WO1998042748A1 - Nouveau polypeptide synthetique - Google Patents

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Takayuki Ban
Yasunobu Takeshima
Hideaki Hagiwara
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Hih.Biocenter Inc.
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel polypeptide, and more specifically, a polypeptide exhibiting a fish growth hormone-like action, a DNA encoding the same, a vector containing the DNA, a microorganism transformed with the vector, and the microorganism.
  • the present invention relates to a method for producing the above-mentioned peptide using the same, and the use of the peptide in promoting the growth of fish and reducing the mortality of fry.
  • Growth hormone which is commonly found in mammals, birds, reptiles, amphibians, and fish, is a polypeptide secreted from the pituitary gland, and has been isolated by various research groups and structurally determined. , It has been reported. These growth hormones can be produced in large quantities in microorganisms with advances in genetic engineering, and are being used in many livestock animals. However, fish have been used at the research level, but have not been put to practical use.
  • fish growth hormone plays a role in promoting the growth of fish, if it can be used as feed for breeding cultured fish, the time required for shipment will be shortened, which will help to reduce costs.
  • natural growth hormone isolated from fish has a certain degree of species specificity.For example, oral administration of tuna growth hormone, which is commercially available as a reagent, to other fish is expected to have some effect. But the effect is not enough.
  • the present inventors can use the present invention in common with many kinds of fish, and have a versatile fish growth which exerts an excellent growth promoting effect on fish. Research was conducted to develop polypeptides with hormonal effects.
  • the present invention comprises the above amino acid sequence or an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added to the above amino acid sequence, and has a fish growth hormone action. It provides polypeptides.
  • the polypeptide of the present invention can be chemically synthesized by a solid phase method or a liquid phase method known per se, or by a genetic engineering technique using DNA encoding the polypeptide of the present invention. It can also be synthesized biochemically.
  • FIG. 1 is a process chart showing the process of constructing the fGH gene of the present invention.
  • FIG. 2 is a process chart showing the process of producing the fGH operon.
  • FIG. 3 is a process diagram showing the process of incorporating the fGH operator into the multi-mouthing site of Escherichia coli-cyanobacterium shuttle vector pBAX18.
  • FIG. 4 is a graph showing the growth promoting effect of fGH polypeptide on carp fry in Test Example 1.
  • FIG. 5 is a graph showing the growth promoting effect of fGH polypeptide and tunaGH on carp fry in Test Example 2.
  • FIG. 6 is a graph showing the effect of fGH polypeptide on growth of juvenile early cichlids in Test Example 5.
  • FIG. 7 is a graph showing the growth promoting effect of fGH polypeptide on juvenile angelfish in Test Example 6.
  • polypeptide of the present invention is biochemically
  • case of synthesis will be specifically described with reference to examples.
  • fGH polypeptide a DNA fragment encoding the polypeptide represented by the amino acid sequence (hereinafter, referred to as “fGH polypeptide”). This DNA is called "fGH gene”.)
  • nucleotide sequence of the designed DNA fragment (SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) is as follows: o
  • the designed DNA is divided into several blocks, for example, 21 blocks of about 60 bases each (see Fig. 1. (A)), and the oligonucleotide of each block is subjected to DNA synthesis by the phosphoramidite method. It synthesize
  • Each synthesized oligonucleotide (excluding No. 1 and No. 11) 3 ⁇ g Takara Use a kination kit (oligonucleotide 3 lO kination buffer 2 ⁇ 1, lOOmM ATP (Pharmacia) 2 zl, polynucleotide kinase 1 ⁇ 1 (10 units) and sterile water 12 ⁇ 1) at 37 ° C for 90 Incubate for a minute. After the reaction, heat-treat at 90 ° C for 5 minutes to inactivate the enzyme, and then perform phenol-cloth form and black form treatment. The phosphorylated oligonucleotide is recovered by ethanol precipitation using ethanol precipitation (manufactured by Nippon Gene).
  • the recovered phosphorylated oligonucleotides were divided into 6 groups of 3 to 4 I to VI (see FIG. L. (A)) and annealed. Oligonucleotides of each group are ligated by T4 DNA ligase to synthesize six fragments I to VI.
  • the reaction solution is treated with an equal volume of phenol-chloroform and black-mouthed form, and the DNA is recovered by ethanol precipitation.
  • Fragments II to VI are synthesized and recovered by the same ligation reaction.
  • the fragments I to VI thus synthesized are ligated as three fragments a (I + II), b (III + IV) and c (V + VI) (see FIG. 1. (B)). .
  • Plasmid is prepared from the obtained white colonies, a part thereof is digested with HIndIII and BamHI, the insert is confirmed, and the colonies containing the desired plasmid DNA (fGH gene) are screened. Cultivate the screened colonies in 100 ml of LB medium (50 ⁇ g / ml ampicillin), and prepare a large amount of plasmid DNA by the SDS-ALP method.
  • Plasmid DM 10 ⁇ g (1 1) Add 10 ⁇ buffer 2 n Hindlll 12 units (1 ⁇ 1), BamHI 12 units (1 ⁇ 1) and sterile water to 20 zl and put in an eppendorf tube at 37 ° C. Incubate for 2 hours. After the reaction, the DNA is treated with phenol-chloroform and black form, and the DNA is collected by ethanol precipitation and dissolved in 10 ⁇ 1 sterile water. After that, separation is performed by 1% agarose gel electrophoresis, and the target DNA fragment is electrically eluted from the cut gel. Concentrate the eluate with butanol, treat it with phenol-form and lip-form, and recover the DNA by ethanol precipitation.
  • Escherichia coli (Takeshima, Y., Sugiura, M., and Hagiwara, H., 1994, A novel expression vector for harboring plasmids (pARupl8, pARutl3) containing the RuBisCO promoter and terminator regions of Anakisitis niziulans, respectively.
  • the Cyanobacterium, Synechococcus PC C6301, DNA Research 1, 181-189) is cultured in 100 ml of a circle growth medium, and a large amount of plasmid DNA is prepared by the SDS-alkali method.
  • pARupl8 digests with EcoRI and Hindlll
  • pARutl8 digests with EcoRI and BamHI.
  • fGH gene 51 (5 ⁇ g) was added to 500 mM Tris-HCl (pH 8.0) 10 ⁇ l, lOOmM D TT 11, EcoRI methylase 30 nit (0.5 ⁇ 1), 3.2 mM S-adenosylmethionine 2 ⁇ ⁇ pendorf tube with ⁇ 1 and sterile water added to 31.5 ⁇ 1 After incubating the mixture at 37 ° C for 1 hour and treating it with phenol-form and lip-form, the DNA is recovered by ethanol precipitation. Precipitate is dissolved in lOOmM Tris-HCl (pH7.6), 5mM MgCl 2 of 5 ⁇ 1.
  • the fGH gene (Methylated EcoRI site) l ⁇ g (2/1) prepared in large quantities according to (9) above, and the Anakistases' Nijuyrans RuBisCO promoter and terminator regions prepared in (8) above, respectively.
  • Put each g (2 ⁇ 1) in an Eppendorf tube add 24 ⁇ 1 of Takara Ligation Kit A, and mix well.
  • To this mixture add 6 ⁇ 1 of TAKARA Ligation Kit B, mix, and react at 16 ° C for 90 minutes. After the reaction, the DNA is treated with phenol-chloroform and black form, and the DNA is recovered by ethanol precipitation. Add 17 l of sterile water, 2 il of lOxH buffer and EcoRI, and incubate at 37 ° C for 1 hour.
  • BG-11 medium sodium lmM sodium thiosulfate, 5 ⁇ g / ml ampicillin, 1.5% agar. Incubate these plates under light irradiation (light source: white fluorescent lamp: 1000-2000 lux) for 4-10 days.
  • the colonies thus obtained are transferred to 2 ml of BG-11 liquid medium (10 g / ml ampicillin) and cultured under light irradiation (light source: white fluorescent lamp; 1000-2000 lux) for 10 days.
  • light source white fluorescent lamp; 1000-2000 lux
  • transfer this culture solution to 100 ml of BG-11 liquid medium (50 // g / ml ampicillin), and incubate for 10 days under light irradiation (light source: white fluorescent lamp; 1000-2000 lux).
  • Collect cells by centrifugation at 10,000 rpm, 4 ° C for 10 minutes, resuspend in lOmM PBS and wash by centrifugation again. After washing, store cells at -20 ° C until use.
  • Anarchist nidulans transformants and non-transformants cultured in 100 ml BG-11 medium are collected by centrifugation, and 90 mg of each is suspended in 1 ml of isogen (manufactured by Futaba Gene) and incubated at room temperature for 10 minutes. You. To this, add 0.2 ml of clonal form, shake vigorously for 15 seconds, and incubate for 5 minutes at room temperature. Then, centrifuge at 15,000 rpm at 4 ° C for 15 minutes, transfer the aqueous layer to a new tube, and add 0.5 ml of isopropanol there. Incubate for 10 minutes at room temperature.
  • RNA fraction was centrifuged at 15,000 rpm at 4 ° C for 15 minutes, the supernatant was discarded, washed with 70% ethanol, lightly dried, dissolved in RNase-free water, and used as a total RNA fraction.
  • RT-PCR is performed using the RNA fraction and the Definitive RT-PCR KIT (Biotech International). As a result of agarose gel electrophoresis of the PCR product, a band was confirmed at the expected position (about 600 bp). This shows that the transfected gene is correctly expressed in the transformed Anakistis nidulans.
  • Transformants of Anakistis nidulanth and non-transformants cultured in 100 ml of BG-11 medium were collected by centrifugation, and subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis according to the method of Laemmi. After electrophoresis, the cells were stained with Coomassie brilliant blue, and a polypeptide band was detected at the expected molecular weight of about 24,000. This band was absent when non-transformants were subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. This band was further transferred to a PVDF membrane, and the amino acid sequence was determined by a 477A / 120A type gas phase sequencer of Applied Biosystems.
  • the amino acid sequence of the polypeptide in this band was determined by the above-mentioned invention. It completely matched the amino acid sequence of the fGH polypeptide. Thus, it can be seen that the cyanobacterium anakistasis nijdurans that harbors pBAX18fGH expresses the fGH polypeptide of the present invention.
  • the fGH polypeptide of the present invention produced as described above promotes the growth and death of various fishes, especially fry. It has a remarkable effect on the reduction of the rate, and as a general-purpose fish growth hormone agent, it is used as a cultured fish (for example, freshwater fish such as carp, crucian, eel, trout, tilapia; sea bream, hamachi, tuna, flounder, flounder) It can be widely used to promote the growth of aquarium fish such as seawater fish and ornamental fish (for example, goldfish, guppy, angelfish, and early cichlids) and / or reduce the mortality of fry.
  • a cultured fish for example, freshwater fish such as carp, crucian, eel, trout, tilapia; sea bream, hamachi, tuna, flounder, flounder
  • aquarium fish such as seawater fish and ornamental fish (for example, goldfish, guppy, angelfish, and early cichlids) and
  • the fGH polypeptide of the present invention to be administered may be in an isolated or purified form, but it is not always necessary, and may be in a crude state, or the above-described transformed culture Dried bacterial cells containing the fGH polypeptide of the body can also be used.
  • the fGH polypeptide of the present invention can be used, for example, by mixing a cyanobacterium containing the same with a normal fish feed and ingesting the fish in a spraying method, and simultaneously with the normal fish feed. It can also be given to fish.
  • Test example 1 Carp growth test 1
  • the carp in the control group was fed with commercially available carp diets at lOOmg / animal / times, three times a day, and mixed with freeze-dried Anakistis' nidulans PCC6301old non-transgenic lmg / animal once a week. Feeding. Rearing was carried out between 24-26 ° C.
  • Table 1 below shows the measurement results of the 25th body weight gain (average of 15 animals) after the first administration.
  • Figure 4 shows a plot of the weight gain (%) during the breeding period.
  • Test example 2 Carp growth test 2
  • a diet containing l ⁇ g / animal of growth hormone (tunaGH: manufactured by Maruha Corporation) in a commercial mug was fed.
  • the carp in the control group was fed with commercially available carp diet 0.5 g / animal / time 1 three times, and once a week freeze-dried Anakistis and Nidurans
  • fGH polypeptide of the present invention Freeze-dried Anakistis' Durans PCC6301old transformant lmg / animal, Guppy mixed with fGH polypeptide (lg / animal / day) of lOOmg / 10 animals / day.
  • the diet containing fGH polypeptide is prepared by adding 0.1 g of Anakistis nidulans PCC6301old transformant lyophilized to 0.9 g of Goodbye Fed (Kyorin Co., Ltd.) and water, kneading well, and freeze-drying.
  • Test example 7 Guppy survival test 1
  • Bait preparation example 3 Cyanobacteria expressing fGH polypeptide (freeze-dried) 0.1 lg and commercially available bait (Suimi, Marquee Co., Ltd.) 7.7 g and gluten (Marcuichi Co., Ltd.) 2.2 g And add water and mix well. This is dried with a freeze dryer. After drying, crush finely in a mortar, dispense into tubes, and store at 20 ° C until use.
  • the diet containing fGH polypeptide is an anaxist freeze-dried to 19.7 g of Discus's diet (manufactured by Tetra Berke Co.). It was made by crushing. The prepared bait was dispensed into tubes and stored at 120 ° C until use.
  • Diet containing fGH polypeptide is made of Discus diet (Tetra Berke). Add 9.9 g of freeze-dried Anakistis nidulans PCC6301old transformant to 9.9 g and water, mix well, freeze-dry and place in a mortar. It was made by crushing finely. The prepared bait was dispensed into tubes and stored at -20 ° C until use. Arrangement
  • Sequence type nucleic acid

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Description

明 細 書
新規な合成ポリペプチド
技術分野
本発明は新規なポリペプチドに関し、 さらに詳しくは、 魚類成長ホル モン様作用を示すポリペプチド、 それをコー ドする DNA、 該 DNAを含むベ クタ一、 該ベクターで形質転換された微生物、 該微生物を利用した上記 ぺプチドの製造方法、 ならびに該ぺプチドの魚類の生育促進および稚魚 のへい死率の低減における利用に関する。
背景技術
哺乳類、 鳥類、 爬虫類、 両生類、 魚類に共通して存在する成長ホルモ ンは脳下垂体から分泌されるポリべプチドであり、 これまでに様々な研 究グループによって単離され、 それぞれ構造決定がなされ、 報告されて いる。 これらの成長ホルモンは遺伝子工学の進歩に伴って微生物内で大 量に生産できるようになり、 多くの家畜動物において利用されようとし ている。 しかし、 魚類においては研究レベルでは利用されているものの、 実用化はされていないというのが現状である。
魚類成長ホルモンは魚類の生育促進を担っていることから、 養殖魚の 飼育用餌料として利用できれば出荷までの期間が短くなり、 コスト削減 に役立つと考えられる。 しかしながら、 魚類から単離された天然の成長 ホルモンは、 ある程度の種特異性があり、 例えば、 試薬として市販され ているマグロの成長ホルモンを他の魚類に経口投与した場合、 若干の効 果は期待することができるが、 その効果は十分とは言えない。
そこで、 本発明者らは多種の魚類に共通して使用することができ、 し かも魚類に対して優れた生育促進効果を発揮する汎用性のある魚類成長 ホルモン様作用を持つポリぺプチドを開発すべく研究を行った。
発明の開示
その結果、 今回、 下記のアミノ酸配列 （配列表の配列番号 1 )
5 10 15
Gin Pro lie Thr Asp Ser Gin Arg Leu Phe Ser lie Ala Val Ser
20 25 30
Arg Val Gin His Leu His Leu Leu Ala Gin Arg Leu Phe Ser Asp
35 40 45
Phe Glu Ser Ser Leu Gin Thr Glu Glu Gin Arg Gin Leu Asn Lys
50 55 60 l ie Phe Leu Gin Asp Phe Cys Asn Ser Asp Tyr He lie Ser Pro
65 70 75 l ie Asp Lys His Glu Thr Gin Arg Ser Ser Val Leu Lys Leu Leu
80 85 90
Ser lie Ser Tyr Arg Leu Val Glu Ser Trp Glu Phe Pro Ser Arg
95 100 105
Ser Leu Ser Gly Gly Ser Ala Pro Arg Asn Gin l ie Ser Pro lys
110 115 120
Leu Ser Glu Leu Lys Met Gly l ie His Leu Leu l ie Arg Ala Asn
125 130 135
Gin Asp Gly Ala Glu Met Phe Ala Asp Ser Ser Ala Leu Gin Leu
140 145 150
Ala Pro Tyr Gly Asn Tyr Tyr Gin Ser Leu Gly Gly Asp Glu Ser
155 160 165
Leu Arg Arg Asn Tyr Glu Leu Leu Ala Cys Phe Lys Lys Asp Met
170 175 180
His Lys Val Glu Thr Tyr Leu Arg Val Ala Lys Cys Arg Leu Ser
185
Pro Glu Ala Asn Cys Thr Leu
で示されるポリべプチドが魚類成長ホルモン様作用を示し、 各種の魚類 に対して顕著な生育促進効果および稚魚のへい死率の低減効果を発揮す ることを見い出した。
かく して、 本発明は、 上記ァミノ酸配列、 叉は上記ァミノ酸配列にお いて 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたァミノ 酸配列からなり且つ魚類成長ホルモン作用を示すポリベプチドを提供す るものである。
本発明のポリべプチドは、 それ自体既知の固相法又は液相法によって 化学的に合成することができ、 或いは本発明のポリぺプチドをコ一ドす る D N Aを用いる遺伝子工学の手法によって生化学的に合成することも できる。
図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の fGH遺伝子の構築の過程を示す工程図である。
図 2は、 fGHオペロンの作製の過程を示す工程図である。
図 3は、 大腸菌ーラン藻シャ トルべクタ一 pBAX18のマルチク口一ニン グサイ 卜への fGHオペ口ンの組み込みの過程を示す工程図である。
図 4は、 試験例 1における fGHポリペプチドの鯉稚魚に対する生育促 進効果を示すグラフである。
図 5は、 試験例 2における fGHポリぺプチドおよび tunaGHの鯉稚魚に 対する生育促進効果を示すグラフである。
図 6は、 試験例 5における fGHポリべプチドのァ一リーシクリ ッ ド稚 魚に対する生育促進効果を示すグラフである。
図 7は、 試験例 6における fGHポリぺプチドのエンゼルフィ ッシュ稚 魚に対する生育促進効果を示すグラフである。
発明を実施するための形態
以下、 本発明のポリベプチドを遺伝子工学の手法によって生化学的に 合成する場合について、 実施例により具体的に説明する。
( 1 ) オリゴヌクレオチドの合成
宿主として使用するラン藻のコ ドン使用頻度を考慮して、 前記アミノ 酸配列で示されるポリペプチド （以下、 このポリペプチドを "fGHポリ ペプチド" という） をコー ドする DNA断片を設計する （以下、 この DNAを " fGH遺伝子" という） 。
設計した DNA断片の塩基配列 （配列表の配列番号 2 ) は次の通りであ o
CAGCCTATTA CCGATTCTCA GCGTCTGTTC TCTATTGCTG TTTCTCGTGT TCAGCACCTG 60 CACCTGCTGG CGCAGCGTCT GTTCTCTGAT TTTGAATCTT CTCTGCAAAC CGAAGAACAG 120 CGTCAGCTGA ACAAAATTTT CCTGCAGGAT TTCTGTAACT CTGATTACAT TATTTCTCCT 180
ATTGATAAAC ACGAAACTCA GCGTTCTTCT GTTCTGAAAC TGCTGTCTAT TTCTTACCGT 240
CTGGTTGAAT CTTGGGAATT CCCTTCTCGT TCTCTGTCTG GTGGTTCTGC TCCTCGTAAC 300
CAGATTTCTC CTAAACTGTC CGAGCTCAAA ATGGGTATTC ACCTGCTGAT TCGTGCTAAC 360
CAGGATGGTG CTGAAATGTT CGCTGATTCT TCTGCTCTGC AGCTCGCTCC TTACGGTAAC 420
TACTACCAGT CTCTGGGTGG TGATGAATCT CTGCGTCGTA ACTACGAACT GCTGGCTTGT 480
TTCAAAAAAG ATATGCACAA AGTTGAAACC TACCTGCGTG TCGCGAAATG TCGTCTGTCT 540
CCTGAAGCTA ACTGCACCCT G 561 設計した DNAを幾つかのプロック、 例えば約 60塩基ごとの 21個のプロッ クに分け （図 1 . ( A ) 参照） 、 各プロックのオリゴヌクレオチドをホ スホアミダイ ト法によって DNAシンセサイザ一を用いて合成する。
( 2 ) 合成ォリゴヌクレオチドのキナーゼによるリ ン酸化
合成した各オリゴヌクレオチド （No. 1と No. 11は除く） 3 ^ gを Takara kination kit (オリゴヌクレオチド 3 lO kination buffer 2〃1、 lOOmM ATP (フアルマシア社製） 2 z l、 ポリヌクレオチドキナーゼ 1〃1 ( 10ュニッ ト） および滅菌水 12 ^ 1) を用いて、 37°Cで 90分間インキュ ベ一卜する。 反応後、 90°Cで 5分間熱処理して酵素を失活させ、 フエノ ール-クロ口ホルムおよびクロ口ホルム処理を行う。 リ ン酸化したオリ ゴヌクレオチドをエタ沈メィ ト （二ツボンジーン 社製） を用い、 エタ ノール沈殿にて回収する。
( 3 ) fGH遺伝子の作製
回収したリ ン酸化されたォリゴヌクレオチドを、 3又は 4個ずつの I ~ V Iの 6つのグループに分け （図 l . (A)参照） 、 アニーリ ングした。 そ れそれのグループのォリゴヌクレオチドを T4 DNAリガーゼにより連結し、 6個の断片 I ~ V Iを合成する。
すなわち、 断片 Iを構成するオリゴヌクレオチドのうち 5'末端に位置 するオリゴヌクレオチドの場合は 1. 5 ;w gを、 その他のォリゴヌクレオチ ドの場合は 1. 0〃gをそれぞれ 80〃 1のライゲーションバッファ一に溶か す。 この溶液を 90°Cで 5分間加熱した後、 2時間かけて 4°Cまで徐冷し、 lOOmM DTTと 10mM ATP (フアルマシア社製） を 10〃 1ずつ加え、 さらに T4 DNAリガーゼ （宝酒造 社製） 2. 5ュニッ トを添加して 4°Cで 16時間イン キュベー卜する。 その後、 反応液を等容のフ ノール-クロ口ホルムお よびクロ口ホルムで処理し、 DNAをエタノール沈殿して回収する。 同様 のライゲーション反応により各断片 I I〜V Iを合成し、 回収する。 次に、 このようにして合成した断片 I ~ V Iを 3つの断片 a ( I + I I ) 、 b ( I I I + I V ) および c ( V + V I ) として連結する （図 1 . (B)参 照） 。 すなわち、 I〜V Iの各断片 2〃gずつを 40〃1のライゲ一ション バッファ一に溶かし、 これを 37°Cで 30分間インキュベートした後、 30分 かけて 4°Cまで徐冷し、 100 mM DTTと 10 mM ATP (ファルマンァ社製） を 5 1ずつ加え、 さらに T4 DNAリガ一ゼ （宝酒造 （株） 社製） 10ュニッ ト を添加して 4°Cで 16時間インキュベートする。 その後、 反応液を等容の フヱノール-クロ口ホルムおよびクロ口ホルムで処理し、 DNAをェタノ一 ル沈殿して回収する。
最後に、 得られた断片 a〜cをそれぞれ 2〃gずつを 40〃1のライゲーショ ンバッファーに溶かし、 これを 37°Cで 30分間インキュベートした後、 30 分かけて 4°Cまで徐冷し、 lOOmM DTTと 10mM ATP (フアルマシア社製） を 5 1ずつ加え、 さらに T4 DNAリガ一ゼ （宝酒造 （株） 社製） 10ュニッ ト を添加して 4°Cで 16時間インキュベートする。 その後、 反応液を等容の フエノール-クロ口ホルムおよびクロ口ホルムで処理し、 DNAをエタノ一 ル沈殿して回収する。 その DNAをァガロース電気泳動にかけ、 最初に設 計した DNA断片と同じ大きさのバンドをゲルから切り出し、 fGH遺伝子を 回収する。
( 4 ) プラスミ ド DNA (pUC18) の Hindlll/BamHI消化および脱リ ン酸化 プラスミ ド DNA (pUC18) 10 g ( 10〃 1) に、 10 x K buffer 2 u Hin dill 10ュニッ ト （1 ^ 1) 、 BamHI 10ュニッ ト （1 / 1) および滅菌水を 加えて 20 1としたエツペンドルフチューブを 37°Cで 1時間ィンキュベー トする。 その後、 反応液をァガロース電気泳動にかけ、 目的のバンドを ゲルから切り出して回収する。 回収した DNAを 100 1の lOOmM Tris-HCl (pH8. 0) に溶解し、 アルカ リ フォスファタ一ゼ 5ュニッ ト （1〃1) を加 え、 37°Cで 60分間イ ンキュベーショ ンした後、 もう一度アルカリフォス ファタ一ゼ 5ユニッ ト （1 / 1) を加え、 65°Cで 15分間インキュベートす る。 反応液をフヱノール-クロ口ホルムおよびクロ口ホルム処理し、 DNA をエタノール沈殿して集め、 5 zlの lOOmM Tris-HCl (pH7.6) 、 5m MgC
12に溶解する。
(5) fGH遺伝子の pUC18への挿入
上記 （3) で得た fGH遺伝子を lOOng (2//1) と上記 （4) で得た pUCl 8 (Hindlll/BamHI) 200ng (3 il) をエツペンドルフチューブに入れ、 夕カラライゲーシヨンキッ 卜 Α液を 20 1加えよく混合する。 この混合液 に、 タカララィゲーシヨンキッ ト B液を 5〃 1加え、 混合した後、 16°Cで 9 0分間反応させる。
(6) 大腸菌 （JM109) の形質転換
氷上で融解したコンビテントセル JM109 (二ツボンジーン社製） 100〃 1に上記 （5) で得たライゲ一シヨン溶液 10 1加え、 おだやかに混合す る。 混合液を氷上で 30 分間ィンキュベー トした後、 さらに 42°Cで 45秒 間、 そしてもう一度、 氷上で 3分間インキュベートして DNAを細胞中に取 り込ませる。 この懸濁液に 400 1の培地 （Hi- competence Broth) を加 え 37°Cで 60分間振盪培養した後、 1.5% LB寒天培地 （50 / g/mlアンピシ リン、 40mg八 X gaU 23.38mg/l IPTG) にプレー トする。 得られた白い コロニーからプラスミ ドを調製し、 その一部を HIndIII、 BamHIで消化し インサー トの確認をして目的のプラスミ ド DNA (fGH遺伝子） を保持して いるコロニーをスク リーニングする。 スクリーニングしたコロニーを 10 0mlの LB培地 （50〃g/mlアンピシリン） で培養し、 プラスミ ド DNAを SDS - アル力リ法により大量に調製する。
(7) fGH遺伝子の大量調製
上記 （6) に従い大量調製したプラスミ ド DM (fGH遺伝子） 10^g (1 1) に、 10 Χ Κ buffer 2 n Hindlll 12ュニッ ト （1〃1) 、 BamHI 1 2ユニッ ト （1 ^ 1) および滅菌水を加えて 20 z lとしたエツペンドルフチュ ーブを 37°Cで 2時間インキュベートする。 反応後、 フヱノール-クロロホ ルムおよびクロ口ホルム処理し、 DNAをエタノール沈殿して集め、 10 ^ 1 の滅菌水に溶解する。 その後、 1 %ァガロースゲル電気泳動により分離 し、 目的の DNA断片を切り出したゲルから電気的に溶出する。 溶出液は ブタノール濃縮し、 フヱノ一ル-ク口口ホルムおよびク口口ホルム処理 した後、 DNAをエタノール沈殿にて回収する。
( 8 ) アナキステイ ス 'ニジュランス （Anacystis nidulans) の RuBisC 0プロモーターおよびターミネ一ター領域の大量調製
アナキスティス 'ニジユランスの RuBisCOプロモーターおよびターミ ネーター領域をそれぞれ含むプラスミ ド （pARupl8、 pARutl3) を保持す る大腸菌 （Takeshima, Y. , Sugiura, M.， and Hagiwara, H. , 1994, A novel expression vector for the Cyanobacterium, Synechococcus PC C6301, DNA Research 1, 181-189) を circle growth培地 100mlで培養し、 プラスミ ド DNAを SDS-アルカリ法により大量に調製する。 pARupl8は EcoR I 、 Hindlll で、 pARut l8は EcoRI 、 BamHI でそれぞれ消化する。 反応 後、 3%ァガロースゲル電気泳動により目的の DNA断片を切り出し、 電気 的に溶出する。 溶出液はブ夕ノール濃縮し、 フヱノール-クロ口ホルム およびクロ口ホルム処理した後、 DNAをエタノール沈殿にて回収する。
( 9 ) fGH遺伝子の EcoRI サイ 卜のメチル化
fGH遺伝子 5 1 (5〃g) に、 500mM Tris-HCl (pH8. 0) 10〃 1、 lOOmM D TT 1 1、 EcoRI methylase30ュニッ 卜 （0. 5〃1) 、 3. 2mM S-アデノシル メチォニン 2〃 1 および滅菌水を 31. 5〃 1加えたエツペンドルフチューブ を 37°Cで 1時間ィンキュベ一卜し、 フヱノ一ル-ク口口ホルムおよびク口 口ホルム処理した後、 DNAをエタノール沈殿にて回収する。 沈殿は 5〃1 の lOOmM Tris-HCl (pH7.6) 、 5mM MgCl2に溶解する。
(10) fGHオペロンの作製 （図 2参照）
上記 （9) に従い大量に調製した fGH遺伝子 （EcoRI サイ 卜のメチル 化済み） l〃g (2 /1) ならびに上記 （8) で調製したアナキステイス ' ニジユランスの RuBisCOプロモーターおよびターミネーター領域それぞ れ l〃g (2〃1) ずつをエツペンドルフチューブにいれ、 タカララィゲー シヨンキッ ト A液を 24〃 1加えよく混合する。 この混合液に、 タカララィ ゲーショ ンキッ ト B液を 6〃1加え、 混合した後、 16°Cで 90分間反応させ る。 反応後、 フエノール-クロ口ホルムおよびクロ口ホルム処理した後、 DNAをエタノール沈殿にて回収する。 そこに滅菌水 17 l、 lOxH buffer 2 ilおよび EcoRI 加え、 37°Cで 1時間インキュベートする。
(1 1) プラスミ ド DNA (ρΒΑΧΙδ) の EcoRI 消化および脱リ ン酸化 プラスミ ド DNA (pBAX18—寄託番号 FERM BP- 4639) 10^g (ΙΟβΙ) に、 10ΧΗ buffer 2n EcoRI 12 ュニッ ト （1〃1) および滅菌水を 加えて 20〃 1としたエツペンドルフチューブを 37°Cで 1時間ィンキュベー トする。 その後、 反応液をァガロース電気泳動にかけ、 目的のバン ドを ゲルから切り出し回収する。 回収した DNAを 100 zlの lOOmM Tris-HCl (p H8.0) に溶解し、 アルカリフォスファターゼ 5ユニッ ト （1〃1) を加え、 37°Cで 60分間ィンキュベ一シヨンした後、 もう一度アル力リフォスファ タ一ゼ 5ュニッ ト （1 zl) を加え、 65°Cで 15分間インキュベートする。 反応液をフヱノール-クロ口ホルムおよびクロ口ホルム処理し、 DNAをェ タノ一ル沈殿して集め、 の lOOmM Tris-HCl (pH7.6) および 5mM MgC 12に溶解する。
( 12) fGHオペロンと pBAX18 (EcoRI 消化、 脱リ ン酸化済） のライゲ ーシヨ ン （図 3参照）
上記 （ 10) で得た精製した fGHオペロンと上記 （ 1 1) で得たブラ スミ ド DNA (ρΒΑΧΙδ) をそれぞれ l〃g (2 l) ずつエツペンドルフチュ —ブにいれ、 タカララィゲーシヨンキッ ト A液を 24 1加えよく混合する。 この混合液に、 タカララィゲーシヨンキッ ト B液を 6〃 1加え、 混合した 後、 16°Cで 90分間反応させる。
(13) 大腸菌 （JM109) の形質転換
氷上で融解したコンビテン トセル JM109 (二ツボンジーン社製） 100〃
1に上記 （ 1 2) で得たライゲーシヨ ン溶液 10 /1加え、 おだやかに混合 する。 混合液を氷上で 30分間ィンキュベートした後、 さらに 42°Cで 45秒 間、 そしてもう一度氷上で 3分間インキュベートして、 DNAを細胞中に取 り込ませる。 この懸濁液に 400 1の Hi- competence Brothを加え 37°Cで 6 0分間振盪培養した後、 1.5% LB寒天培地 （50//g/mlアンピシリ ン、 40m g/1 X gal、 23.38mg/l IPTG) にプレー 卜する。 得られた白いコロニー からプラスミ ドを調製し、 その一部を EcoRI で消化しインサートの確認 をして目的の発現ベクター DNA (PBAX18fGH) を保持しているコロニーを スク リ一二ングする。 スク リ一二ングしたコロニーを 100mlの LB培地 （5 0〃g/mlアンピシリ ン） で培養し、 発現べクタ一 DNAを SDS-アルカリ法に より大量に調製する。
( 14) fGH遺伝子のラン藻 （アナキスティ ス · ニジュランス PCC6301 old株一寄託番号 FERM BP- 6267; ATCC 27144) による発現
100 mlの BG- 11液体培地で約 1週間培養したアナキスティス ·ニジユラ ンス PCC6301 oldを 8000rpmで 5分間遠心して集め、 10mlの新鮮な液体培 地に懸濁した （108〜109 cells/ml) 。 この細胞懸濁液を lmlずつポリプ ロピレンチューブに分注し、 それぞれのチューブに上記 （ 1 3 ) で調製 した発現べク夕一 DNAを 0. l~ 10〃gの濃度で加える。 これらのチューブ をそれぞれアルミホイルで被い、 25°Cで一晩培養した後、 被っていたァ ルミホイルをはずし、 光照射下 （光源： 白色蛍光灯； 1000〜2000ルクス） でさらに 6時間培養する。 これらの細胞懸濁液から 100〜500 1取り、 BG -11培地 （lmMチォ硫酸ナ ト リ ウム、 5〃g/mlアンピシリ ン、 1. 5%寒天） にプレー卜する。 これらのプレー トを光照射下 （光源 ： 白色蛍光灯： 10 00〜2000ルクス） で 4〜10日間培養する。
このようにして得られたコロニ一を 2mlの BG- 11液体培地 （10 g/mlァ ンピシリ ン） に移し、 光照射下 （光源： 白色蛍光灯； 1000〜2000ルクス） で 10日間培養する。 次に、 この培養液を 100mlの BG - 11液体培地 （50 // g/ mlアンピシリ ン） に移し、 光照射下 （光源 ： 白色蛍光灯； 1000~2000ル クス） で 10日間培養する。 細胞を 10, 000rpm、 4°Cで 10分間遠心して集め、 lOmM PBSに再懸濁し、 もう一度遠心することによって洗浄する。 洗浄後、 細胞は使用時まで- 20°Cにて保存する。
( 1 5 ) RT- PCR法による fGH遺伝子の発現確認
100ml BG- 11培地で培養したアナキスティス · ニジュランス形質転換 体および非形質転換体を遠心して回収し、 それぞれ 90mgずつを lmlの iso gen (二ツボンジーン社製） に懸濁し、 室温で 10分間インキュベートす る。 それに 0. 2mlのクロ口ホルムを加え、 15秒間激しく振盪した後、 5分 間室温でインキュベートする。 その後、 15, 000 rpm、 4°Cで 15分間遠心 し、 水層を新しいチューブに移し、 そこに 0. 5mlのイソプロパノールを 加え、 10分間室温でインキュベートする。 その後、 15, 000rpm、 4°Cで 15 分間遠心し、 上清を捨て、 70%エタノールで洗ったら軽く乾かして、 RN aseフリーの水に溶かし、 これをトータル RNA画分とした。 次に、 この RN A画分と Definitive RT-PCR KIT (Biotech International社製） を用 いて RT- PCRを行う。 PCR産物をァガロースゲル電気泳動した結果、 予想 された位置 （約 600bp) にバンドが確認できた。 これにより、 形質転換 されたアナキスティス ·ニジユランスにおいて導入した遺伝子が正確に 発現していることが分かる。
( 1 6 ) SDS-PAGE (SDSボリアク リルアミ ドゲル電気泳動） による本発 明の fGHポリペプチドの発現確認
100ml BG- 11培地で培養したアナキスティス ·ニジユランス形質転換 体および非形質転換体を遠心して回収し、 これを Laemml iの方法に従い S DS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動を行つた。 泳動後クマシ一ブリ リ アントブルーにて染色し、 予想された分子量約 24， 000の位置にポリぺプ チドのバンドを検出した。 このバンドは非形質転換体を SDS-ポリアクリ ルアミ ドゲル電気泳動した場合には存在しなかった。 さらにこのバンド を PVDF膜に転写し、 アプライ ドバイオシステムズ社の 477A/120A型気相 シークェンサ一によりァミノ酸配列を決定したところ、 このバンドのポ リぺプチドのァミノ酸配列は前記の本発明の fGHポリぺプチドのァミノ 酸配列と完全に一致した。 これにより、 pBAX18fGHを保持するラン藻ァ ナキステイス .ニジユランスは本発明の fGHポリぺプチドを発現してい ることが分かる。
以上に述べた如く して製造される本発明の fGHポリペプチドは、 後記 の試験例に示すとおり、 各種の魚類、 殊に稚魚の生育促進およびへい死 率の低減に顕著な効果を有しており、 汎用の魚類成長ホルモン剤として、 養殖魚 （例えば、 鯉、 鮒、 鰻、 鱒、 テラピア、 などの淡水魚；鯛、 ハマ チ、 マグロ、 ヒラメ、 カレイなどの海水魚） や観賞魚 （例えば、 金魚、 グッピー、 エンゼルフイ ツシュ、 アーリ一シクリ ツ ドなど） の生育促進 および または稚魚のへい死率の低減のために広く利用することができ る。
投与すべき本発明の fGHポリペプチドは、 単離、 精製された形態のも のであってもよいが、 必ずしもその必要はなく、 粗製の状態のものであつ てもよく、 或いは培養した上記形質転換体の fGHポリぺプチドを含む乾 燥菌体そのものを用いることもできる。
使用に際して本発明の fGHポリペプチドは、 例えば、 これを含むラン 藻を通常の魚類用の餌と混合し散布方式で魚類に摂取させることができ、 また、 通常の魚類用の餌と併行して魚類に与えることもできる。
試験例
以下、 試験例により本発明の fGHポリペプチドの魚類生育促進および 稚魚のへい死率低減効果についてさらに具体的に説明する。
試験例 1 ：鯉の生育試験その 1
孵化後 2 ~ 3ヶ月齢の鯉を水槽 （60cm X 30cm X 30cm) に 15匹ずつ入れ、 通常は市販の鯉の餌を lOOmg/匹/回づっ 1日 3回与え、 週に 1回本発明 の fGHポリぺプチド （凍結乾燥したアナキスティス ·ニジュランス PCC6 301old 形質転換体 lmg/匹、 本発明の fGHポリペプチド l // g /匹相当） を 混ぜた餌を与えた （fGHポリペプチド投与区） 。 また、 対照区の鯉には 市販の鯉の餌を lOOmg/匹/回づっ 1日 3回与え、 週に 1回凍結乾燥した アナキスティス 'ニジュランス PCC6301old 非形質転換体 lmg/匹を混ぜ た餌を与えた。 飼育は 24〜26°Cの間で行った。 第 1回目の投与後 2 5曰 目の体重増加量 （15匹の平均） の測定結果を下記表 1に示す。 また、 図 4に飼育期間中の体重増加割合 （％) をプロッ 卜したグラフを示す。
Figure imgf000016_0001
* 標準誤差
試験例 2 ： 鯉の生育試験その 2
孵化後 4〜5ヶ月齢の鯉を水槽 （90cm x 40cm X 40cm) に 5匹ずつ入れ、 通常は市販の鯉の餌を 0. 5g/匹/回、 1日 3回与え、 週に 1回本発明の fG Hポリぺプチド （凍結乾燥したアナキスティス ·ニジュランス PCC6301O Id 形質転換体 lmg、 本発明の fGHポリペプチド 1 g/匹相当） を混ぜた餌 を与えた （fGHポリペプチド投与区） 。 また、 tunaGH投与区の鯉には市 販の鯉の餌を 0. 5g/匹/回づっ 1日 3回与え、 週に 1回凍結乾燥したアナ キステイス .ニジユランス PCC6301old非形質転換体 lmg/匹と市販のマグ 口の成長ホルモン （tunaGH： マルハコーポレーショ ン製） l〃g/匹を混 せた餌を与えた。 さらに、 対照区の鯉には市販の鯉の餌を 0. 5g/匹/回づ つ 1曰 3回与え、 週に 1回凍結乾燥したアナキスティス ，ニジュランス
PCC6301old非形質転換体 lmg/匹を混ぜた餌を与えた。 飼育は 24〜26°C の間で行った。 第 1回目の投与後 4 9日目の体重増加量 （5匹の平均） の測定結果を下記表 2に示す。 また、 図 5に飼育期間中の体重増加割合
( % ) をプロッ 卜したグラフを示す。 表 2
Figure imgf000017_0001
* 標準誤差 試験例 3 ： グッピーの生育試験その 1
孵化後約 10〜20日のグッピーを水槽 （60cni x 30cm X 30cm) に 10匹ずつ を入れ、 本発明の fGHポリペプチド （凍結乾燥したアナキステイス -二 ジュランス PCC6301old 形質転換体 3mg/匹、 本発明の fGHポリペプチド 3 g/匹/曰相当） を混ぜたグッピーの餌 （後記餌の調製例 2で調製し たもの） を lOOmg/10匹/日与えた。 対照区のグッピーの飼育は、 アナキ ステイ ス · ニジュランス PCC6301old形質転換体の代わりに非形質転換 体を使用して行った。 グッピーの飼育は 2 5〜2 7 °Cの間で行った。 第 1回目の投与後 3 3日目の体長の度数分布表を下記表 3に示す。 表 3
級 級間 度数
体長（cm) A B
1 1. 7-2. 0 0 2
2 2. 0-2. 3 0 4
3 2. 3-2. 6 1 3
4 2. 6-2. 9 2 1
5 2. 9-3. 2 5 0
6 3. 2-3. 5 2 0 Λ: 本発明の fGHポリペプチド投与区
B: 対照区 試験例 4 ： グッピーの生育試験その 2
孵化後約 10〜20日のグッ ピーを水槽 （60cmx 30cm X 30cm) に 10匹ずつ を入れ、 本発明の fGHポリペプチド （凍結乾燥したアナキスティス '二 ジュランス PCC6301old 形質転換体 lmg/匹、 本発明の fGHポリペプチド l g/匹/日相当） を混ぜたグッピーの餌を lOOmg/10匹/日与えた。 fGH ポリべプチド入りの餌はグッビーフ一ド （キヨ一リ ン（株）製） 0.9 g に凍結乾燥したアナキスティス · ニジュランス PCC6301old形質転換体 0. 1 gおよび水を加えよく練り、 凍結乾燥後、 乳鉢にて細かく砕くこ とによって作製した。 対照区のグッピーの飼育は、 アナキステイス .二 ジュランス PCC6301old形質転換体の代わりに非形質転換体を使用して行 た。 作製した餌は 1 0 Omgずつ分注し使用時まで一 20°Cで保存した c グッピーの飼育は 25〜27°Cの間で行った。 第 1回目の投与後 35日目の 体長の度数分布表を下記表 4に示す。
表 4
Figure imgf000018_0001
A: 本発明の fGHポリペプチド投与区 B : 対照区 試験例 5 ： アーリーシクリ ツ ドの生育試験
孵化後約 4〜 5ヶ月のアーリ一シクリ ッ ド （Aulonocara) を水槽 （60 cm X 30cm X 30cm) に 6匹ずつを入れ、 本発明の fGHポリペプチド （凍結 乾燥したアナキステイス ' ニジュランス PCC6301old 形質転 体 3 mg/ 匹、 本発明の fGHポリぺプチド 3 〃g /匹/日相当） を混ぜたディスカスの 餌 （テトラべルケ社製） を 2 0 O m g Z匹 曰与えた。 対照区のアーリ —シク リ ッ ドの飼育は、 アナキスティス · ニジユランス PCC6301old形質 転換体の代わりに非形質転換体を使用して行った。 アーリーシクリ ツ ド の飼育は 2 5〜2 7 °Cの間で行った。 第 1回目の投与後 4 2日目の体重 増加量 （6匹の平均） の測定結果を下記表 5に示す。 また、 図 6に飼育 期間中の体重増加割合 （％) をプロッ 卜したグラフを示す。
表 5
Figure imgf000019_0001
* 標準誤差 試験例 6 ： エンゼルフィ ッ シュの生育試験
孵化後約 3〜4ヶ月のエンゼルフィ ッシュ （Pterophyllum) を水槽 （6 0cm X 30cm X 30cm) に 1 5匹ずつを入れ、 本発明の fGHポリペプチド （凍 結乾燥したアナキスティス 'ニジュランス PCC6301old 形質転換体 l mg /匹、 本発明の fGHポリペプチド 1 z g/匹/日相当） を混ぜたデイスカス の餌 （テトラべルケ社製） を 1 0 O m g Z匹ノ曰与えた。 対照区のァー リ一シク リ ッ ドの飼育は、 アナキスティ ス ·ニジユランス PCC6301old形 質転換体の代わりに非形質転換体を使用して行った。 アーリ一シクリッ ドの飼育は 2 5〜2 7 °Cの間で行った。 第 1回目の投与後 7 1曰目の体 重増加量 （ 1 5匹の平均） の測定結果を下記表 6に示す。 また、 図 7に 飼育期間中の体重増加割合 （％) をプロッ 卜したグラフを示す。
表 6
Figure imgf000020_0001
試験例 7 ： グッピーの生存試験その 1
孵化後約 1 0日のグッピーを水槽 （60cm x 30cm X 30cm) に 4 3匹ずつ を入れ、 本発明の fGHポリペプチド （凍結乾燥したアナキスティス ·二 ジュランス PCC6301old 形質転換体 l mg/匹、 本発明の fGHポリペプチド 1 ^ g/匹/日相当） を混ぜた市販のグッピーの餌を 1 O m g /匹/日与 えた。 対照区のグッ ピーの飼育は、 アナキスティス ·ニジユランス PCC6 301old形質転換体の代わりに非形質転換体を使用して行った。 グッピー の飼育は 2 5〜2 7 °Cの間で行った。 第 1回目の投与から 3 5曰目まで の生存率を下記表 7に示す。 表 7
Figure imgf000021_0001
A：本発明の fGHポリぺプチド投与区
B：対照区 試験例 8 ： グッピーの生存試験その 2
孵化後約 1 0日のグッピーを水槽 （60cmx 30cm X 30cm) に 20匹ずつ を入れ、 本発明の fGHポリぺプチド （凍結乾燥したアナキスティス ·二 ジュランス PCC6301old 形質転換体 lmg/匹、 本発明の fGHポリペプチド 1〃g /匹/日相当） を混ぜた市販のグッピーの餌を 1 OmgZ匹ノ日与 えた。 対照区のグッピーの飼育は、 アナキスティス *ニジユランス PCC6 301old形質転換体の代わりに非形質転換体を使用して行った。 グッピー の飼育は 25-27 °Cの間で行った。 第 1回目の投与から 23曰目まで の生存率を下記表 8に示す。
表 8
Figure imgf000022_0001
Λ： 本発明の fGHポリペプチド投与区
B：対照区 餌の調製例 1
fGHポリペプチドを発現しているラン藻 （凍結乾燥体） l gと市販の餌 (スイ ミ一、 マルキュー（株）社製） 7 gおよびグルテン （マルキュー （株 ) 社製） 2 gを混ぜ合わせ、 さらに水を加えてよく混合する。 これを凍 結乾燥機にて乾燥させる。 乾燥したら乳鉢にて細かく砕き、 チューブな どに分注して使用時まで一 2 0 °Cで保存する。 餌の調製例 2 fGHポリペプチドを発現しているラン藻 （凍結乾燥体） 3 gと市販の 餌 （熱帯魚飼料ひかりクレス トグッピー、 キヨ一リ ン（株）社製） 7 gと を混ぜ合わせ、 さらに水を加えてよく混合する。 これを凍結乾燥機にて 乾燥させる。 乾燥したら乳鉢にて細かく砕き、 チューブなどに分注して 使用時まで一 2 0 °Cで保存する。 餌の調製例 3 fGHポリぺプチドを発現しているラン藻 （凍結乾燥体） 0. lgと市販 の餌 （スイ ミ一、 マルキュー（株）社製） 7.7 gおよびグルテン （マルキュ 一（株）社製） 2.2gを混ぜ合わせ、 さらに水を加えてよく混合する。 こ れを凍結乾燥機にて乾燥させる。 乾燥したら乳鉢にて細かく砕き、 チュ —ブなどに分注して使用時まで一 20°Cで保存する。
餌の調製例 4
fGHポリペプチドを発現しているラン藻 （凍結乾燥体） 0.3gと市販 の餌 （熱帯魚飼料ひかりクレストグッピ一、 キヨーリ ン（株）社製） 2. 7gとを混ぜ合わせ、 さらに水を加えてよく混合する。 これを凍結乾燥 機にて乾燥させる。 乾燥したら乳鉢にて細かく砕き、 チューブなどに分 注して使用時まで一 20°Cで保存する。
餌の調製例 5
fGHポリペプチド入りの餌はデイスカスの餌 （テトラべルケ社製） 1 9.7 gに凍結乾燥したアナキスティ ス .ニジュランス PCC6301old 形 質転換体 0.3 gおよび水を加えよく練り、 凍結乾燥後、 乳鉢にて細か く砕く ことによって作製した。 作製した餌はチューブなどに分注し使用 時まで一 20°Cで保存した。
餌の調製例 6
fGHポリペプチド入りの餌はデイスカスの餌 （テトラべルケ社製） 9. 9 gに凍結乾燥したアナキスティス ·ニジュランス PCC6301old 形質転 換体 0. 1 gおよび水を加えよく練り、 凍結乾燥後、 乳鉢にて細かく砕 く ことによって作製した。 作製した餌はチューブなどに分注し使用時ま で— 20°Cで保存した。 配 列
配列番号： 1
配列の長さ ： 1 8 7
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： ぺプチド
配列 ：
5 10 15
Gin Pro lie Thr Asp Ser Gin Arg Leu Phe Ser lie Ala Val Ser
20 25 30 Arg Val Gin His Leu His Leu Leu Ala Gin Arg Leu Phe Ser Asp
35 40 45 Phe Glu Ser Ser Leu Gin Thr Glu Glu Gin Arg Gin Leu Asn Lys
50 55 60 lie Phe Leu Gin Asp Phe Cys Asn Ser Asp Tyr lie lie Ser Pro
65 70 75 lie Asp Lys His Glu Thr Gin Arg Ser Ser Val Leu Lys Leu Leu
80 85 90 Ser lie Ser Tyr Arg Leu Val Glu Ser Trp Glu Phe Pro Ser Arg
95 100 105 Ser Leu Ser Gly Gly Ser Ala Pro Arg Asn Gin lie Ser Pro Lys
110 115 120 Leu Ser Glu Leu Lys Met Gly lie His Leu Leu lie Arg Ala Asn
125 130 135 Gin Asp Gly Ala Glu Met Phe Ala Asp Ser Ser Ala Leu Gin Leu
140 145 150 Ala Pro Tyr Gly Asn Tyr Tyr Gin Ser Leu Gly Gly Asp Glu Ser
155 160 165 Leu Arg Arg Asn Tyr Glu Leu Leu Ala Cys Phe Lys Lys Asp Met
170 175 180 His Lys Val Glu Thr Tyr Leu Arg Val Ala Lys Cys Arg Leu Ser 185
Pro Glu Ala Asn Cys Thr Leu 配列番号： 2
配列の長さ ： 5 6 1
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： 合成 D N A
配列 ：
CAGCCTATTA CCGATTCTCA GCGTCTGTTC TCTATTGCTG TTTCTCGTGT TCAGCACCTG 60 CACCTGCTGG CGCAGCGTCT GTTCTCTGAT TTTGAATCTT CTCTGCAAAC CGAAGAACAG 120 CGTCAGCTGA ACAAAATTTT CCTGCAGGAT TTCTGTAACT CTGATTACAT TATTTCTCCT 180 ATTGATAAAC ACGAAACTCA GCGTTCTTCT GTTCTGAAAC TGCTGTCTAT TTCTTACCGT 240 CTGGTTGAAT CTTGGGAATT CCCTTCTCGT TCTCTGTCTG GTGGTTCTGC TCCTCGTAAC 300 CAGATTTCTC CTAAACTGTC CGAGCTCAAA ATGGGTATTC ACCTGCTGAT TCGTGCTAAC 360 CAGGATGGTG CTGAAATGTT CGCTGATTCT TCTGCTCTGC AGCTCGCTCC TTACGGTAAC 420 TACTACCAGT CTCTGGGTGG TGATGAATCT CTGCGTCGTA ACTACGAACT GCTGGCTTGT 480 TTCAAAAAAG ATATGCACAA AGTTGAAACC TACCTGCGTG TCGCGAAATG TCGTCTGTCT 540 CCTGAAGCTA ACTGCACCCT G 561

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 下記のアミノ酸配列 （配列表の配列番号 1 )
5 10 15
Gin Pro lie Thr Asp Ser Gin Arg Leu Phe Ser lie Ala Val Ser
20 25 30 Arg Val Gin His Leu His Leu Leu Ala Gin Arg Leu Phe Ser Asp
35 40 45
Phe Glu Ser Ser Leu Gin Thr Glu Glu Gin Arg Gin Leu Asn Lys
50 55 60 lie Phe Leu Gin Asp Phe Cys Asn Ser Asp Tyr lie lie Ser Pro
65 70 75 lie Asp Lys His Glu Thr Gin Arg Ser Ser Val Leu Lys Leu Leu
80 85 90
Ser lie Ser Tyr Arg leu Val Glu Ser Trp Glu Phe Pro Ser Arg
95 100 105
Ser Leu Ser Gly Gly Ser Ala Pro Arg Asn Gin lie Ser Pro Lys
110 115 120
Leu Ser Glu Leu Lys Met Gly lie His Leu Leu lie Arg Ala Asn
125 130 135
Gin Asp Gly Ala Glu Met Phe Ala Asp Ser Ser Ala Leu Gin Leu
140 145 150
Ala Pro Tyr Gly Asn Tyr Tyr Gin Ser Leu Gly Gly Asp Glu Ser
155 160 165
Leu Arg Arg Asn Tyr Glu Leu Leu Ala Cys Phe Lys Lys Asp Met
170 175 180
His Lys Val Glu Thr Tyr Leu Arg Val Ala Lys Cys Arg Leu Ser
185
Pro Glu Ala Asn Cys Thr Leu 又は上記ァミノ酸配列において 1 もしくは数個のァミノ酸が欠失、 置換 もしくは付加されたァミノ酸配列からなり且つ魚類成長ホルモン様作用 を示すポリべプチド。
2 . 請求の範囲第 1項記載のポリベプチドをコ一ドする DNA。
3 . 下記の塩基配列 （配列表の配列番号 2 )
CAGCCTATTA CCGATTCTCA GCGTCTGTTC TCTATTGCTG TTTCTCGTGT TCAGCACCTG 60 CACCTGCTGG CGCAGCGTCT GTTCTCTGAT TTTGAATCTT CTCTGCAAAC CGAAGAACAG 120 CGTCAGCTGA ACAAAATTTT CCTGCAGGAT TTCTGTAACT CTGATTACAT TATTTCTCCT 180
ATTGATAAAC ACGAAACTCA GCGTTCTTCT GTTCTGAAAC TGCTGTCTAT TTCTTACCGT 240
CTGGTTGAAT CTTGGGAATT CCCTTCTCGT TCTCTGTCTG GTGGTTCTGC TCCTCGTAAC 300
CAGATTTCTC CTAAACTGTC CGAGCTCAAA ATGGGTATTC ACCTGCTGAT TCGTGCTAAC 360
CAGGATGGTG CTGAAATGTT CGCTGATTCT TCTGCTCTGC AGCTCGCTCC TTACGGTAAC 420 TACTACCAGT CTCTGGGTGG TGATGAATCT CTGCGTCGTA ACTACGAACT GCTGGCTTGT 480
TTCAAAAAAG ATATGCACAA AGTTGAAACC TACCTGCGTG TCGCGAAATG TCGTCTGTCT 540
CCTGAAGCTA ACTGCACCCT G 561 からなる請求の範囲第 2項記載の DNA。
4 . 請求の範囲第 3項記載の DMを含むことを特徴とする請求の範囲 第 1項記載のポリペプチドを発現しうるベクター。
5 . p B A X 1 8 f G Hである請求の範囲第 4項記載のベクター。
6 . 請求の範囲第 4項記載の発現べクタ一で形質転換されたらん藻。
7 . p B A X 1 8 f G Hで形質転換されたアナキスティス ·ニジユラ ンス PCC6301old 株。
8 . 請求の範囲第 1項記載のポリペプチドを発現した請求の範囲第 7 項記載の形質転換されたアナキスティス ·ニシュランス PCC6301old 株 の乾燥菌体。
9 . 請求の範囲第 1項記載のポリべプチドまたは請求の範囲第 8項記 載の乾燥菌体を含有する魚類餌料。
1 0 . 魚に請求の範囲第 1項記載のポリべプチドまたは請求の範囲第 8項記載の乾燥菌体を投与することを特徴とする魚類の生育促進又は稚 魚のへい死率の低減のための方法。
1 1 . 魚類の餌料の調製における請求の範囲第 1項記載のポリべプチ ドまたは請求の範囲第 8項記載の乾燥菌体の使用。
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