JP3669184B2 - 免疫学的測定方法及び免疫学的測定装置 - Google Patents
免疫学的測定方法及び免疫学的測定装置Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、溶液中の抗原または抗体の濃度を測定する免疫学的測定方法及び免疫学的測定装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、抗原の一種であるアレルゲンが発症原因物質とされる花粉症等のアレルギー性鼻炎、アレルギー性気管支喘息、アトピー性皮膚炎等のいわゆるアレルギー症患が、先進諸国を中心に増加傾向にあり、ダニ、花粉、動物の毛、カビ等の各種構成物質がその原因物質であることが特定されてきている。これらのアレルギー症状は比較的軽度の場合もあるが、アレルギー性気管支喘息のように死に至るほど重篤な場合もある。このため、感作、発症を抑制するための一つの手段として、各個人に特有な発症原因物質であるアレルゲンを低レベルに維持することが必要になってくる。しかし、現状ではアレルゲンの測定は比較的難しい高度な技術とされ、専門の測定技術者を必要とし、半日から１日かかる長い測定時間を必要とし、かつ高価な測定装置が必要である。ところで、環境中のアレルゲン濃度とアレルギー疾患の感作・発症は一般的に相関することが知られている。環境中のアレルゲン濃度の測定をおこなえば、掃除、洗濯等をどの程度おこなったり、どのくらいの頻度おこなえばよいのかの指標となり、アレルギー疾患患者やアレルギー疾患の感作の危険のある者にとって社会生活上有用なものとなる。また、アレルギー疾患患者の血液中のＩｇＥ抗体の濃度が即時型アレルギー反応のＩ型アレルギーの感作程度の指標になることも一般に知られており、血液中のＩｇＥ抗体濃度の測定が感作の程度ひいてはアレルギー疾患の程度を知るための指標としてきわめて有用である。
【０００３】
また、近年病原性大腸菌Ｏ−１５７に代表されるバクテリア等の微生物の感染、代謝物に起因する食中毒等の被害が問題になっているが、問題となる微生物の検出は培養した後に種類の同定や定量することが一般的であり、培養操作に時間が掛かることを主因として検査結果が出るまで１〜７日間といった長時間を要し、かつ専門の測定技術者を必要とする。特に生鮮食品等への検査の必要が生じた場合には、測定時間が長いことが問題となる。ところで、このような微生物と上記した抗原は無縁のものではない。すなわち、菌体例えば病原性大腸菌Ｏ−１５７という名称は抗体の名前に由来しており、病原性大腸菌Ｏ−１５７は“Ｏ−１５７という抗体が特異的に結合する抗原決定基を菌体表面に発現した病原性を有する大腸菌”の意味である。個々の微生物種はそれぞれ体表面に固有の抗原決定基を有しており、微生物自体を抗原と捉えることができる。以上のような理由で、微生物を抗原として同定、定量することが可能であり、生鮮食品等の検査にきわめて有用である。
【０００４】
このような背景から、抗原あるいは抗体濃度をそれぞれ特異的、迅速、簡便さらに高感度に測定する方法およびその方法を利用した安価な測定装置が求められている。
【０００５】
以下、従来の抗原濃度の分析方法について説明する。
従来の抗原抗体反応を利用した抗原の測定法は免疫測定法と総称され、非標識免疫測定法と標識免疫測定法に大別される。非標識免疫測定法は抗体に酵素等の標識物質を結合せずに抗原抗体反応による物理量等の変化を利用して抗原の量を測定する方法である。非標識免疫測定法にはＳＰＲ法（表面プラズモン共鳴法）や水晶振動子を使った方法等がある。標識免疫測定法は抗体に酵素等の標識物質を結合させたものを使用し標識物質の量を測定することで抗原の量を測定する方法である。標識免疫測定法には標識の種類によってラジオイムノアッセイ法（放射性同位体標識）、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法（例えば、石川英治ら：「酵素免疫測定法（第三版）」、ｐ３１〜５４、医学書院（１９８７）を参照）等がある。
【０００６】
これらの測定法のうち現在主として用いられている免疫測定法は、酵素免疫測定法の一種であるＥＬＩＳＡ法と呼称される方法である。なかでも特に、サンドイッチ法（以下サンドイッチＥＬＩＳＡ法）と呼ばれる方法が、測定感度が高いことと比較的操作が簡易であることを主な理由に一般的に広く用いられている。
【０００７】
例えば、ダニアレルゲンの測定をする場合を例にしてサンドイッチＥＬＩＳＡ法がどの様におこなはれるのか図１４と図１５に基づいて概要を説明する。
【０００８】
図１４は従来のサンドイッチＥＬＩＳＡ法の主要工程を示す模式図であり、図１５は同各ステップの反応模式を示す図である。
【０００９】
図１４において、８０はＣ−１．測定用反応容器作製工程、８１はＣ−２．反応工程、８２はＣ−３．測定工程、８３はＣ−４．換算工程である。
【００１０】
図１５において、１は測定用反応容器、９１は抗体、９２は抗原、９４は酵素標識抗体、９５は酵素である。
【００１１】
この方法は図１４に示すように４段階の工程（Ｃ−１．測定用反応容器作製工程）、（Ｃ−２．反応工程）、（Ｃ−３．測定工程）、および（Ｃ−４．換算工程）から構成される。
【００１２】
以下、上記４段階の工程について説明する。
（Ｃ−１．測定用反応容器作製工程）
これは抗体を測定用反応容器に固定化して安定化状態とする工程である。以下に示す（ａ）乃至（ｅ）のステップから構成される。
【００１３】
（Ｃ−１ａ）は抗原に特異的に結合する抗体９１を測定用反応容器１に固定化するステップである。非特異的な吸着が起こり易い測定用反応容器１に、測定対象の抗原に特異的に結合する抗体９１の溶液を注ぎ、測定用反応容器１の固相に抗体９１を非特異吸着させて固定化する。
【００１４】
（Ｃ−１ｂ）は未反応の抗体９１を洗浄除去するステップである。緩衝液等で３回以上測定用反応容器１を洗浄して、未反応であった抗体９１を除去する。
【００１５】
（Ｃ−１ｃ）はブロッキング剤で測定用反応容器１の非特異吸着面を被覆するステップである。測定用反応容器１にブロッキング剤溶液を注ぎ、測定用反応容器１の表面に残存する非特異吸着面に、ブロッキング剤を非特異吸着させ、以後他の有機物等の測定用反応容器１への非特異的吸着が極力おこらないようにする。
【００１６】
（Ｃ−１ｄ）は未反応のブロッキング剤を洗浄除去するステップである。緩衝液等で３回以上測定用反応容器１を洗浄して、未反応であったブロッキング剤を除去する。
【００１７】
（Ｃ−１ｅ）は測定用の測定用反応容器１を保存可能とする処理をするステップである。保存手段として凍結乾燥法を用いて、測定用反応容器１を長期安定化した状態とする。
【００１８】
（Ｃ−２．反応工程）
これは抗原量に比例した量の酵素標識抗体を測定用反応容器１に固定化させる工程である。以下に示す（ａ）乃至（ｄ）のステップから構成される。
【００１９】
（Ｃ−２ａ）は抗原９２を測定用反応容器１に特異的に固定化するステップである。少なくとも３つの測定用反応容器１に濃度が既知の標準抗原溶液、抗原９２を含有する被検液、およびブランク液をそれぞれ注ぎ、それぞれ同条件下で平行して標準抗原または抗原９２を測定用反応容器１内の固定化抗体９１に抗原抗体反応で特異的に結合させる。
【００２０】
（Ｃ−２ｂ）は未反応の抗原９２を洗浄除去するステップである。緩衝液等で３回以上測定用反応容器１を洗浄して、未反応であった抗原９２を除去する。
【００２１】
（Ｃ−２ｃ）は酵素標識抗体９４を測定用反応容器１に特異的に結合させるステップである。測定用反応容器１に酵素標識抗体９４溶液を注ぎ、酵素標識抗体９４を測定用反応容器１内の抗原抗体複合体の抗原９２を介して抗原抗体反応で特異的に結合させる。
【００２２】
（Ｃ−２ｄ）は未反応の酵素標識抗体９４を洗浄除去するステップである。緩衝液等で３回以上測定用反応容器１を洗浄して、未反応であった酵素標識抗体９４を除去する。
【００２３】
以上各ステップの反応模式図を図１５に示す。抗体９１が固定化された測定用反応容器１を図１５（ａ）に示し、測定用反応容器１への抗原９２含有溶液の添加時の状態を図１５（ｂ）に示し、時間経過による固定化抗体９１と抗原９２の抗原抗体反応の進行を図１５（ｃ）に示し、洗浄操作による未反応抗原９２を除去した状態を図１５（ｄ）に示し、測定用反応容器１への酵素標識抗体９４の添加した状態を図１５（ｅ）に示し、時間経過による固定化抗体９１−抗原９２複合体と酵素標識抗体９４の抗原抗体反応の進行状態を図１５（ｆ）に示し、洗浄操作による未反応酵素標識抗体９４を除去した状態を図１５（ｇ）に示す。
【００２４】
（Ｃ−３．測定工程）
これは発色基質を添加して酵素反応で発色させ、発色の度合いを測定する工程である。以下に示す（ａ）乃至（ｃ）のステップから構成される。
【００２５】
（Ｃ−３ａ）は基質を酵素反応で発色させるステップである。基質溶液を測定用反応容器１に添加し、測定用反応容器１内の酵素標識抗体９４の酵素９５に基質から酵素反応によって色素を生成させる。
【００２６】
（Ｃ−３ｂ）は酵素反応を停止させるステップである。反応停止液を測定用反応容器１に添加して酵素反応を停止させる。
【００２７】
（Ｃ−３ｃ）は発色波長における発色の度合いの測定ステップである。分光光度計の所定の波長で生じた色素を測定する。
【００２８】
（Ｃ−４．換算工程）
これは標準抗原溶液の検量線より抗原濃度の換算をおこなう工程である。以下に示す（ａ）のステップから構成される。
【００２９】
（Ｃ−４ａ）は換算ステップである。測定結果から標準抗原溶液の検量線を作成し、被検液の抗原濃度の換算をおこない、被検液の抗原濃度の値を得ることができる。
【００３０】
尚、以上が抗原濃度の測定についての説明であるが、抗原と抗体を入れ替えて抗体を測定することでもまったく同一である。したがって、特に断らない限り、一方を説明したらもう一方も説明しているものである。さらに、必要に応じて抗原（または抗体）あるいは抗体（または抗原）と明示的に記載することとする。
【００３１】
【発明が解決しようとする課題】
上記従来の測定方法は、以下の課題を有していた。
【００３２】
（１）２ステップの抗原抗体反応（上記（Ｃ−２ａ）、（Ｃ−２ｃ））が必要で、反応全てが完全に進行せねば正しい値が得られず、かつ全体で４〜２４時間程度と測定に要する時間が長い。特に精度を向上させるためには２４時間程度を要し、測定時間が長いという課題を有していた。
【００３３】
（２）１０種類程度の異なる試薬を必要とし、また、２ステップの洗浄操作（上記（Ｃ−２ｂ）、（Ｃ−２ｄ））をおこなう必要があり、作業が煩雑で操作性が悪く、利便性に欠けるという課題を有していた。
【００３４】
（３）試験をおこなうためには分注器、恒温槽、冷蔵庫等が必要であり、測定コストが高いという課題を有していた。
【００３５】
本発明は上記従来の課題を解決するもので、迅速、簡便、安価に定量することができる抗原（または抗体）の特異的な測定方法を提供、及び迅速、簡便、高精度な測定が自動的におこなえ、低原価で量産できる抗原（または抗体）の特異的な免疫学的測定装置を提供することを目的とする。
【００３６】
【課題を解決するための手段】
この目的を達成するために本発明の免疫学的測定方法及び測定装置は次の構成からなる。
【００３７】
本発明の免疫学的測定方法は、測定用反応容器の固相に測定対象である第二の抗原と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗原を一定量固定し、次いで、測定対象である第二の抗原と前記抗原と特異的に結合することができ標識物質を結合した抗体を含有する被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、前記測定用反応容器に固定された前記第一の標準抗原と前記被検液中の前記第二の抗原とで前記抗体を抗原抗体反応によりそれぞれの抗原濃度に応じて分配して抗原抗体複合体を形成させた後、前記測定用反応容器に比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を添加または分離用固体を挿入し、前記測定用反応容器の固相上の標識物質の反応を抑制し、前記被検液の液相中の前記標識物質量の測定を行う構成を有している。
【００３８】
この構成により、迅速、簡便、安価に定量することができる抗原（または抗体）の特異的な免疫学的測定方法を提供することができる。
【００３９】
また、本発明の免疫学的測定装置は、測定対象である第二の抗原と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗原を一定量固定した測定用反応容器を移送する移送部と、測定対象である第二の抗原と前記抗原と特異的に結合できる標識物質を結合した抗体を含有した被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を一定量添加する分離用液体注入部または分離用固体を挿入する分離用固体挿入部と、前記被検液中の前記第二の抗原と抗原抗体反応した前記抗体の前記標識物質の量を測定する測定部と、前記測定部が計測した前記標識物質の量を前記被検液の前記第二の抗原濃度に換算する換算部と、を備えた構成を有している。
【００４０】
この構成により、迅速、簡便、高精度な測定が自動的におこなえ、低原価で量産できる抗原（または抗体）の特異的な免疫学的測定装置を提供することができる。
【００４１】
【発明の実施の形態】
本発明の請求項１に記載の免疫学的測定方法は、測定用反応容器の固相に測定対象である第二の抗原と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗原を一定量固定し、次いで、測定対象である第二の抗原と前記抗原と特異的に結合することができ標識物質を結合した抗体を含有する被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、前記測定用反応容器に固定された前記第一の標準抗原と前記被検液中の前記第二の抗原とで前記抗体を抗原抗体反応によりそれぞれの抗原濃度に応じて分配して抗原抗体複合体を形成させた後、前記測定用反応容器に比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を添加または分離用固体を挿入し、前記測定用反応容器の固相上の標識物質の反応を抑制し、前記被検液の液相中の前記標識物質量の測定を行う構成を有している。
【００４２】
これにより、（１）別途作製され保存された前記測定用反応容器を用いることで測定を簡便・迅速化することができるという作用を有する。
【００４３】
（２）前記測定用反応容器は前記抗原だけを固定化しているため、長期保存をすることができるという作用を有する。
【００４４】
（３）抗原抗体反応は被検液と測定用反応容器の接触を行うときの一回であるため短時間のうちに、かつ複数回の反応であるならば各反応間に必要となる洗浄を不要化することができ、測定用反応容器に固定化された一定量の第一の標準抗原と被検液中の第二の抗原によって、被検液に添加した前記抗体を、それぞれの抗原濃度に応じて所定の割合に分配させ、分配された抗体量と標識物質には所定の関係があるため、前記測定用反応容器または前記被検液と結合した前記標識物質の量を測定することによって、前記被検液中の第二の抗原濃度を算出することができるという作用を有する。
【００４５】
ここで、測定用反応容器は、ポリスチレン、ガラス、石英ガラスの光学的に透明な材料を用いて形成される。測定用反応容器の水平断面積が１０ｍｍ2〜５００ｍｍ2が用いられる。また、測定用反応容器１の内容量が１０μｌ〜１５ｍｌ、好ましくは５０μｌ〜５００μｌが用いられる。測定用反応容器の内容量が５０μｌより小さくなるにつれ、操作が困難になるという傾向が認められ、また５００μｌよりも大きくなるにつれ、一検体を測定するのに要する高価な抗原、抗体等の試薬を大量に要し無駄にするという傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【００４６】
測定用反応容器は独立した単一又は複数の容器の集合体でよい。例えば、図３に示すように形成される。
【００４７】
標準抗原としては、濃度既知の抗原である菌体やアレルゲンの溶液が用いられる。標準抗原溶液は菌体の場合は１０4個／ｍｌ〜１０12個／ｍｌ、好ましくは１０7個／ｍｌ〜１０11個／ｍｌが用いられ、アレルゲンの場合は０．０００１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．００１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌが用いられる。標準抗原の濃度は、菌体の場合１０7個／ｍｌあるいはアレルゲンの場合０．００１μｇ／ｍｌより少なくなるにつれ、充分な抗原量を測定用反応容器１に接触し非特異吸着により固定化することが不可能となる傾向が認められ、また菌体の場合１０11個／ｍｌあるいはアレルゲンの場合１０μｇ／ｍｌよりも多くなるにつれ、吸着量が飽和して未反応の抗原が増加し、経済性が悪くなる傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【００４８】
標準抗原溶液の溶媒としては、りん酸緩衝液、ホウ酸緩衝液が用いられる。他の溶液のｐＨを一定に保持することができるものでもよい。前記緩衝液に塩類、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムを溶解して使用するのが好ましい。緩衝液のｐＨとしてはｐＨ５〜ｐＨ９、好ましくはｐＨ６〜ｐＨ８が用いられる。緩衝液のｐＨがｐＨ６より小さくなるにつれ、安定な抗原の非特異吸着を測定用反応容器に発生させることができないという傾向が認められ、またｐＨ８よりも大きくなるにつれ、安定な抗原の非特異吸着を測定用反応容器に発生させることができないという傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【００４９】
本発明の請求項２に記載の免疫学的測定方法は、測定用反応容器の固相に測定対象である第二の抗体と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗体を一定量固定し、次いで、測定対象である第二の抗体と前記抗体と特異的に結合することができ標識物質を結合した抗原を含有する被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、前記測定用反応容器に固定された前記第一の標準抗体と前記被検液中の前記第二の抗体とで前記抗原を抗原抗体反応によりそれぞれの抗体濃度に応じて分配して抗原抗体複合体を形成させた後、前記測定用反応容器に比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を添加または分離用固体を挿入し、前記測定用反応容器の固相上の標識物質の反応を抑制し、前記被検液の液相中の前記標識物質量の測定を行う構成を有している。
【００５０】
これにより、（１）別途作製され保存された前記測定用反応容器を用いることで測定を簡便・迅速化することができるという作用を有する。
【００５１】
（２）前記測定用反応容器は前記抗体だけを固定化しているため、長期保存をすることができるという作用を有する。
【００５２】
（３）抗原抗体反応は被検液と測定用反応容器の接触を行うときの一回であるため短時間のうちに、かつ複数回の反応であるならば各反応間に必要となる洗浄を不要化することができ、測定用反応容器に固定化された一定量の第一の標準抗体と被検液中の第二の抗体によって、被検液に添加した前記抗原を、それぞれの抗体濃度に応じて所定の割合に分配させ、分配された抗原量と標識物質には所定の関係があるため、前記測定用反応容器または前記被検液と結合した前記標識物質の量を測定することによって、前記被検液中の第二の抗体濃度を算出することができるという作用を有する。
【００５３】
ここで、測定用反応容器としては、請求項１と同様のものが用いられる。
標準抗体としては、抗原である菌体又はアレルゲンに特異的な結合能を有するモノクロナール（又はポリクロナール）抗体が用いられる。標準抗体溶液は標準抗体が０．０００１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．００１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌが用いられる。標準抗体が０．００１μｇ／ｍｌより少なくなるにつれ、充分な抗体量を測定用反応容器に固定化することが不可能となるという傾向が認められ、また１０μｇ／ｍｌよりも多くなるにつれ、吸着量が飽和して未反応の抗原が増加し、経済性が悪くなる傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【００５４】
標準抗体溶液の溶媒としては、請求項１と同様のものが用いられる。本発明の請求項３に記載の免疫学的測定方法は、測定用反応容器の固相に測定対象である第二の抗原と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗原を一定量固定し、次いで、前記第一の標準抗原と特異的に結合することができ標識物質を結合した抗体を前記第一の標準抗原に接触させ、固相上に前記第一の標準抗原と前記抗体の抗原抗体複合体を形成させた後、測定対象である第二の抗原を含有する被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、前記測定用反応容器に固定された前記第一の標準抗原と前記被検液中の前記第二の抗原とで前記抗体を抗原抗体反応によりそれぞれの抗原濃度に応じて分配して抗原抗体複合体を形成させ、前記測定用反応容器に比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を添加または分離用固体を挿入し、前記測定用反応容器の固相上の標識物質の反応を抑制し、前記被検液の液相中の前記標識物質量の測定を行う構成を有している。
【００５５】
これにより、（１）別途作製され保存された前記測定用反応容器を用いることで測定を簡便・迅速化することができるという作用を有する。
【００５６】
（２）前記測定用反応容器には前記第一の標準抗原と前記抗体を固定化しているため、前記抗体を後で加える操作を省くことができるという作用を有する。
【００５７】
（３）抗原抗体反応は被検液と測定用反応容器の接触を行うときの一回であるため短時間のうちに、かつ複数回の反応であるならば各反応間に必要となる洗浄を不要化することができ、測定用反応容器に固定化された一定量の第一の標準抗原と被検液中の第二の抗原によって、被検液に添加した前記抗体を、それぞれの抗原濃度に応じて所定の割合に分配させ、分配された抗体量と標識物質には所定の関係があるため、前記測定用反応容器または前記被検液と結合した前記標識物質の量を測定することによって、前記被検液中の第二の抗原濃度を算出することができるという作用を有する。
【００５８】
ここで、測定用反応容器としては、請求項１と同様のものが用いられる。
標準抗原としては、請求項１と同様のものが用いられる。
【００５９】
標準抗原溶液の溶媒としては、請求項１と同様のものが用いられる。本発明の請求項４に記載の免疫学的測定方法は、測定用反応容器の固相に測定対象である第二の抗体と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗体を一定量固定し、次いで、前記第一の標準抗体と特異的に結合することができ標識物質を結合した抗原を前記第一の標準抗体に接触させ、固相上に前記第一の標準抗体と前記抗原の抗原抗体複合体を形成させた後、測定対象である第二の抗体を含有する被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、前記測定用反応容器に固定された前記第一の標準抗体と前記被検液中の前記第二の抗体とで前記抗原を抗原抗体反応によりそれぞれの抗体濃度に応じて分配して抗原抗体複合体を形成し、前記測定用反応容器に比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を添加または分離用固体を挿入し、前記測定用反応容器の固相上の標識物質の反応を抑制し、前記被検液の液相中の前記標識物質量の測定を行う構成を有している。
【００６０】
これにより、（１）別途作製され保存された前記測定用反応容器を用いることで測定を簡便・迅速化することができるという作用を有する。
【００６１】
（２）前記測定用反応容器には前記第一の標準抗体と前記抗原を固定化しているため、前記抗原を後で加える操作を省くことができるという作用を有する。
【００６２】
（３）抗原抗体反応は被検液と測定用反応容器の接触を行うときの一回であるため短時間のうちに、かつ複数回の反応であるならば各反応間に必要となる洗浄を不要化することができ、測定用反応容器に固定化された一定量の第一の標準抗体と被検液中の第二の抗体によって、被検液に添加した前記抗原を、それぞれの抗体濃度に応じて所定の割合に分配させ、分配された抗原量と標識物質には所定の関係があるため、前記測定用反応容器または前記被検液と結合した前記標識物質の量を測定することによって、前記被検液中の第二の抗体濃度を算出することができるという作用を有する。
【００６３】
ここで、測定用反応容器としては、請求項１と同様のものが用いられる。
標準抗体としては、請求項２と同様のものが用いられる。
【００６４】
標準抗体溶液の溶媒としては、請求項１と同様のものが用いられる。
請求項５に記載の免疫学的測定方法は、請求項１乃至４の内いずれか１項に記載の発明において、標識物質が酵素である構成を有している。
【００６５】
これにより、請求項１乃至４の内いずれか１項により得られる作用の他、酵素を利用することで、速く、容易に、安価に抗原または抗体を測定することができるという作用を有する。
【００６６】
ここで、酵素としては、ペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等が用いられる。
【００６７】
請求項６に記載の免疫学的測定方法は、請求項１乃至５の内いずれか１項に記載の発明において、分離用液体が、シリコンオイル、単糖類の溶液、二糖類以上の多糖類の溶液、ゼラチンの溶液、ポリエチレングリコールの溶液、アルギン酸ナトリウムの溶液の少なくとも１種またはそれらの混合物である構成を有している。
【００６８】
これにより、請求項１乃至５の内いずれか１項により得られる作用の他、測定用反応容器固相上の抗原抗体複合体と前記被検液の液相中の抗原抗体複合体との分離を、前記分離用液体を添加するだけで、短時間かつ容易におこなうことができるという作用を有する。
【００６９】
ここで、単糖類としては、トレオース、エリトロース、エリツルロース、リボース、デオキシリボース、アラビノース、キシロース、リブロース、キシルロース、アラビヌロース、グルコース、マンノース、アロース、アルトロース、ガラクトース、タロース、イドース、グロース、フコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、プシコース等が用いられる。また、二糖類以上の多糖類としては、スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、トレハロース等が用いられる。
【００７０】
請求項７に記載の免疫学的測定方法は、請求項１乃至５の内いずれか１項に記載の発明において、分離用固体に１以上の貫通孔が形成された構成を有している。
【００７１】
これにより、請求項１乃至５の内いずれか１項により得られる作用の他、測定用反応容器固相上の抗原抗体複合体と前記被検液の液相中の抗原抗体複合体との分離を、前記分離用固体を挿入するだけで、短時間かつ容易におこなうことができるという作用を有する。
【００７２】
請求項８に記載の免疫学的測定装置は、測定対象である第二の抗原と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗原を一定量固定した測定用反応容器を移送する移送部と、測定対象である第二の抗原と前記抗原と特異的に結合できる標識物質を結合した抗体を含有した被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を一定量添加する分離用液体注入部または分離用固体を挿入する分離用固体挿入部と、前記被検液中の前記第二の抗原と抗原抗体反応した前記抗体の前記標識物質の量を測定する測定部と、前記測定部が計測した前記標識物質の量を前記被検液の前記第二の抗原濃度に換算する換算部と、を備えた構成を有している。
【００７３】
これにより、（１）測定用反応容器は抗原だけを固定化しているため、長期保存ができ、測定が常時簡便におこなうことができるという作用を有する。
【００７４】
（２）１台の測定装置により反応・測定・換算をおこなえるため、操作のバラツキや煩雑さが低減され、高精度かつ簡便な測定をおこなうことができるという作用を有する。
【００７５】
ここで、移送部は測定用反応容器を水平方向に順次移動させるための駆動力を供給する測定用反応容器駆動用モータと、測定用反応容器駆動用モータの駆動力を測定用反応容器に伝達するための測定用反応容器駆動用ベルトと、を備えている。
【００７６】
分離用液体注入部は、分離用溶液を貯留する分離用溶液槽と、分離用溶液槽内の分離用溶液の蒸発を防止する分離用溶液槽蓋と、分離用溶液槽の分離用溶液を測定用反応容器に注入するための分離用溶液ポンプと、分離用溶液ポンプから吐出される分離用溶液を測定用反応容器に導くための分離用溶液注入ノズルと、を備えている。
【００７７】
分離用固体挿入部は、分離用固体と、分離用固体を挿入するための駆動力を供給する分離用固体挿入用モータと、分離用固体挿入用モータの駆動力を分離用固体に伝達するための分離用固体挿入用サポートと、を備えている。
【００７８】
測定部は、可視光を照射するための発光ダイオード、ハロゲンランプを用いた発光部と、測定用反応容器の透過光を検知するために必要に応じてフィルタ、レンズ、フォトマル、フォトダイオードを使用した受光部と、を備えている。
【００７９】
換算部は、液晶等を使用した表示部と、入力部と、サーマルヘッドプリンタ等を利用した印字部と、外部情報の入力や出力を行うための入出力インターフェース部と、電源部と、マイコン又は制御部と、を備えている。
【００８０】
請求項９に記載の免疫学的測定装置は、測定対象である第二の抗体と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗体を一定量固定した測定用反応容器を移送する移送部と、測定対象である第二の抗体と前記抗体と特異的に結合できる標識物質を結合した抗原を含有した被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を一定量添加する分離用液体注入部または分離用固体を挿入する分離用固体挿入部と、前記被検液中の前記第二の抗体と抗原抗体反応した前記抗原の前記標識物質の量を測定する測定部と、前記測定部が計測した前記標識物質の量を前記被検液の前記第二の抗体濃度に換算する換算部と、を備えた構成を有している。
【００８１】
これにより、（１）測定用反応容器は抗体だけを固定化しているため、長期保存ができ、測定が常時簡便におこなえることができるという作用を有する。
【００８２】
（２）１台の測定装置により反応・測定・換算をおこなえるため、操作のバラツキや煩雑さが低減され、高精度かつ簡便な測定をおこなうことができるという作用を有する。
【００８３】
ここで、移送部や分離用液体注入部又は分離用固体挿入部や測定部及び換算部は請求項８と同様のものが形成されている。
【００８４】
請求項１０に記載の免疫学的測定装置は、測定対象である第二の抗原と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗原を一定量固定し、前記第一の標準抗原と特異的に結合できる標識物質を結合した抗体と前記第一の標準抗原の抗原抗体複合体を形成させた測定用反応容器を移送する移送部と、測定対象である第二の抗原を含有した被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を一定量添加する分離用液体注入部または分離用固体を挿入する分離用固体挿入部と、前記被検液中の前記第二の抗原と抗原抗体反応した前記抗体の前記標識物質の量を測定する測定部と、前記測定部が計測した前記標識物質の量を前記被検液の前記第二の抗原濃度に換算する換算部と、を備えた構成を有している。
【００８５】
これにより、（１）測定用反応容器には前記抗原と前記抗体を固定化しているため、前記抗体を、後で加える操作を省くことができるという作用を有する。
【００８６】
（２）１台の測定装置により反応・測定・換算をおこなえるため、操作のバラツキや煩雑さが低減され、高精度かつ簡便な測定をおこなうことができるという作用を有する。
【００８７】
ここで、移送部や分離用液体注入部又は分離用固体挿入部や測定部及び換算部は請求項８と同様のものが形成されている。
【００８８】
請求項１１に記載の免疫学的測定装置は、測定対象である第二の抗体と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗体を一定量固定し、前記第一の標準抗体と特異的に結合できる標識物質を結合した抗原と前記第一の標準抗体の抗原抗体複合体を形成させた測定用反応容器を移送する移送部と、測定対象である第二の抗体を含有した被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を一定量添加する分離用液体注入部または分離用固体を挿入する分離用固体挿入部と、前記被検液中の前記第二の抗体と抗原抗体反応した前記抗原の前記標識物質の量を測定する測定部と、前記測定部が計測した前記標識物質の量を前記被検液の前記第二の抗体濃度に換算する換算部と、を備えた構成を有している。
【００８９】
これにより、（１）測定用反応容器には前記抗体と前記抗原を固定化しているため、前記抗原を、後で加える操作を省くことができるという作用を有する。
【００９０】
（２）１台の測定装置により反応・測定・換算をおこなえるため、操作のバラツキや煩雑さが低減され、高精度かつ簡便な測定をおこなうことができるという作用を有する。
【００９１】
ここで、移送部や分離用液体注入部又は分離用固体挿入部や測定部及び換算部は請求項８と同様のものが形成されている。
【００９２】
請求項１２に記載の免疫学的測定装置は、請求項８乃至１１の内いずれか１項に記載の発明において、前記測定用反応容器が１以上配設されユニット化された構成を有している。
【００９３】
これにより、請求項８乃至１１の内いずれか１項により得られる作用の他、複数の被険液を同時に測定でき、一被検液当たりの測定時間を短くし、一被検液当たりの測定操作を軽減し、一被検液当たりの測定に要する費用を安価にすることができるという作用を有する。
【００９４】
請求項１３に記載の免疫学的測定装置は、請求項８乃至１２の内いずれか１項に記載の発明において、測定用反応容器が、円筒体、角筒体の少なくとも１種またはそれらの複合した形状である構成を有している。
【００９５】
これにより、請求項８乃至１２の内いずれか１項により得られる作用の他、前記測定用試験片固相上の抗原抗体複合体と前記被検液の液相中の抗原抗体複合体との分離を、短時間かつ容易におこなうことができるという作用を有する。
【００９６】
請求項１４に記載の免疫学的測定装置は、請求項８乃至１３の内いずれか１項に記載の発明において、測定用反応容器の温度を一定に保持する温度保持手段を備えた構成を有している。
【００９７】
これにより、請求項８乃至１３の内いずれか１項により得られる作用の他、抗原抗体反応、酵素反応時の温度を一定とすることで、適正な反応を迅速かつ安定的に進行させ、測定時間を短くし、高精度な測定をおこなうことができるという作用を有する。
【００９８】
ここで、温度保持装置としては、反応時の温度を測定するために熱電対等を利用した温度センサと、ニクロム線、ペルチェ素子等を利用した温度調整ヒータと、温度センサからの温度測定結果を受けて設定した温度になるように温度調整ヒータを制御する温度調整ユニットと、を備えている。
【００９９】
請求項１５に記載の免疫学的測定装置は、請求項８乃至１４の内いずれか１項に記載の発明において、前記測定用反応容器を撹拌する撹拌手段を備えた構成を有している。
【０１００】
これにより、請求項８乃至１４の内いずれか１項により得られる作用の他、撹拌によって抗原抗体反応、酵素反応を効率的に進行させ、測定時間を短くすることができるという作用を有する。
【０１０１】
ここで、撹拌手段としては、移送部の測定用反応容器駆動用モータと、測定用反応容器駆動用ベルトと、により測定用反応容器を水平方向に１〜３００往復／分で振動する手段や、垂直方向に振動させる手段や、空気を被検液に導入し曝気する手段や、外部の磁性体の回転運動等を被検液中の磁性体に磁力により伝える手段等が用いられる。
【０１０２】
以下、本発明の抗原（または抗体）の免疫学的測定方法及び免疫学的測定装置の実施の形態について図面を参照しながら説明する。
【０１０３】
（実施の形態１）
実施の形態１では、抗体が特異的に結合する抗原決定基を有する菌体を抗原とし、分離用液体を使用して菌体数を測定する免疫学的測定方法及び免疫学的測定装置について説明する。
【０１０４】
以下、抗原の測定について説明するが、抗原と抗体を逆にすることも可能である。抗体の測定に関する説明は省略する。
【０１０５】
図１は本発明の実施の形態１の免疫学的測定装置の概略断面図であり、図２は本発明の実施の形態１の免疫学的測定装置の概略平面図であり、図３は本発明の実施の形態１の測定用反応容器を示す概略斜視図であり、図４は本発明の実施の形態１の主要工程を示す模式図であり、図５は本発明の実施の形態１の各ステップの反応模式を示す図である。
【０１０６】
図１、図２において、１は標準液や被検液等を保持して反応させるための測定用反応容器、２は測定用反応容器１を水平方向に順次移動させるための駆動力を供給する測定用反応容器駆動用モータ、３は測定用反応容器駆動用モータ２の駆動力を測定用反応容器１に伝達するための測定用反応容器駆動用ベルト、４は分離用溶液槽５内の分離用溶液の蒸発を防止するための分離用溶液槽蓋、５は分離用溶液を貯留するための分離用溶液槽、６は分離用溶液槽５の分離用溶液を測定用反応容器１に注入するための分離用溶液ポンプ、７は分離用溶液ポンプ６から吐出される分離用溶液を測定用反応容器１に導くための分離用溶液注入ノズル、８は基質溶液槽９内の基質溶液の蒸発を防止するための基質溶液槽蓋、９は基質溶液を貯留するための基質溶液槽、１０は基質溶液槽９の基質溶液を測定用反応容器１に注入するための基質溶液ポンプ、１１は基質溶液ポンプ１０から吐出される基質溶液を測定用反応容器１に導くための基質溶液注入ノズル、１２は反応停止液槽１３内の反応停止液の蒸発を防止するための反応停止液槽蓋、１３は反応停止液を貯留するための反応停止液槽、１４は反応停止液槽１３の反応停止液を測定用反応容器１に注入するための反応停止液ポンプ、１５は反応停止液ポンプ１４から吐出される反応停止液を測定用反応容器１に導くための反応停止液注入ノズル、１８は可視光を照射するための発光ダイオード、ハロゲンランプ等を使用した発光部、１９は測定用反応容器１の透過光を検知するために必要に応じてフィルタ、レンズ、フォトマル等を使用した受光部、２０はマイコン等を使用し菌体濃度まで算出する換算部、２１は液晶等を使用した表示部、２２は入力部、２３はサーマルヘッドプリンタ等を利用した印字部、２４は外部情報の入力や出力を行うための入出力インターフェース部、２５は電源部、２６は制御部、２７は測定用反応容器１を入れるための測定用反応容器挿入口、２８は測定用反応容器１を取り出すための測定用反応容器排出口、２９は筐体、３１は反応時の温度を測定するために熱電対等を使用した温度センサー、３２は温度センサー３１からの温度測定結果を受けて設定した温度になるように温度調整ヒータ３３を制御する温度調整ユニット、３３は温度調整のための熱を供給するためにニクロム線等を使用した温度調整ヒータである。
【０１０７】
図３において、５０は反応容器５１乃至５８を一体化する反応容器連結枠、５１乃至５８は独立した第１乃至第８反応容器である。
【０１０８】
図４において、７１はＡ−１．測定用反応容器作製工程、７２はＡ−２．反応工程、７３はＡ−３．測定工程、７４はＡ−４．換算工程である。
【０１０９】
図５において、９１は抗体、９２は抗原、９３は標準抗原、９４は酵素標識抗体、９５は酵素、４０は分離用溶液、７０は標準液あるいは被検液である。
【０１１０】
尚、図１または図２と同様のものには同一の符号を付して説明を省略する。
実施の形態１の免疫学的測定方法は、図４に示すように４段階の工程（Ａ−１．測定用反応容器作製工程）、（Ａ−２．反応工程）、（Ａ−３．測定工程）、および（Ａ−４．換算工程）から構成される。
【０１１１】
測定用反応容器１は以下の工程によって作製した。
（Ａ−１．測定用反応容器１作製工程）
これは標準抗原９３を測定用反応容器１（図３に示す）に固定化して安定化状態とする工程である。以下に示す（ａ）〜（ｇ）のステップから構成される。
【０１１２】
（Ａ−１ａ）は標準抗原９３を測定用反応容器１に固定化するステップである。標準抗原９３は測定対象となる抗原で単一種の菌体の懸濁液を使用する。
【０１１３】
測定用反応容器１は、ポリスチレン、ガラス、石英ガラスの光学的に透明な合成樹脂を用いて形成される。測定用反応容器１は独立した単一又は複数の容器の集合体でもよい。例えば、図３に示すように形成される。
【０１１４】
標準抗原溶液の標準抗原９３濃度としては１０4個／ｍｌ〜１０12個／ｍｌ、好ましくは１０7個／ｍｌ〜１０11個／ｍｌが用いられる。
【０１１５】
標準抗原９３溶液の溶媒としては、りん酸緩衝液、ホウ酸緩衝液が用いられる。他の溶液でｐＨを一定に保持することができるものでもよい。前記緩衝液に塩類、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウムを溶解して使用するのが好ましい。緩衝液のｐＨとしてはｐＨ５〜ｐＨ９、好ましくはｐＨ６〜ｐＨ８が用いられる。
【０１１６】
標準抗原９３溶液を測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８にそれぞれ同容量・同濃度となるように注ぐ。
【０１１７】
標準抗原９３溶液による測定用反応容器１の処理条件としては、ｐＨ５〜ｐＨ９、処理時間１０分〜４８時間、処理温度４℃〜４０℃、好ましくはｐＨ６〜ｐＨ８、処理時間３０分〜２時間、処理温度５℃〜３０℃が用いられる。この条件で浸漬処理することにより測定用反応容器１に標準抗原９３である菌体を高密度で非特異吸着させることが可能となる。
【０１１８】
（Ａ−１ｂ）は未反応の標準抗原９３を洗浄除去するステップである。緩衝液で、測定用反応容器１を好ましくは１回〜１０回、好ましくは２回〜５回洗浄することで未反応の標準抗原９３を効率的に除去することができ、以降の測定の精度を向上させることができる。
【０１１９】
（Ａ−１ｃ）はブロッキング剤で測定用反応容器１の非特異吸着面を被覆するステップである。測定用反応容器１にブロッキング剤溶液を注ぐ。ブロッキング剤溶液による測定用反応容器１の処理条件としては、ｐＨ５〜ｐＨ９、処理時間１０分〜４８時間、処理温度４℃〜４０℃、好ましくはｐＨ６〜ｐＨ８、処理時間３０分〜２時間、処理温度５℃〜３０℃が用いられる。この条件で浸漬処理することにより測定用反応容器１に残存する非特異吸着を起こす表面にブロッキング剤を非特異吸着させ、以後他の有機物の非特異吸着が極力おこらないようになり、より精度の高い測定が可能となる。
【０１２０】
ブロッキング剤として、牛血清アルブミン、牛乳由来カゼイン、ゼラチン等のタンパク質を含有したブロッキング剤溶液を使用する。ブロッキング剤溶液の溶媒としては、りん酸緩衝液、ホウ酸緩衝液が用いられる。他の溶液のｐＨを一定に保持することができるものでもよい。前記緩衝液に塩類、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムを溶解して使用するのが好ましい。緩衝液のｐＨとしては、ｐＨ５〜ｐＨ９、好ましくはｐＨ６〜ｐＨ８が用いられる。緩衝液のｐＨがｐＨ６より小さくなるにつれ、安定なブロッキング剤の非特異吸着を測定用反応容器に発生させることができないという傾向が認められ、またｐＨ８より大きくなるにつれ、安定な抗ブロッキング剤の非特異吸着を測定用反応容器に発生させることができないという傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【０１２１】
（Ａ−１ｄ）は未反応のブロッキング剤を洗浄除去するステップである。界面活性剤含有緩衝液で、測定用反応容器１を１回〜１０回、好ましくは２回〜５回洗浄することで未反応のブロッキング剤を効率的に除去することができ以降の測定の精度を向上させることができる。
【０１２２】
ここで、界面活性剤としてポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノラウレートが用いられる。界面活性剤の濃度は０．００１Ｗ／Ｖ％〜１Ｗ／Ｖ、好ましくは０．０１Ｗ／Ｖ％〜０．２Ｗ／Ｖ％が用いられる。界面活性剤の濃度が０．０１Ｗ／Ｖ％より少なくなるにつれ、未反応のタンパク質等を効率的に除去することができず以降の測定の精度を低下させるという傾向が認められ、また０．２Ｗ／Ｖ％より多くなるにつれ、発泡が著しく起こるため洗浄しにくくなるという傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【０１２３】
（Ａ−１ｅ）は酵素標識抗体９４を測定用反応容器１上の標準抗原９３に特異吸着させるステップである。酵素標識抗体９４としては、界面活性剤含有緩衝液に抗体として、抗原である菌体に特異的な結合能を有するモノクロナール（またはポリクロナール）抗体に標識物質を結合させた抗体、または抗原である菌体に特異的な結合能を有するモノクロナール（またはポリクロナール）抗体とこの抗体に特異的な結合能を有するモノクロナール（またはポリクロナール）抗体に標識物質を結合させた抗体の組み合わせたものが用いられる。
【０１２４】
標識物質９５としては、ペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ酵素が用いられる。
【０１２５】
酵素標識抗体９４溶液を測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８にそれぞれ同容量・同濃度となるように注ぐ。酵素標識抗体９４溶液による測定用反応容器１の処理条件はｐＨ５〜ｐＨ９、処理時間１０分〜４８時間、処理温度４℃〜４０℃、好ましくはｐＨ６〜ｐＨ８、処理時間３０分〜２時間、処理温度５℃〜３０℃で浸漬処理することにより、測定用反応容器１上の固定化標準抗原９３に酵素標識抗体９４が抗原抗体反応で特異的に結合することが可能となる。
【０１２６】
（Ａ−１ｆ）は未反応の酵素標識抗体９４を洗浄除去するステップである。界面活性剤含有緩衝液で、測定用反応容器１を好ましくは１回〜１０回、好ましくは２回〜５回洗浄することで未反応の酵素標識抗体９４を効率的に除去することができ以降の測定の精度を向上させることができる。
【０１２７】
（Ａ−１ｇ）は測定用反応容器１を保存可能とする処理をおこなうステップである。保存手段として凍結乾燥法、風乾等を用いて、測定用反応容器１を長期安定化した状態とする。
【０１２８】
標準抗原９３と酵素標識抗体９４を測定用反応容器１上に固定した様子を図５（ａ）に示す。
【０１２９】
次に（Ａ−１．測定用反応容器作製工程）で作製された測定用反応容器１を用いて菌体数を測定する本発明の免疫学的測定方法の（Ａ−２．反応工程）、（Ａ−３．測定工程）、（Ａ−４．換算工程）と、その免疫学的測定方法を実施するための免疫学的測定装置について説明する。
【０１３０】
実施の形態１における免疫学的測定装置は、標準液や被検液等を保持して反応させるための測定用反応容器１と、測定用反応容器１を水平方向に順次移動させるための駆動力を供給する測定用反応容器駆動用モータ２と、測定用反応容器駆動用モータ２の駆動力を測定用反応容器１に伝達するための測定用反応容器駆動用ベルト３を備えた移送部と、分離用溶液槽５内の分離用溶液の蒸発を防止するための分離用溶液槽蓋４と分離用溶液を貯留するための分離用溶液槽５と分離用溶液槽５の分離用溶液を測定用反応容器１に注入するための分離用溶液ポンプ６と分離用溶液ポンプ６から吐出される分離用溶液を測定用反応容器１に導くための分離用溶液注入ノズル７を備えた分離部と、可視光を照射するための発光ダイオード、ハロゲンランプ等を使用した発光部１８と、測定用反応容器１の透過光を検知するために必要に応じてフィルタ、レンズ、フォトマル、フォトダイオード等を使用した受光部１９、を備えた測定部と、マイコン等を使用し菌体濃度まで算出する換算部２０からなる構成とした。
【０１３１】
また、基質溶液の蒸発を防止するための基質溶液槽蓋８と基質溶液を貯留するための基質溶液槽９と基質溶液槽９の基質溶液を測定用反応容器１に注入するための基質溶液ポンプ１０と基質溶液ポンプ１０から吐出される基質溶液を測定用反応容器１に導くための基質溶液注入ノズル１１を配設した。
【０１３２】
更に、反応停止液の蒸発を防止するための反応停止液槽蓋１２と反応停止液を貯留するための反応停止液槽１３と反応停止液槽１３の反応停止液を測定用反応容器１に注入するための反応停止液ポンプ１４と反応停止液ポンプ１４から吐出される反応停止液を測定用反応容器１に導くための反応停止液注入ノズル１５を配設した。
【０１３３】
換算部２０に、液晶等を使用した表示部２１と入力部２２とサーマルヘッドプリンタ等を利用した印字部２３と外部情報の入力や出力を行うための入出力インターフェース部２４と電源部２５及び制御部２６を必要に応じて配設した。
【０１３４】
必要に応じて筐体２９内が、測定用反応容器１を入れるための測定用反応容器挿入口２７と測定用反応容器１を取り出すための測定用反応容器排出口２８と反応時の温度を測定するために熱電対等を使用した温度センサー３１と温度センサ−３１からの温度測定結果を受けて設定した温度になるように温度調整ヒータ３３を制御する温度調整ユニット３２と温度調整のための熱を供給するためにニクロム線等を使用した温度調整ヒータ３３等を配設した。
【０１３５】
また、撹拌手段としては、移送部の測定用反応容器駆動用モータと、測定用反応容器駆動用ベルトと、により測定用反応容器を水平方向に１〜３００往復／分で振動する手段を用いた。
【０１３６】
次に、上記実施の形態１の免疫学的測定装置を用いた、免疫学的測定方法を説明する。
【０１３７】
（Ａ−２．反応工程）
これは抗原量に比例した量の酵素標識抗体９４を測定用反応容器１に固定化された標準抗原９３と被検液等に含まれる抗原９２に分配させ、分配させた酵素標識抗体９４を分離する工程である。以下に示す（ａ）のステップから構成される。
【０１３８】
（Ａ−２ａ）は抗原量に比例した量の酵素標識抗体９４を測定用反応容器１と被検液に分配・分離させるステップである。標準抗原懸濁液を原液として、界面活性剤含有緩衝液で順次希釈して６種類の２倍から２０倍好ましくは３倍から５倍の標準希釈列溶液を調製し、測定用反応容器１の第２反応容器５２から第７反応容器５７にそれぞれ一定量注ぐ。ブランク液として界面活性剤含有緩衝液を新たな測定用反応容器１の第１反応容器５１に標準希釈列溶液と同量注ぐ。被検液を新たな測定用反応容器１の第８反応容器５８に標準希釈列溶液と同量注ぐ。ブランク液と標準希釈列溶液は検量線作成に用いるためのものである。
【０１３９】
測定用反応容器１を筐体２９に設けられた測定用反応容器挿入口２７より挿入する。さらに、標準希釈列の溶液の菌体濃度と測定用反応容器１の各測定用反応容器の対応を入力部２２を介して換算部２０に入力する。入力部２２からの操作により反応容器駆動用モータ２の正回転、逆回転により反応容器駆動用ベルト３ひいては測定用反応容器１水平方向に周期的に動かすことによって、測定用反応容器１を構成する複数の容器内に貯められた被検液と標準希釈列の溶液とブランク液を撹拌させる。被検液と標準希釈列の溶液とブランク液による測定用反応容器１の処理条件は、処理時間１０分〜３時間、処理温度４℃〜４０℃、好ましくは処理時間３０分〜２時間、処理温度４℃〜３０℃で浸漬処理することにより、酵素標識抗体９４を固相である測定用反応容器１に固定化されている標準抗原９３と測定用反応容器１内の液相に溶解している抗原９２に化学平衡反応で分配させることが可能となる。より好ましくは、処理時間３０分以上２時間以下で、処理温度４℃以上３０℃以下の範囲での浸漬処理である。
【０１４０】
あらかじめ分離用溶液４０を調製し、この分離用溶液を分離用溶液槽５に充填する。分離用溶液４０としてはシリコンオイル、単糖類の溶液、二糖類以上の多糖類の溶液、ゼラチンの溶液、ポリエチレングリコールの溶液、アルギン酸ナトリウムの溶液等の少なくとも一種またはそれらの混合物で比重が標準液、被検液またはブランク液よりも大きい溶液が使用可能である。好ましくは比重１．１以上２以下の溶液である。また、光学的な測定をする場合は使用する波長の吸収が極力少ないことが望ましい。
【０１４１】
反応容器駆動用モータ２により反応容器駆動用ベルト３ひいては測定用反応容器１を順次移動させながら、分離用溶液ポンプ７により分離用溶液槽５内の分離用溶液４０を分離用溶液注入ノズル７を介して測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８に一定量添加することにより、極めて簡単に測定用反応容器１の標準抗原９３に分配された酵素標識抗体９４の酵素９５が以後の測定工程で反応しない状態とする。
【０１４２】
以上各ステップの反応模式を図５（ｂ）〜（ｄ）に示す。測定用反応容器１への抗原９２含有被検液の注入による測定用反応容器１と抗原９２含有被検液の接触を図５（ｂ）に示し、時間経過による酵素標識抗体９４の測定用反応容器１と被検液への分配を図５（ｃ）に示し、分離用溶液４０の添加を図１５（ｄ）に示す。
【０１４３】
（Ａ−３．測定工程）
これは発色基質を添加して酵素反応で発色させ、発色の度合いを測定する工程である。以下に示す（ａ）乃至（ｃ）のステップから構成される。
【０１４４】
（Ａ−３ａ）は基質を酵素反応で発色させるステップである。あらかじめ基質溶液を調製し、この基質溶液を基質溶液槽９に充填する。基質溶液は溶質として標識物質に応じた発色基質を含有し、発色基質としてペルオキシダーゼの場合はオルトフェニレンジアミン二塩酸塩、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン、２，２’−アジノ−ビス（３−チルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム塩、５−アミノサリチル酸等が使用できる。また、基質溶液は基質として過酸化水素を含有し、溶媒としては緩衝液を使用し、ｐＨ５．０±０．１の０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸緩衝液等が使用できる。測定用反応容器駆動用モータ２により測定用反応容器駆動用ベルト３ひいては測定用反応容器１を水平方向に順次移動させて、測定用反応容器１の複数の各測定用反応容器に基質溶液槽９内の基質溶液を基質溶液注入ポンプ１０により基質溶液注入ノズル１１を介し添加し反応を進める。
【０１４５】
反応条件としては、反応時間１分〜６０分、反応温度１０℃〜４０℃、好ましくは反応時間２分〜２０分、反応温度１５℃〜３０℃が用いられる。この条件で反応させることにより測定用反応容器１に残留している標識物質が発色基質から酵素反応によって色素を効率的に生成させることが可能となる。反応時間が２分より短くなるにつれ、十分な発色が得られないという傾向が認められ、また２０分より長くなるにつれ、測定感度が低下するという傾向が認められるので、いずれも好ましくない。反応温度が１５℃より低くなるにつれ、酵素の活性が低下するという傾向が認められ、また３０℃より高くなるにつれ、酵素の活性が低下するという傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【０１４６】
（Ａ−３ｂ）は酵素反応を停止させるステップである。あらかじめ反応停止液を調製し、反応停止液槽１３に充填する。反応停止液は溶質として標識物質に応じた反応停止剤を含有し、反応停止剤として硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、水酸化ナトリウムが用いられる。
【０１４７】
測定用反応容器駆動用モータ２により測定用反応容器駆動用ベルト３ひいては測定用反応容器１を水平方向に順次移動させて、測定用反応容器１の各測定用反応容器に反応停止液槽１３内の反応停止液を反応停止液注入ポンプ１４により反応停止液注入ノズル１５を介して添加して、酵素反応を停止させる。
【０１４８】
（Ａ−３ｃ）は発色波長における発色の度合いの測定ステップである。測定用反応容器駆動用モータ２により測定用反応容器駆動用ベルト３ひいては測定用反応容器１を水平方向に順次移動させて、発光部１８を光源とし、色素が特異的に吸収する波長の光を受光部１９で検出し換算部２０に出力する。
【０１４９】
これにより標準希釈列溶液の菌体濃度に対応した吸光度の関係を示す検量関係のデータおよび被検液に関するデータが得られる。
【０１５０】
（Ａ−４．換算工程）
これは標準抗原溶液の検量線より抗原濃度の換算をおこなう工程である。以下に示す（ａ）のステップから構成される。
【０１５１】
（Ａ−４ａ）は換算ステップである。換算部２０において受光部１９の検出値より吸光度を算出し、ブランク液の吸光度を各標準抗原溶液の吸光度より差し引き検量線の回帰直線または回帰曲線を換算部２０で求める。検量線の回帰直線または回帰曲線より任意の被検液の吸光度を測定すれば、被検液の濃度を算出することができ結果を表示部２１に出力し、表示ことができる。さらに、印字部２３により結果の印字出力や入出力インターフェース２４を介して結果を外部換算装置等に出力することができる。
【０１５２】
以上のように本実施の形態によれば、供給者側で反応済み測定用反応容器１を作製し、測定用反応容器１と被検液を測定用反応容器１内で反応させることで被検液の抗原９２濃度に応じた標識抗体（または抗原）の測定用反応容器１あるいは標準液あるいは被検液７０への分配を行わせ、分離用溶液で極めて容易に分離でき、測定用反応容器１内の液体または測定用反応容器２上の標識物質濃度を定量することで被検液中の抗原（または抗体）濃度を測定することが可能で、従来の測定方法及び測定装置、例えば、現在最も一般的に利用されているサンドイッチ法ＥＬＩＳＡと本発明の測定方法を比較すると、サンドイッチ法が２工程の抗原抗体反応工程、２工程の洗浄操作を必要とするのに対して、本発明の測定方法は１工程の抗原抗体反応工程、洗浄操作は不要にでき簡便、迅速、安価に抗原（または抗体）を定量することができる特異的な免疫学的測定方法及び測定装置を提供することができる。
【０１５３】
（実施の形態２）
実施の形態２では、抗体が特異的に結合する抗原決定基を有するアレルゲンを抗原とし、分離用固体を使用してアレルゲン濃度を測定する免疫学的測定方法及び免疫学的測定装置について説明する。
【０１５４】
以下抗原の測定について説明するが、例えば、アレルゲン（抗原）に対する血清中の抗体量を測定する等、抗原と抗体を逆にすることも可能である。こうした理由から抗体の測定に関する説明は省略する。
【０１５５】
図６は本発明の実施の形態２における免疫学的測定装置の概略断面図であり、図７は本発明の実施の形態２の免疫学的測定装置の概略平面図であり、図８は本発明の実施の形態２の分離用固体を示す概略斜視図であり、図９は本発明の実施の形態２の測定用反応容器と分離用固体を組み合わせた状態を示す概念断面図であり、図１０は本発明の実施の形態２の主要工程を示す模式図であり、図１１は同各ステップの反応模式を示す図である。
【０１５６】
図６、図７において、４３は分離用固体、４４は分離用固体挿入用サポート４５を介して分離用固体４３を測定用反応容器１に挿入するための分離用固体挿入用モータ、４５は分離用固体挿入用サポートである。
【０１５７】
図８、図９、図１０において、４６は分離用固体４３の垂直方向に設けた１以上の貫通孔、４７は測定用反応容器１の内径に適合し標準液あるいは被検液７０を貫通孔４６以外から流動させないためのＯ−リングである。
【０１５８】
図１１において、７５はＢ−１．測定用反応容器作製工程、７６はＢ−２．反応工程、７７はＢ−３．測定工程、７８はＢ−４．換算工程である。
【０１５９】
尚、図１乃至図５と同様のものには同一の符号を付して説明を省略する。
実施の形態２の免疫学的測定方法は、４段階の工程（Ｂ−１．測定用反応容器作製工程）、（Ｂ−２．反応工程）、（Ｂ−３．測定工程）、および（Ｂ−４．換算工程）から構成される。
【０１６０】
測定用反応容器１は以下の工程によって作製した。
（Ｂ−１．測定用反応容器１作製工程）
これは標準抗原９３を測定用反応容器１に固定化して安定化状態とする工程である。以下に示す（ａ）乃至（ｅ）のステップから構成される。
【０１６１】
（Ｂ−１ａ）は標準抗原９３を測定用反応容器１に固定化するステップである。標準抗原９３は測定対象となる抗原で単一種のアレルゲンの溶液を使用する。
【０１６２】
測定用反応容器１は実施の形態１の（Ａ−１ａ）と同様のものが用いられる。
標準抗原９３溶液としては、抗原であるアレルゲンの溶液が用いられる。標準抗原９３の濃度は０．０００１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．００１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌが用いられる。この範囲の標準抗原９３の濃度が、充分な抗原量を測定用反応容器１に接触し非特異吸着により固定化することが可能となる。標準抗原９３の濃度が０．００１μｇ／ｍｌより少なくなるにつれ、充分な抗原量を測定用反応容器に固定化することが不可能となるという傾向が認められ、また１０μｇ／ｍｌより多くなるにつれ、吸着量が飽和して未反応の抗原が増加し、経済性が悪くなるという傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【０１６３】
標準抗原９３の溶媒は、実施の形態１の（Ａ−１ａ）と同様のものを用いた。
緩衝液は、実施の形態１の（Ａ−１ａ）と同様のものを用いた。
【０１６４】
標準抗原９３溶液を測定用反応容器１の第１測定用反応容器５１から第８測定用反応容器５８にそれぞれ同容量・同濃度となるように注ぐ。
【０１６５】
標準抗原９３溶液による測定用反応容器１の処理は実施の形態１の（Ａ−１ａ）と同様の条件で行った。
【０１６６】
（Ｂ−１ｂ）は未反応の標準抗原９３を洗浄除去するステップである。緩衝液で、測定用反応容器１を１回〜１０回、好ましくは２回〜５回洗浄することで未反応の標準抗原９３を効率的に除去することができ、以降の測定の精度を向上させることができる。
【０１６７】
（Ｂ−１ｃ）はブロッキング剤で測定用反応容器１の非特異吸着面を被覆するステップである。（Ｂ−１ｃ）では実施の形態１の（Ａ−１ｃ）と同様の条件、同様のものを用いて浸漬処理を行った。
【０１６８】
（Ｂ−１ｄ）は未反応のブロッキング剤を洗浄除去するステップである。（Ｂ−１ｄ）では実施の形態１の（Ａ−１ｄ）と同様の条件、同様のものを用いて洗浄を行った。
【０１６９】
（Ｂ−１ｅ）は測定用反応容器１を保存可能とする処理をおこなうステップである。保存手段として凍結乾燥法、風乾等を用いて、測定用反応容器１を長期安定化した状態とする。
【０１７０】
標準抗原９３が測定用反応容器１に固定化された様子を図１１（ａ）に示す。次に（Ｂ−１．測定用反応容器作製工程）で作製された測定用反応容器１を用いてアレルゲン濃度測定する本発明の免疫学的測定方法の（Ｂ−２．反応工程）、（Ｂ−３．測定工程）、（Ｂ−４．換算工程）と、その免疫学的測定方法を実施するための免疫学的測定装置について説明する。
【０１７１】
以下図６と図７に記載した免疫学的測定装置と図８と図９に記載した分離用固体に従って説明する。
【０１７２】
実施の形態２の免疫学的測定装置と実施の形態１の免疫学的測定装置との相違は、分離溶液注入部の代わりに分離用固体挿入部が配設されたことである。
【０１７３】
実施の形態２の免疫学的測定装置の分離用固体挿入部は、図６と図７に示すような分離用固体４３と、分離用固体挿入用サポート４５を介して分離用固体４０を測定用反応容器１に挿入するための分離用固体挿入用モータ４４と、分離用固体挿入用サポート４５と、を備えている。
【０１７４】
実施の形態２の分離用固体４３は、図８に示すような分離用固体４３の垂直方向に設けた１または複数の貫通孔４６と、測定用反応容器１の内径に適合し標準液あるいは被検液７０を貫通孔４６以外から流動させないためのＯ−リング４７と、を備えている。
【０１７５】
実施の形態２の測定用反応容器１と分離用固体４３は図９の様に配設される。測定用反応容器１の内側に、１以上の貫通孔４６を垂直方向に形成した分離用固体４３と分離用固体挿入用サポート４５を配設し、測定用反応容器１の内径に適合し標準液あるいは被検液７０を貫通孔４６以外から流動させないためのＯ−リングを配設した。尚、実施の形態１と同様のものには同一の符号を付して説明を省略する。
【０１７６】
次に、実施の形態２の測定装置を用いて、免疫学的測定方法を説明する。尚、実施の形態１と同様のものは説明を省略する。
【０１７７】
（Ｂ−２．反応工程）
これは抗原量に比例した量の酵素標識抗体９４を測定用反応容器１に固定化された標準抗原９３と被検液等に含まれる抗原９２に分配させ、分配させた酵素標識抗体９４を分離する工程である。以下に示す（ａ）のステップから構成される。
【０１７８】
（Ｂ−２ａ）は抗原量に比例した量の酵素標識抗体９４を測定用反応容器１と被検液に分配・分離させるステップである。標準抗原懸濁液を原液として、界面活性剤含有緩衝液で順次希釈して６種類の２倍から２０倍好ましくは３倍から５倍の標準希釈列溶液を調製し、測定用反応容器１の第２反応容器５２から第７反応容器５７にそれぞれ一定量注ぐ。ブランク液として界面活性剤含有緩衝液を新たな測定用反応容器１の第１反応容器５１に標準希釈列溶液と同量注ぐ。被検液を新たな測定用反応容器１の第８反応容器５８に標準希釈列溶液と同量注ぐ。さらに、一定量の酵素標識抗体９４溶液を被検液と標準希釈列溶液とブランク液を注いだ新たな測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８にそれぞれ一定量添加する。ブランク液と標準希釈列溶液は検量線作成に用いるためのものである。さらに、測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８の上部にそれぞれ分離用固体４３を設置する。
【０１７９】
分離用固体４３としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、アクリル樹脂の光学的に透明な合成樹脂を用いて形成される。測定用反応容器１の各反応容器の内部形状に適合し、標準液あるいは被検液７０を貫通孔４６以外から流動させない構造を有する。
【０１８０】
分離用固体４３の形状としては、円柱状、角柱状、多孔質状体等が用いられる。例えば、図８に示す形態である。
【０１８１】
分離用固体４３の高さとしては、１ｍｍ〜３０ｍｍ、好ましく２ｍｍ〜５ｍｍが用いられる。分離用固体４３の高さが２ｍｍより低くなるにつれ、分離が充分に行われないという傾向が認められ、また５ｍｍより高くなるにつれ、貫通孔４６の容量が大きくなるという傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【０１８２】
貫通孔４６は１以上または複数で形成され、貫通孔４６の総水平断面積（各貫通孔４６の水平断面積の和）は０．１ｍｍ2〜５０ｍｍ2、好ましくは０．２ｍｍ2〜５ｍｍ2が用いられる。貫通孔４６の総水平断面積が０．２より小さくなるにつれ、挿入抵抗が増加し挿入し難くなるという傾向が認められ、また５ｍｍ2より大きくなるにつれ、貫通孔４６の上下の拡散による混合が早やかに起こるという傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【０１８３】
また、各貫通孔４６の水平断面積は０．１ｍｍ2〜２ｍｍ2、好ましくは０．２ｍｍ2〜１ｍｍ2が用いられる。各貫通孔４６の水平断面積が０．２ｍｍ2より小さくなるにつれ、挿入抵抗が増加し挿入し難くなるという傾向が認められ、また１ｍｍ2より大きくなるにつれ、貫通孔４６の上下の拡散による混合が早やかに起こるという傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【０１８４】
分離用固体４３を上部に設置した測定用反応容器１を、筐体２９に設けられた測定用反応容器挿入口２７より挿入する。さらに、標準希釈列溶液のアレルゲン濃度と測定用反応容器１の各測定用反応容器の対応を入力部２２を介して換算部２０に入力する。入力部２２からの操作により反応容器駆動用モータ２の正回転、逆回転により反応容器駆動用ベルト３ひいては測定用反応容器１水平方向に周期的に動かすことによって、測定用反応容器１を構成する複数の容器内に貯められた被検液と標準希釈列の溶液とブランク液を撹拌させる。被検液と標準希釈列の溶液とブランク液による測定用反応容器１の処理条件は、実施の形態１の（Ａ−２ａ）と同様の条件で行った。
【０１８５】
反応容器駆動用モータ２により反応容器駆動用ベルト３ひいては測定用反応容器１を移動させ、分離用固体挿入用モータ４４を起動し、分離用固体挿入用サポート４６を介して各分離用固体４３を測定用反応容器１の各反応容器底面まで挿入することにより、測定用反応容器１の標準抗原９３に分配された酵素標識抗体９４の酵素９５が以後の測定工程で反応しない状態とする。図９は分離用固体挿入用サポート４６により各分離用固体４３を測定用反応容器１の各反応容器底面まで挿入した状態を示している。
【０１８６】
以上の各ステップの反応模式は図１１（ｂ）〜（ｄ）を示す。測定用反応容器１への抗原含有被検液の注入による測定用反応容器１と抗原含有被検液の接触及び分離用固体４３の上部設置を図１１（ｂ）に示し、時間経過による酵素標識抗体９４の測定用反応容器１と被検液への分配を図１１（ｃ）に示し、分離用固体４３の挿入を図１１（ｄ）に示す。
【０１８７】
（Ｂ−３．測定工程）
これは発色基質を添加して酵素反応で発色させ、発色の度合いを測定する工程である。以下に示す（ａ）〜（ｃ）のステップから構成される。
【０１８８】
（Ｂ−３ａ）、（Ｂ−３ｂ）、（Ｂ−３ｃ）は実施の形態１の（Ａ−３ａ）、（Ａ−３ｂ）、（Ａ−３ｃ）と同様のものを用いて同様の条件で処理を行った。
【０１８９】
（Ｂ−４．換算工程）
これは標準抗原溶液の検量線より抗原濃度の換算をおこなう工程である。以下に示す（ａ）のステップから構成される。
【０１９０】
（Ｂ−４ａ）は換算ステップである。（Ｂ−４ａ）は実施の形態１の（Ａ−４ａ）と同様のものを用いて同様の条件で換算を行った。被検液の抗原９２濃度が表示部又は印字部の出力から得られる。
【０１９１】
なお、以上の説明では、抗原の測定について説明したが、抗原と抗体を逆にして抗体の測定についても同様に実施可能である。
【０１９２】
以上のように本実施の形態によれば、供給者側で反応済み測定用反応容器１を作製し、測定用反応容器１と被検液を測定用反応容器１内で反応させることで被検液の抗原９２濃度に応じた標識抗体（または抗原）の測定用反応容器１あるいは標準液あるいは被検液７０への分配を行わせ、分離用固体４３により極めて容易に分離ができ、測定用反応容器１内の液体または測定用反応容器１上の標識物質濃度を定量することで被検液中の抗原（または抗体）濃度を測定することが可能で、従来の測定方法及び測定装置、例えば、現在最も一般的に利用されているサンドイッチ法ＥＬＩＳＡと本発明の測定方法を比較すると、サンドイッチ法ＥＬＩＳＡが２工程の抗原抗体反応工程、２工程の洗浄操作を必要とするのに対して、本発明の測定方法は１工程の抗原抗体反応工程、洗浄操作は不要にでき簡便、迅速、安価に抗原（または抗体）を定量することができる特異的な免疫学的測定方法及び測定装置を提供することができる。
【０１９３】
【実施例】
（実施例１）
実施例１では、実施の形態１の免疫学的測定方法及び免疫学的測定装置を用いて、レジオネラ ニューモフィラ セログループＩ（Legionella pneumophila serogroup Ｉ）の菌体数の測定をおこなった。
【０１９４】
実施の形態１の免疫学的測定方法は４段階の工程（Ａ−１．測定用反応容器作製工程）、（Ａ−２．反応工程）、（Ａ−３．測定工程）、および（Ａ−４．換算工程）から構成される。
【０１９５】
（Ａ−１．測定用反応容器１作製工程）
これは標準抗原９３を測定用反応容器１に固定化して安定化状態とする工程である。以下に示す（ａ）乃至（ｇ）のステップから構成される。
【０１９６】
（Ａ−１ａ）は標準抗原９３を測定用反応容器１に固定化するステップである。標準抗原９３として２４時間７０％エタノールで処理したレジオネラ ニューモフィラ セログループ１（Legionella pneumophila serogroup Ｉ、以下Ｌｐ）を使用した。その希釈にはｐＨ７．４±０．２のダルベッコりん酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳ）を使用した。
【０１９７】
測定用反応容器１はポリスチレン製で、水平断面積約２４ｍｍ2（内径５．５ｍｍ）で、深さ約１１．５ｍｍの円筒形の容器で、容器底部が光学的に透明で均一である第１測定用反応容器５１から第８測定用反応容器５８までの８個が測定用反応容器連結枠５０で一列に形成された構造である。
【０１９８】
測定用反応容器１に標準抗原９３であるＬｐのＰＢＳ懸濁液を１０10個／ｍｌに調製してそれぞれ５０μｌ注ぎ、２時間、２５℃の条件で浸漬処理すことによって標準抗原Ｌｐを固相となる測定用反応容器１の内側の底面と底から約２．２ｍｍの側面に非特異的に固定化させた。
【０１９９】
（Ａ−１ｂ）は未反応の標準抗原９３を洗浄除去するステップである。緩衝液であるＰＢＳで測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８内をそれぞれ３回洗浄して、未反応のＬｐを除去した。
【０２００】
（Ａ−１ｃ）はブロッキング剤で測定用反応容器１の非特異吸着面を被覆するステップである。ブロッキング剤として１ｗ／ｖ％の牛血清アルブミン（以下ＢＳＡ）を含有したｐＨ７．４±０．２のＰＢＳ溶液（以下ＰＢＳ−Ｂ）を使用した。
【０２０１】
測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８内にＰＢＳ−Ｂを２５０μｌ注ぎ、１時間、２５℃の条件で浸漬処理して、測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８に残存する非特異吸着面にＢＳＡを非特異吸着させ、以後他の有機物の非特異吸着が極力おこらないようにした。
【０２０２】
（Ａ−１ｄ）は未反応のブロッキング剤を洗浄除去するステップである。緩衝液としてＰＢＳに０．０５ｗ／ｖ％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含有し、ｐＨ７．４±０．２の溶液（以下ＰＢＳ−Ｔ）を使用した。ＰＢＳ−Ｔで測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８をそれぞれ３回洗浄して未反応のＢＳＡを除去した。
【０２０３】
（Ａ−１ｅ）は酵素標識抗体９４を測定用反応容器１上の標準抗原９３に特異吸着させるステップである。酵素標識抗体９４として抗Ｌｐマウス由来モノクロナールＩｇＧ抗体に西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼを標識化したもの（以下ＡＬｐＰＯ）を使用した。
【０２０４】
測定用反応容器１の第１測定用反応容器５１から第８測定用反応容器５８に２０．０μｇ／ｍｌのＡＬｐＰＯ溶液５０μｌを注ぎ、２時間、２５℃の条件で浸漬処理して、測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８の表面上の固相化抗原Ｌｐに抗原抗体反応で特異的に結合させた。
【０２０５】
（Ａ−１ｆ）は未反応の酵素標識抗体９４を洗浄除去するステップである。ＰＢＳ−Ｔで測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８をそれぞれ３回洗浄して未反応のＡＬｐＰＯを除去した。
【０２０６】
（Ａ−１ｇ）は測定用反応容器１を保存可能とする処理を行うステップである。保存手段として凍結乾燥法を用いて、測定用反応容器１を長期安定化した状態とした。
【０２０７】
（Ａ−２．反応工程）
これは抗原量に比例した量の酵素標識抗体９４を測定用反応容器１に固定化された標準抗原９３と被検液等に含まれる抗原９２に分配させ、分配させた酵素標識抗体９４を分離する工程である。以下に示す（ａ）のステップから構成される。
【０２０８】
（Ａ−２ａ）は抗原量に比例した量の酵素標識抗体９４を測定用反応容器１と被検液に分配・分離させるステップである。標準抗原５×１０9個／ｍｌより１０倍に順次ＰＢＳ−Ｔで希釈して７種の標準希釈列の溶液を調製し、７種の標準希釈列の溶液とブランク液としてＰＢＳ−Ｔを測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８にそれぞれ５０μｌ添加した。
【０２０９】
２時間、２５℃の条件で測定用反応容器１を浸漬処理して、測定用反応容器１に固相化された標準抗原Ｌｐ９３と溶液中の抗原Ｌｐ９２の濃度に応じて、酵素標識抗体ＡＬｐＰＯ９４を固相である測定用反応容器１に固定化されている標準抗原９３と測定用反応容器１の液相に溶解している抗原９２に化学平衡反応で分配させた。
【０２１０】
あらかじめ２ｍｌの１００Ｗ／Ｖ％ショ糖溶液を蒸留水で調整し、分離用溶液４０とした。さらに、分離用溶液４０を分離用溶液槽５に充填した。
【０２１１】
分離用溶液４０を測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８にそれぞれ１００μｌ添加し、測定用反応容器１の標準抗原９３に分配された酵素標識抗体９４の酵素９５が以後の測定工程で反応しない状態とした。
【０２１２】
（Ａ−３．測定工程）
これは発色基質を添加して酵素反応で発色させ、発色の度合いを測定する工程である。以下に示す（ａ）乃至（ｃ）のステップから構成される。
【０２１３】
（Ａ−３ａ）は基質を酵素反応で発色させるステップである。あらかじめ１０ｍｌのｐＨ５．０±０．１の０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸緩衝液（以下クエン酸緩衝液）に４ｍｇのオルトフェニレンジアミン二塩酸塩（以下ＯＰＤ）を溶解させ、１０μｌの３０％過酸化水素を添加した溶液（以下基質溶液）を調製した。基質溶液を基質溶液槽９に充填した。
【０２１４】
測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８に基質溶液を各々５０μｌ添加し、１５分間、２５℃反応させ、ＡＬｐＰＯの標識物質（酵素）であるペルオキシダーゼに発色基質ＯＰＤから酵素反応によって色素を生成させた。
【０２１５】
（Ａ−３ｂ）は酵素反応を停止させるステップである。あらかじめ５ｍｌの１ｍｏｌ／ｌ硫酸溶液（以下反応停止液）を反応停止液槽１３に充填した。測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８に基質溶液を各々５０μｌ添加し、酵素反応を停止させた。
【０２１６】
（Ａ−３ｃ）は発色波長における発色の度合いの測定ステップである。発光部１８を光源とした波長４９０ｎｍの光を受光部１９で検出し換算部２０に出力した。
【０２１７】
（Ａ−４．換算工程）
これは標準抗原溶液の検量線より抗原濃度の換算をおこなう工程である。以下に示す（ａ）のステップから構成される。
【０２１８】
（Ａ−４ａ）は換算ステップである。換算部２０において受光部１９の検出値より吸光度を算出し、ブランク液であるＰＢＳ−Ｔ溶液の吸光度を、各標準抗原溶液の吸光度より差し引き検量線を作成すると図１２が得られた。図１２の直線部より最小２乗法で回帰直線を求めると次式（１）が得られた。
【０２１９】
吸光度（−）＝０．２２３×ｌｎ（Ｌｐ濃度（個／ｍｌ））−２．１８９・・・（１）
図１２は実施の形態１の測定装置を使用して作成したレジオネラ ニューモフィラ セログループＩ（Legionella pneumophila serogroup Ｉ）の検量線である。
【０２２０】
図１２から明らかなように、実施例１では５×１０4個／ｍｌ〜５×１０6個／ｍｌの範囲のレジオネラ ニューモフィラ セログループＩが測定可能であることがわかる。そして、任意の被検液に対して吸光度測定をすれば、式（１）より被検液の濃度を算出することができ結果を表示部２１に出力に表示ことができた。さらに、印字部２３により結果の印字出力や入出力インターフェース２４を介して結果を外部換算装置等に出力することもできる。
【０２２１】
従来の方法では、レジオネラ ニューモフィラ セログループＩの菌体数の測定を２４時間と長い測定時間を必要とし、かつ高価な測定装置が必要であるのに対して、実施例１はあらかじめ制作した測定用反応容器を利用することで、２時間３０分で測定を完了させることができた。
【０２２２】
（実施例２）
実施例２では、実施の形態２の免疫学的測定方法及び測定装置を用いて、コナヒョウヒダ二のアレルゲンであるｒＤｅｒｆＩＩの濃度の測定をおこなった。
【０２２３】
実施の形態２の免疫学的測定方法は、４段階の工程（Ｂ−１．測定用反応容器作製工程）、（Ｂ−２．反応工程）、（Ｂ−３．測定工程）、および（Ｂ−４．換算工程）から構成される。
【０２２４】
（Ｂ−１．測定用反応容器１作製工程）
これは標準抗原９３と酵素標識抗体９４を測定用反応容器１に固定化して安定化状態とする工程である。以下に示す（ａ）乃至（ｇ）のステップから構成される。
【０２２５】
（Ｂ−１ａ）は標準抗原９３を測定用反応容器１に固定化するステップである。標準抗原９３としてコナヒョウヒダニの虫体由来アレルゲンを大腸菌の遺伝子操作により生産させ精製したｒＤｅｒｆＩＩ（以下ｒＤｅｒｆＩＩ）を使用した。その希釈にはｐＨ７．４±０．２のダルベッコりん酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳ）を使用した。
【０２２６】
測定用反応容器１はポリスチレン製で、水平断面積約２４ｍｍ2（内径５．５ｍｍ）で、深さ約１１．５ｍｍの円筒形の容器で、容器底部が光学的に透明で均一である第１測定用反応容器５１から第８測定用反応容器５８までの８個が測定用反応容器連結枠５０で一列に形成された構造である。
【０２２７】
測定用反応容器１に標準抗原９３であるｒＤｅｒｆＩＩのＰＢＳ溶液を０．５μｇ／ｍｌに調製してそれぞれ５０μｌ注ぎ、２時間、２５℃の条件で浸漬処理すことによって標準抗原ｒＤｅｒｆＩＩを固相となる測定用反応容器１の内側の底面と底から約２．２ｍｍの側面に非特異的に固定化させた。
【０２２８】
（Ｂ−１ｂ）は未反応の標準抗原９３を洗浄除去するステップである。緩衝液であるＰＢＳで測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８内をそれぞれ３回洗浄して、未反応のｒＤｅｒｆＩＩを除去した。
【０２２９】
（Ｂ−１ｃ）はブロッキング剤で測定用反応容器１の非特異吸着面を被覆するステップである。測定用反応容器１の第１測定用反応容器５１から第８測定用反応容器５８にＰＢＳ−Ｂを各２５０μｌ注ぎ、１時間、２５℃の条件で浸漬処理して、測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８に残存する非特異吸着面にＢＳＡを非特異吸着させ、以後他の有機物の非特異吸着が極力おこらないようにした。
【０２３０】
（Ｂ−１ｄ）は未反応のブロッキング剤を洗浄除去するステップである。緩衝液としてＰＢＳに０．０５ｗ／ｖ％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含有し、ｐＨ７．４±０．２の溶液（以下ＰＢＳ−Ｔ）を使用した。ＰＢＳ−Ｔで測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８をそれぞれ３回洗浄して未反応のＢＳＡを除去した。
【０２３１】
（Ｂ−１ｅ）は測定用反応容器１を保存可能とする処理をおこなうステップである。保存手段として凍結乾燥法を用いて、測定用反応容器１を長期安定化した状態とした。
【０２３２】
測定用反応容器１の第１測定用反応容器５１から第８測定用反応容器５８に０．５μｇ／ｍｌの１３Ａ４ＰＯ溶液（アサヒビール（株）製、商品名）１００μｌを注ぎ、２時間、２５℃の条件で浸漬処理して、測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８の表面上の固相化抗原ｒＤｅｒｆＩＩに抗原抗体反応で特異的に結合させた。
【０２３３】
（Ｂ−１ｆ）は未反応の酵素標識抗体９４を洗浄除去するステップである。ＰＢＳ−Ｔで測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８をそれぞれ３回洗浄して未反応の１３Ａ４ＰＯを除去した。
【０２３４】
（Ｂ−１ｇ）は測定用反応容器２を保存可能とする処理をおこなうステップである。保存手段として凍結乾燥法を用いて、測定用反応容器１を長期安定化した状態とした。
【０２３５】
（Ｂ−２．反応工程）
これは抗原量に比例した量の酵素標識抗体９４を測定用反応容器１に固定化された標準抗原９３と被検液等に含まれる抗原９２に分配させ、分配させた酵素標識抗体９４を分離する工程である。以下に示す（ａ）のステップから構成される。
【０２３６】
（Ｂ−２ａ）は抗原量に比例した量の酵素標識抗体９４を測定用反応容器１とと被検液に分配・分離させるステップである。標準抗原を０．１μｇ／ｍｌより３倍に順次ＰＢＳ−Ｔで希釈して７種の標準希釈列の溶液を調製し、７種の標準希釈列の溶液とブランク液としてＰＢＳ−Ｔを新たな測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８にそれぞれ５０μｌ添加した。酵素標識抗体９４として抗ｒＤｅｒｆＩＩマウスモノクロナールＩｇＧ抗体に西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼを標識化した抗体（以下１３Ａ４ＰＯ）を使用した。５μｇ／ｍｌの１３Ａ４ＰＯのＰＢＳ−Ｔ溶液を各５μｌずつ標準希釈列溶液とブランク液を注いだ測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８にそれぞれ添加した。さらに、測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８の上部にそれぞれ分離用固体４３を設置した。分離用固体として水平断面積約２３ｍｍ２（外径５．４ｍｍ）で、高さ３ｍｍの円柱形に、貫通孔４６として水平断面積約０．２６ｍｍ２（外径０．５ｍｍ）で、高さ３ｍｍの円筒形を８個設けたものを使用した。また、Ｏ−リング４７としてシリコンゴム製のものを使用した。
【０２３７】
さらに、第１反応容器５１から第８反応容器５８の上部にそれぞれ分離用固体４３を設置した測定用反応容器１を、筐体２９に設けられた測定用反応容器挿入口２７より挿入し、反応容器駆動用モータ２の正回転、逆回転により反応容器駆動用ベルト３ひいては測定用反応容器１水平方向に周期的に動かすことによって、測定用反応容器１を構成する８個の反応容器内に貯められた標準希釈列の溶液とブランク液を２時間、２５℃の条件で撹拌させた。以上の操作により測定用反応容器１に固定化された標準抗原ｒＤｅｒｆＩＩ９３と溶液中の抗原ｒＤｅｒｆＩＩ９２の濃度に応じて、酵素標識抗体ｒＤｅｒｆＩＩ９４を固相である測定用反応容器１に固定化されている標準抗原９３と測定用反応容器１内の液相に溶解している抗原９２に化学平衡反応で分配させた。
【０２３８】
反応容器駆動用モータ２により反応容器駆動用ベルト３ひいては測定用反応容器１を移動させ、分離用固体挿入用モータ４４を起動し、分離用固体挿入用サポート４６を介して各分離用固体４３を測定用反応容器１の各反応容器底面まで挿入することにより、測定用反応容器１の標準抗原９３に分配された酵素標識抗体９４の酵素９５が以後の測定工程で反応しない状態とした。
【０２３９】
（Ｂ−３．測定工程）
発色基質を添加して酵素反応で発色させ、発色の度合いを測定する工程である。以下に示す（ａ）乃至（ｃ）のステップから構成される。
【０２４０】
（Ｂ−３ａ）は基質を酵素反応で発色させるステップである。あらかじめ１０ｍｌのｐＨ５．０±０．１の０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸緩衝液（以下クエン酸緩衝液）に４ｍｇのオルトフェニレンジアミン二塩酸塩（以下ＯＰＤ）を溶解させ、１０μｌの３０％過酸化水素を添加した溶液（以下基質溶液）を調製した。基質溶液を基質溶液槽９に充填した。
【０２４１】
測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８に基質溶液を各々５０μｌ添加し、１５分間、２５℃反応させ、１３Ａ４ＰＯの標識物質（酵素）であるペルオキシダーゼに発色基質ＯＰＤから酵素反応によって色素を生成させた。
【０２４２】
（Ｂ−３ｂ）は酵素反応を停止させるステップである。あらかじめ５ｍｌの１ｍｏｌ／ｌ硫酸溶液（以下反応停止液）を反応停止液槽１３に充填した。
【０２４３】
各測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８に基質溶液を各々５０μｌ添加し、酵素反応を停止させた。
【０２４４】
（Ｂ−３ｃ）は発色波長における発色の度合いの測定ステップである。発光部１８を光源とした波長４９０ｎｍの光を受光部１９で検出し換算部２０に出力した。
【０２４５】
（Ｂ−４．換算工程）
標準抗原溶液の検量線より抗原濃度の換算をおこなう工程である。以下に示す（ａ）のステップから構成される。
【０２４６】
（Ｂ−４ａ）は換算ステップである。換算部２０において受光部１９の検出値より吸光度を算出し、ブランク液であるＰＢＳ−Ｔ溶液の吸光度を、各標準抗原溶液の吸光度より差し引き検量線を作成すると図１３が得られた。図１３の直線部より最小２乗法で回帰直線を求めると次式（２）が得られる。
【０２４７】
吸光度（−）＝０．３３５×ｌｎ（ｒＤｅｒｆＩＩ濃度（μｇ／ｍｌ））＋２．５４２・・・（２）
図１３は本発明の測定装置を使用して作成したコナヒョウヒダ二のアレルゲンｒＤｅｒｆＩＩの検量線図である。
【０２４８】
図１３から明らかなように、実施例２では０．００２μｇ／ｍｌ〜０．０３μｇ／ｍｌの範囲のｒＤｅｒｆＩＩが測定可能であることがわかる。そして、任意の被検液に対しても吸光度測定をすれば、式（２）より被検液の濃度を算出することができ結果を表示部２１に出力に表示ことができた。さらに、印字部２３により結果の印字出力や入出力インターフェース２４を介して結果を外部換算装置等に出力することもできる。
【０２４９】
従来方法では、ｒＤｅｒｆＩＩ濃度の測定に２４時間と長い測定時間を必要とし、かつ高価な測定装置が必要であることに対して、実施例２はあらかじめ制作した測定用反応容器を利用することで、２時間３０分で測定を完了させることができた。
【０２５０】
実施の形態１、２以外にも抗原（または抗体）を測定する装置は種々考えることが出来る。例えば、より自動化を推進した装置、検出法が電気化学的、放射性同位体の検出を利用したもの等、抗原抗体反応にカラムを利用したもの等が考えられる。
【０２５１】
【発明の効果】
以上のように本発明においては、以下の優れた効果を実現できる。
【０２５２】
（１）本発明の免疫学的測定方法によれば、測定用反応容器と被検液を反応させることで被検液濃度に応じた標識抗体（または抗原）の液相あるいは固相への分配をおこなはせ、液相または固相の標識物質濃度を定量することで被検液中の抗原（または抗体）濃度を測定することに着目することで迅速、簡便、安価に定量することができる。
【０２５３】
（２）本発明の免疫学的測定装置によれば、迅速、簡便、高精度な測定が自動的におこなえ、且つ低原価で量産できる抗原（または抗体）に特異的な免疫学的測定装置を提供できる。
【０２５４】
（３）本発明の抗原（または抗体）の免疫学的測定方法及び免疫学的測定装置の利用で抗原（または抗体）成分濃度を特異的、簡便、迅速、安価に入手できるようになり、医療現場での臨床検査、クリーニング業者、清掃業者の洗浄度合いの確認のみならず家庭での個人的なアレルゲン管理においても有用な情報提供が可能になる。さらに各成分に係る基礎研究や応用・開発研究において研究速度および研究精度の向上をはかることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態１の免疫学的測定装置の概略断面図
【図２】本発明の実施の形態１の免疫学的測定装置の概略平面図
【図３】本発明の実施の形態１及び実施の形態２の測定用反応容器を示す概略斜視図
【図４】本発明の実施の形態１の主要工程を示す模式図
【図５】本発明の実施の形態１の各ステップの反応模式を示す図
【図６】本発明の実施の形態２における免疫学的測定装置の概略断面図
【図７】本発明の実施の形態２の免疫学的測定装置の概略平面図
【図８】本発明の実施の形態２の分離用固体を示す概略斜視図
【図９】本発明の実施の形態２の測定用反応容器と分離用固体を組み合わせた状態を示す概念断面図
【図１０】本発明の実施の形態２の主要工程を示す模式図
【図１１】本発明の実施の形態２の各ステップの反応模式を示す図
【図１２】本発明の測定装置を使用して作成したレジオネラ ニューモフィラ セログループＩの検量線図
【図１３】本発明の測定装置を使用して作成したコナヒョウヒダニのアレルゲンｒＤｅｒｆＩＩの検量線図
【図１４】従来のサンドイッチＥＬＩＳＡ法の主要工程を示す模式図
【図１５】従来のサンドイッチＥＬＩＳＡ法の各ステップの反応模式を示す図
【符号の説明】
１ 測定用反応容器
２ 反応容器駆動用モータ
３ 反応容器駆動用ベルト
４ 分離用溶液槽蓋
５ 分離用溶液槽
６ 分離用溶液ポンプ
７ 分離用溶液注入ノズル
８ 基質溶液槽蓋
９ 基質溶液槽
１０ 基質溶液ポンプ
１１ 基質溶液注入ノズル
１２ 反応停止液槽蓋
１３ 反応停止液槽
１４ 反応停止液ポンプ
１５ 反応停止液注入ノズル
１８ 発光部
１９ 受光部
２０ 換算部
２１ 表示部
２２ 入力部
２３ 印字部
２４ 入出力インターフェース部
２５ 電源部
２６ 制御部
２７ 反応容器挿入口
２８ 反応容器排出口
２９ 筐体
３１ 温度センサー
３２ 温度調整ユニット
３３ 温度調整ヒータ
４０ 分離用溶液
４３ 分離用固体
４４ 分離用固体挿入用モータ
４５ 分離用固体挿入用サポート
４６ 貫通孔
４７ Ｏ−リング
５０ 反応容器連結枠
５１ 第１反応容器
５２ 第２反応容器
５３ 第３反応容器
５４ 第４反応容器
５５ 第５反応容器
５６ 第６反応容器
５７ 第７反応容器
５８ 第８反応容器
７０ 標準液あるいは被検液
７１ Ａ−１，測定用反応容器作製工程
７２ Ａ−２，反応工程
７３ Ａ−３，測定工程
７４ Ａ−４，換算工程
７５ Ｂ−１，測定用反応容器作製工程
７６ Ｂ−２，反応工程
７７ Ｂ−３，測定工程
７８ Ｂ−４，換算工程
８０ Ｃ−１，測定用反応容器作製工程
８１ Ｃ−２，反応工程
８２ Ｃ−３，測定工程
８３ Ｃ−４，換算工程
９１ 抗体
９２ 抗原（被検液由来、第二の）
９３ 標準抗原（第一の）
９４ 酵素標識抗体
９５ 酵素
【発明の属する技術分野】
本発明は、溶液中の抗原または抗体の濃度を測定する免疫学的測定方法及び免疫学的測定装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、抗原の一種であるアレルゲンが発症原因物質とされる花粉症等のアレルギー性鼻炎、アレルギー性気管支喘息、アトピー性皮膚炎等のいわゆるアレルギー症患が、先進諸国を中心に増加傾向にあり、ダニ、花粉、動物の毛、カビ等の各種構成物質がその原因物質であることが特定されてきている。これらのアレルギー症状は比較的軽度の場合もあるが、アレルギー性気管支喘息のように死に至るほど重篤な場合もある。このため、感作、発症を抑制するための一つの手段として、各個人に特有な発症原因物質であるアレルゲンを低レベルに維持することが必要になってくる。しかし、現状ではアレルゲンの測定は比較的難しい高度な技術とされ、専門の測定技術者を必要とし、半日から１日かかる長い測定時間を必要とし、かつ高価な測定装置が必要である。ところで、環境中のアレルゲン濃度とアレルギー疾患の感作・発症は一般的に相関することが知られている。環境中のアレルゲン濃度の測定をおこなえば、掃除、洗濯等をどの程度おこなったり、どのくらいの頻度おこなえばよいのかの指標となり、アレルギー疾患患者やアレルギー疾患の感作の危険のある者にとって社会生活上有用なものとなる。また、アレルギー疾患患者の血液中のＩｇＥ抗体の濃度が即時型アレルギー反応のＩ型アレルギーの感作程度の指標になることも一般に知られており、血液中のＩｇＥ抗体濃度の測定が感作の程度ひいてはアレルギー疾患の程度を知るための指標としてきわめて有用である。
【０００３】
また、近年病原性大腸菌Ｏ−１５７に代表されるバクテリア等の微生物の感染、代謝物に起因する食中毒等の被害が問題になっているが、問題となる微生物の検出は培養した後に種類の同定や定量することが一般的であり、培養操作に時間が掛かることを主因として検査結果が出るまで１〜７日間といった長時間を要し、かつ専門の測定技術者を必要とする。特に生鮮食品等への検査の必要が生じた場合には、測定時間が長いことが問題となる。ところで、このような微生物と上記した抗原は無縁のものではない。すなわち、菌体例えば病原性大腸菌Ｏ−１５７という名称は抗体の名前に由来しており、病原性大腸菌Ｏ−１５７は“Ｏ−１５７という抗体が特異的に結合する抗原決定基を菌体表面に発現した病原性を有する大腸菌”の意味である。個々の微生物種はそれぞれ体表面に固有の抗原決定基を有しており、微生物自体を抗原と捉えることができる。以上のような理由で、微生物を抗原として同定、定量することが可能であり、生鮮食品等の検査にきわめて有用である。
【０００４】
このような背景から、抗原あるいは抗体濃度をそれぞれ特異的、迅速、簡便さらに高感度に測定する方法およびその方法を利用した安価な測定装置が求められている。
【０００５】
以下、従来の抗原濃度の分析方法について説明する。
従来の抗原抗体反応を利用した抗原の測定法は免疫測定法と総称され、非標識免疫測定法と標識免疫測定法に大別される。非標識免疫測定法は抗体に酵素等の標識物質を結合せずに抗原抗体反応による物理量等の変化を利用して抗原の量を測定する方法である。非標識免疫測定法にはＳＰＲ法（表面プラズモン共鳴法）や水晶振動子を使った方法等がある。標識免疫測定法は抗体に酵素等の標識物質を結合させたものを使用し標識物質の量を測定することで抗原の量を測定する方法である。標識免疫測定法には標識の種類によってラジオイムノアッセイ法（放射性同位体標識）、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法（例えば、石川英治ら：「酵素免疫測定法（第三版）」、ｐ３１〜５４、医学書院（１９８７）を参照）等がある。
【０００６】
これらの測定法のうち現在主として用いられている免疫測定法は、酵素免疫測定法の一種であるＥＬＩＳＡ法と呼称される方法である。なかでも特に、サンドイッチ法（以下サンドイッチＥＬＩＳＡ法）と呼ばれる方法が、測定感度が高いことと比較的操作が簡易であることを主な理由に一般的に広く用いられている。
【０００７】
例えば、ダニアレルゲンの測定をする場合を例にしてサンドイッチＥＬＩＳＡ法がどの様におこなはれるのか図１４と図１５に基づいて概要を説明する。
【０００８】
図１４は従来のサンドイッチＥＬＩＳＡ法の主要工程を示す模式図であり、図１５は同各ステップの反応模式を示す図である。
【０００９】
図１４において、８０はＣ−１．測定用反応容器作製工程、８１はＣ−２．反応工程、８２はＣ−３．測定工程、８３はＣ−４．換算工程である。
【００１０】
図１５において、１は測定用反応容器、９１は抗体、９２は抗原、９４は酵素標識抗体、９５は酵素である。
【００１１】
この方法は図１４に示すように４段階の工程（Ｃ−１．測定用反応容器作製工程）、（Ｃ−２．反応工程）、（Ｃ−３．測定工程）、および（Ｃ−４．換算工程）から構成される。
【００１２】
以下、上記４段階の工程について説明する。
（Ｃ−１．測定用反応容器作製工程）
これは抗体を測定用反応容器に固定化して安定化状態とする工程である。以下に示す（ａ）乃至（ｅ）のステップから構成される。
【００１３】
（Ｃ−１ａ）は抗原に特異的に結合する抗体９１を測定用反応容器１に固定化するステップである。非特異的な吸着が起こり易い測定用反応容器１に、測定対象の抗原に特異的に結合する抗体９１の溶液を注ぎ、測定用反応容器１の固相に抗体９１を非特異吸着させて固定化する。
【００１４】
（Ｃ−１ｂ）は未反応の抗体９１を洗浄除去するステップである。緩衝液等で３回以上測定用反応容器１を洗浄して、未反応であった抗体９１を除去する。
【００１５】
（Ｃ−１ｃ）はブロッキング剤で測定用反応容器１の非特異吸着面を被覆するステップである。測定用反応容器１にブロッキング剤溶液を注ぎ、測定用反応容器１の表面に残存する非特異吸着面に、ブロッキング剤を非特異吸着させ、以後他の有機物等の測定用反応容器１への非特異的吸着が極力おこらないようにする。
【００１６】
（Ｃ−１ｄ）は未反応のブロッキング剤を洗浄除去するステップである。緩衝液等で３回以上測定用反応容器１を洗浄して、未反応であったブロッキング剤を除去する。
【００１７】
（Ｃ−１ｅ）は測定用の測定用反応容器１を保存可能とする処理をするステップである。保存手段として凍結乾燥法を用いて、測定用反応容器１を長期安定化した状態とする。
【００１８】
（Ｃ−２．反応工程）
これは抗原量に比例した量の酵素標識抗体を測定用反応容器１に固定化させる工程である。以下に示す（ａ）乃至（ｄ）のステップから構成される。
【００１９】
（Ｃ−２ａ）は抗原９２を測定用反応容器１に特異的に固定化するステップである。少なくとも３つの測定用反応容器１に濃度が既知の標準抗原溶液、抗原９２を含有する被検液、およびブランク液をそれぞれ注ぎ、それぞれ同条件下で平行して標準抗原または抗原９２を測定用反応容器１内の固定化抗体９１に抗原抗体反応で特異的に結合させる。
【００２０】
（Ｃ−２ｂ）は未反応の抗原９２を洗浄除去するステップである。緩衝液等で３回以上測定用反応容器１を洗浄して、未反応であった抗原９２を除去する。
【００２１】
（Ｃ−２ｃ）は酵素標識抗体９４を測定用反応容器１に特異的に結合させるステップである。測定用反応容器１に酵素標識抗体９４溶液を注ぎ、酵素標識抗体９４を測定用反応容器１内の抗原抗体複合体の抗原９２を介して抗原抗体反応で特異的に結合させる。
【００２２】
（Ｃ−２ｄ）は未反応の酵素標識抗体９４を洗浄除去するステップである。緩衝液等で３回以上測定用反応容器１を洗浄して、未反応であった酵素標識抗体９４を除去する。
【００２３】
以上各ステップの反応模式図を図１５に示す。抗体９１が固定化された測定用反応容器１を図１５（ａ）に示し、測定用反応容器１への抗原９２含有溶液の添加時の状態を図１５（ｂ）に示し、時間経過による固定化抗体９１と抗原９２の抗原抗体反応の進行を図１５（ｃ）に示し、洗浄操作による未反応抗原９２を除去した状態を図１５（ｄ）に示し、測定用反応容器１への酵素標識抗体９４の添加した状態を図１５（ｅ）に示し、時間経過による固定化抗体９１−抗原９２複合体と酵素標識抗体９４の抗原抗体反応の進行状態を図１５（ｆ）に示し、洗浄操作による未反応酵素標識抗体９４を除去した状態を図１５（ｇ）に示す。
【００２４】
（Ｃ−３．測定工程）
これは発色基質を添加して酵素反応で発色させ、発色の度合いを測定する工程である。以下に示す（ａ）乃至（ｃ）のステップから構成される。
【００２５】
（Ｃ−３ａ）は基質を酵素反応で発色させるステップである。基質溶液を測定用反応容器１に添加し、測定用反応容器１内の酵素標識抗体９４の酵素９５に基質から酵素反応によって色素を生成させる。
【００２６】
（Ｃ−３ｂ）は酵素反応を停止させるステップである。反応停止液を測定用反応容器１に添加して酵素反応を停止させる。
【００２７】
（Ｃ−３ｃ）は発色波長における発色の度合いの測定ステップである。分光光度計の所定の波長で生じた色素を測定する。
【００２８】
（Ｃ−４．換算工程）
これは標準抗原溶液の検量線より抗原濃度の換算をおこなう工程である。以下に示す（ａ）のステップから構成される。
【００２９】
（Ｃ−４ａ）は換算ステップである。測定結果から標準抗原溶液の検量線を作成し、被検液の抗原濃度の換算をおこない、被検液の抗原濃度の値を得ることができる。
【００３０】
尚、以上が抗原濃度の測定についての説明であるが、抗原と抗体を入れ替えて抗体を測定することでもまったく同一である。したがって、特に断らない限り、一方を説明したらもう一方も説明しているものである。さらに、必要に応じて抗原（または抗体）あるいは抗体（または抗原）と明示的に記載することとする。
【００３１】
【発明が解決しようとする課題】
上記従来の測定方法は、以下の課題を有していた。
【００３２】
（１）２ステップの抗原抗体反応（上記（Ｃ−２ａ）、（Ｃ−２ｃ））が必要で、反応全てが完全に進行せねば正しい値が得られず、かつ全体で４〜２４時間程度と測定に要する時間が長い。特に精度を向上させるためには２４時間程度を要し、測定時間が長いという課題を有していた。
【００３３】
（２）１０種類程度の異なる試薬を必要とし、また、２ステップの洗浄操作（上記（Ｃ−２ｂ）、（Ｃ−２ｄ））をおこなう必要があり、作業が煩雑で操作性が悪く、利便性に欠けるという課題を有していた。
【００３４】
（３）試験をおこなうためには分注器、恒温槽、冷蔵庫等が必要であり、測定コストが高いという課題を有していた。
【００３５】
本発明は上記従来の課題を解決するもので、迅速、簡便、安価に定量することができる抗原（または抗体）の特異的な測定方法を提供、及び迅速、簡便、高精度な測定が自動的におこなえ、低原価で量産できる抗原（または抗体）の特異的な免疫学的測定装置を提供することを目的とする。
【００３６】
【課題を解決するための手段】
この目的を達成するために本発明の免疫学的測定方法及び測定装置は次の構成からなる。
【００３７】
本発明の免疫学的測定方法は、測定用反応容器の固相に測定対象である第二の抗原と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗原を一定量固定し、次いで、測定対象である第二の抗原と前記抗原と特異的に結合することができ標識物質を結合した抗体を含有する被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、前記測定用反応容器に固定された前記第一の標準抗原と前記被検液中の前記第二の抗原とで前記抗体を抗原抗体反応によりそれぞれの抗原濃度に応じて分配して抗原抗体複合体を形成させた後、前記測定用反応容器に比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を添加または分離用固体を挿入し、前記測定用反応容器の固相上の標識物質の反応を抑制し、前記被検液の液相中の前記標識物質量の測定を行う構成を有している。
【００３８】
この構成により、迅速、簡便、安価に定量することができる抗原（または抗体）の特異的な免疫学的測定方法を提供することができる。
【００３９】
また、本発明の免疫学的測定装置は、測定対象である第二の抗原と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗原を一定量固定した測定用反応容器を移送する移送部と、測定対象である第二の抗原と前記抗原と特異的に結合できる標識物質を結合した抗体を含有した被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を一定量添加する分離用液体注入部または分離用固体を挿入する分離用固体挿入部と、前記被検液中の前記第二の抗原と抗原抗体反応した前記抗体の前記標識物質の量を測定する測定部と、前記測定部が計測した前記標識物質の量を前記被検液の前記第二の抗原濃度に換算する換算部と、を備えた構成を有している。
【００４０】
この構成により、迅速、簡便、高精度な測定が自動的におこなえ、低原価で量産できる抗原（または抗体）の特異的な免疫学的測定装置を提供することができる。
【００４１】
【発明の実施の形態】
本発明の請求項１に記載の免疫学的測定方法は、測定用反応容器の固相に測定対象である第二の抗原と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗原を一定量固定し、次いで、測定対象である第二の抗原と前記抗原と特異的に結合することができ標識物質を結合した抗体を含有する被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、前記測定用反応容器に固定された前記第一の標準抗原と前記被検液中の前記第二の抗原とで前記抗体を抗原抗体反応によりそれぞれの抗原濃度に応じて分配して抗原抗体複合体を形成させた後、前記測定用反応容器に比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を添加または分離用固体を挿入し、前記測定用反応容器の固相上の標識物質の反応を抑制し、前記被検液の液相中の前記標識物質量の測定を行う構成を有している。
【００４２】
これにより、（１）別途作製され保存された前記測定用反応容器を用いることで測定を簡便・迅速化することができるという作用を有する。
【００４３】
（２）前記測定用反応容器は前記抗原だけを固定化しているため、長期保存をすることができるという作用を有する。
【００４４】
（３）抗原抗体反応は被検液と測定用反応容器の接触を行うときの一回であるため短時間のうちに、かつ複数回の反応であるならば各反応間に必要となる洗浄を不要化することができ、測定用反応容器に固定化された一定量の第一の標準抗原と被検液中の第二の抗原によって、被検液に添加した前記抗体を、それぞれの抗原濃度に応じて所定の割合に分配させ、分配された抗体量と標識物質には所定の関係があるため、前記測定用反応容器または前記被検液と結合した前記標識物質の量を測定することによって、前記被検液中の第二の抗原濃度を算出することができるという作用を有する。
【００４５】
ここで、測定用反応容器は、ポリスチレン、ガラス、石英ガラスの光学的に透明な材料を用いて形成される。測定用反応容器の水平断面積が１０ｍｍ2〜５００ｍｍ2が用いられる。また、測定用反応容器１の内容量が１０μｌ〜１５ｍｌ、好ましくは５０μｌ〜５００μｌが用いられる。測定用反応容器の内容量が５０μｌより小さくなるにつれ、操作が困難になるという傾向が認められ、また５００μｌよりも大きくなるにつれ、一検体を測定するのに要する高価な抗原、抗体等の試薬を大量に要し無駄にするという傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【００４６】
測定用反応容器は独立した単一又は複数の容器の集合体でよい。例えば、図３に示すように形成される。
【００４７】
標準抗原としては、濃度既知の抗原である菌体やアレルゲンの溶液が用いられる。標準抗原溶液は菌体の場合は１０4個／ｍｌ〜１０12個／ｍｌ、好ましくは１０7個／ｍｌ〜１０11個／ｍｌが用いられ、アレルゲンの場合は０．０００１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．００１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌが用いられる。標準抗原の濃度は、菌体の場合１０7個／ｍｌあるいはアレルゲンの場合０．００１μｇ／ｍｌより少なくなるにつれ、充分な抗原量を測定用反応容器１に接触し非特異吸着により固定化することが不可能となる傾向が認められ、また菌体の場合１０11個／ｍｌあるいはアレルゲンの場合１０μｇ／ｍｌよりも多くなるにつれ、吸着量が飽和して未反応の抗原が増加し、経済性が悪くなる傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【００４８】
標準抗原溶液の溶媒としては、りん酸緩衝液、ホウ酸緩衝液が用いられる。他の溶液のｐＨを一定に保持することができるものでもよい。前記緩衝液に塩類、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムを溶解して使用するのが好ましい。緩衝液のｐＨとしてはｐＨ５〜ｐＨ９、好ましくはｐＨ６〜ｐＨ８が用いられる。緩衝液のｐＨがｐＨ６より小さくなるにつれ、安定な抗原の非特異吸着を測定用反応容器に発生させることができないという傾向が認められ、またｐＨ８よりも大きくなるにつれ、安定な抗原の非特異吸着を測定用反応容器に発生させることができないという傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【００４９】
本発明の請求項２に記載の免疫学的測定方法は、測定用反応容器の固相に測定対象である第二の抗体と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗体を一定量固定し、次いで、測定対象である第二の抗体と前記抗体と特異的に結合することができ標識物質を結合した抗原を含有する被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、前記測定用反応容器に固定された前記第一の標準抗体と前記被検液中の前記第二の抗体とで前記抗原を抗原抗体反応によりそれぞれの抗体濃度に応じて分配して抗原抗体複合体を形成させた後、前記測定用反応容器に比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を添加または分離用固体を挿入し、前記測定用反応容器の固相上の標識物質の反応を抑制し、前記被検液の液相中の前記標識物質量の測定を行う構成を有している。
【００５０】
これにより、（１）別途作製され保存された前記測定用反応容器を用いることで測定を簡便・迅速化することができるという作用を有する。
【００５１】
（２）前記測定用反応容器は前記抗体だけを固定化しているため、長期保存をすることができるという作用を有する。
【００５２】
（３）抗原抗体反応は被検液と測定用反応容器の接触を行うときの一回であるため短時間のうちに、かつ複数回の反応であるならば各反応間に必要となる洗浄を不要化することができ、測定用反応容器に固定化された一定量の第一の標準抗体と被検液中の第二の抗体によって、被検液に添加した前記抗原を、それぞれの抗体濃度に応じて所定の割合に分配させ、分配された抗原量と標識物質には所定の関係があるため、前記測定用反応容器または前記被検液と結合した前記標識物質の量を測定することによって、前記被検液中の第二の抗体濃度を算出することができるという作用を有する。
【００５３】
ここで、測定用反応容器としては、請求項１と同様のものが用いられる。
標準抗体としては、抗原である菌体又はアレルゲンに特異的な結合能を有するモノクロナール（又はポリクロナール）抗体が用いられる。標準抗体溶液は標準抗体が０．０００１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．００１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌが用いられる。標準抗体が０．００１μｇ／ｍｌより少なくなるにつれ、充分な抗体量を測定用反応容器に固定化することが不可能となるという傾向が認められ、また１０μｇ／ｍｌよりも多くなるにつれ、吸着量が飽和して未反応の抗原が増加し、経済性が悪くなる傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【００５４】
標準抗体溶液の溶媒としては、請求項１と同様のものが用いられる。本発明の請求項３に記載の免疫学的測定方法は、測定用反応容器の固相に測定対象である第二の抗原と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗原を一定量固定し、次いで、前記第一の標準抗原と特異的に結合することができ標識物質を結合した抗体を前記第一の標準抗原に接触させ、固相上に前記第一の標準抗原と前記抗体の抗原抗体複合体を形成させた後、測定対象である第二の抗原を含有する被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、前記測定用反応容器に固定された前記第一の標準抗原と前記被検液中の前記第二の抗原とで前記抗体を抗原抗体反応によりそれぞれの抗原濃度に応じて分配して抗原抗体複合体を形成させ、前記測定用反応容器に比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を添加または分離用固体を挿入し、前記測定用反応容器の固相上の標識物質の反応を抑制し、前記被検液の液相中の前記標識物質量の測定を行う構成を有している。
【００５５】
これにより、（１）別途作製され保存された前記測定用反応容器を用いることで測定を簡便・迅速化することができるという作用を有する。
【００５６】
（２）前記測定用反応容器には前記第一の標準抗原と前記抗体を固定化しているため、前記抗体を後で加える操作を省くことができるという作用を有する。
【００５７】
（３）抗原抗体反応は被検液と測定用反応容器の接触を行うときの一回であるため短時間のうちに、かつ複数回の反応であるならば各反応間に必要となる洗浄を不要化することができ、測定用反応容器に固定化された一定量の第一の標準抗原と被検液中の第二の抗原によって、被検液に添加した前記抗体を、それぞれの抗原濃度に応じて所定の割合に分配させ、分配された抗体量と標識物質には所定の関係があるため、前記測定用反応容器または前記被検液と結合した前記標識物質の量を測定することによって、前記被検液中の第二の抗原濃度を算出することができるという作用を有する。
【００５８】
ここで、測定用反応容器としては、請求項１と同様のものが用いられる。
標準抗原としては、請求項１と同様のものが用いられる。
【００５９】
標準抗原溶液の溶媒としては、請求項１と同様のものが用いられる。本発明の請求項４に記載の免疫学的測定方法は、測定用反応容器の固相に測定対象である第二の抗体と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗体を一定量固定し、次いで、前記第一の標準抗体と特異的に結合することができ標識物質を結合した抗原を前記第一の標準抗体に接触させ、固相上に前記第一の標準抗体と前記抗原の抗原抗体複合体を形成させた後、測定対象である第二の抗体を含有する被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、前記測定用反応容器に固定された前記第一の標準抗体と前記被検液中の前記第二の抗体とで前記抗原を抗原抗体反応によりそれぞれの抗体濃度に応じて分配して抗原抗体複合体を形成し、前記測定用反応容器に比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を添加または分離用固体を挿入し、前記測定用反応容器の固相上の標識物質の反応を抑制し、前記被検液の液相中の前記標識物質量の測定を行う構成を有している。
【００６０】
これにより、（１）別途作製され保存された前記測定用反応容器を用いることで測定を簡便・迅速化することができるという作用を有する。
【００６１】
（２）前記測定用反応容器には前記第一の標準抗体と前記抗原を固定化しているため、前記抗原を後で加える操作を省くことができるという作用を有する。
【００６２】
（３）抗原抗体反応は被検液と測定用反応容器の接触を行うときの一回であるため短時間のうちに、かつ複数回の反応であるならば各反応間に必要となる洗浄を不要化することができ、測定用反応容器に固定化された一定量の第一の標準抗体と被検液中の第二の抗体によって、被検液に添加した前記抗原を、それぞれの抗体濃度に応じて所定の割合に分配させ、分配された抗原量と標識物質には所定の関係があるため、前記測定用反応容器または前記被検液と結合した前記標識物質の量を測定することによって、前記被検液中の第二の抗体濃度を算出することができるという作用を有する。
【００６３】
ここで、測定用反応容器としては、請求項１と同様のものが用いられる。
標準抗体としては、請求項２と同様のものが用いられる。
【００６４】
標準抗体溶液の溶媒としては、請求項１と同様のものが用いられる。
請求項５に記載の免疫学的測定方法は、請求項１乃至４の内いずれか１項に記載の発明において、標識物質が酵素である構成を有している。
【００６５】
これにより、請求項１乃至４の内いずれか１項により得られる作用の他、酵素を利用することで、速く、容易に、安価に抗原または抗体を測定することができるという作用を有する。
【００６６】
ここで、酵素としては、ペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等が用いられる。
【００６７】
請求項６に記載の免疫学的測定方法は、請求項１乃至５の内いずれか１項に記載の発明において、分離用液体が、シリコンオイル、単糖類の溶液、二糖類以上の多糖類の溶液、ゼラチンの溶液、ポリエチレングリコールの溶液、アルギン酸ナトリウムの溶液の少なくとも１種またはそれらの混合物である構成を有している。
【００６８】
これにより、請求項１乃至５の内いずれか１項により得られる作用の他、測定用反応容器固相上の抗原抗体複合体と前記被検液の液相中の抗原抗体複合体との分離を、前記分離用液体を添加するだけで、短時間かつ容易におこなうことができるという作用を有する。
【００６９】
ここで、単糖類としては、トレオース、エリトロース、エリツルロース、リボース、デオキシリボース、アラビノース、キシロース、リブロース、キシルロース、アラビヌロース、グルコース、マンノース、アロース、アルトロース、ガラクトース、タロース、イドース、グロース、フコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、プシコース等が用いられる。また、二糖類以上の多糖類としては、スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、トレハロース等が用いられる。
【００７０】
請求項７に記載の免疫学的測定方法は、請求項１乃至５の内いずれか１項に記載の発明において、分離用固体に１以上の貫通孔が形成された構成を有している。
【００７１】
これにより、請求項１乃至５の内いずれか１項により得られる作用の他、測定用反応容器固相上の抗原抗体複合体と前記被検液の液相中の抗原抗体複合体との分離を、前記分離用固体を挿入するだけで、短時間かつ容易におこなうことができるという作用を有する。
【００７２】
請求項８に記載の免疫学的測定装置は、測定対象である第二の抗原と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗原を一定量固定した測定用反応容器を移送する移送部と、測定対象である第二の抗原と前記抗原と特異的に結合できる標識物質を結合した抗体を含有した被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を一定量添加する分離用液体注入部または分離用固体を挿入する分離用固体挿入部と、前記被検液中の前記第二の抗原と抗原抗体反応した前記抗体の前記標識物質の量を測定する測定部と、前記測定部が計測した前記標識物質の量を前記被検液の前記第二の抗原濃度に換算する換算部と、を備えた構成を有している。
【００７３】
これにより、（１）測定用反応容器は抗原だけを固定化しているため、長期保存ができ、測定が常時簡便におこなうことができるという作用を有する。
【００７４】
（２）１台の測定装置により反応・測定・換算をおこなえるため、操作のバラツキや煩雑さが低減され、高精度かつ簡便な測定をおこなうことができるという作用を有する。
【００７５】
ここで、移送部は測定用反応容器を水平方向に順次移動させるための駆動力を供給する測定用反応容器駆動用モータと、測定用反応容器駆動用モータの駆動力を測定用反応容器に伝達するための測定用反応容器駆動用ベルトと、を備えている。
【００７６】
分離用液体注入部は、分離用溶液を貯留する分離用溶液槽と、分離用溶液槽内の分離用溶液の蒸発を防止する分離用溶液槽蓋と、分離用溶液槽の分離用溶液を測定用反応容器に注入するための分離用溶液ポンプと、分離用溶液ポンプから吐出される分離用溶液を測定用反応容器に導くための分離用溶液注入ノズルと、を備えている。
【００７７】
分離用固体挿入部は、分離用固体と、分離用固体を挿入するための駆動力を供給する分離用固体挿入用モータと、分離用固体挿入用モータの駆動力を分離用固体に伝達するための分離用固体挿入用サポートと、を備えている。
【００７８】
測定部は、可視光を照射するための発光ダイオード、ハロゲンランプを用いた発光部と、測定用反応容器の透過光を検知するために必要に応じてフィルタ、レンズ、フォトマル、フォトダイオードを使用した受光部と、を備えている。
【００７９】
換算部は、液晶等を使用した表示部と、入力部と、サーマルヘッドプリンタ等を利用した印字部と、外部情報の入力や出力を行うための入出力インターフェース部と、電源部と、マイコン又は制御部と、を備えている。
【００８０】
請求項９に記載の免疫学的測定装置は、測定対象である第二の抗体と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗体を一定量固定した測定用反応容器を移送する移送部と、測定対象である第二の抗体と前記抗体と特異的に結合できる標識物質を結合した抗原を含有した被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を一定量添加する分離用液体注入部または分離用固体を挿入する分離用固体挿入部と、前記被検液中の前記第二の抗体と抗原抗体反応した前記抗原の前記標識物質の量を測定する測定部と、前記測定部が計測した前記標識物質の量を前記被検液の前記第二の抗体濃度に換算する換算部と、を備えた構成を有している。
【００８１】
これにより、（１）測定用反応容器は抗体だけを固定化しているため、長期保存ができ、測定が常時簡便におこなえることができるという作用を有する。
【００８２】
（２）１台の測定装置により反応・測定・換算をおこなえるため、操作のバラツキや煩雑さが低減され、高精度かつ簡便な測定をおこなうことができるという作用を有する。
【００８３】
ここで、移送部や分離用液体注入部又は分離用固体挿入部や測定部及び換算部は請求項８と同様のものが形成されている。
【００８４】
請求項１０に記載の免疫学的測定装置は、測定対象である第二の抗原と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗原を一定量固定し、前記第一の標準抗原と特異的に結合できる標識物質を結合した抗体と前記第一の標準抗原の抗原抗体複合体を形成させた測定用反応容器を移送する移送部と、測定対象である第二の抗原を含有した被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を一定量添加する分離用液体注入部または分離用固体を挿入する分離用固体挿入部と、前記被検液中の前記第二の抗原と抗原抗体反応した前記抗体の前記標識物質の量を測定する測定部と、前記測定部が計測した前記標識物質の量を前記被検液の前記第二の抗原濃度に換算する換算部と、を備えた構成を有している。
【００８５】
これにより、（１）測定用反応容器には前記抗原と前記抗体を固定化しているため、前記抗体を、後で加える操作を省くことができるという作用を有する。
【００８６】
（２）１台の測定装置により反応・測定・換算をおこなえるため、操作のバラツキや煩雑さが低減され、高精度かつ簡便な測定をおこなうことができるという作用を有する。
【００８７】
ここで、移送部や分離用液体注入部又は分離用固体挿入部や測定部及び換算部は請求項８と同様のものが形成されている。
【００８８】
請求項１１に記載の免疫学的測定装置は、測定対象である第二の抗体と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗体を一定量固定し、前記第一の標準抗体と特異的に結合できる標識物質を結合した抗原と前記第一の標準抗体の抗原抗体複合体を形成させた測定用反応容器を移送する移送部と、測定対象である第二の抗体を含有した被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を一定量添加する分離用液体注入部または分離用固体を挿入する分離用固体挿入部と、前記被検液中の前記第二の抗体と抗原抗体反応した前記抗原の前記標識物質の量を測定する測定部と、前記測定部が計測した前記標識物質の量を前記被検液の前記第二の抗体濃度に換算する換算部と、を備えた構成を有している。
【００８９】
これにより、（１）測定用反応容器には前記抗体と前記抗原を固定化しているため、前記抗原を、後で加える操作を省くことができるという作用を有する。
【００９０】
（２）１台の測定装置により反応・測定・換算をおこなえるため、操作のバラツキや煩雑さが低減され、高精度かつ簡便な測定をおこなうことができるという作用を有する。
【００９１】
ここで、移送部や分離用液体注入部又は分離用固体挿入部や測定部及び換算部は請求項８と同様のものが形成されている。
【００９２】
請求項１２に記載の免疫学的測定装置は、請求項８乃至１１の内いずれか１項に記載の発明において、前記測定用反応容器が１以上配設されユニット化された構成を有している。
【００９３】
これにより、請求項８乃至１１の内いずれか１項により得られる作用の他、複数の被険液を同時に測定でき、一被検液当たりの測定時間を短くし、一被検液当たりの測定操作を軽減し、一被検液当たりの測定に要する費用を安価にすることができるという作用を有する。
【００９４】
請求項１３に記載の免疫学的測定装置は、請求項８乃至１２の内いずれか１項に記載の発明において、測定用反応容器が、円筒体、角筒体の少なくとも１種またはそれらの複合した形状である構成を有している。
【００９５】
これにより、請求項８乃至１２の内いずれか１項により得られる作用の他、前記測定用試験片固相上の抗原抗体複合体と前記被検液の液相中の抗原抗体複合体との分離を、短時間かつ容易におこなうことができるという作用を有する。
【００９６】
請求項１４に記載の免疫学的測定装置は、請求項８乃至１３の内いずれか１項に記載の発明において、測定用反応容器の温度を一定に保持する温度保持手段を備えた構成を有している。
【００９７】
これにより、請求項８乃至１３の内いずれか１項により得られる作用の他、抗原抗体反応、酵素反応時の温度を一定とすることで、適正な反応を迅速かつ安定的に進行させ、測定時間を短くし、高精度な測定をおこなうことができるという作用を有する。
【００９８】
ここで、温度保持装置としては、反応時の温度を測定するために熱電対等を利用した温度センサと、ニクロム線、ペルチェ素子等を利用した温度調整ヒータと、温度センサからの温度測定結果を受けて設定した温度になるように温度調整ヒータを制御する温度調整ユニットと、を備えている。
【００９９】
請求項１５に記載の免疫学的測定装置は、請求項８乃至１４の内いずれか１項に記載の発明において、前記測定用反応容器を撹拌する撹拌手段を備えた構成を有している。
【０１００】
これにより、請求項８乃至１４の内いずれか１項により得られる作用の他、撹拌によって抗原抗体反応、酵素反応を効率的に進行させ、測定時間を短くすることができるという作用を有する。
【０１０１】
ここで、撹拌手段としては、移送部の測定用反応容器駆動用モータと、測定用反応容器駆動用ベルトと、により測定用反応容器を水平方向に１〜３００往復／分で振動する手段や、垂直方向に振動させる手段や、空気を被検液に導入し曝気する手段や、外部の磁性体の回転運動等を被検液中の磁性体に磁力により伝える手段等が用いられる。
【０１０２】
以下、本発明の抗原（または抗体）の免疫学的測定方法及び免疫学的測定装置の実施の形態について図面を参照しながら説明する。
【０１０３】
（実施の形態１）
実施の形態１では、抗体が特異的に結合する抗原決定基を有する菌体を抗原とし、分離用液体を使用して菌体数を測定する免疫学的測定方法及び免疫学的測定装置について説明する。
【０１０４】
以下、抗原の測定について説明するが、抗原と抗体を逆にすることも可能である。抗体の測定に関する説明は省略する。
【０１０５】
図１は本発明の実施の形態１の免疫学的測定装置の概略断面図であり、図２は本発明の実施の形態１の免疫学的測定装置の概略平面図であり、図３は本発明の実施の形態１の測定用反応容器を示す概略斜視図であり、図４は本発明の実施の形態１の主要工程を示す模式図であり、図５は本発明の実施の形態１の各ステップの反応模式を示す図である。
【０１０６】
図１、図２において、１は標準液や被検液等を保持して反応させるための測定用反応容器、２は測定用反応容器１を水平方向に順次移動させるための駆動力を供給する測定用反応容器駆動用モータ、３は測定用反応容器駆動用モータ２の駆動力を測定用反応容器１に伝達するための測定用反応容器駆動用ベルト、４は分離用溶液槽５内の分離用溶液の蒸発を防止するための分離用溶液槽蓋、５は分離用溶液を貯留するための分離用溶液槽、６は分離用溶液槽５の分離用溶液を測定用反応容器１に注入するための分離用溶液ポンプ、７は分離用溶液ポンプ６から吐出される分離用溶液を測定用反応容器１に導くための分離用溶液注入ノズル、８は基質溶液槽９内の基質溶液の蒸発を防止するための基質溶液槽蓋、９は基質溶液を貯留するための基質溶液槽、１０は基質溶液槽９の基質溶液を測定用反応容器１に注入するための基質溶液ポンプ、１１は基質溶液ポンプ１０から吐出される基質溶液を測定用反応容器１に導くための基質溶液注入ノズル、１２は反応停止液槽１３内の反応停止液の蒸発を防止するための反応停止液槽蓋、１３は反応停止液を貯留するための反応停止液槽、１４は反応停止液槽１３の反応停止液を測定用反応容器１に注入するための反応停止液ポンプ、１５は反応停止液ポンプ１４から吐出される反応停止液を測定用反応容器１に導くための反応停止液注入ノズル、１８は可視光を照射するための発光ダイオード、ハロゲンランプ等を使用した発光部、１９は測定用反応容器１の透過光を検知するために必要に応じてフィルタ、レンズ、フォトマル等を使用した受光部、２０はマイコン等を使用し菌体濃度まで算出する換算部、２１は液晶等を使用した表示部、２２は入力部、２３はサーマルヘッドプリンタ等を利用した印字部、２４は外部情報の入力や出力を行うための入出力インターフェース部、２５は電源部、２６は制御部、２７は測定用反応容器１を入れるための測定用反応容器挿入口、２８は測定用反応容器１を取り出すための測定用反応容器排出口、２９は筐体、３１は反応時の温度を測定するために熱電対等を使用した温度センサー、３２は温度センサー３１からの温度測定結果を受けて設定した温度になるように温度調整ヒータ３３を制御する温度調整ユニット、３３は温度調整のための熱を供給するためにニクロム線等を使用した温度調整ヒータである。
【０１０７】
図３において、５０は反応容器５１乃至５８を一体化する反応容器連結枠、５１乃至５８は独立した第１乃至第８反応容器である。
【０１０８】
図４において、７１はＡ−１．測定用反応容器作製工程、７２はＡ−２．反応工程、７３はＡ−３．測定工程、７４はＡ−４．換算工程である。
【０１０９】
図５において、９１は抗体、９２は抗原、９３は標準抗原、９４は酵素標識抗体、９５は酵素、４０は分離用溶液、７０は標準液あるいは被検液である。
【０１１０】
尚、図１または図２と同様のものには同一の符号を付して説明を省略する。
実施の形態１の免疫学的測定方法は、図４に示すように４段階の工程（Ａ−１．測定用反応容器作製工程）、（Ａ−２．反応工程）、（Ａ−３．測定工程）、および（Ａ−４．換算工程）から構成される。
【０１１１】
測定用反応容器１は以下の工程によって作製した。
（Ａ−１．測定用反応容器１作製工程）
これは標準抗原９３を測定用反応容器１（図３に示す）に固定化して安定化状態とする工程である。以下に示す（ａ）〜（ｇ）のステップから構成される。
【０１１２】
（Ａ−１ａ）は標準抗原９３を測定用反応容器１に固定化するステップである。標準抗原９３は測定対象となる抗原で単一種の菌体の懸濁液を使用する。
【０１１３】
測定用反応容器１は、ポリスチレン、ガラス、石英ガラスの光学的に透明な合成樹脂を用いて形成される。測定用反応容器１は独立した単一又は複数の容器の集合体でもよい。例えば、図３に示すように形成される。
【０１１４】
標準抗原溶液の標準抗原９３濃度としては１０4個／ｍｌ〜１０12個／ｍｌ、好ましくは１０7個／ｍｌ〜１０11個／ｍｌが用いられる。
【０１１５】
標準抗原９３溶液の溶媒としては、りん酸緩衝液、ホウ酸緩衝液が用いられる。他の溶液でｐＨを一定に保持することができるものでもよい。前記緩衝液に塩類、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウムを溶解して使用するのが好ましい。緩衝液のｐＨとしてはｐＨ５〜ｐＨ９、好ましくはｐＨ６〜ｐＨ８が用いられる。
【０１１６】
標準抗原９３溶液を測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８にそれぞれ同容量・同濃度となるように注ぐ。
【０１１７】
標準抗原９３溶液による測定用反応容器１の処理条件としては、ｐＨ５〜ｐＨ９、処理時間１０分〜４８時間、処理温度４℃〜４０℃、好ましくはｐＨ６〜ｐＨ８、処理時間３０分〜２時間、処理温度５℃〜３０℃が用いられる。この条件で浸漬処理することにより測定用反応容器１に標準抗原９３である菌体を高密度で非特異吸着させることが可能となる。
【０１１８】
（Ａ−１ｂ）は未反応の標準抗原９３を洗浄除去するステップである。緩衝液で、測定用反応容器１を好ましくは１回〜１０回、好ましくは２回〜５回洗浄することで未反応の標準抗原９３を効率的に除去することができ、以降の測定の精度を向上させることができる。
【０１１９】
（Ａ−１ｃ）はブロッキング剤で測定用反応容器１の非特異吸着面を被覆するステップである。測定用反応容器１にブロッキング剤溶液を注ぐ。ブロッキング剤溶液による測定用反応容器１の処理条件としては、ｐＨ５〜ｐＨ９、処理時間１０分〜４８時間、処理温度４℃〜４０℃、好ましくはｐＨ６〜ｐＨ８、処理時間３０分〜２時間、処理温度５℃〜３０℃が用いられる。この条件で浸漬処理することにより測定用反応容器１に残存する非特異吸着を起こす表面にブロッキング剤を非特異吸着させ、以後他の有機物の非特異吸着が極力おこらないようになり、より精度の高い測定が可能となる。
【０１２０】
ブロッキング剤として、牛血清アルブミン、牛乳由来カゼイン、ゼラチン等のタンパク質を含有したブロッキング剤溶液を使用する。ブロッキング剤溶液の溶媒としては、りん酸緩衝液、ホウ酸緩衝液が用いられる。他の溶液のｐＨを一定に保持することができるものでもよい。前記緩衝液に塩類、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムを溶解して使用するのが好ましい。緩衝液のｐＨとしては、ｐＨ５〜ｐＨ９、好ましくはｐＨ６〜ｐＨ８が用いられる。緩衝液のｐＨがｐＨ６より小さくなるにつれ、安定なブロッキング剤の非特異吸着を測定用反応容器に発生させることができないという傾向が認められ、またｐＨ８より大きくなるにつれ、安定な抗ブロッキング剤の非特異吸着を測定用反応容器に発生させることができないという傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【０１２１】
（Ａ−１ｄ）は未反応のブロッキング剤を洗浄除去するステップである。界面活性剤含有緩衝液で、測定用反応容器１を１回〜１０回、好ましくは２回〜５回洗浄することで未反応のブロッキング剤を効率的に除去することができ以降の測定の精度を向上させることができる。
【０１２２】
ここで、界面活性剤としてポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノラウレートが用いられる。界面活性剤の濃度は０．００１Ｗ／Ｖ％〜１Ｗ／Ｖ、好ましくは０．０１Ｗ／Ｖ％〜０．２Ｗ／Ｖ％が用いられる。界面活性剤の濃度が０．０１Ｗ／Ｖ％より少なくなるにつれ、未反応のタンパク質等を効率的に除去することができず以降の測定の精度を低下させるという傾向が認められ、また０．２Ｗ／Ｖ％より多くなるにつれ、発泡が著しく起こるため洗浄しにくくなるという傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【０１２３】
（Ａ−１ｅ）は酵素標識抗体９４を測定用反応容器１上の標準抗原９３に特異吸着させるステップである。酵素標識抗体９４としては、界面活性剤含有緩衝液に抗体として、抗原である菌体に特異的な結合能を有するモノクロナール（またはポリクロナール）抗体に標識物質を結合させた抗体、または抗原である菌体に特異的な結合能を有するモノクロナール（またはポリクロナール）抗体とこの抗体に特異的な結合能を有するモノクロナール（またはポリクロナール）抗体に標識物質を結合させた抗体の組み合わせたものが用いられる。
【０１２４】
標識物質９５としては、ペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ酵素が用いられる。
【０１２５】
酵素標識抗体９４溶液を測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８にそれぞれ同容量・同濃度となるように注ぐ。酵素標識抗体９４溶液による測定用反応容器１の処理条件はｐＨ５〜ｐＨ９、処理時間１０分〜４８時間、処理温度４℃〜４０℃、好ましくはｐＨ６〜ｐＨ８、処理時間３０分〜２時間、処理温度５℃〜３０℃で浸漬処理することにより、測定用反応容器１上の固定化標準抗原９３に酵素標識抗体９４が抗原抗体反応で特異的に結合することが可能となる。
【０１２６】
（Ａ−１ｆ）は未反応の酵素標識抗体９４を洗浄除去するステップである。界面活性剤含有緩衝液で、測定用反応容器１を好ましくは１回〜１０回、好ましくは２回〜５回洗浄することで未反応の酵素標識抗体９４を効率的に除去することができ以降の測定の精度を向上させることができる。
【０１２７】
（Ａ−１ｇ）は測定用反応容器１を保存可能とする処理をおこなうステップである。保存手段として凍結乾燥法、風乾等を用いて、測定用反応容器１を長期安定化した状態とする。
【０１２８】
標準抗原９３と酵素標識抗体９４を測定用反応容器１上に固定した様子を図５（ａ）に示す。
【０１２９】
次に（Ａ−１．測定用反応容器作製工程）で作製された測定用反応容器１を用いて菌体数を測定する本発明の免疫学的測定方法の（Ａ−２．反応工程）、（Ａ−３．測定工程）、（Ａ−４．換算工程）と、その免疫学的測定方法を実施するための免疫学的測定装置について説明する。
【０１３０】
実施の形態１における免疫学的測定装置は、標準液や被検液等を保持して反応させるための測定用反応容器１と、測定用反応容器１を水平方向に順次移動させるための駆動力を供給する測定用反応容器駆動用モータ２と、測定用反応容器駆動用モータ２の駆動力を測定用反応容器１に伝達するための測定用反応容器駆動用ベルト３を備えた移送部と、分離用溶液槽５内の分離用溶液の蒸発を防止するための分離用溶液槽蓋４と分離用溶液を貯留するための分離用溶液槽５と分離用溶液槽５の分離用溶液を測定用反応容器１に注入するための分離用溶液ポンプ６と分離用溶液ポンプ６から吐出される分離用溶液を測定用反応容器１に導くための分離用溶液注入ノズル７を備えた分離部と、可視光を照射するための発光ダイオード、ハロゲンランプ等を使用した発光部１８と、測定用反応容器１の透過光を検知するために必要に応じてフィルタ、レンズ、フォトマル、フォトダイオード等を使用した受光部１９、を備えた測定部と、マイコン等を使用し菌体濃度まで算出する換算部２０からなる構成とした。
【０１３１】
また、基質溶液の蒸発を防止するための基質溶液槽蓋８と基質溶液を貯留するための基質溶液槽９と基質溶液槽９の基質溶液を測定用反応容器１に注入するための基質溶液ポンプ１０と基質溶液ポンプ１０から吐出される基質溶液を測定用反応容器１に導くための基質溶液注入ノズル１１を配設した。
【０１３２】
更に、反応停止液の蒸発を防止するための反応停止液槽蓋１２と反応停止液を貯留するための反応停止液槽１３と反応停止液槽１３の反応停止液を測定用反応容器１に注入するための反応停止液ポンプ１４と反応停止液ポンプ１４から吐出される反応停止液を測定用反応容器１に導くための反応停止液注入ノズル１５を配設した。
【０１３３】
換算部２０に、液晶等を使用した表示部２１と入力部２２とサーマルヘッドプリンタ等を利用した印字部２３と外部情報の入力や出力を行うための入出力インターフェース部２４と電源部２５及び制御部２６を必要に応じて配設した。
【０１３４】
必要に応じて筐体２９内が、測定用反応容器１を入れるための測定用反応容器挿入口２７と測定用反応容器１を取り出すための測定用反応容器排出口２８と反応時の温度を測定するために熱電対等を使用した温度センサー３１と温度センサ−３１からの温度測定結果を受けて設定した温度になるように温度調整ヒータ３３を制御する温度調整ユニット３２と温度調整のための熱を供給するためにニクロム線等を使用した温度調整ヒータ３３等を配設した。
【０１３５】
また、撹拌手段としては、移送部の測定用反応容器駆動用モータと、測定用反応容器駆動用ベルトと、により測定用反応容器を水平方向に１〜３００往復／分で振動する手段を用いた。
【０１３６】
次に、上記実施の形態１の免疫学的測定装置を用いた、免疫学的測定方法を説明する。
【０１３７】
（Ａ−２．反応工程）
これは抗原量に比例した量の酵素標識抗体９４を測定用反応容器１に固定化された標準抗原９３と被検液等に含まれる抗原９２に分配させ、分配させた酵素標識抗体９４を分離する工程である。以下に示す（ａ）のステップから構成される。
【０１３８】
（Ａ−２ａ）は抗原量に比例した量の酵素標識抗体９４を測定用反応容器１と被検液に分配・分離させるステップである。標準抗原懸濁液を原液として、界面活性剤含有緩衝液で順次希釈して６種類の２倍から２０倍好ましくは３倍から５倍の標準希釈列溶液を調製し、測定用反応容器１の第２反応容器５２から第７反応容器５７にそれぞれ一定量注ぐ。ブランク液として界面活性剤含有緩衝液を新たな測定用反応容器１の第１反応容器５１に標準希釈列溶液と同量注ぐ。被検液を新たな測定用反応容器１の第８反応容器５８に標準希釈列溶液と同量注ぐ。ブランク液と標準希釈列溶液は検量線作成に用いるためのものである。
【０１３９】
測定用反応容器１を筐体２９に設けられた測定用反応容器挿入口２７より挿入する。さらに、標準希釈列の溶液の菌体濃度と測定用反応容器１の各測定用反応容器の対応を入力部２２を介して換算部２０に入力する。入力部２２からの操作により反応容器駆動用モータ２の正回転、逆回転により反応容器駆動用ベルト３ひいては測定用反応容器１水平方向に周期的に動かすことによって、測定用反応容器１を構成する複数の容器内に貯められた被検液と標準希釈列の溶液とブランク液を撹拌させる。被検液と標準希釈列の溶液とブランク液による測定用反応容器１の処理条件は、処理時間１０分〜３時間、処理温度４℃〜４０℃、好ましくは処理時間３０分〜２時間、処理温度４℃〜３０℃で浸漬処理することにより、酵素標識抗体９４を固相である測定用反応容器１に固定化されている標準抗原９３と測定用反応容器１内の液相に溶解している抗原９２に化学平衡反応で分配させることが可能となる。より好ましくは、処理時間３０分以上２時間以下で、処理温度４℃以上３０℃以下の範囲での浸漬処理である。
【０１４０】
あらかじめ分離用溶液４０を調製し、この分離用溶液を分離用溶液槽５に充填する。分離用溶液４０としてはシリコンオイル、単糖類の溶液、二糖類以上の多糖類の溶液、ゼラチンの溶液、ポリエチレングリコールの溶液、アルギン酸ナトリウムの溶液等の少なくとも一種またはそれらの混合物で比重が標準液、被検液またはブランク液よりも大きい溶液が使用可能である。好ましくは比重１．１以上２以下の溶液である。また、光学的な測定をする場合は使用する波長の吸収が極力少ないことが望ましい。
【０１４１】
反応容器駆動用モータ２により反応容器駆動用ベルト３ひいては測定用反応容器１を順次移動させながら、分離用溶液ポンプ７により分離用溶液槽５内の分離用溶液４０を分離用溶液注入ノズル７を介して測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８に一定量添加することにより、極めて簡単に測定用反応容器１の標準抗原９３に分配された酵素標識抗体９４の酵素９５が以後の測定工程で反応しない状態とする。
【０１４２】
以上各ステップの反応模式を図５（ｂ）〜（ｄ）に示す。測定用反応容器１への抗原９２含有被検液の注入による測定用反応容器１と抗原９２含有被検液の接触を図５（ｂ）に示し、時間経過による酵素標識抗体９４の測定用反応容器１と被検液への分配を図５（ｃ）に示し、分離用溶液４０の添加を図１５（ｄ）に示す。
【０１４３】
（Ａ−３．測定工程）
これは発色基質を添加して酵素反応で発色させ、発色の度合いを測定する工程である。以下に示す（ａ）乃至（ｃ）のステップから構成される。
【０１４４】
（Ａ−３ａ）は基質を酵素反応で発色させるステップである。あらかじめ基質溶液を調製し、この基質溶液を基質溶液槽９に充填する。基質溶液は溶質として標識物質に応じた発色基質を含有し、発色基質としてペルオキシダーゼの場合はオルトフェニレンジアミン二塩酸塩、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン、２，２’−アジノ−ビス（３−チルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム塩、５−アミノサリチル酸等が使用できる。また、基質溶液は基質として過酸化水素を含有し、溶媒としては緩衝液を使用し、ｐＨ５．０±０．１の０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸緩衝液等が使用できる。測定用反応容器駆動用モータ２により測定用反応容器駆動用ベルト３ひいては測定用反応容器１を水平方向に順次移動させて、測定用反応容器１の複数の各測定用反応容器に基質溶液槽９内の基質溶液を基質溶液注入ポンプ１０により基質溶液注入ノズル１１を介し添加し反応を進める。
【０１４５】
反応条件としては、反応時間１分〜６０分、反応温度１０℃〜４０℃、好ましくは反応時間２分〜２０分、反応温度１５℃〜３０℃が用いられる。この条件で反応させることにより測定用反応容器１に残留している標識物質が発色基質から酵素反応によって色素を効率的に生成させることが可能となる。反応時間が２分より短くなるにつれ、十分な発色が得られないという傾向が認められ、また２０分より長くなるにつれ、測定感度が低下するという傾向が認められるので、いずれも好ましくない。反応温度が１５℃より低くなるにつれ、酵素の活性が低下するという傾向が認められ、また３０℃より高くなるにつれ、酵素の活性が低下するという傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【０１４６】
（Ａ−３ｂ）は酵素反応を停止させるステップである。あらかじめ反応停止液を調製し、反応停止液槽１３に充填する。反応停止液は溶質として標識物質に応じた反応停止剤を含有し、反応停止剤として硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、水酸化ナトリウムが用いられる。
【０１４７】
測定用反応容器駆動用モータ２により測定用反応容器駆動用ベルト３ひいては測定用反応容器１を水平方向に順次移動させて、測定用反応容器１の各測定用反応容器に反応停止液槽１３内の反応停止液を反応停止液注入ポンプ１４により反応停止液注入ノズル１５を介して添加して、酵素反応を停止させる。
【０１４８】
（Ａ−３ｃ）は発色波長における発色の度合いの測定ステップである。測定用反応容器駆動用モータ２により測定用反応容器駆動用ベルト３ひいては測定用反応容器１を水平方向に順次移動させて、発光部１８を光源とし、色素が特異的に吸収する波長の光を受光部１９で検出し換算部２０に出力する。
【０１４９】
これにより標準希釈列溶液の菌体濃度に対応した吸光度の関係を示す検量関係のデータおよび被検液に関するデータが得られる。
【０１５０】
（Ａ−４．換算工程）
これは標準抗原溶液の検量線より抗原濃度の換算をおこなう工程である。以下に示す（ａ）のステップから構成される。
【０１５１】
（Ａ−４ａ）は換算ステップである。換算部２０において受光部１９の検出値より吸光度を算出し、ブランク液の吸光度を各標準抗原溶液の吸光度より差し引き検量線の回帰直線または回帰曲線を換算部２０で求める。検量線の回帰直線または回帰曲線より任意の被検液の吸光度を測定すれば、被検液の濃度を算出することができ結果を表示部２１に出力し、表示ことができる。さらに、印字部２３により結果の印字出力や入出力インターフェース２４を介して結果を外部換算装置等に出力することができる。
【０１５２】
以上のように本実施の形態によれば、供給者側で反応済み測定用反応容器１を作製し、測定用反応容器１と被検液を測定用反応容器１内で反応させることで被検液の抗原９２濃度に応じた標識抗体（または抗原）の測定用反応容器１あるいは標準液あるいは被検液７０への分配を行わせ、分離用溶液で極めて容易に分離でき、測定用反応容器１内の液体または測定用反応容器２上の標識物質濃度を定量することで被検液中の抗原（または抗体）濃度を測定することが可能で、従来の測定方法及び測定装置、例えば、現在最も一般的に利用されているサンドイッチ法ＥＬＩＳＡと本発明の測定方法を比較すると、サンドイッチ法が２工程の抗原抗体反応工程、２工程の洗浄操作を必要とするのに対して、本発明の測定方法は１工程の抗原抗体反応工程、洗浄操作は不要にでき簡便、迅速、安価に抗原（または抗体）を定量することができる特異的な免疫学的測定方法及び測定装置を提供することができる。
【０１５３】
（実施の形態２）
実施の形態２では、抗体が特異的に結合する抗原決定基を有するアレルゲンを抗原とし、分離用固体を使用してアレルゲン濃度を測定する免疫学的測定方法及び免疫学的測定装置について説明する。
【０１５４】
以下抗原の測定について説明するが、例えば、アレルゲン（抗原）に対する血清中の抗体量を測定する等、抗原と抗体を逆にすることも可能である。こうした理由から抗体の測定に関する説明は省略する。
【０１５５】
図６は本発明の実施の形態２における免疫学的測定装置の概略断面図であり、図７は本発明の実施の形態２の免疫学的測定装置の概略平面図であり、図８は本発明の実施の形態２の分離用固体を示す概略斜視図であり、図９は本発明の実施の形態２の測定用反応容器と分離用固体を組み合わせた状態を示す概念断面図であり、図１０は本発明の実施の形態２の主要工程を示す模式図であり、図１１は同各ステップの反応模式を示す図である。
【０１５６】
図６、図７において、４３は分離用固体、４４は分離用固体挿入用サポート４５を介して分離用固体４３を測定用反応容器１に挿入するための分離用固体挿入用モータ、４５は分離用固体挿入用サポートである。
【０１５７】
図８、図９、図１０において、４６は分離用固体４３の垂直方向に設けた１以上の貫通孔、４７は測定用反応容器１の内径に適合し標準液あるいは被検液７０を貫通孔４６以外から流動させないためのＯ−リングである。
【０１５８】
図１１において、７５はＢ−１．測定用反応容器作製工程、７６はＢ−２．反応工程、７７はＢ−３．測定工程、７８はＢ−４．換算工程である。
【０１５９】
尚、図１乃至図５と同様のものには同一の符号を付して説明を省略する。
実施の形態２の免疫学的測定方法は、４段階の工程（Ｂ−１．測定用反応容器作製工程）、（Ｂ−２．反応工程）、（Ｂ−３．測定工程）、および（Ｂ−４．換算工程）から構成される。
【０１６０】
測定用反応容器１は以下の工程によって作製した。
（Ｂ−１．測定用反応容器１作製工程）
これは標準抗原９３を測定用反応容器１に固定化して安定化状態とする工程である。以下に示す（ａ）乃至（ｅ）のステップから構成される。
【０１６１】
（Ｂ−１ａ）は標準抗原９３を測定用反応容器１に固定化するステップである。標準抗原９３は測定対象となる抗原で単一種のアレルゲンの溶液を使用する。
【０１６２】
測定用反応容器１は実施の形態１の（Ａ−１ａ）と同様のものが用いられる。
標準抗原９３溶液としては、抗原であるアレルゲンの溶液が用いられる。標準抗原９３の濃度は０．０００１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．００１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌが用いられる。この範囲の標準抗原９３の濃度が、充分な抗原量を測定用反応容器１に接触し非特異吸着により固定化することが可能となる。標準抗原９３の濃度が０．００１μｇ／ｍｌより少なくなるにつれ、充分な抗原量を測定用反応容器に固定化することが不可能となるという傾向が認められ、また１０μｇ／ｍｌより多くなるにつれ、吸着量が飽和して未反応の抗原が増加し、経済性が悪くなるという傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【０１６３】
標準抗原９３の溶媒は、実施の形態１の（Ａ−１ａ）と同様のものを用いた。
緩衝液は、実施の形態１の（Ａ−１ａ）と同様のものを用いた。
【０１６４】
標準抗原９３溶液を測定用反応容器１の第１測定用反応容器５１から第８測定用反応容器５８にそれぞれ同容量・同濃度となるように注ぐ。
【０１６５】
標準抗原９３溶液による測定用反応容器１の処理は実施の形態１の（Ａ−１ａ）と同様の条件で行った。
【０１６６】
（Ｂ−１ｂ）は未反応の標準抗原９３を洗浄除去するステップである。緩衝液で、測定用反応容器１を１回〜１０回、好ましくは２回〜５回洗浄することで未反応の標準抗原９３を効率的に除去することができ、以降の測定の精度を向上させることができる。
【０１６７】
（Ｂ−１ｃ）はブロッキング剤で測定用反応容器１の非特異吸着面を被覆するステップである。（Ｂ−１ｃ）では実施の形態１の（Ａ−１ｃ）と同様の条件、同様のものを用いて浸漬処理を行った。
【０１６８】
（Ｂ−１ｄ）は未反応のブロッキング剤を洗浄除去するステップである。（Ｂ−１ｄ）では実施の形態１の（Ａ−１ｄ）と同様の条件、同様のものを用いて洗浄を行った。
【０１６９】
（Ｂ−１ｅ）は測定用反応容器１を保存可能とする処理をおこなうステップである。保存手段として凍結乾燥法、風乾等を用いて、測定用反応容器１を長期安定化した状態とする。
【０１７０】
標準抗原９３が測定用反応容器１に固定化された様子を図１１（ａ）に示す。次に（Ｂ−１．測定用反応容器作製工程）で作製された測定用反応容器１を用いてアレルゲン濃度測定する本発明の免疫学的測定方法の（Ｂ−２．反応工程）、（Ｂ−３．測定工程）、（Ｂ−４．換算工程）と、その免疫学的測定方法を実施するための免疫学的測定装置について説明する。
【０１７１】
以下図６と図７に記載した免疫学的測定装置と図８と図９に記載した分離用固体に従って説明する。
【０１７２】
実施の形態２の免疫学的測定装置と実施の形態１の免疫学的測定装置との相違は、分離溶液注入部の代わりに分離用固体挿入部が配設されたことである。
【０１７３】
実施の形態２の免疫学的測定装置の分離用固体挿入部は、図６と図７に示すような分離用固体４３と、分離用固体挿入用サポート４５を介して分離用固体４０を測定用反応容器１に挿入するための分離用固体挿入用モータ４４と、分離用固体挿入用サポート４５と、を備えている。
【０１７４】
実施の形態２の分離用固体４３は、図８に示すような分離用固体４３の垂直方向に設けた１または複数の貫通孔４６と、測定用反応容器１の内径に適合し標準液あるいは被検液７０を貫通孔４６以外から流動させないためのＯ−リング４７と、を備えている。
【０１７５】
実施の形態２の測定用反応容器１と分離用固体４３は図９の様に配設される。測定用反応容器１の内側に、１以上の貫通孔４６を垂直方向に形成した分離用固体４３と分離用固体挿入用サポート４５を配設し、測定用反応容器１の内径に適合し標準液あるいは被検液７０を貫通孔４６以外から流動させないためのＯ−リングを配設した。尚、実施の形態１と同様のものには同一の符号を付して説明を省略する。
【０１７６】
次に、実施の形態２の測定装置を用いて、免疫学的測定方法を説明する。尚、実施の形態１と同様のものは説明を省略する。
【０１７７】
（Ｂ−２．反応工程）
これは抗原量に比例した量の酵素標識抗体９４を測定用反応容器１に固定化された標準抗原９３と被検液等に含まれる抗原９２に分配させ、分配させた酵素標識抗体９４を分離する工程である。以下に示す（ａ）のステップから構成される。
【０１７８】
（Ｂ−２ａ）は抗原量に比例した量の酵素標識抗体９４を測定用反応容器１と被検液に分配・分離させるステップである。標準抗原懸濁液を原液として、界面活性剤含有緩衝液で順次希釈して６種類の２倍から２０倍好ましくは３倍から５倍の標準希釈列溶液を調製し、測定用反応容器１の第２反応容器５２から第７反応容器５７にそれぞれ一定量注ぐ。ブランク液として界面活性剤含有緩衝液を新たな測定用反応容器１の第１反応容器５１に標準希釈列溶液と同量注ぐ。被検液を新たな測定用反応容器１の第８反応容器５８に標準希釈列溶液と同量注ぐ。さらに、一定量の酵素標識抗体９４溶液を被検液と標準希釈列溶液とブランク液を注いだ新たな測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８にそれぞれ一定量添加する。ブランク液と標準希釈列溶液は検量線作成に用いるためのものである。さらに、測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８の上部にそれぞれ分離用固体４３を設置する。
【０１７９】
分離用固体４３としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、アクリル樹脂の光学的に透明な合成樹脂を用いて形成される。測定用反応容器１の各反応容器の内部形状に適合し、標準液あるいは被検液７０を貫通孔４６以外から流動させない構造を有する。
【０１８０】
分離用固体４３の形状としては、円柱状、角柱状、多孔質状体等が用いられる。例えば、図８に示す形態である。
【０１８１】
分離用固体４３の高さとしては、１ｍｍ〜３０ｍｍ、好ましく２ｍｍ〜５ｍｍが用いられる。分離用固体４３の高さが２ｍｍより低くなるにつれ、分離が充分に行われないという傾向が認められ、また５ｍｍより高くなるにつれ、貫通孔４６の容量が大きくなるという傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【０１８２】
貫通孔４６は１以上または複数で形成され、貫通孔４６の総水平断面積（各貫通孔４６の水平断面積の和）は０．１ｍｍ2〜５０ｍｍ2、好ましくは０．２ｍｍ2〜５ｍｍ2が用いられる。貫通孔４６の総水平断面積が０．２より小さくなるにつれ、挿入抵抗が増加し挿入し難くなるという傾向が認められ、また５ｍｍ2より大きくなるにつれ、貫通孔４６の上下の拡散による混合が早やかに起こるという傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【０１８３】
また、各貫通孔４６の水平断面積は０．１ｍｍ2〜２ｍｍ2、好ましくは０．２ｍｍ2〜１ｍｍ2が用いられる。各貫通孔４６の水平断面積が０．２ｍｍ2より小さくなるにつれ、挿入抵抗が増加し挿入し難くなるという傾向が認められ、また１ｍｍ2より大きくなるにつれ、貫通孔４６の上下の拡散による混合が早やかに起こるという傾向が認められるので、いずれも好ましくない。
【０１８４】
分離用固体４３を上部に設置した測定用反応容器１を、筐体２９に設けられた測定用反応容器挿入口２７より挿入する。さらに、標準希釈列溶液のアレルゲン濃度と測定用反応容器１の各測定用反応容器の対応を入力部２２を介して換算部２０に入力する。入力部２２からの操作により反応容器駆動用モータ２の正回転、逆回転により反応容器駆動用ベルト３ひいては測定用反応容器１水平方向に周期的に動かすことによって、測定用反応容器１を構成する複数の容器内に貯められた被検液と標準希釈列の溶液とブランク液を撹拌させる。被検液と標準希釈列の溶液とブランク液による測定用反応容器１の処理条件は、実施の形態１の（Ａ−２ａ）と同様の条件で行った。
【０１８５】
反応容器駆動用モータ２により反応容器駆動用ベルト３ひいては測定用反応容器１を移動させ、分離用固体挿入用モータ４４を起動し、分離用固体挿入用サポート４６を介して各分離用固体４３を測定用反応容器１の各反応容器底面まで挿入することにより、測定用反応容器１の標準抗原９３に分配された酵素標識抗体９４の酵素９５が以後の測定工程で反応しない状態とする。図９は分離用固体挿入用サポート４６により各分離用固体４３を測定用反応容器１の各反応容器底面まで挿入した状態を示している。
【０１８６】
以上の各ステップの反応模式は図１１（ｂ）〜（ｄ）を示す。測定用反応容器１への抗原含有被検液の注入による測定用反応容器１と抗原含有被検液の接触及び分離用固体４３の上部設置を図１１（ｂ）に示し、時間経過による酵素標識抗体９４の測定用反応容器１と被検液への分配を図１１（ｃ）に示し、分離用固体４３の挿入を図１１（ｄ）に示す。
【０１８７】
（Ｂ−３．測定工程）
これは発色基質を添加して酵素反応で発色させ、発色の度合いを測定する工程である。以下に示す（ａ）〜（ｃ）のステップから構成される。
【０１８８】
（Ｂ−３ａ）、（Ｂ−３ｂ）、（Ｂ−３ｃ）は実施の形態１の（Ａ−３ａ）、（Ａ−３ｂ）、（Ａ−３ｃ）と同様のものを用いて同様の条件で処理を行った。
【０１８９】
（Ｂ−４．換算工程）
これは標準抗原溶液の検量線より抗原濃度の換算をおこなう工程である。以下に示す（ａ）のステップから構成される。
【０１９０】
（Ｂ−４ａ）は換算ステップである。（Ｂ−４ａ）は実施の形態１の（Ａ−４ａ）と同様のものを用いて同様の条件で換算を行った。被検液の抗原９２濃度が表示部又は印字部の出力から得られる。
【０１９１】
なお、以上の説明では、抗原の測定について説明したが、抗原と抗体を逆にして抗体の測定についても同様に実施可能である。
【０１９２】
以上のように本実施の形態によれば、供給者側で反応済み測定用反応容器１を作製し、測定用反応容器１と被検液を測定用反応容器１内で反応させることで被検液の抗原９２濃度に応じた標識抗体（または抗原）の測定用反応容器１あるいは標準液あるいは被検液７０への分配を行わせ、分離用固体４３により極めて容易に分離ができ、測定用反応容器１内の液体または測定用反応容器１上の標識物質濃度を定量することで被検液中の抗原（または抗体）濃度を測定することが可能で、従来の測定方法及び測定装置、例えば、現在最も一般的に利用されているサンドイッチ法ＥＬＩＳＡと本発明の測定方法を比較すると、サンドイッチ法ＥＬＩＳＡが２工程の抗原抗体反応工程、２工程の洗浄操作を必要とするのに対して、本発明の測定方法は１工程の抗原抗体反応工程、洗浄操作は不要にでき簡便、迅速、安価に抗原（または抗体）を定量することができる特異的な免疫学的測定方法及び測定装置を提供することができる。
【０１９３】
【実施例】
（実施例１）
実施例１では、実施の形態１の免疫学的測定方法及び免疫学的測定装置を用いて、レジオネラ ニューモフィラ セログループＩ（Legionella pneumophila serogroup Ｉ）の菌体数の測定をおこなった。
【０１９４】
実施の形態１の免疫学的測定方法は４段階の工程（Ａ−１．測定用反応容器作製工程）、（Ａ−２．反応工程）、（Ａ−３．測定工程）、および（Ａ−４．換算工程）から構成される。
【０１９５】
（Ａ−１．測定用反応容器１作製工程）
これは標準抗原９３を測定用反応容器１に固定化して安定化状態とする工程である。以下に示す（ａ）乃至（ｇ）のステップから構成される。
【０１９６】
（Ａ−１ａ）は標準抗原９３を測定用反応容器１に固定化するステップである。標準抗原９３として２４時間７０％エタノールで処理したレジオネラ ニューモフィラ セログループ１（Legionella pneumophila serogroup Ｉ、以下Ｌｐ）を使用した。その希釈にはｐＨ７．４±０．２のダルベッコりん酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳ）を使用した。
【０１９７】
測定用反応容器１はポリスチレン製で、水平断面積約２４ｍｍ2（内径５．５ｍｍ）で、深さ約１１．５ｍｍの円筒形の容器で、容器底部が光学的に透明で均一である第１測定用反応容器５１から第８測定用反応容器５８までの８個が測定用反応容器連結枠５０で一列に形成された構造である。
【０１９８】
測定用反応容器１に標準抗原９３であるＬｐのＰＢＳ懸濁液を１０10個／ｍｌに調製してそれぞれ５０μｌ注ぎ、２時間、２５℃の条件で浸漬処理すことによって標準抗原Ｌｐを固相となる測定用反応容器１の内側の底面と底から約２．２ｍｍの側面に非特異的に固定化させた。
【０１９９】
（Ａ−１ｂ）は未反応の標準抗原９３を洗浄除去するステップである。緩衝液であるＰＢＳで測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８内をそれぞれ３回洗浄して、未反応のＬｐを除去した。
【０２００】
（Ａ−１ｃ）はブロッキング剤で測定用反応容器１の非特異吸着面を被覆するステップである。ブロッキング剤として１ｗ／ｖ％の牛血清アルブミン（以下ＢＳＡ）を含有したｐＨ７．４±０．２のＰＢＳ溶液（以下ＰＢＳ−Ｂ）を使用した。
【０２０１】
測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８内にＰＢＳ−Ｂを２５０μｌ注ぎ、１時間、２５℃の条件で浸漬処理して、測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８に残存する非特異吸着面にＢＳＡを非特異吸着させ、以後他の有機物の非特異吸着が極力おこらないようにした。
【０２０２】
（Ａ−１ｄ）は未反応のブロッキング剤を洗浄除去するステップである。緩衝液としてＰＢＳに０．０５ｗ／ｖ％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含有し、ｐＨ７．４±０．２の溶液（以下ＰＢＳ−Ｔ）を使用した。ＰＢＳ−Ｔで測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８をそれぞれ３回洗浄して未反応のＢＳＡを除去した。
【０２０３】
（Ａ−１ｅ）は酵素標識抗体９４を測定用反応容器１上の標準抗原９３に特異吸着させるステップである。酵素標識抗体９４として抗Ｌｐマウス由来モノクロナールＩｇＧ抗体に西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼを標識化したもの（以下ＡＬｐＰＯ）を使用した。
【０２０４】
測定用反応容器１の第１測定用反応容器５１から第８測定用反応容器５８に２０．０μｇ／ｍｌのＡＬｐＰＯ溶液５０μｌを注ぎ、２時間、２５℃の条件で浸漬処理して、測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８の表面上の固相化抗原Ｌｐに抗原抗体反応で特異的に結合させた。
【０２０５】
（Ａ−１ｆ）は未反応の酵素標識抗体９４を洗浄除去するステップである。ＰＢＳ−Ｔで測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８をそれぞれ３回洗浄して未反応のＡＬｐＰＯを除去した。
【０２０６】
（Ａ−１ｇ）は測定用反応容器１を保存可能とする処理を行うステップである。保存手段として凍結乾燥法を用いて、測定用反応容器１を長期安定化した状態とした。
【０２０７】
（Ａ−２．反応工程）
これは抗原量に比例した量の酵素標識抗体９４を測定用反応容器１に固定化された標準抗原９３と被検液等に含まれる抗原９２に分配させ、分配させた酵素標識抗体９４を分離する工程である。以下に示す（ａ）のステップから構成される。
【０２０８】
（Ａ−２ａ）は抗原量に比例した量の酵素標識抗体９４を測定用反応容器１と被検液に分配・分離させるステップである。標準抗原５×１０9個／ｍｌより１０倍に順次ＰＢＳ−Ｔで希釈して７種の標準希釈列の溶液を調製し、７種の標準希釈列の溶液とブランク液としてＰＢＳ−Ｔを測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８にそれぞれ５０μｌ添加した。
【０２０９】
２時間、２５℃の条件で測定用反応容器１を浸漬処理して、測定用反応容器１に固相化された標準抗原Ｌｐ９３と溶液中の抗原Ｌｐ９２の濃度に応じて、酵素標識抗体ＡＬｐＰＯ９４を固相である測定用反応容器１に固定化されている標準抗原９３と測定用反応容器１の液相に溶解している抗原９２に化学平衡反応で分配させた。
【０２１０】
あらかじめ２ｍｌの１００Ｗ／Ｖ％ショ糖溶液を蒸留水で調整し、分離用溶液４０とした。さらに、分離用溶液４０を分離用溶液槽５に充填した。
【０２１１】
分離用溶液４０を測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８にそれぞれ１００μｌ添加し、測定用反応容器１の標準抗原９３に分配された酵素標識抗体９４の酵素９５が以後の測定工程で反応しない状態とした。
【０２１２】
（Ａ−３．測定工程）
これは発色基質を添加して酵素反応で発色させ、発色の度合いを測定する工程である。以下に示す（ａ）乃至（ｃ）のステップから構成される。
【０２１３】
（Ａ−３ａ）は基質を酵素反応で発色させるステップである。あらかじめ１０ｍｌのｐＨ５．０±０．１の０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸緩衝液（以下クエン酸緩衝液）に４ｍｇのオルトフェニレンジアミン二塩酸塩（以下ＯＰＤ）を溶解させ、１０μｌの３０％過酸化水素を添加した溶液（以下基質溶液）を調製した。基質溶液を基質溶液槽９に充填した。
【０２１４】
測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８に基質溶液を各々５０μｌ添加し、１５分間、２５℃反応させ、ＡＬｐＰＯの標識物質（酵素）であるペルオキシダーゼに発色基質ＯＰＤから酵素反応によって色素を生成させた。
【０２１５】
（Ａ−３ｂ）は酵素反応を停止させるステップである。あらかじめ５ｍｌの１ｍｏｌ／ｌ硫酸溶液（以下反応停止液）を反応停止液槽１３に充填した。測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８に基質溶液を各々５０μｌ添加し、酵素反応を停止させた。
【０２１６】
（Ａ−３ｃ）は発色波長における発色の度合いの測定ステップである。発光部１８を光源とした波長４９０ｎｍの光を受光部１９で検出し換算部２０に出力した。
【０２１７】
（Ａ−４．換算工程）
これは標準抗原溶液の検量線より抗原濃度の換算をおこなう工程である。以下に示す（ａ）のステップから構成される。
【０２１８】
（Ａ−４ａ）は換算ステップである。換算部２０において受光部１９の検出値より吸光度を算出し、ブランク液であるＰＢＳ−Ｔ溶液の吸光度を、各標準抗原溶液の吸光度より差し引き検量線を作成すると図１２が得られた。図１２の直線部より最小２乗法で回帰直線を求めると次式（１）が得られた。
【０２１９】
吸光度（−）＝０．２２３×ｌｎ（Ｌｐ濃度（個／ｍｌ））−２．１８９・・・（１）
図１２は実施の形態１の測定装置を使用して作成したレジオネラ ニューモフィラ セログループＩ（Legionella pneumophila serogroup Ｉ）の検量線である。
【０２２０】
図１２から明らかなように、実施例１では５×１０4個／ｍｌ〜５×１０6個／ｍｌの範囲のレジオネラ ニューモフィラ セログループＩが測定可能であることがわかる。そして、任意の被検液に対して吸光度測定をすれば、式（１）より被検液の濃度を算出することができ結果を表示部２１に出力に表示ことができた。さらに、印字部２３により結果の印字出力や入出力インターフェース２４を介して結果を外部換算装置等に出力することもできる。
【０２２１】
従来の方法では、レジオネラ ニューモフィラ セログループＩの菌体数の測定を２４時間と長い測定時間を必要とし、かつ高価な測定装置が必要であるのに対して、実施例１はあらかじめ制作した測定用反応容器を利用することで、２時間３０分で測定を完了させることができた。
【０２２２】
（実施例２）
実施例２では、実施の形態２の免疫学的測定方法及び測定装置を用いて、コナヒョウヒダ二のアレルゲンであるｒＤｅｒｆＩＩの濃度の測定をおこなった。
【０２２３】
実施の形態２の免疫学的測定方法は、４段階の工程（Ｂ−１．測定用反応容器作製工程）、（Ｂ−２．反応工程）、（Ｂ−３．測定工程）、および（Ｂ−４．換算工程）から構成される。
【０２２４】
（Ｂ−１．測定用反応容器１作製工程）
これは標準抗原９３と酵素標識抗体９４を測定用反応容器１に固定化して安定化状態とする工程である。以下に示す（ａ）乃至（ｇ）のステップから構成される。
【０２２５】
（Ｂ−１ａ）は標準抗原９３を測定用反応容器１に固定化するステップである。標準抗原９３としてコナヒョウヒダニの虫体由来アレルゲンを大腸菌の遺伝子操作により生産させ精製したｒＤｅｒｆＩＩ（以下ｒＤｅｒｆＩＩ）を使用した。その希釈にはｐＨ７．４±０．２のダルベッコりん酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳ）を使用した。
【０２２６】
測定用反応容器１はポリスチレン製で、水平断面積約２４ｍｍ2（内径５．５ｍｍ）で、深さ約１１．５ｍｍの円筒形の容器で、容器底部が光学的に透明で均一である第１測定用反応容器５１から第８測定用反応容器５８までの８個が測定用反応容器連結枠５０で一列に形成された構造である。
【０２２７】
測定用反応容器１に標準抗原９３であるｒＤｅｒｆＩＩのＰＢＳ溶液を０．５μｇ／ｍｌに調製してそれぞれ５０μｌ注ぎ、２時間、２５℃の条件で浸漬処理すことによって標準抗原ｒＤｅｒｆＩＩを固相となる測定用反応容器１の内側の底面と底から約２．２ｍｍの側面に非特異的に固定化させた。
【０２２８】
（Ｂ−１ｂ）は未反応の標準抗原９３を洗浄除去するステップである。緩衝液であるＰＢＳで測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８内をそれぞれ３回洗浄して、未反応のｒＤｅｒｆＩＩを除去した。
【０２２９】
（Ｂ−１ｃ）はブロッキング剤で測定用反応容器１の非特異吸着面を被覆するステップである。測定用反応容器１の第１測定用反応容器５１から第８測定用反応容器５８にＰＢＳ−Ｂを各２５０μｌ注ぎ、１時間、２５℃の条件で浸漬処理して、測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８に残存する非特異吸着面にＢＳＡを非特異吸着させ、以後他の有機物の非特異吸着が極力おこらないようにした。
【０２３０】
（Ｂ−１ｄ）は未反応のブロッキング剤を洗浄除去するステップである。緩衝液としてＰＢＳに０．０５ｗ／ｖ％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含有し、ｐＨ７．４±０．２の溶液（以下ＰＢＳ−Ｔ）を使用した。ＰＢＳ−Ｔで測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８をそれぞれ３回洗浄して未反応のＢＳＡを除去した。
【０２３１】
（Ｂ−１ｅ）は測定用反応容器１を保存可能とする処理をおこなうステップである。保存手段として凍結乾燥法を用いて、測定用反応容器１を長期安定化した状態とした。
【０２３２】
測定用反応容器１の第１測定用反応容器５１から第８測定用反応容器５８に０．５μｇ／ｍｌの１３Ａ４ＰＯ溶液（アサヒビール（株）製、商品名）１００μｌを注ぎ、２時間、２５℃の条件で浸漬処理して、測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８の表面上の固相化抗原ｒＤｅｒｆＩＩに抗原抗体反応で特異的に結合させた。
【０２３３】
（Ｂ−１ｆ）は未反応の酵素標識抗体９４を洗浄除去するステップである。ＰＢＳ−Ｔで測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８をそれぞれ３回洗浄して未反応の１３Ａ４ＰＯを除去した。
【０２３４】
（Ｂ−１ｇ）は測定用反応容器２を保存可能とする処理をおこなうステップである。保存手段として凍結乾燥法を用いて、測定用反応容器１を長期安定化した状態とした。
【０２３５】
（Ｂ−２．反応工程）
これは抗原量に比例した量の酵素標識抗体９４を測定用反応容器１に固定化された標準抗原９３と被検液等に含まれる抗原９２に分配させ、分配させた酵素標識抗体９４を分離する工程である。以下に示す（ａ）のステップから構成される。
【０２３６】
（Ｂ−２ａ）は抗原量に比例した量の酵素標識抗体９４を測定用反応容器１とと被検液に分配・分離させるステップである。標準抗原を０．１μｇ／ｍｌより３倍に順次ＰＢＳ−Ｔで希釈して７種の標準希釈列の溶液を調製し、７種の標準希釈列の溶液とブランク液としてＰＢＳ−Ｔを新たな測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８にそれぞれ５０μｌ添加した。酵素標識抗体９４として抗ｒＤｅｒｆＩＩマウスモノクロナールＩｇＧ抗体に西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼを標識化した抗体（以下１３Ａ４ＰＯ）を使用した。５μｇ／ｍｌの１３Ａ４ＰＯのＰＢＳ−Ｔ溶液を各５μｌずつ標準希釈列溶液とブランク液を注いだ測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８にそれぞれ添加した。さらに、測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８の上部にそれぞれ分離用固体４３を設置した。分離用固体として水平断面積約２３ｍｍ２（外径５．４ｍｍ）で、高さ３ｍｍの円柱形に、貫通孔４６として水平断面積約０．２６ｍｍ２（外径０．５ｍｍ）で、高さ３ｍｍの円筒形を８個設けたものを使用した。また、Ｏ−リング４７としてシリコンゴム製のものを使用した。
【０２３７】
さらに、第１反応容器５１から第８反応容器５８の上部にそれぞれ分離用固体４３を設置した測定用反応容器１を、筐体２９に設けられた測定用反応容器挿入口２７より挿入し、反応容器駆動用モータ２の正回転、逆回転により反応容器駆動用ベルト３ひいては測定用反応容器１水平方向に周期的に動かすことによって、測定用反応容器１を構成する８個の反応容器内に貯められた標準希釈列の溶液とブランク液を２時間、２５℃の条件で撹拌させた。以上の操作により測定用反応容器１に固定化された標準抗原ｒＤｅｒｆＩＩ９３と溶液中の抗原ｒＤｅｒｆＩＩ９２の濃度に応じて、酵素標識抗体ｒＤｅｒｆＩＩ９４を固相である測定用反応容器１に固定化されている標準抗原９３と測定用反応容器１内の液相に溶解している抗原９２に化学平衡反応で分配させた。
【０２３８】
反応容器駆動用モータ２により反応容器駆動用ベルト３ひいては測定用反応容器１を移動させ、分離用固体挿入用モータ４４を起動し、分離用固体挿入用サポート４６を介して各分離用固体４３を測定用反応容器１の各反応容器底面まで挿入することにより、測定用反応容器１の標準抗原９３に分配された酵素標識抗体９４の酵素９５が以後の測定工程で反応しない状態とした。
【０２３９】
（Ｂ−３．測定工程）
発色基質を添加して酵素反応で発色させ、発色の度合いを測定する工程である。以下に示す（ａ）乃至（ｃ）のステップから構成される。
【０２４０】
（Ｂ−３ａ）は基質を酵素反応で発色させるステップである。あらかじめ１０ｍｌのｐＨ５．０±０．１の０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸緩衝液（以下クエン酸緩衝液）に４ｍｇのオルトフェニレンジアミン二塩酸塩（以下ＯＰＤ）を溶解させ、１０μｌの３０％過酸化水素を添加した溶液（以下基質溶液）を調製した。基質溶液を基質溶液槽９に充填した。
【０２４１】
測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８に基質溶液を各々５０μｌ添加し、１５分間、２５℃反応させ、１３Ａ４ＰＯの標識物質（酵素）であるペルオキシダーゼに発色基質ＯＰＤから酵素反応によって色素を生成させた。
【０２４２】
（Ｂ−３ｂ）は酵素反応を停止させるステップである。あらかじめ５ｍｌの１ｍｏｌ／ｌ硫酸溶液（以下反応停止液）を反応停止液槽１３に充填した。
【０２４３】
各測定用反応容器１の第１反応容器５１から第８反応容器５８に基質溶液を各々５０μｌ添加し、酵素反応を停止させた。
【０２４４】
（Ｂ−３ｃ）は発色波長における発色の度合いの測定ステップである。発光部１８を光源とした波長４９０ｎｍの光を受光部１９で検出し換算部２０に出力した。
【０２４５】
（Ｂ−４．換算工程）
標準抗原溶液の検量線より抗原濃度の換算をおこなう工程である。以下に示す（ａ）のステップから構成される。
【０２４６】
（Ｂ−４ａ）は換算ステップである。換算部２０において受光部１９の検出値より吸光度を算出し、ブランク液であるＰＢＳ−Ｔ溶液の吸光度を、各標準抗原溶液の吸光度より差し引き検量線を作成すると図１３が得られた。図１３の直線部より最小２乗法で回帰直線を求めると次式（２）が得られる。
【０２４７】
吸光度（−）＝０．３３５×ｌｎ（ｒＤｅｒｆＩＩ濃度（μｇ／ｍｌ））＋２．５４２・・・（２）
図１３は本発明の測定装置を使用して作成したコナヒョウヒダ二のアレルゲンｒＤｅｒｆＩＩの検量線図である。
【０２４８】
図１３から明らかなように、実施例２では０．００２μｇ／ｍｌ〜０．０３μｇ／ｍｌの範囲のｒＤｅｒｆＩＩが測定可能であることがわかる。そして、任意の被検液に対しても吸光度測定をすれば、式（２）より被検液の濃度を算出することができ結果を表示部２１に出力に表示ことができた。さらに、印字部２３により結果の印字出力や入出力インターフェース２４を介して結果を外部換算装置等に出力することもできる。
【０２４９】
従来方法では、ｒＤｅｒｆＩＩ濃度の測定に２４時間と長い測定時間を必要とし、かつ高価な測定装置が必要であることに対して、実施例２はあらかじめ制作した測定用反応容器を利用することで、２時間３０分で測定を完了させることができた。
【０２５０】
実施の形態１、２以外にも抗原（または抗体）を測定する装置は種々考えることが出来る。例えば、より自動化を推進した装置、検出法が電気化学的、放射性同位体の検出を利用したもの等、抗原抗体反応にカラムを利用したもの等が考えられる。
【０２５１】
【発明の効果】
以上のように本発明においては、以下の優れた効果を実現できる。
【０２５２】
（１）本発明の免疫学的測定方法によれば、測定用反応容器と被検液を反応させることで被検液濃度に応じた標識抗体（または抗原）の液相あるいは固相への分配をおこなはせ、液相または固相の標識物質濃度を定量することで被検液中の抗原（または抗体）濃度を測定することに着目することで迅速、簡便、安価に定量することができる。
【０２５３】
（２）本発明の免疫学的測定装置によれば、迅速、簡便、高精度な測定が自動的におこなえ、且つ低原価で量産できる抗原（または抗体）に特異的な免疫学的測定装置を提供できる。
【０２５４】
（３）本発明の抗原（または抗体）の免疫学的測定方法及び免疫学的測定装置の利用で抗原（または抗体）成分濃度を特異的、簡便、迅速、安価に入手できるようになり、医療現場での臨床検査、クリーニング業者、清掃業者の洗浄度合いの確認のみならず家庭での個人的なアレルゲン管理においても有用な情報提供が可能になる。さらに各成分に係る基礎研究や応用・開発研究において研究速度および研究精度の向上をはかることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態１の免疫学的測定装置の概略断面図
【図２】本発明の実施の形態１の免疫学的測定装置の概略平面図
【図３】本発明の実施の形態１及び実施の形態２の測定用反応容器を示す概略斜視図
【図４】本発明の実施の形態１の主要工程を示す模式図
【図５】本発明の実施の形態１の各ステップの反応模式を示す図
【図６】本発明の実施の形態２における免疫学的測定装置の概略断面図
【図７】本発明の実施の形態２の免疫学的測定装置の概略平面図
【図８】本発明の実施の形態２の分離用固体を示す概略斜視図
【図９】本発明の実施の形態２の測定用反応容器と分離用固体を組み合わせた状態を示す概念断面図
【図１０】本発明の実施の形態２の主要工程を示す模式図
【図１１】本発明の実施の形態２の各ステップの反応模式を示す図
【図１２】本発明の測定装置を使用して作成したレジオネラ ニューモフィラ セログループＩの検量線図
【図１３】本発明の測定装置を使用して作成したコナヒョウヒダニのアレルゲンｒＤｅｒｆＩＩの検量線図
【図１４】従来のサンドイッチＥＬＩＳＡ法の主要工程を示す模式図
【図１５】従来のサンドイッチＥＬＩＳＡ法の各ステップの反応模式を示す図
【符号の説明】
１ 測定用反応容器
２ 反応容器駆動用モータ
３ 反応容器駆動用ベルト
４ 分離用溶液槽蓋
５ 分離用溶液槽
６ 分離用溶液ポンプ
７ 分離用溶液注入ノズル
８ 基質溶液槽蓋
９ 基質溶液槽
１０ 基質溶液ポンプ
１１ 基質溶液注入ノズル
１２ 反応停止液槽蓋
１３ 反応停止液槽
１４ 反応停止液ポンプ
１５ 反応停止液注入ノズル
１８ 発光部
１９ 受光部
２０ 換算部
２１ 表示部
２２ 入力部
２３ 印字部
２４ 入出力インターフェース部
２５ 電源部
２６ 制御部
２７ 反応容器挿入口
２８ 反応容器排出口
２９ 筐体
３１ 温度センサー
３２ 温度調整ユニット
３３ 温度調整ヒータ
４０ 分離用溶液
４３ 分離用固体
４４ 分離用固体挿入用モータ
４５ 分離用固体挿入用サポート
４６ 貫通孔
４７ Ｏ−リング
５０ 反応容器連結枠
５１ 第１反応容器
５２ 第２反応容器
５３ 第３反応容器
５４ 第４反応容器
５５ 第５反応容器
５６ 第６反応容器
５７ 第７反応容器
５８ 第８反応容器
７０ 標準液あるいは被検液
７１ Ａ−１，測定用反応容器作製工程
７２ Ａ−２，反応工程
７３ Ａ−３，測定工程
７４ Ａ−４，換算工程
７５ Ｂ−１，測定用反応容器作製工程
７６ Ｂ−２，反応工程
７７ Ｂ−３，測定工程
７８ Ｂ−４，換算工程
８０ Ｃ−１，測定用反応容器作製工程
８１ Ｃ−２，反応工程
８２ Ｃ−３，測定工程
８３ Ｃ−４，換算工程
９１ 抗体
９２ 抗原（被検液由来、第二の）
９３ 標準抗原（第一の）
９４ 酵素標識抗体
９５ 酵素
Claims (15)
- 測定用反応容器の固相に測定対象である第二の抗原と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗原を一定量固定し、次いで、測定対象である第二の抗原と前記抗原と特異的に結合することができ標識物質を結合した抗体を含有する被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、前記測定用反応容器に固定された前記第一の標準抗原と前記被検液中の前記第二の抗原とで前記抗体を抗原抗体反応によりそれぞれの抗原濃度に応じて分配して抗原抗体複合体を形成させた後、前記測定用反応容器に比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を添加または分離用固体を挿入し、前記測定用反応容器の固相上の標識物質の反応を抑制し、前記被検液の液相中の前記標識物質量の測定を行うことを特徴とする免疫学的測定方法。
- 測定用反応容器の固相に測定対象である第二の抗体と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗体を一定量固定し、次いで、測定対象である第二の抗体と前記抗体と特異的に結合することができ標識物質を結合した抗原を含有する被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、前記測定用反応容器に固定された前記第一の標準抗体と前記被検液中の前記第二の抗体とで前記抗原を抗原抗体反応によりそれぞれの抗体濃度に応じて分配して抗原抗体複合体を形成させた後、前記測定用反応容器に比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を添加または分離用固体を挿入し、前記測定用反応容器の固相上の標識物質の反応を抑制し、前記被検液の液相中の前記標識物質量の測定を行うことを特徴とする免疫学的測定方法。
- 測定用反応容器の固相に測定対象である第二の抗原と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗原を一定量固定し、次いで、前記第一の標準抗原と特異的に結合することができ標識物質を結合した抗体を前記第一の標準抗原に接触させ、固相上に前記第一の標準抗原と前記抗体の抗原抗体複合体を形成させた後、測定対象である第二の抗原を含有する被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、前記測定用反応容器に固定された前記第一の標準抗原と前記被検液中の前記第二の抗原とで前記抗体を抗原抗体反応によりそれぞれの抗原濃度に応じて分配して抗原抗体複合体を形成させ、前記測定用反応容器に比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を添加または分離用固体を挿入し、前記測定用反応容器の固相上の標識物質の反応を抑制し、前記被検液の液相中の前記標識物質量の測定を行うことを特徴とする免疫学的測定方法。
- 測定用反応容器の固相に測定対象である第二の抗体と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗体を一定量固定し、次いで、前記
第一の標準抗体と特異的に結合することができ標識物質を結合した抗原を前記第一の標準抗体に接触させ、固相上に前記第一の標準抗体と前記抗原の抗原抗体複合体を形成させた後、測定対象である第二の抗体を含有する被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、前記測定用反応容器に固定された前記第一の標準抗体と前記被検液中の前記第二の抗体とで前記抗原を抗原抗体反応によりそれぞれの抗体濃度に応じて分配して抗原抗体複合体を形成し、前記測定用反応容器に比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を添加または分離用固体を挿入し、前記測定用反応容器の固相上の標識物質の反応を抑制し、前記被検液の液相中の前記標識物質量の測定を行うことを特徴とする免疫学的測定方法。 - 前記標識物質が酵素であることを特徴とする請求項１乃至４の内いずれか１項に記載の免疫学的測定方法。
- 前記分離用液体が、シリコンオイル、単糖類の溶液、二糖類以上の多糖類の溶液、ゼラチンの溶液、ポリエチレングリコールの溶液、アルギン酸ナトリウムの溶液の少なくとも１種またはそれらの混合物であることを特徴とする請求項１乃至５の内いずれか１項に記載の免疫学的測定方法。
- 前記分離用固体に１以上の貫通孔が形成されていることを特徴とする請求項１乃至５の内いずれか１項に記載の免疫学的測定方法。
- 測定対象である第二の抗原と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗原を一定量固定した測定用反応容器を移送する移送部と、測定対象である第二の抗原と前記抗原と特異的に結合できる標識物質を結合した抗体を含有した被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を一定量添加する分離用液体注入部または分離用固体を挿入する分離用固体挿入部と、前記被検液中の前記第二の抗原と抗原抗体反応した前記抗体の前記標識物質の量を測定する測定部と、前記測定部が計測した前記標識物質の量を前記被検液の前記第二の抗原濃度に換算する換算部と、を備えていることを特徴とする免疫学的測定装置。
- 測定対象である第二の抗体と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗体を一定量固定した測定用反応容器を移送する移送部と、測定対象である第二の抗体と前記抗体と特異的に結合できる標識物質を結合した抗原を含有した被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を一定量添加する分離用液体注入部または分離用固体を挿入する分離用固体挿入部と、前記被検液中の前記第二の抗体と抗原抗体反応した前記抗原の前記標識物質の量を測定する測定部と、前記測定部が計測した前記標識物質の量を前記被検液の前記第二の抗体濃度に換算する換算部と、を備えていることを特徴とする免疫学的測定装置。
- 測定対象である第二の抗原と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗原を一定量固定し、前記第一の標準抗原と特異的に結合できる標識物質を結合した抗体と前記第一の標準抗原の抗原抗体複合体を形成させた測定用反応容器を移送する移送部と、測定対象である第二の抗原を含有した被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を一定量添加する分離用液体注入部または分離用固体を挿入する分離用固体挿入部と、前記被検液中の前記第二の抗原と抗原抗体反応した前記抗体の前記標識物質の量を測定する測定部と、前記測定部が計測した前記標識物質の量を前記被検液の前記第二の抗原濃度に換算する換算部と、を備えていることを特徴とする免疫学的測定装置。
- 測定対象である第二の抗体と同一若しくはその抗原抗体反応のための抗原決定基が共通な第一の標準抗体を一定量固定し、前記第一の標準抗体と特異的に結合できる標識物質を結合した抗原と前記第一の標準抗体の抗原抗体複合体を形成させた測定用反応容器を移送する移送部と、測定対象である第二の抗体を含有した被検液を前記測定用反応容器に注ぎ、比重が前記被検液よりも大きな分離用液体を一定量添加する分離用液体注入部または分離用固体を挿入する分離用固体挿入部と、前記被検液中の前記第二の抗体と抗原抗体反応した前記抗原の前記標識物質の量を測定する測定部と、前記測定部が計測した前記標識物質の量を前記被検液の前記第二の抗体濃度に換算する換算部と、を備えていることを特徴とする免疫学的測定装置。
- 前記測定用反応容器が１以上配設されユニット化されていることを特徴とする請求項８乃至１１の内いずれか１項に記載の免疫学的測定装置。
- 前記測定用反応容器が、円筒体、角筒体の少なくとも１種またはそれらの複合した形状であることを特徴とする請求項８乃至１２の内いずれか１項に記載の免疫学的測定装置。
- 前記測定用反応容器の温度を一定に保持する温度保持手段を備えていることを特徴とする請求項８乃至１３の内いずれか１項に記載の免疫学的測定装置。
- 前記測定用反応容器を撹拌する撹拌手段を備えていることを特徴とする請求項８乃至１４の内いずれか１項に記載の免疫学的測定装置。
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