JP3637692B2 - 診断薬担体 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、診断薬担体用の磁性体含有ポリマー粒子に関する。
【0002】
【従来の技術】
磁性体含有ポリマー粒子は、磁力により容易に捕集される特性に着目し、主に生化学分野において、診断薬担体、細菌あるいは細胞分離担体、核酸あるいは蛋白分離・精製担体、ドラッグデリバリー担体、酵素反応担体、細胞培養担体等としての優れた実効作用が期待されている。
磁性体含有ポリマー粒子の合成法として、従来知られている代表的な方法を挙げると、次のようなものがある。
まず、磁性体が主にポリマー粒子内部に存在するタイプについては、親油化処理した磁性体を重合性モノマー中に分散し、これを懸濁重合する方法(特開昭59−221302号公報参照)、同じく親油化処理した磁性体を重合性モノマー中に分散し、ホモジナイザーで水中に均質化して重合することにより、比較的小粒子径の磁性粒子を得る方法(特公平4−3088号公報参照)、あるいは特定の官能基を有する多孔ポリマー粒子の存在下で、鉄化合物を析出させたのち酸化することにより、多孔ポリマー粒子内部に磁性体を入り込ませ、大粒径かつ均一径の磁性粒子を得る方法(特公平5−10808号公報参照)等が知られている。
一方、磁性体が主にポリマー粒子表面に存在するタイプについては、ポリマー粒子エマルジョン中で鉄化合物を析出させたのち、ポリマー粒子表面をフェライト化する方法(特開平3−115862号公報あるいは特開平5−138009号公報参照)が知られている。
しかしながら、これら従来の合成法により得られた磁性体含有ポリマー粒子を診断薬担体等に用いると、磁性体が主にポリマー粒子内部に存在する場合でも、感度が大幅に低下したり、非特異的反応を示したりして、十分な実用性能が得られない場合が多い。これは、磁性体含有ポリマー粒子の表面に磁性体が部分的に露出し、あるいは粒子表面と内部の磁性体の間にミクロパスが形成されるため、磁性体成分が溶出し、実用性能を損なうものと考えられている。しかも、多くの場合磁性体はポリマー粒子よりも親水性が高く、水系重合では、磁性体が粒子の表面あるいは表面近傍に多く存在する結果となることが、さらに悪影響を与えていると考えられている。
これに対して、磁性体粒子をコアとし、疎水性の架橋性モノマーを水中で重合することによる磁性体を内包したポリマー粒子(特開平2−286729号公報参照)も提案されているが、この粒子も前記問題点を十分解決できるとはいえない。また、磁性体粒子の表面に非磁性のポリマー層を形成させた粒子構造(特公平5−16164号公報参照)も提案されているが、該構造を達成する具体的な方法は、実質的に界面重縮合法とスプレードライ噴霧法に限られ、適用範囲が狭いという問題がある。
即ち、従来の磁性体含有ポリマー粒子は、含まれる磁性体成分の溶出が十分抑えられず、その溶出が問題とならない分野に限定して使用せざるをえないのが実状であり、磁性体成分の溶出量が実質上問題とならないレベルにまで低減された磁性体含有ポリマー粒子の開発が強く求められていた。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような従来の問題点を解決すべき鋭意検討した結果なされたものであり、その課題は、使用時の磁性体成分の溶出を有効に抑制できる、診断薬担体用の磁性体含有ポリマー粒子を提供することにある。
【0004】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨は、第一に、鉄系磁性体を含有するポリマー粒子を鉄溶解剤で処理してなる磁性体含有ポリマー粒子(以下、「改質磁性粒子(1)」という。)からなる診断薬担体、に関わる。
ここで、「鉄系磁性体を含有するポリマー粒子」(以下、「非改質磁性粒子」という。)とは、当該磁性体を少なくともポリマー粒子の内部に含有する粒子を意味する。
【0005】
本発明の要旨は、第二に、前記改質磁性粒子(1)の存在下にビニル系モノマーを重合して得られる磁性体含有ポリマー粒子(以下、「改質磁性粒子(2)」という。)からなる診断薬担体、に関わる。
【0006】
以下、本発明を詳細に説明する。
改質磁性粒子(1)
改質磁性粒子(1)に使用される鉄系磁性体としては、粒子径が小さいほどポリマー粒子内部に均一に分散しやすい点から好ましく、特に粒子径が20nm以下の超常磁性鉄系磁性体、就中酸化鉄系磁性体が好ましい。この場合、鉄系磁性体の代わりにコバルト系あるいはサマリウム−コバルト系等の非鉄系磁性体を用いると、現段階ではこれらの金属成分の溶解の制御が困難であり、良好な磁性体含有ポリマー粒子が得られない。但し、本発明は、鉄系磁性体が他の金属成分を含有することを妨げるものではない。
前記鉄系磁性体としては、例えば、 Fe3O4、γ−Fe2O3 、MnZnフェライト、NiZnフェライト、 YFeガーネット、GaFeガーネット、Baフェライト、Srフェライト等を挙げることができる。これらの鉄系磁性体は、単独でまたは2種以上を混合して使用することができる。
【0007】
また、改質磁性粒子(1)におけるポリマー粒子は、改質磁性粒子(1)あるいは後述する改質磁性粒子(2)の用途に応じて適宜選定され、その例としては、ビニル系ポリマー、オレフイン系ポリマー、ポリエステル、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリイミド、ポリシロキサン、ポリアセタール、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポルスルフィド等の粒子を挙げることができ、これらの粒子は官能性基含有ポリマーからなることもできる。
特に好ましいポリマー粒子は、ビニル系ポリマーあるいは官能性基含有ビニル系ポリマーの粒子である。
前記ビニル系ポリマーあるいは官能性基含有ビニル系ポリマーの主成分をなすビニル系モノマーとしては、スチレン、α−メチルスチレン、o−ビニルトルエン、m−ビニルトルエン、p−ビニルトルエン、ジビニルベンゼン等の芳香族ビニル化合物;(メタ)アクリル酸、クロトン酸等の不飽和カルボン酸類;メチル(メタ)アクリレート、エチル(メタ)アクリレート、n−プロピル(メタ)アクリレート、i−プロピル(メタ)アクリレート、n−ブチル(メタ)アクリレート、t−ブチル(メタ)アクリレート、n−ヘキシル(メタ)アクリレート、2−エチルヘキシル(メタ)アクリレート、シクロヘキシル(メタ)アクリレート、(ポリ)エチレングリコールジ(メタ)アクリレート、(ポリ)プロピレングリコールジ(メタ)アクリレート、トリメチロールプロパントリ(メタ)アクリレート等の(メタ)アクリレート類;(メタ)アクリロニトリル、シアン化ビニルデン等のシアン化ビニル化合物;塩化ビニル、塩化ビニリデン、ふっ化ビニル、ふっ化ビニリデン、テトラフルオロエチレン等のハロゲン化ビニル化合物等を挙げることができる。これらのビニル系モノマーのうち、芳香族ビニル化合物、(メタ)アクリレート類が好ましい。
前記ビニル系モノマーは、単独でまたは2種以上を混合して使用することができる。
また、官能性基含有ビニル系ポリマーにおける官能性基としては、例えば、カルボキシル基、水酸基、メルカプト基、アミノ基、置換アミノ基、エポキシ基等を挙げることができる。
官能性基含有ビニル系ポリマーは、前記不飽和カルボン酸類を(共)重合する方法のほか、官能性基を含有しない前記ビニル系モノマーを官能性基を含有する他のビニル系モノマーと共重合する方法、不飽和カルボン酸類以外の前記ビニル系モノマーの(共)重合体に官能性基を導入する方法等により製造することができる。
【0008】
非改質磁性粒子の合成法は、鉄系磁性体が少なくともポリマー粒子の内部に含有される限り特に制約されるものではない。但し、非改質磁性粒子の表面には多少の鉄系磁性体が存在することが普通である。
非改質磁性粒子の合成法としては、例えば(a)鉄系磁性体をビニル系モノマー中に分散させたのち、水系媒体中で懸濁重合する方法、(b)鉄系磁性体をビニル系モノマー中に分散させ、これをホモジナイザーにより水系媒体中に均質化して重合し、比較的小粒子径の磁性粒子を得る方法、(c)多孔性ポリマー粒子の存在下に鉄化合物を析出させ、該ポリマー粒子の内部および表面に含有される鉄化合物を酸化して磁性体とする方法、(d)鉄系磁性体を水系媒体中に分散した水分散体中で、ビニル系モノマーを乳化重合する方法等を挙げることができる。
これらの合成法のうち、鉄系磁性体が粒子内部に多く含有される前記(a)、(b)の方法が好ましい。
非改質磁性粒子中の鉄系磁性体の含有量は、鉄系磁性体の種類、改質磁性粒子(1)あるいは改質磁性粒子(2)の用途等に応じて適宜選定されるが、通常、5〜80重量%、好ましくは10〜70重量%、特に好ましくは15〜60重量%である。この場合、鉄系磁性体の含有量が5重量%未満では、磁気性能が不足し、磁性体含有ポリマー粒子としての性能が不十分となるおそれがあり、また80重量%を超えると、鉄系磁性体が多すぎるため、ポリマー粒子本来の機能が損なわれ、実用性能の面で満足できなくなるおそれがある。
非改質磁性粒子の粒子径は、改質磁性粒子(1)あるいは改質磁性粒子(2)の用途等に応じて適宜選定されるが、通常、0.05〜100μm、好ましくは0.1〜20μmである。
【0009】
改質磁性粒子(1)は、前記非改質磁性粒子を鉄溶解剤で処理することにより得られる。本発明における「鉄溶解剤」とは、非改質磁性粒子中に含有される鉄成分を溶解するが、該粒子を構成するポリマー粒子を実質的に溶解しない化合物からなる。また、本発明における「鉄溶解剤で処理する」とは、非改質磁性粒子を直接に、または好ましくは水系媒体中で、鉄溶解剤と接触させる処理を意味する。
非改質磁性粒子は、一般に該粒子の表面および/または表面近傍に鉄系磁性体が存在することが避けられないが、非改質磁性粒子を鉄溶解剤で処理することによって、該粒子の表面および/または表面近傍に存在する鉄成分が優先的に溶解除去されるものと考えられる。それにより改質磁性粒子(1)からの鉄系磁性体の溶出が実用上問題とならないレベルにまで抑制され、磁性体含有ポリマー粒子としての性能を著しく向上させることができるとともに、用途拡大にも資することとなる。
本発明において、非改質磁性粒子を鉄溶解剤で処理する方法としては、非改質磁性粒子を水系媒体中に分散した水分散体に鉄溶解剤の水溶液を添加する方法が好ましい。
本発明における鉄溶解剤としては、例えば、硫酸、塩酸、硝酸等の無機酸;シュウ酸、クエン酸、クロロ酢酸、メルカプト酢酸、スルホサリチル酸等の有機酸のほか、鉄との錯形成剤として、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジン等のチオシアン酸塩;2−メルカプトエタノール、ジチオグリセリン、ジチオトリメチロールプロパン、ジチオエリトリトール等のメルカプト化合物;o−フェナントロリン、2,2’−ビピリジル、8−キノリノール、エチレンジアミン4酢酸等の窒素系錯形成剤等を挙げることができる。
これらの鉄溶解剤のうち、無機酸としては、特に硫酸が鉄成分の溶解速度が速く好ましいが、溶解量を制御するために酸濃度と処理時間を調整することが好ましい。また、塩酸単独では鉄成分の溶解速度が速すぎる傾向があり、硝酸は酸化作用を有するため、処理条件の設定に十分な注意が必要である。
次に、有機酸としては、特にメルカプト酢酸とスルホサリチル酸が好ましいが、一般に鉄成分の溶解速度が遅いため、処理条件としては加温下で長めの処理時間を取ることが好ましい。
さらに、錯形成剤としては、チオシアン酸塩の中では特にチオシアン酸カリウムとチオシアン酸グアニジンが好ましく、メルカプト化合物の中では特にメルカプトエタノールとジチオエリトリトールが好ましく、窒素系錯形成剤の中では特にo−フェナントロリンと2,2’−ビピリジルが好ましい。
本発明においては、前記鉄溶解剤を2種以上を組み合せることにより、さらに優れた効果が奏され、特に有機酸とチオシアン酸塩、メルカプト化合物とチオシアン酸塩のように、タイプの異なる鉄溶解剤を組み合わせることが好ましい。
前記鉄溶解剤による処理時の鉄成分の溶解除去量は、非改質磁性粒子や改質磁性粒子(1)あるいは改質磁性粒子(2)中の鉄系磁性体の含有量と用いる鉄溶解剤に応じて異なる。
即ち、無機酸を鉄溶解剤として用いる場合は、一般に鉄成分の溶解速度が大きく、粒子表面および/または表面近傍だけでなく粒子内部の鉄成分の溶出が避けられないため、非改質磁性粒子中に含有される鉄系磁性体の5〜60重量%を溶解除去することが好ましい。この場合、鉄成分の溶解除去量が5重量%未満では、改質磁性粒子の表面および/または表面近傍に残存する鉄系磁性体が多くなり、使用時の鉄系磁性体の溶出が無視できず、例えば生化学用途における実用性能の点で満足できなくなるおそれがある。また、無機酸による鉄成分の溶解除去量が60重量%を超えると、処理済粒子中の鉄系磁性体の含有量が不足し、磁気沈降速度が低下するなど、磁気特性の面で満足できなくなるおそれがある。
また、有機酸または錯形成剤を鉄溶解剤として用いる場合は、非改質磁性粒子表面および/または表面近傍に存在する鉄成分が選択的に溶解除去される。そのため、これらの鉄処理剤による鉄成分の好ましい溶解除去量は、処理前の該粒子表面および/または表面近傍に存在する鉄系磁性体の量によって異なり、一概に定められないが、表面および/または表面近傍に存在する鉄系磁性体の量が少ないものでは、例えば1重量%程度の溶解除去量でも十分な効果がある。
鉄溶解剤による処理条件は、鉄溶解剤として無機酸を用いる場合、鉄成分の前記好ましい溶解除去量を目安として、これを確保できるように選定される。その好ましい処理条件は、鉄系磁性体や無機酸の種類によって異なるが、溶解除去量の制御の観点から、処理温度は0〜100℃の範囲、処理時間は0.5〜20時間程度である。好ましい処理条件の具体例を示すと、硫酸の場合、水系媒体の硫酸濃度が2規定、水系媒体中の非改質磁性粒子の濃度が4g/リットル、処理温度が25℃、処理時間が2時間程度である。このような無機酸による処理後の改質磁性粒子(1)は、洗浄したのち、該磁性粒子の水分散体にアルカリ性化合物を添加して、pH7程度に中和することが好ましい。
また、鉄溶解剤として有機酸または錯形成剤を用いる場合は、非改質磁性粒子表面および/または表面近傍に存在する鉄成分に対する選択的溶解性が高いため、処理条件を無機酸の場合ほど厳密に制御する必要性が少ない。好ましい処理条件の具体例を示すと、水系媒体中で1モル/リットルのチオシアン酸グアニジンと1重量%の2−メルカプトエタールとの組み合わせからなる鉄溶解剤を用いる場合、処理温度が25℃、処理時間が12時間程度である。
本発明の改質磁性粒子(1)が、特に生化学用途において優れた性能を示す理由の詳細は必ずしも明確ではない。しかし、非改質磁性粒子の鉄溶解剤による処理によって磁性体成分の一部が溶解除去されること、および該処理後に十分洗浄した改質磁性粒子(1)を純水(蒸留水あるいはイオン交換水)で抽出した抽出液中の鉄濃度が処理前より大幅に減少することが、分析の結果確認されている。これらのことから、鉄溶解剤による処理によって、非改質磁性粒子の表面および/または表面近傍から優先して鉄成分が溶解除去されるものと考えられる。さらに、鉄系磁性体には数種類の酸化状態の異なる酸化鉄が混在するのが普通であるが、鉄溶解剤による処理によって、溶解度の高い酸化第二鉄が多く溶解除去され、比較的溶解度が低くかつ磁気性能の大きい四三酸化鉄が残ることも、改質磁性粒子(1)が磁気性能を確保しながら鉄系磁性体の悪影響を低減できる理由の一つと考えられる。
このようにして鉄溶解剤で処理された改質磁性粒子(1)の表面および表面近傍に残存する鉄系磁性体の量は、可及的に少ない方が好ましい。この量は、鉄溶解剤による処理後に十分洗浄した改質磁性粒子(1)を一定量の純水で抽出した抽出液中の鉄濃度を目安として制御することができる。本発明において、該抽出液中の鉄濃度は、抽出に使用した純水の量を改質磁性粒子(1)0.1g当たり10ミリリットルとし、70℃で2時間抽出したとき、通常、10ppm以下、好ましくは1ppm以下である。
【0010】
改質磁性粒子(2)
改質磁性粒子(2)は、前記改質磁性粒子(1)の存在下にビニル系モノマーを重合して得られるものである。このように改質磁性粒子(1)の存在下にビニル系モノマーを重合することにより、鉄系磁性体の溶出をより確実に抑え、磁性体含有ポリマー粒子としての性能上の信頼性をさらに高め、また当該性能の経時変化も極めて少なくすることができる。
前記ビニル系モノマーは、改質磁性粒子(2)の用途に応じて適宜選定され、その例としては、前記改質磁性粒子(1)について例示したビニル系モノマーを挙げることができるが、中でも芳香族ビニル化合物、(メタ)アクリレート類、不飽和カルボン酸類等が好ましい。また、前記ビニル系モノマーとして、改質磁性粒子(1)を構成するポリマーに吸収され難いモノマー、例えば水溶性ビニル系モノマーを使用することにより、改質磁性粒子(1)表面に非磁性ポリマー成分を多く存在させることが可能となる。
改質磁性粒子(1)の存在下にビニル系モノマーを重合する方法としては、特に限定されるものでないが、例えば、(イ)改質磁性粒子(1)にビニル系モノマーを吸収させたのち重合するモノマー吸収重合法、(ロ)水中に分散した改質磁性粒子(1)をシードとし、ビニル系モノマーを連続的および/または間欠的に供給しつつ重合するシード重合法のほか、(ハ)改質磁性粒子(1)の粒子表面に吸着相を形成し、該吸着相中でビニル系モノマーを重合するカプセル重合方等を挙げることができる。これらの方法のうち、改質磁性粒子(1)が小粒子径である場合でも確実に被覆できることから、特に(イ)および(ロ)の方法が好ましい。
改質磁性粒子(2)を製造する際のビニル系モノマーの使用量は、改質磁性粒子(1)100重量部に対して、通常、10〜1000重量部、好ましくは20〜500重量部である。この場合、ビニル系モノマーの使用量が過剰であると、磁性をもたない粒子が生成される場合があるが、このような非磁性粒子は、必要に応じて、磁気沈降処理により容易に除去することができる。
【0011】
改質磁性粒子(1)および改質磁性粒子(2)の特性および用途
改質磁性粒子(1)および改質磁性粒子(2)は、粒子の表面および/または表面近傍に鉄系磁性体が実質的に存在しないか、存在しても極めて少ないため、使用時の鉄系磁性体の溶出による影響が実質上問題となることがない。したがって、改質磁性粒子(1)および改質磁性粒子(2)は、鉄成分を嫌うことの多い一般の診断薬担体として、広範な抗原、抗体、蛋白、核酸等の吸着あるいは化学結合に適用することが可能である。また、酵素免疫法の診断薬担体として、鉄系磁性体の溶出による非特異的酵素発色が抑えられるなど、多様な検出手法に適用できるものであり、極めて実用性能の高いものである。
しかも、改質磁性粒子(1)および改質磁性粒子(2)は、製造時に特別の装置や薬剤を必要とせず、製造が容易かつ安価である。
【0012】
【発明の実施の形態】
以下、実施例を挙げて、本発明の実施の形態をさらに具体的に説明する。
合成例1(非改質磁性粒子の合成)
非改質磁性粒子を、下記懸濁重合法により合成した。
超常磁性フェライト粒子(平均粒径10nm)20gを、攪拌しつつ、濃度0.005モル/リットルの塩化第二鉄水溶液60g中に分散させて、フェライト粒子の表面に正荷電を付与した。次いで、該分散液に、濃度10重量%のオレイン酸ナトリウム水溶液40gを加え、30℃で60分間攪拌したのち、スチレン20gを加え、希塩酸を用いて反応液のpHを6〜7に調整した。このとき、フェライト粒子の表面にオレイン酸が吸着されて親油化され、フェライト粒子が水相からスチレン相に移動した。そこで水相を除去したのち、スチレン相を充分水洗して、親油化されたフェライト粒子がスチレン中に均一に分散した分散液を得た。
次いで、前記フェライト粒子のスチレン分散液(フェライト固形分で10g)に、該分散液中のスチレンとの合計が18gとなる量のスチレン、ジビニルベンゼン1g、メタクリル酸1g、ベンゾイルペルオキシド1gを加えて混合した。得られたモノマー相を、ポリビニルアルコール(商品名ゴーセノールGH17、日本合成化学(株)製)の濃度2重量%水溶液200g中に加えて、ホモミキサーで10分間攪拌し、液滴の粒子径が0.1〜3μmの懸濁液を調製した。
その後、前記懸濁液を容量500ミリリットルのセパラブルフラスコに移し、窒素雰囲気下、80℃、攪拌速度120rpmで、6時間重合を行って、非改質磁性粒子を得た。
得られた非改質磁性粒子は、平均粒子径が1.2μm、粒子径の分布範囲が約0.2〜5μm、熱天秤測定によるフェライト含量が31.0重量%であった。この磁性粒子を、非改質磁性粒子(A)とする。
【0013】
合成例2(非改質磁性粒子の合成)
スチレンの代わりにシクロヘキシルメタクリレートを用いた以外は、合成例1と同様にして、非改質磁性粒子を得た。
得られた非改質磁性粒子は、平均粒子径が2.1μm、粒子径の分布範囲が約0.2〜7μm、熱天秤測定によるフェライト含量が30.8重量%であった。この磁性粒子を、非改質磁性粒子(B)とする。
【0014】
【実施例】
実施例1(改質磁性粒子(1)の製造)
非改質磁性粒子(A)を水中に分散させた分散液10g(固形分で1g)に、2N硫酸250ミリリットルを加え、25℃で3時間緩く攪拌して、酸処理を行った。その後直ちに磁気沈降処理を行って、該磁性粒子を処理液から分離し、さらに濃度0.01重量%のポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル(商品名エマルゲン910、花王(株)製)水溶液200ミリリットルで2回洗浄したのち、10ミリリットルの蒸留水中に分散し、濃度0.5重量%の水酸化ナトリウム水溶液でpH7に調整して、0.75gの改質磁性粒子(1)を含有する分散液を得た。この改質磁性粒子(1)を、改質磁性粒子(1-1) とする。
改質磁性粒子(1-1) は、熱天秤測定によるフェライト含量が26.4重量%であり、非改質磁性粒子(A)中に含有されたフェライトの20重量%が溶解除去されていた。また、改質磁性粒子(1-1) の平均粒子径は1.2μm、粒子径の分布範囲は0.1〜5μmであり、酸処理前と大差なかった。
さらに、改質磁性粒子(1-1) の分散液と非改質磁性粒子(A)の分散液(ともに固形分で0.1g)にイオン交換水を加えて磁気沈降処理を2回行って各磁性粒子を回収したのち、十分水洗した。次いで、各磁性粒子をイオン交換水10ミリリットル中、70℃で24時間攪拌したのち、上澄み液の原子吸光分析を行って、鉄濃度を測定した。その結果、非改質磁性粒子(A)では、73ppmの鉄が検出されたのに対し、改質磁性粒子(1-1) では、鉄濃度が1ppm以下であった。
【0015】
実施例2〜5(改質磁性粒子(1)の製造)
酸処理の時間を0.3時間(実施例2)、1時間(実施例3)、7時間(実施例4)あるいは10時間(実施例5)に変更した以外は、実施例1と同様にして、それぞれ0.85g(実施例2)、0.80g(実施例3)、0.60g(実施例4)、0.55g(実施例5)の改質磁性粒子(1)を含有する分散液を得た。但し、実施例5の改質磁性粒子(1)は、磁気沈降速度が遅いため、酸処理後、遠心分離処理により回収した。これらの改質磁性粒子(1)を、それぞれ改質磁性粒子(1-2) 、改質磁性粒子(1-3) 、改質磁性粒子(1-4) 、改質磁性粒子 (1-5)とする。
改質磁性粒子(1-2) 〜 (1-5)は、熱天秤測定によるフェライト含量が、それぞれ30.3重量%、29.7重量%、20.7重量%、13.6重量%であり、非改質磁性粒子(A)中に含有されたフェライトのそれぞれ3重量%、6重量%、56重量%、65重量%が溶解除去されていた。また、改質磁性粒子(1-2) 〜 (1-5)の平均粒子径はいずれも1.5μmであり、粒径の分布範囲は非改質磁性粒子(A)とほぼ同等であった。
さらに、改質磁性粒子(1-2) 〜 (1-5)について、実施例1と同様にして上澄み液の原子吸光分析を行ったところ、鉄濃度はいずれも1ppm以下であった。
【0016】
実施例6(改質磁性粒子(2)の製造)
実施例1で得た改質磁性粒子(1-1) の乾燥粉体10gをアセトン50ミリリットル中に分散させ、チタンカップリング剤(商品名プレンアクトKR−TTS)0.2gを加えて、アセトンを蒸発させたのち、一夜乾燥した。
次いで、得られた乾燥粉体をよくほぐしたのち、スチレン4g、ジビニルベンゼン0.5g、メチルメタクリレート0.5g、ベンゾイルペルオキシド0.1gおよびアセトン10gの混合物を加えて、十分混合し、この混合液を室温で一夜放置して、アセトンを蒸発させるとともに改質磁性粒子(1-1) に前記モノマーを吸収させた。
次いで、得られた磁性粒子を再度ほぐし、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルの0.2重量%水溶液1リットル中に加え、十分攪拌して、磁性粒子を均一に分散させた。その後、この分散液を窒素置換し、攪拌速度120rpmで緩く攪拌しつつ、80℃で8時間重合し、改質磁性粒子(1-1) の表面をポリマー層で被覆して、改質磁性粒子(2)を得た。この改質磁性粒子(2)を、改質磁性粒子(2-1) とする。
重合後、重合液をガスクロマトグラフィー法で分析したところ、残存モノマーは100ppm以下であった。また、改質磁性粒子(2-1) を光学顕微鏡および電子顕微鏡で観察したところ、凝集粒子および融合粒子の生成は認められなかった。また、改質磁性粒子(2-1) の平均粒子径は1.5μmであり、粒径の分布範囲は改質磁性粒子(1-1) とほぼ同等であった。
さらに、改質磁性粒子(2-1) について、実施例1と同様にして上澄み液の原子吸光分析を行ったところ、鉄濃度が1ppm以下であった。
【0017】
実施例7〜14(改質磁性粒子(1)の製造)
合成例1で得た非改質磁性粒子(B)を水中に分散させた分散液10g(固形分で1g)に、表1に示す鉄溶解剤各10gを添加したのち、25℃で12時間攪拌した。その後、各磁性粒子を磁石で回収し、0.01重量%のポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル水溶液50ミリリットル中に分散させて回収する操作を4回繰り返して洗浄した。得られた各磁性粒子をそれぞれ改質磁性粒子(1-6) 〜(1-13)とする。
改質磁性粒子(1-6) 〜(1-13)について、実施例1と同様にして上澄み液の鉄濃度を測定したところ、いずれも非改質磁性粒子(B)に比べて磁性体成分の溶出量が大幅に減少していた。測定結果を表1に示す。
【0018】
応用例1(免疫診断薬担体粒子としての評価)
実施例1〜14で得た改質磁性粒子(1-1) 〜 (1-13) と改質磁性粒子(2-1) および非改質磁性粒子(A)と非改質磁性粒子(B)について、免疫診断薬担体粒子としての特性を評価するために、各磁性粒子の抗体吸着量および酵素発色値を、下記のようにして測定した。
−抗体吸着量の測定−
各磁性粒子の分散液を固形分でそれぞれ1mgとり、各磁性粒子の磁気分離処理とpH7.5のリン酸生理食塩水緩衝液1ミリリットル中に分散させる処理とを2回繰り返して、各磁性粒子の洗浄を行った。
次いで、各磁性粒子に、ウサギIgG抗体を10μg、25μg、50μgあるいは100μgづつ添加し、37℃で30分間緩く振とうした。その後、各磁性粒子を磁気分離した上澄み液について、波長280nmにおける吸光度を測定し、残存IgG抗体量を測定して、各磁性粒子に吸着したIgGの量を求めた。測定結果を表2に示す。
表2から明らかなように、本発明の改質磁性粒子(1-1) 〜 (1-13) および改質磁性粒子(2-1) は、いずれも高い抗体吸着量を示した。これに対して、非改質磁性粒子(A)および非改質磁性粒子(B)は抗体吸着量が低く、診断薬担体として満足できないものであった。
【0019】
−酵素発色値の測定−
各磁性粒子の分散液を固形分でそれぞれ10mgとり、各磁性粒子を磁気分離したのち、pH7.5のリン酸生理食塩水緩衝液1ミリリットル中に再分散させて、分散液を調製した。
その後、各分散液にそれぞれ20μgの抗ヒトIgM抗体を加え、室温で1時間緩く振とうして、各磁性粒子に抗体を吸着させる感作操作を行った。感作操作後、各磁性粒子(感作粒子)を磁気沈降処理した上澄み液について、波長280nmにおける吸光度を測定し、吸着されない残存抗体量を測定したところ、いずれも残存抗体がなく、すべての抗体が吸着されていた。
次に、前記のようにして感作操作を行ったのち磁気沈降処理した各磁性粒子に、0.5重量%の牛血清アルブミンと0.1重量%のポリエチレングリコールを含むpH7.5のリン酸生理食塩水緩衝液溶液1ミリリットルを加え、バイブレーターでよく分散させたのち、室温で30分間緩く振とうし、各磁性粒子の抗ヒトIgM抗体が吸着されていない表面をアルブミンでブロッキング処理して、酵素免疫法(EIA法)の診断薬担体の分散液を調製した。
別に、ヒトIgM抗原を0ng/ミリリットル、50ng/ミリリットル、100ng/ミリリットルあるいは500ng/ミリリットルの濃度で含むリン酸生理食塩水緩衝液を、それぞれ100μリットル調製したのち、各緩衝液に、前記ブロッキング処理した診断薬担体を含む各分散液20μリットルを加え、室温で30分間静置した。その後、磁気分離した各診断薬担体に、アセチルコリンエステラーゼを結合した抗ヒトIgM抗体100μgを含む溶液200μリットルを添加し、バイブレータで振動分散させたのち、25℃で1時間静置した。
次いで、アセチルコリンエステラーゼの基質であるエルマン(Ellman's)試薬(Cayman社製)を100μリットルづつ加え、室温で10分間緩く振とうして酵素発色反応させたのち、反応停止液として2N硫酸を50μリットル加えて、波長412nmにおける吸光度を測定した。また比較のため、感作操作を行っていない各磁性粒子(未感作粒子)についても、同様に吸光度を測定した。測定結果を表3に示す。
表3から明らかなように、本発明の改質磁性粒子(1-1) 〜 (1-13)および改質磁性粒子(2-1) は、いずれも抗ヒトIgM抗体による感作操作を行っていない状態では発色が低く、また抗ヒトIgM抗体による感作操作を行った状態では、抗原量にほぼ比例した酵素発色を呈し、良好な酵素免疫法の診断薬担体であった。なお、実施例2の改質磁性粒子(1-2) では、未感作粒子の発色はやや大きいが、これを差し引いて計算すれば実用可能なレベルであった。これに対して、非改質磁性粒子(A)および非改質磁性粒子(B)では、未感作粒子の酵素発色が高く、非特異的発色性が著しいため、診断薬担体としては不適当であった。
【0020】
【表1】
【0021】
【表2】
【0022】
【表3】
【発明の効果】
本発明の改質磁性粒子(1)および改質磁性粒子(2)は、表面および/または表面近傍に残存する鉄系磁性体が実用上問題のないレベルまで低減されているため、吸着性能が著しく優れ、特に酵素免疫法の診断薬担体として非特異的酵素発色が抑えられ、検出反応である酵素反応に有害な影響を与えることがなく、診断薬担体として極めて有用である。
Claims (2)
- 鉄系磁性体を含有するポリマー粒子を鉄溶解剤で処理してなる磁性体含有ポリマー粒子からなる診断薬担体。
- 請求項1記載の磁性体含有ポリマー粒子の存在下にビニル系モノマーを重合して得られる磁性体含有ポリマー粒子からなる診断薬担体。
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