリペプチドまたは請求の範囲第６項記載の乾燥菌体を含有する魚類餌料。
- 魚に請求の範囲第１項記載のポリペプチドまたは請求の範囲第６項記載の乾燥菌体を投与することを特徴とする魚類の生育促進又は稚魚のへい死率の低減のための方法。
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