JP3621925B2 - 液体サンプル調製装置 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＰＣＲ−ＭＰＮ法（ポリメラーゼ連鎖反応と最確数法の組み合わせ）に用いられる液体サンプル調製装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般的に、土壌や汚泥などの複合微生物系内の各生物種のＤＮＡを定量するためにＰＣＲ−ＭＰＮ法が有用であり、さらに特願２００１−０５７２８２号に記載されるように、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）をキャピラリ内で行うことにより、反応の迅速化および酵素の失活防止が可能となる。現在、主に行われているＰＣＲモニタリング法と比較すると、ＰＣＲ−ＭＰＮ法は増幅効率が厳密に一定である必要がなので、共通プライマーを用いることにより複数の生物種をまとめて定量できるという利点を備えている。またＰＣＲ−ＭＰＮ法は増幅効率に影響を及ぼす物質を完全に取り除くことが困難なサンプルにも対応できるので有利である。
【０００３】
図４はＤＮＡサンプルをＰＣＲ−ＭＰＮ法により定量する処理の流れを示す工程系統図である。図４に示されるようにＰＣＲ−ＭＰＮ法によってＤＮＡ定量を行う際には主に三つの工程を経ている。すなわち第一の工程において生体サンプル源、例えば土壌や汚泥等からのＤＮＡを抽出し（ＤＮＡ抽出）、第二の工程において多重ＰＣＲ測定を行い（多重ＰＣＲ測定）、さらに第三の工程において電気泳動、可視化、画像処理および統計データ解析によりＤＮＡ定量データを取得する（ＤＮＡ定量データ取得）。これら三つの工程のうちの第一の工程および第三の工程は、ＰＣＲ−ＭＰＮ法以外の多数のＤＮＡ定量手法と共通する技術であり、電気泳動を初めとしてマイクロリアクタの技術開発が進んでいる。従って、第一および第三の工程においては省力化および迅速化が図られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、第二の工程における多重ＰＣＲ測定はＰＣＲ−ＭＰＮ法に特有の工程であり、他の工程よりも技術開発が遅れている。一般的には第二の工程においては五段階に希釈したサンプルをそれぞれ五つ、多重測定する。従って、一つの検体当たり２５回のＰＣＲ測定を行っている。ＰＣＲ−ＭＰＮ法において精度を高めるためには多重度（ＰＣＲ本数）をさらに増やす必要がある。このような多重測定をするためにＰＣＲの前処理、すなわち煩雑な希釈列作成、ＰＣＲ試薬混合、および分注などの作業が必要であり、ＤＮＡ定量をハイスループットで行うのは困難であった。
【０００５】
この前処理工程には、ＤＮＡの抽出逐次希釈、ＰＣＲ用試薬との混合、ＰＣＲ反応液の分注、分注した反応液のキャピラリへの封入、ＰＣＲ反応装置へのセット、ＰＣＲ反応、ＰＣＲ反応後のキャピラリ開封、反応液吐出を経て、その後電気泳動による増幅確認が含まれる。
【０００６】
しかしながら、これら前処理工程のうち、ＰＣＲ反応および電気泳動のマイクロリアクタは開発されているが、ＰＣＲ−ＭＰＮ法をトータルでマイクロリアクタ化した例はない。
【０００７】
それゆえ、本発明はＰＣＲ−ＭＰＮ法の工程において、ＰＣＲ−ＭＰＮ法の作業時における時間および労力の大幅な削減を可能としてスループットを格段に向上させると共にヒューマンエラーを少なくするために、既存のＰＣＲ反応および電気泳動以外の部分をマイクロ流路化するようにして既存のマイクロリアクタと結合可能な液体サンプル調製装置を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前述した目的を達成するために請求項１に記載の発明によれば、液体サンプル源と、該液体サンプル源からの液体サンプルの流れに対して下流に位置する定量供給部と、該定量供給部の下流に位置する段とを具備し、該段は等量分岐部と、該等量分岐部から延びる二つの流路とを含み、該二つの流路のうちの一方の流路は希釈液供給部からの希釈液と合流する合流部と該合流部の下流に位置する段用定量供給部とを含んでおり、さらに、前記段の下流において前記二つの流路に合流するための少なくとも一つの試薬供給部と、該試薬供給部の下流において前記二つの流路に接続される少なくとも一つの等量リザーバとを具備する液体サンプル調製装置が提供される。
【０００９】
すなわち請求項１に記載の発明によって、ＰＣＲ−ＭＰＮ法の作業における大幅な時間および労力の削減ができる。多重ＰＣＲ測定における前処理工程を、マイクロ流路での輸送、混合および分配の形式（以下マイクロ流路化と呼ぶ）を取ることにより自動処理化できるので、ＤＮＡ定量作用のスループットを向上させることができる。さらに結果的にヒューマンエラーを少なくできる。また、既存のマイクロリアクタと結合することにより、上記のＤＮＡの抽出逐次希釈からＰＣＲ反応装置へのセットまでの工程を大幅に省力化できる。その結果、さまざまな生体サンプルのＤＮＡ定量解析に大きく貢献できる。また前述した等量リザーバは八つでありうる。
【００１０】
請求項２に記載の発明によれば、さらに、前記二つの流路のうちの少なくとも一方に接続される少なくとも一つの追加の段を前記段の下流に具備し、該追加の段は追加の等量分岐部と、該追加の等量分岐部から延びる二つの追加の流路とを含み、該二つの追加の流路のうちの一方の追加の流路は追加の希釈液供給部からの希釈液と合流する追加の合流部と該追加の合流部の下流に位置する追加の段用定量供給部とを含んでおり、前記試薬供給部が最も下流に延びうる流路に合流している液体サンプル調製装置が提供される。
【００１１】
すなわち請求項２に記載の発明によって、追加の希釈液供給部を備えることにより、複数種類の希釈率のサンプルを作成することができる。
【００１２】
請求項３に記載の発明によれば、前記希釈液供給部と前記追加の希釈液供給部における希釈率が異なるようにした。
すなわち請求項３に記載の発明によって、さらに複数種類の希釈率のサンプルを作成することができる。
【００１３】
請求項４に記載の発明によれば、前記定量供給部が少なくとも一つの弁と空気注入口と液溜めと光学センサとを含む。
すなわち請求項４に記載の発明によって、定量供給部の弁と光学センサの検出点との間の液体サンプルを供給できるので、定量作用を比較的容易に行うことができる。
【００１４】
請求項５に記載の発明によれば、液体サンプル源と、該液体サンプル源からの液体サンプルの流れに対して下流に位置する第一の定量供給部と、該第一の定量供給部の下流に位置する第一の弁と、該弁から延びる複数の流路とを具備し、該複数の流路のうちの少なくとも一つの流路は希釈液供給部からの希釈液と合流する合流部をそれぞれ含んでおり、さらに、該合流部の下流において前記複数の流路に合流するための試薬供給部と、該試薬供給部の下流に位置する第二の定量供給部と、該第二の定量供給部の下流に位置する第二の弁に接続される少なくとも一つの等量リザーバとを具備する液体サンプル調製装置が提供される。
【００１５】
すなわち請求項５に記載の発明によって、ＰＣＲ−ＭＰＮ法の作業における大幅な時間および労力の削減ができる。多重ＰＣＲ測定における前処理工程を、マイクロ流路での輸送、混合および分配の形式（以下マイクロ流路化と呼ぶ）を取ることにより自動処理化できるので、ＤＮＡ定量作用のスループットを向上させることができる。さらに結果的にヒューマンエラーを少なくできる。また、既存のマイクロリアクタと結合することにより、上記のＤＮＡの抽出逐次希釈からＰＣＲ反応装置へのセットまでの工程を大幅に省力化できる。その結果、さまざまな生体サンプルのＤＮＡ定量解析に大きく貢献できる。また前述した等量リザーバは八つでありうる。さらに、請求項５の場合には弁から延びる複数の流路を備えることにより、高精度な流路加工技術を必要とすることなしに、比較的容易に液体サンプルを等分することができる。
【００１６】
請求項６に記載の発明によれば、前記希釈液供給部が複数存在する場合には前記各希釈液供給部における希釈率が異なるようにした。
すなわち請求項６に記載の発明によって、さらに複数種類の希釈率のサンプルを作成することができる。
【００１７】
請求項７に記載の発明によれば、前記定量供給部が少なくとも一つの弁と空気注入口と液溜めと光学センサとを含む。
すなわち請求項７に記載の発明によって、定量供給部の弁と光学センサの検出点との間の液体サンプルを供給できるので、定量作用を比較的容易に行うことができる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面を参照して本発明の実施形態を説明する。以下の図面において同一の部材には同一の参照符号が付けられている。理解を容易にするためにこれら図面は縮尺を適宜変更している。
図１は本発明の第一の実施形態に基づく液体サンプル調製装置のマイクロ流路の構成を示す図である。図１を参照することにより、１０倍の逐次希釈列を４列（１倍、１０倍、１００倍、１０００倍）作成し、各希釈列が八つのリザーバを含む場合の液体サンプル調製装置のマイクロ流路機構を説明する。
【００１９】
本発明に基づく液体サンプル調製装置１００は液体サンプル／空気注入口５を備えており、この液体サンプル／空気注入口５は空気圧によって液体サンプルを流路７に通してディスペンサ６内に導入する。
【００２０】
図２（ａ）および図２（ｂ）はディスペンサの構成を示す図である。図２（ａ）に示されるようにディスペンサ６は、バルブ１０１、空気注入口１０２、液だめ１０３、および光学センサ１０４により構成されている。ディスペンサ６はバルブ１０１と光学センサ１０４の検出点１０５との間に存在する液体サンプルの量が取分けるべき量となるように設計されている。従って、定量供給部の弁と光学センサの検出点との間の液体サンプルを供給できるので、ディスペンサ６によって定量作用を比較的容易に行うことができる。
【００２１】
本発明の液体サンプル調製装置１００、１１０は複数のディスペンサを備えているが、取分けられるべき液体サンプルの量は各ディスペンサに応じて定まり、これらディスペンサはそれぞれ最終的に必要とされる液体サンプルの量から逆算することにより設定されている。初期にはバルブ１０１の空気注入口１０２側が閉鎖された状態になっている。光学センサ１０４は液体サンプルの先頭部分がバルブ１０１および液だめ１０３を通って検出点１０５に差掛かかるときを検出する。光学センサ１０４における検出作用によって、適切な駆動部、例えばモータ（図示しない）がサンプル流入側を閉鎖するようにバルブ１０１を作動させて、空気注入口１０２側を開放させる。次いで空気を空気注入口１０２から圧入することにより、所定の量の液体サンプルを輸送できるようになる。また図２（ｂ）に示すように、バルブ１０１の代わりに二つのバルブ１０６、１０７を採用することもできる。この場合には、バルブ１０６を閉鎖してバルブ１０７を開放した状態で空気注入口１０２から空気を供給する。次いで、バルブ１０６を開放してバルブ１０７を閉鎖した状態で液体サンプルを供給する。次いで、図２（ａ）と同様に、液だめ１０３、光学センサ１０４、検出点１０５を用いることにより、所定の量の液体サンプルを輸送する。従って、図２（ｂ）の場合にも、少なくとも一つのバルブを用いることにより、所定の量の液体サンプルを輸送できる。なお本発明の液体サンプル調製装置においてはバルブ１０１として公知のバルブを採用できる。後述する他のディスペンサも同様の構成である。
【００２２】
本発明の第一の実施形態に基づく液体サンプル調製装置１００はディスペンサ６の液体サンプルの流れに対して下流に第一の段を含んでいる。この第一の段は流路７に接続されていて二つに等量で分配可能な分岐部１０とこの分岐部１０から延びる二つの流路１１、１２とを含んでいる。第一の段の二つの流路のうちの一方の流路、本実施形態においては流路１２には、ディスペンサ１４を介して希釈液供給部１３に接続された混合部１５が設けられている。さらに第一の段は流路１２において混合部１５の下流にディスペンサ１６を含んでいる。本実施形態においては第一の段に含まれる希釈液供給部１３は１００倍希釈用の希釈液、例えば水またはバッファを供給するようになっている。すなわち第一の段に含まれる希釈液供給部１３の希釈液はディスペンサ１４により液体サンプルの９９倍の量だけ混合部１５に供給される。
【００２３】
第一の段に含まれる二つの流路のうちの一方の流路、本実施形態においては流路１１は第二の段に接続されている。さらに、ディスペンサ１６の下流に位置する流路１２は第三の段に接続されている。前述した第一の段と同様に、第二の段は流路１１に接続されていて二つに等量で分配可能な分岐部２０と分岐部２０から延びる二つの流路２１、２２とを含み、流路２２は、ディスペンサ２４を介して希釈液供給部２３に接続された混合部２５と混合部２５の下流に位置するディスペンサ２６とを含んでいる。さらに、第三の段は流路１２に接続されていて二つに等量で分配可能な分岐部３０と分岐部３０から延びる二つの流路３１、３２とを含み、流路３２は、ディスペンサ３４を介して希釈液供給部３３に接続された混合部３５と混合部３５の下流に位置するディスペンサ３６とを含んでいる。本実施形態においては、第二の段に含まれる希釈液供給部２３は１０倍希釈用の希釈液、例えば水またはバッファを供給するようになっている。第三の段に含まれる希釈液供給部３３は１０倍希釈用の希釈液、例えば水またはバッファを供給するようになっている。すなわち第二の段および第三の段に含まれる希釈液供給部２３、３３の希釈液はディスペンサ２４、３４により液体サンプルの９倍の量だけ混合部２５、３５にそれぞれ供給される。
【００２４】
図１に示されるように第二の段のディスペンサ２６よりも下流に位置する流路２２および流路２１には混合部２８および混合部２７がそれぞれ設けられている。これら混合部２７、２８はディスペンサ４２を介してＰＣＲ試薬供給部４１に接続されている。図１に示されるように、ディスペンサ４２と混合部２７、２８との間には弁４３が設けられている。この弁４３によって、ＰＣＲ試薬供給部４１からのＰＣＲ試薬を混合部２７、２８の一方にのみ供給するよう設定することができる。
【００２５】
同様に、第三の段のディスペンサ３６よりも下流に位置する流路３２および流路３１には混合部３８および混合部３７がそれぞれ設けられている。第二の段の場合と同様に、これら混合部３７、３８は弁４６およびディスペンサ４５を介してＰＣＲ試薬供給部４４に接続されている。弁４６によって、ＰＣＲ試薬供給部４４からのＰＣＲ試薬を混合部３７、３８の一方にのみ供給するよう設定することができる。
【００２６】
図１に示されるように、リザーバ集合体５１、５２が第二の段の流路２１、２２の混合部２７、２８よりもさらに下流にそれぞれ設けられている。さらに同様なリザーバ集合体５３、５４が第三の段の流路３１、３２の混合部３７、３８よりもさらに下流にそれぞれ設けられている。図１から分かるように、本実施形態における各リザーバ集合体５１、５２、５３、５４においては流路２１、２２、３１、３２からの液体サンプルが二つに等量に分けられる分岐部による分岐作用が三段階で行われている。従って、各リザーバ集合体５１、５２、５３、５４は八つのリザーバをそれぞれ含んでいる。図１に示す実施形態においては、リザーバ集合体５１、５２、５３、５４はそれぞれ八つのリザーバを含んでいるが、少なくとも一つのリザーバを含んでいれば足りる。
【００２７】
液体サンプル調製装置１００使用時における、１倍希釈の液体サンプルをテンプレートとしたＰＣＲ試薬の調製を説明する。使用時、液体サンプル／空気注入口５から試料、すなわち液体サンプルをディスペンサ６により定量しつつ流路７に供給する。次いで液体サンプルは分岐部１０において等量に二つに分けられて流路１１、１２に進入する。流路１１に進入した液体サンプルは分岐部２０においてさらに等量に二つに分けられて流路２１、２２に進入する。流路２１内の液体サンプルは混合部２７内に進入する。弁４３は初期にはディスペンサ４２と混合部２７とを接続するよう設定されているので、液体サンプルはディスペンサ４２より定量されたＰＣＲ試薬と混合部２７内において混合される。次いで、ＰＣＲ試薬と混合された液体サンプルはさらに流路２１内を通ってリザーバ集合体５１に進入する。リザーバ集合体５１においては、二つに等量に分けられる分岐作用が三段階で行われている。従って、液体サンプルを含む八つのリザーバが形成される。従って、本発明の液体サンプル調製装置１００によれば、液体サンプルを流路１１および流路２１に通過させることにより１倍希釈の液体サンプルをテンプレートとした八つのＰＣＲ試薬を調製することができる。
【００２８】
次いで、１０倍希釈液体サンプルをテンプレートとしたＰＣＲ試薬の調製を説明する。前述したように分岐部２０において等量に二つに分けられた液体サンプルが流路２１と流路２２とに進入する。流路２２内の液体サンプルは流路２２において分岐部２０の下流に設けられた混合部２５に進入する。希釈液供給部２３内の１０倍希釈液がディスペンサ２４により定量されつつ混合部２５に進入し、次いで液体サンプルと混合される。この液体サンプルはディスペンサ２６において定量されて混合部２８に進入する。前述した弁４３はこの場合には混合部２８とディスペンサ４２とを接続するように設定されている。従って、ディスペンサ４２により定量されたＰＣＲ試薬供給部４１内のＰＣＲ試薬が混合部２８内に進入する。混合部２８において液体サンプルとＰＣＲ試薬とが混合される。この液体サンプルはさらに流路２２内を通ってリザーバ集合体５２に進入する。リザーバ集合体５２においては、二つに等量に分けられる分岐作用が三段階で行われることによって、液体サンプルを含む八つのリザーバが形成される。従って、本発明の液体サンプル調製装置によれば、液体サンプルを流路１１および流路２２に通過させることにより１０倍希釈の液体サンプルをテンプレートとした八つのＰＣＲ試薬を調製することができる。
【００２９】
次いで、１００倍希釈液体サンプルをテンプレートとしたＰＣＲ試薬の調製を説明する。液体サンプルは分岐部１０において等量に二つに分けられて流路１１、１２にそれぞれ進入する。次いで流路１２内の液体サンプルは混合部１５に進入する。前述したように、混合部１５はディスペンサ１４を介して１００倍希釈用の希釈液供給部１３に接続されている。希釈液供給部１３内の１００倍希釈液はディスペンサ１４により定量されつつ混合部１５に進入し、次いで液体サンプルと混合される。この液体サンプルはディスペンサ１６において定量されて分岐部３０に進入する。次いで液体サンプルは分岐部３０において等量に二つに分けられて流路３１、３２に進入する。流路３１内の液体サンプルが混合部３７に進入する。弁４６は初期にはディスペンサ４５と混合部３７とを接続するよう設定されているので、液体サンプルはディスペンサ４５より定量されたＰＣＲ試薬と混合部３７内において混合される。次いで、ＰＣＲ試薬と混合された液体サンプルはさらに流路３１内を通ってリザーバ集合体５３に進入する。リザーバ集合体５３においては、二つに等量に分けられる分岐作用が三段階で行われることによって、液体サンプルを含む八つのリザーバが形成される。従って、本発明の液体サンプル調製装置によれば、液体サンプルを流路１２および流路３１に通過させることにより１００倍希釈の液体サンプルをテンプレートとした八つのＰＣＲ試薬を調製することができる。
【００３０】
次いで、１０００倍希釈液体サンプルをテンプレートとしたＰＣＲ試薬の調製を説明する。前述したように混合部１５を通過した液体サンプルが分岐部３０において等量に二つに分けられて流路３１、３２に進入する。流路３２内のサンプルは混合部３５に進入する。希釈液供給部３３内の１０倍希釈液がディスペンサ３４により定量されつつ混合部３５に進入し、次いで液体サンプルと混合される。この液体サンプルはディスペンサ３６において定量されて混合部３８に進入する。前述した弁４６はこの場合には混合部３８とディスペンサ４５とを接続するように設定されている。従って、ディスペンサ４５により定量されたＰＣＲ試薬供給部４４内のＰＣＲ試薬が混合部３８内に進入する。混合部３８において液体サンプルとＰＣＲ試薬とが混合される。この液体サンプルはさらに流路３２内を通ってリザーバ集合体５４に進入する。リザーバ集合体５４においては、二つに等量に分けられる分岐作用が三段階で行われることによって、液体サンプルを含む八つのリザーバが形成される。従って、本発明の液体サンプル調製装置によれば、液体サンプルを流路１２および流路３２に通過させることにより１０００倍希釈の液体サンプルをテンプレートとした八つのＰＣＲ試薬を調製することができる。これにより、本発明の液体サンプル調製装置１００によれば、１０倍の逐次希釈列を４列（１倍、１０倍、１００倍、１０００倍）作成することができる。
【００３１】
最終的にリザーバ集合体５１、５２、５３、５４に含まれる調製済液体サンプルは公知のＰＣＲリアクタに搬送される。従って、ＰＣＲ−ＭＰＮ法の作業における大幅な時間および労力の削減ができる。多重ＰＣＲ測定における前処理工程を、マイクロ流路での輸送、混合および分配の形式（以下マイクロ流路化と呼ぶ）を取ることにより自動処理化できるので、ＤＮＡ定量をハイスループットで行うことができる。さらに結果的にヒューマンエラーを少なくできる。また、既存のマイクロリアクタと結合することにより、上記のＤＮＡの抽出逐次希釈からＰＣＲ反応装置へのセットまでの工程が大幅に省力化できる。その結果、さまざまな生体サンプルのＤＮＡ定量解析に大きく貢献できる。
【００３２】
図３は本発明の第二の実施形態に基づくマイクロ流路の構成を示す図である。前述した第一の実施形態においては厳密に二等分するために高精度な流路加工技術を必要とする分岐部を採用しているが、本実施形態においては少なくとも二つに等分するための弁を含んでいる。図３を参照することにより、１０倍の逐次希釈列を４列（１倍、１０倍、１００倍、１０００倍）作成し、各希釈列が八つのリザーバを含む場合の液体サンプル調製装置のマイクロ流路機構を説明する。
【００３３】
図３において本発明に基づく液体サンプル調製装置１１０は液体サンプル／空気注入口５を備えており、前述した実施形態と同様にこの液体サンプル／空気注入口５は空気圧によって液体サンプルを流路７に通してディスペンサ６内に導入する。
【００３４】
図３に示されるように、流路７の下流には弁６０が設けられており、この弁６０から複数、本実施形態においては四つの流路６１、６２、６３、６４が延びている。これら流路のうちの流路６２には混合部７６が設けられている。前述した実施形態と同様にこの混合部７６はディスペンサ７５を介して希釈液供給部７４に接続されている。混合部７６よりも下流に位置する流路６２および流路６１には混合部６６および混合部６５がそれぞれ設けられている。これら混合部６５、６６はディスペンサ８２を介してＰＣＲ試薬供給部８１に接続されている。図３に示されるように、ディスペンサ８２と混合部６５、６６との間には弁８３が設けられている。この弁８３によって、ＰＣＲ試薬供給部８１からのＰＣＲ試薬を混合部６５、６６の一方にのみ供給することができる。本実施形態におけるディスペンサ、混合部、弁および希釈液供給部は前述した第一の実施形態におけるディスペンサ、混合部、弁および希釈液供給部と同様の構成である。
【００３５】
さらに流路６１、６２の混合部６５、６６よりも液体サンプルの流れに対して下流にはディスペンサ９１、９２が設けられており、これらディスペンサ９１、９２のさらに下流には弁９５、９６がそれぞれ設けられている。図３に示されるように、これら弁は複数のリザーバを含むリザーバ集合体５５、５６にそれぞれ接続されている。本実施形態における希釈液供給部７４は１０倍希釈用の希釈液、例えば水またはバッファを供給するようになっている。
【００３６】
弁６０から延びる流路６３には混合部７９が設けられており、この混合部７９はディスペンサ７８を介して希釈液供給部７７に接続されている。さらに弁６０から延びる流路６４には混合部７３が設けられており、この混合部７３はディスペンサ７２を介して希釈液供給部７１に接続されている。混合部７３、７９よりも下流に位置する流路６３および流路６４には混合部６７および混合部６８がそれぞれ設けられている。これら混合部６７、６８はディスペンサ８５を介してＰＣＲ試薬供給部８４に接続されている。図３に示されるように、ディスペンサ８５と混合部６７、６８との間には弁８６が同様に設けられている。この弁８６によって、ＰＣＲ試薬供給部８４からのＰＣＲ試薬を混合部６７、６８の一方にのみ供給することができる。
【００３７】
流路６３、６４の混合部６７、６８よりも液体サンプルの流れに対して下流にはディスペンサ９３、９４が同様に設けられており、これらディスペンサ９３、９４のさらに下流には弁９７、９８がそれぞれ設けられている。図３に示されるように、これら弁は複数のリザーバを含むリザーバ集合体５７、５８に接続されている。本実施形態における希釈液供給部７７は１００倍希釈用の希釈液、例えば水またはバッファ、希釈液供給部７１は１０００倍希釈用の希釈液、例えば水またはバッファをそれぞれ供給するようになっている。
【００３８】
動作時、本実施形態においては液体サンプル／空気注入口５から試料、すなわち液体サンプルがディスペンサ６により定量されつつ流路７に進入する。初期には弁６０はディスペンサ６と混合部６５とを接続するように設定されているので、液体サンプルは流路６１を通って混合部６５に進入する。弁８３は初期にはディスペンサ８２と混合部６５とを接続するよう設置されているので、液体サンプルは混合部６５内においてＰＣＲ試薬と混合される。次いで、この液体サンプルはディスペンサ９１により定量される。弁９５はディスペンサ９１とリザーバ集合体５５の一つのリザーバとを接続するよう設定されており、液体サンプルはこのリザーバを充填する。次いで、弁９５がディスペンサ９１と他のリザーバとを接続するように設定された後、液体サンプルはこのリザーバを充填する。この操作をリザーバ集合体５５に含まれるリザーバの数に応じた回数だけ行うことにより、リザーバ集合体５５内の全てのリザーバを充填する。従って、本発明の液体サンプル調製装置１１０によれば、リザーバ集合体５５において１倍希釈の液体サンプルをテンプレートとしたＰＣＲ試薬を調製することができる。なお、ディスペンサ９１によりリザーバ集合体５５内のリザーバの数に相当する回数だけ定量を行うのに足りる量の液体サンプルをディスペンサ６により定量する必要がある。
【００３９】
次いで、弁６０の設定を変更してディスペンサ６と混合部７６とが接続されるようにする。これによりディスペンサ６により定量された液体サンプルが流路６２を通って混合部７６に進入する。希釈液供給部７４内の１０倍希釈用希釈液がディスペンサ７５を介して混合部７６内に進入して液体サンプルと共に混合される。次いで、液体サンプルは混合部６６に進入して、ＰＣＲ試薬供給部８１からのＰＣＲ試薬と混合される。当然のことながら、この場合には弁８３はディスペンサ８２と混合部６６とが接続するように設定されている。次いでリザーバ集合体５５の場合と同様に、液体サンプルがディスペンサ９２により定量されて、弁９６によりリザーバ集合体５６の一つのリザーバを充填する。この操作をリザーバ集合体５６に含まれるリザーバの数に応じた回数だけ行うことにより、リザーバ集合体５６内の全てのリザーバを充填する。従って、本発明の液体サンプル調製装置１１０によれば、１０倍希釈の液体サンプルをテンプレートとしたＰＣＲ試薬を調製することができる。
【００４０】
次いで、弁６０の設定を変更してディスペンサ６と混合部７９とが接続されるようにする。これによりディスペンサ６により定量された液体サンプルが流路６３を通って混合部７９に進入する。希釈液供給部７７内の１００倍希釈用希釈液がディスペンサ７８を介して混合部７９内に進入して液体サンプルと共に混合される。次いで、液体サンプルは混合部６７に進入する。弁８６は初期にはディスペンサ８５と混合部６７とが接続されるように設定されているので、ＰＣＲ試薬供給部８１からのＰＣＲ試薬と混合される。次いでリザーバ集合体５５の場合と同様に、液体サンプルがディスペンサ９３により定量されて、弁９７によりリザーバ集合体５７の一つのリザーバを充填する。この操作をリザーバ集合体５７に含まれるリザーバの数に応じた回数だけ行うことにより、リザーバ集合体５７内の全てのリザーバを充填する。従って、本発明の液体サンプル調製装置１１０によれば、リザーバ集合体５７において１００倍希釈の液体サンプルをテンプレートとしたＰＣＲ試薬を調製することができる。
【００４１】
次いで、弁６０の設定を変更してディスペンサ６と混合部７３とが接続されるようにする。これによりディスペンサ６により定量された液体サンプルが流路６４を通って混合部７３に進入する。希釈液供給部７１内の１０００倍希釈用希釈液がディスペンサ７２を介して混合部７３内に進入して液体サンプルと共に混合される。次いで、液体サンプルは混合部６８に進入して、ＰＣＲ試薬供給部８４からのＰＣＲ試薬と混合される。当然のことながら、この場合には弁８６はディスペンサ８５と混合部６８とが接続するように設定されている。次いでリザーバ集合体５５の場合と同様に、液体サンプルがディスペンサ９４により定量されて、弁９８によりリザーバ集合体５８の一つのリザーバを充填する。この操作をリザーバ集合体５８に含まれるリザーバの数に応じた回数だけ行うことにより、リザーバ集合体５８内の全てのリザーバを充填する。従って、本発明の液体サンプル調製装置１１０によれば、１０倍希釈の液体サンプルをテンプレートとしたＰＣＲ試薬を調製することができる。
【００４２】
このようにして、本発明の液体サンプル調製装置１１０により、１０倍の逐次希釈列を４列（１倍、１０倍、１００倍、１０００倍）作成することができる。
【００４３】
最終的にリザーバ集合体５５、５６、５７、５８に含まれる調製済液体サンプルは公知のＰＣＲリアクタに搬送される。従って、ＰＣＲ−ＭＰＮ法の作業における大幅な時間および労力の削減ができる。多重ＰＣＲ測定における前処理工程を、マイクロ流路での輸送、混合および分配の形式（以下マイクロ流路化と呼ぶ）を取ることにより自動処理化できるので、ＤＮＡ定量をハイスループットで行うことができる。さらに結果的にヒューマンエラーを少なくできる。また、既存のマイクロリアクタと結合することにより、上記のＤＮＡの抽出逐次希釈からＰＣＲ反応装置へのセットまでの工程が大幅に省力化できる。その結果、さまざまな生体サンプルのＤＮＡ定量解析に大きく貢献できる。
【００４４】
希釈液供給量の関係から、ディスペンサ９２、９３、９４においては、弁９６、９７、９８により使用されえない無駄な液体サンプルが生じ、その結果液体サンプル調製装置１１０全体が大型化する可能性がある。従って、弁６０と混合部７６、７９、７３との間に追加のディスペンサを設けてこれら混合部への液体サンプルの進入量を制限することにより、希釈液供給部７４、７７、７１を小型化できると共に、これら混合部およびディスペンサ７５、７８、７２を小型化できる。それゆえ液体サンプル調製装置１１０全体を小型化することができる。
【００４５】
当然のことながら、本発明において前述した希釈率とは異なる希釈率の希釈液供給部を含むことは本発明の範囲に含まれる。この場合にはさらに複数種類の希釈率のサンプルを作成することができる。また第一の実施形態の場合において、四つ以上の段を含んでいてもよく、この場合にも、段内に追加の希釈液供給部を備えることにより、複数種類の希釈率のサンプルを作成することができる。さらに、第一および第二の実施形態において液体サンプルまたは希釈液が混合部に進入する順番が逆であっても良く、また同時であってもよい。また、本発明においては希釈液およびＰＣＲ試薬をディスペンサにより混合部に供給しているが、本発明の液体サンプル調製装置の形成時に、これら希釈液および／またはＰＣＲ試薬を混合部内に所定の量だけ予め封入してもよい。このような場合にはＰＣＲ試薬が固体であってもよく、ならびに希釈液供給部および／またはＰＣＲ試薬供給部を排除できる。さらに本発明においては一つのＰＣＲ試薬供給部によってＰＣＲ試薬を二つの混合部に供給しているが、一つのＰＣＲ試薬供給部によってＰＣＲ試薬を一つの混合部のみに供給すること、および三つ以上の混合部に供給（例えば立体的な流路を用いる）することもできる。一つのＰＣＲ試薬供給部を二つ以上の流路に接続する場合には、液体サンプル調製装置全体を小型にすることができる。また、本発明は前述した第一および第二の実施形態により制限されるものではなく、希釈の順序を変更することは本発明の範囲に含まれる。当然のことながら、本発明のサンプル調製装置をＰＣＲ−ＭＰＮ法以外にも適用することができる。
【００４６】
【発明の効果】
各請求項に記載の発明によれば、本発明の装置によりＰＣＲ−ＭＰＮ法の作業時における時間および労力の大幅な削減を可能でき、スループットを格段に向上させると共にヒューマンエラーを少なくでき、その結果、さまざまな生体サンプルのＤＮＡ定量解析に大きく貢献できるという共通の効果を奏しうる。
【００４７】
さらに、請求項２に記載の発明によれば、追加の希釈液供給部を備えることにより、複数種類の希釈率のサンプルを作成することができるという効果を奏しうる。
さらに、請求項３および６に記載の発明によれば、さらに複数種類の希釈率のサンプルを作成することができるという効果を奏しうる。
さらに、請求項４および７に記載の発明によれば、定量供給部の弁と光学センサの検出点との間の液体サンプルを供給できるので、定量作用を比較的容易に行うことができるという効果を奏しうる。
【００４８】
さらに、請求項５に記載の発明によれば、弁から延びる複数の流路を備えることにより、高精度な流路加工技術を必要とすることなしに、比較的容易に液体サンプルを等分することができるという効果を奏しうる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第一の実施形態に基づくマイクロ流路の構成を示す図である。
【図２】（ａ）ディスペンサの構成を示す図である。
（ｂ）ディスペンサの別の構成を示す図である。
【図３】本発明の第二の実施形態に基づくマイクロ流路の構成を示す図である。
【図４】ＤＮＡサンプルをＰＣＲ−ＭＰＮ法により定量する処理の流れを示す工程系統図である。
【符号の説明】
５…液体サンプル／空気注入口
６…ディスペンサ
７…流路
１０、２０、３０…分岐部
１１、１２、２１、２２、３１、３２…流路
１３、２３、３３…希釈液供給部
１４、２４、３４…ディスペンサ
１５、２５、３５…混合部
１６、２６、３６…ディスペンサ
２７、２８、３７、３８…混合部
４１、４４、８１、８４…ＰＣＲ試薬供給部
４２、４５、８２、８５…ディスペンサ
４３、４６、８３、８６…弁
５１、５２、５３、５４…リザーバ集合体
５５、５６、５７、５８…リザーバ集合体
６０…弁
６１、６２、６３、６４…流路
６５、６６、６７、６８…混合部
７１、７４、７７…希釈液供給部
７２、７５、７８…ディスペンサ
７３、７６、７９…混合部
９１、９２、９３、９４…ディスペンサ
９５、９６、９７、９８…弁
１００、１１０…液体サンプル調製装置
１０１…バルブ
１０２…空気注入口
１０４…光学センサ
１０５…検出点
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＰＣＲ−ＭＰＮ法（ポリメラーゼ連鎖反応と最確数法の組み合わせ）に用いられる液体サンプル調製装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般的に、土壌や汚泥などの複合微生物系内の各生物種のＤＮＡを定量するためにＰＣＲ−ＭＰＮ法が有用であり、さらに特願２００１−０５７２８２号に記載されるように、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）をキャピラリ内で行うことにより、反応の迅速化および酵素の失活防止が可能となる。現在、主に行われているＰＣＲモニタリング法と比較すると、ＰＣＲ−ＭＰＮ法は増幅効率が厳密に一定である必要がなので、共通プライマーを用いることにより複数の生物種をまとめて定量できるという利点を備えている。またＰＣＲ−ＭＰＮ法は増幅効率に影響を及ぼす物質を完全に取り除くことが困難なサンプルにも対応できるので有利である。
【０００３】
図４はＤＮＡサンプルをＰＣＲ−ＭＰＮ法により定量する処理の流れを示す工程系統図である。図４に示されるようにＰＣＲ−ＭＰＮ法によってＤＮＡ定量を行う際には主に三つの工程を経ている。すなわち第一の工程において生体サンプル源、例えば土壌や汚泥等からのＤＮＡを抽出し（ＤＮＡ抽出）、第二の工程において多重ＰＣＲ測定を行い（多重ＰＣＲ測定）、さらに第三の工程において電気泳動、可視化、画像処理および統計データ解析によりＤＮＡ定量データを取得する（ＤＮＡ定量データ取得）。これら三つの工程のうちの第一の工程および第三の工程は、ＰＣＲ−ＭＰＮ法以外の多数のＤＮＡ定量手法と共通する技術であり、電気泳動を初めとしてマイクロリアクタの技術開発が進んでいる。従って、第一および第三の工程においては省力化および迅速化が図られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、第二の工程における多重ＰＣＲ測定はＰＣＲ−ＭＰＮ法に特有の工程であり、他の工程よりも技術開発が遅れている。一般的には第二の工程においては五段階に希釈したサンプルをそれぞれ五つ、多重測定する。従って、一つの検体当たり２５回のＰＣＲ測定を行っている。ＰＣＲ−ＭＰＮ法において精度を高めるためには多重度（ＰＣＲ本数）をさらに増やす必要がある。このような多重測定をするためにＰＣＲの前処理、すなわち煩雑な希釈列作成、ＰＣＲ試薬混合、および分注などの作業が必要であり、ＤＮＡ定量をハイスループットで行うのは困難であった。
【０００５】
この前処理工程には、ＤＮＡの抽出逐次希釈、ＰＣＲ用試薬との混合、ＰＣＲ反応液の分注、分注した反応液のキャピラリへの封入、ＰＣＲ反応装置へのセット、ＰＣＲ反応、ＰＣＲ反応後のキャピラリ開封、反応液吐出を経て、その後電気泳動による増幅確認が含まれる。
【０００６】
しかしながら、これら前処理工程のうち、ＰＣＲ反応および電気泳動のマイクロリアクタは開発されているが、ＰＣＲ−ＭＰＮ法をトータルでマイクロリアクタ化した例はない。
【０００７】
それゆえ、本発明はＰＣＲ−ＭＰＮ法の工程において、ＰＣＲ−ＭＰＮ法の作業時における時間および労力の大幅な削減を可能としてスループットを格段に向上させると共にヒューマンエラーを少なくするために、既存のＰＣＲ反応および電気泳動以外の部分をマイクロ流路化するようにして既存のマイクロリアクタと結合可能な液体サンプル調製装置を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前述した目的を達成するために請求項１に記載の発明によれば、液体サンプル源と、該液体サンプル源からの液体サンプルの流れに対して下流に位置する定量供給部と、該定量供給部の下流に位置する段とを具備し、該段は等量分岐部と、該等量分岐部から延びる二つの流路とを含み、該二つの流路のうちの一方の流路は希釈液供給部からの希釈液と合流する合流部と該合流部の下流に位置する段用定量供給部とを含んでおり、さらに、前記段の下流において前記二つの流路に合流するための少なくとも一つの試薬供給部と、該試薬供給部の下流において前記二つの流路に接続される少なくとも一つの等量リザーバとを具備する液体サンプル調製装置が提供される。
【０００９】
すなわち請求項１に記載の発明によって、ＰＣＲ−ＭＰＮ法の作業における大幅な時間および労力の削減ができる。多重ＰＣＲ測定における前処理工程を、マイクロ流路での輸送、混合および分配の形式（以下マイクロ流路化と呼ぶ）を取ることにより自動処理化できるので、ＤＮＡ定量作用のスループットを向上させることができる。さらに結果的にヒューマンエラーを少なくできる。また、既存のマイクロリアクタと結合することにより、上記のＤＮＡの抽出逐次希釈からＰＣＲ反応装置へのセットまでの工程を大幅に省力化できる。その結果、さまざまな生体サンプルのＤＮＡ定量解析に大きく貢献できる。また前述した等量リザーバは八つでありうる。
【００１０】
請求項２に記載の発明によれば、さらに、前記二つの流路のうちの少なくとも一方に接続される少なくとも一つの追加の段を前記段の下流に具備し、該追加の段は追加の等量分岐部と、該追加の等量分岐部から延びる二つの追加の流路とを含み、該二つの追加の流路のうちの一方の追加の流路は追加の希釈液供給部からの希釈液と合流する追加の合流部と該追加の合流部の下流に位置する追加の段用定量供給部とを含んでおり、前記試薬供給部が最も下流に延びうる流路に合流している液体サンプル調製装置が提供される。
【００１１】
すなわち請求項２に記載の発明によって、追加の希釈液供給部を備えることにより、複数種類の希釈率のサンプルを作成することができる。
【００１２】
請求項３に記載の発明によれば、前記希釈液供給部と前記追加の希釈液供給部における希釈率が異なるようにした。
すなわち請求項３に記載の発明によって、さらに複数種類の希釈率のサンプルを作成することができる。
【００１３】
請求項４に記載の発明によれば、前記定量供給部が少なくとも一つの弁と空気注入口と液溜めと光学センサとを含む。
すなわち請求項４に記載の発明によって、定量供給部の弁と光学センサの検出点との間の液体サンプルを供給できるので、定量作用を比較的容易に行うことができる。
【００１４】
請求項５に記載の発明によれば、液体サンプル源と、該液体サンプル源からの液体サンプルの流れに対して下流に位置する第一の定量供給部と、該第一の定量供給部の下流に位置する第一の弁と、該弁から延びる複数の流路とを具備し、該複数の流路のうちの少なくとも一つの流路は希釈液供給部からの希釈液と合流する合流部をそれぞれ含んでおり、さらに、該合流部の下流において前記複数の流路に合流するための試薬供給部と、該試薬供給部の下流に位置する第二の定量供給部と、該第二の定量供給部の下流に位置する第二の弁に接続される少なくとも一つの等量リザーバとを具備する液体サンプル調製装置が提供される。
【００１５】
すなわち請求項５に記載の発明によって、ＰＣＲ−ＭＰＮ法の作業における大幅な時間および労力の削減ができる。多重ＰＣＲ測定における前処理工程を、マイクロ流路での輸送、混合および分配の形式（以下マイクロ流路化と呼ぶ）を取ることにより自動処理化できるので、ＤＮＡ定量作用のスループットを向上させることができる。さらに結果的にヒューマンエラーを少なくできる。また、既存のマイクロリアクタと結合することにより、上記のＤＮＡの抽出逐次希釈からＰＣＲ反応装置へのセットまでの工程を大幅に省力化できる。その結果、さまざまな生体サンプルのＤＮＡ定量解析に大きく貢献できる。また前述した等量リザーバは八つでありうる。さらに、請求項５の場合には弁から延びる複数の流路を備えることにより、高精度な流路加工技術を必要とすることなしに、比較的容易に液体サンプルを等分することができる。
【００１６】
請求項６に記載の発明によれば、前記希釈液供給部が複数存在する場合には前記各希釈液供給部における希釈率が異なるようにした。
すなわち請求項６に記載の発明によって、さらに複数種類の希釈率のサンプルを作成することができる。
【００１７】
請求項７に記載の発明によれば、前記定量供給部が少なくとも一つの弁と空気注入口と液溜めと光学センサとを含む。
すなわち請求項７に記載の発明によって、定量供給部の弁と光学センサの検出点との間の液体サンプルを供給できるので、定量作用を比較的容易に行うことができる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面を参照して本発明の実施形態を説明する。以下の図面において同一の部材には同一の参照符号が付けられている。理解を容易にするためにこれら図面は縮尺を適宜変更している。
図１は本発明の第一の実施形態に基づく液体サンプル調製装置のマイクロ流路の構成を示す図である。図１を参照することにより、１０倍の逐次希釈列を４列（１倍、１０倍、１００倍、１０００倍）作成し、各希釈列が八つのリザーバを含む場合の液体サンプル調製装置のマイクロ流路機構を説明する。
【００１９】
本発明に基づく液体サンプル調製装置１００は液体サンプル／空気注入口５を備えており、この液体サンプル／空気注入口５は空気圧によって液体サンプルを流路７に通してディスペンサ６内に導入する。
【００２０】
図２（ａ）および図２（ｂ）はディスペンサの構成を示す図である。図２（ａ）に示されるようにディスペンサ６は、バルブ１０１、空気注入口１０２、液だめ１０３、および光学センサ１０４により構成されている。ディスペンサ６はバルブ１０１と光学センサ１０４の検出点１０５との間に存在する液体サンプルの量が取分けるべき量となるように設計されている。従って、定量供給部の弁と光学センサの検出点との間の液体サンプルを供給できるので、ディスペンサ６によって定量作用を比較的容易に行うことができる。
【００２１】
本発明の液体サンプル調製装置１００、１１０は複数のディスペンサを備えているが、取分けられるべき液体サンプルの量は各ディスペンサに応じて定まり、これらディスペンサはそれぞれ最終的に必要とされる液体サンプルの量から逆算することにより設定されている。初期にはバルブ１０１の空気注入口１０２側が閉鎖された状態になっている。光学センサ１０４は液体サンプルの先頭部分がバルブ１０１および液だめ１０３を通って検出点１０５に差掛かかるときを検出する。光学センサ１０４における検出作用によって、適切な駆動部、例えばモータ（図示しない）がサンプル流入側を閉鎖するようにバルブ１０１を作動させて、空気注入口１０２側を開放させる。次いで空気を空気注入口１０２から圧入することにより、所定の量の液体サンプルを輸送できるようになる。また図２（ｂ）に示すように、バルブ１０１の代わりに二つのバルブ１０６、１０７を採用することもできる。この場合には、バルブ１０６を閉鎖してバルブ１０７を開放した状態で空気注入口１０２から空気を供給する。次いで、バルブ１０６を開放してバルブ１０７を閉鎖した状態で液体サンプルを供給する。次いで、図２（ａ）と同様に、液だめ１０３、光学センサ１０４、検出点１０５を用いることにより、所定の量の液体サンプルを輸送する。従って、図２（ｂ）の場合にも、少なくとも一つのバルブを用いることにより、所定の量の液体サンプルを輸送できる。なお本発明の液体サンプル調製装置においてはバルブ１０１として公知のバルブを採用できる。後述する他のディスペンサも同様の構成である。
【００２２】
本発明の第一の実施形態に基づく液体サンプル調製装置１００はディスペンサ６の液体サンプルの流れに対して下流に第一の段を含んでいる。この第一の段は流路７に接続されていて二つに等量で分配可能な分岐部１０とこの分岐部１０から延びる二つの流路１１、１２とを含んでいる。第一の段の二つの流路のうちの一方の流路、本実施形態においては流路１２には、ディスペンサ１４を介して希釈液供給部１３に接続された混合部１５が設けられている。さらに第一の段は流路１２において混合部１５の下流にディスペンサ１６を含んでいる。本実施形態においては第一の段に含まれる希釈液供給部１３は１００倍希釈用の希釈液、例えば水またはバッファを供給するようになっている。すなわち第一の段に含まれる希釈液供給部１３の希釈液はディスペンサ１４により液体サンプルの９９倍の量だけ混合部１５に供給される。
【００２３】
第一の段に含まれる二つの流路のうちの一方の流路、本実施形態においては流路１１は第二の段に接続されている。さらに、ディスペンサ１６の下流に位置する流路１２は第三の段に接続されている。前述した第一の段と同様に、第二の段は流路１１に接続されていて二つに等量で分配可能な分岐部２０と分岐部２０から延びる二つの流路２１、２２とを含み、流路２２は、ディスペンサ２４を介して希釈液供給部２３に接続された混合部２５と混合部２５の下流に位置するディスペンサ２６とを含んでいる。さらに、第三の段は流路１２に接続されていて二つに等量で分配可能な分岐部３０と分岐部３０から延びる二つの流路３１、３２とを含み、流路３２は、ディスペンサ３４を介して希釈液供給部３３に接続された混合部３５と混合部３５の下流に位置するディスペンサ３６とを含んでいる。本実施形態においては、第二の段に含まれる希釈液供給部２３は１０倍希釈用の希釈液、例えば水またはバッファを供給するようになっている。第三の段に含まれる希釈液供給部３３は１０倍希釈用の希釈液、例えば水またはバッファを供給するようになっている。すなわち第二の段および第三の段に含まれる希釈液供給部２３、３３の希釈液はディスペンサ２４、３４により液体サンプルの９倍の量だけ混合部２５、３５にそれぞれ供給される。
【００２４】
図１に示されるように第二の段のディスペンサ２６よりも下流に位置する流路２２および流路２１には混合部２８および混合部２７がそれぞれ設けられている。これら混合部２７、２８はディスペンサ４２を介してＰＣＲ試薬供給部４１に接続されている。図１に示されるように、ディスペンサ４２と混合部２７、２８との間には弁４３が設けられている。この弁４３によって、ＰＣＲ試薬供給部４１からのＰＣＲ試薬を混合部２７、２８の一方にのみ供給するよう設定することができる。
【００２５】
同様に、第三の段のディスペンサ３６よりも下流に位置する流路３２および流路３１には混合部３８および混合部３７がそれぞれ設けられている。第二の段の場合と同様に、これら混合部３７、３８は弁４６およびディスペンサ４５を介してＰＣＲ試薬供給部４４に接続されている。弁４６によって、ＰＣＲ試薬供給部４４からのＰＣＲ試薬を混合部３７、３８の一方にのみ供給するよう設定することができる。
【００２６】
図１に示されるように、リザーバ集合体５１、５２が第二の段の流路２１、２２の混合部２７、２８よりもさらに下流にそれぞれ設けられている。さらに同様なリザーバ集合体５３、５４が第三の段の流路３１、３２の混合部３７、３８よりもさらに下流にそれぞれ設けられている。図１から分かるように、本実施形態における各リザーバ集合体５１、５２、５３、５４においては流路２１、２２、３１、３２からの液体サンプルが二つに等量に分けられる分岐部による分岐作用が三段階で行われている。従って、各リザーバ集合体５１、５２、５３、５４は八つのリザーバをそれぞれ含んでいる。図１に示す実施形態においては、リザーバ集合体５１、５２、５３、５４はそれぞれ八つのリザーバを含んでいるが、少なくとも一つのリザーバを含んでいれば足りる。
【００２７】
液体サンプル調製装置１００使用時における、１倍希釈の液体サンプルをテンプレートとしたＰＣＲ試薬の調製を説明する。使用時、液体サンプル／空気注入口５から試料、すなわち液体サンプルをディスペンサ６により定量しつつ流路７に供給する。次いで液体サンプルは分岐部１０において等量に二つに分けられて流路１１、１２に進入する。流路１１に進入した液体サンプルは分岐部２０においてさらに等量に二つに分けられて流路２１、２２に進入する。流路２１内の液体サンプルは混合部２７内に進入する。弁４３は初期にはディスペンサ４２と混合部２７とを接続するよう設定されているので、液体サンプルはディスペンサ４２より定量されたＰＣＲ試薬と混合部２７内において混合される。次いで、ＰＣＲ試薬と混合された液体サンプルはさらに流路２１内を通ってリザーバ集合体５１に進入する。リザーバ集合体５１においては、二つに等量に分けられる分岐作用が三段階で行われている。従って、液体サンプルを含む八つのリザーバが形成される。従って、本発明の液体サンプル調製装置１００によれば、液体サンプルを流路１１および流路２１に通過させることにより１倍希釈の液体サンプルをテンプレートとした八つのＰＣＲ試薬を調製することができる。
【００２８】
次いで、１０倍希釈液体サンプルをテンプレートとしたＰＣＲ試薬の調製を説明する。前述したように分岐部２０において等量に二つに分けられた液体サンプルが流路２１と流路２２とに進入する。流路２２内の液体サンプルは流路２２において分岐部２０の下流に設けられた混合部２５に進入する。希釈液供給部２３内の１０倍希釈液がディスペンサ２４により定量されつつ混合部２５に進入し、次いで液体サンプルと混合される。この液体サンプルはディスペンサ２６において定量されて混合部２８に進入する。前述した弁４３はこの場合には混合部２８とディスペンサ４２とを接続するように設定されている。従って、ディスペンサ４２により定量されたＰＣＲ試薬供給部４１内のＰＣＲ試薬が混合部２８内に進入する。混合部２８において液体サンプルとＰＣＲ試薬とが混合される。この液体サンプルはさらに流路２２内を通ってリザーバ集合体５２に進入する。リザーバ集合体５２においては、二つに等量に分けられる分岐作用が三段階で行われることによって、液体サンプルを含む八つのリザーバが形成される。従って、本発明の液体サンプル調製装置によれば、液体サンプルを流路１１および流路２２に通過させることにより１０倍希釈の液体サンプルをテンプレートとした八つのＰＣＲ試薬を調製することができる。
【００２９】
次いで、１００倍希釈液体サンプルをテンプレートとしたＰＣＲ試薬の調製を説明する。液体サンプルは分岐部１０において等量に二つに分けられて流路１１、１２にそれぞれ進入する。次いで流路１２内の液体サンプルは混合部１５に進入する。前述したように、混合部１５はディスペンサ１４を介して１００倍希釈用の希釈液供給部１３に接続されている。希釈液供給部１３内の１００倍希釈液はディスペンサ１４により定量されつつ混合部１５に進入し、次いで液体サンプルと混合される。この液体サンプルはディスペンサ１６において定量されて分岐部３０に進入する。次いで液体サンプルは分岐部３０において等量に二つに分けられて流路３１、３２に進入する。流路３１内の液体サンプルが混合部３７に進入する。弁４６は初期にはディスペンサ４５と混合部３７とを接続するよう設定されているので、液体サンプルはディスペンサ４５より定量されたＰＣＲ試薬と混合部３７内において混合される。次いで、ＰＣＲ試薬と混合された液体サンプルはさらに流路３１内を通ってリザーバ集合体５３に進入する。リザーバ集合体５３においては、二つに等量に分けられる分岐作用が三段階で行われることによって、液体サンプルを含む八つのリザーバが形成される。従って、本発明の液体サンプル調製装置によれば、液体サンプルを流路１２および流路３１に通過させることにより１００倍希釈の液体サンプルをテンプレートとした八つのＰＣＲ試薬を調製することができる。
【００３０】
次いで、１０００倍希釈液体サンプルをテンプレートとしたＰＣＲ試薬の調製を説明する。前述したように混合部１５を通過した液体サンプルが分岐部３０において等量に二つに分けられて流路３１、３２に進入する。流路３２内のサンプルは混合部３５に進入する。希釈液供給部３３内の１０倍希釈液がディスペンサ３４により定量されつつ混合部３５に進入し、次いで液体サンプルと混合される。この液体サンプルはディスペンサ３６において定量されて混合部３８に進入する。前述した弁４６はこの場合には混合部３８とディスペンサ４５とを接続するように設定されている。従って、ディスペンサ４５により定量されたＰＣＲ試薬供給部４４内のＰＣＲ試薬が混合部３８内に進入する。混合部３８において液体サンプルとＰＣＲ試薬とが混合される。この液体サンプルはさらに流路３２内を通ってリザーバ集合体５４に進入する。リザーバ集合体５４においては、二つに等量に分けられる分岐作用が三段階で行われることによって、液体サンプルを含む八つのリザーバが形成される。従って、本発明の液体サンプル調製装置によれば、液体サンプルを流路１２および流路３２に通過させることにより１０００倍希釈の液体サンプルをテンプレートとした八つのＰＣＲ試薬を調製することができる。これにより、本発明の液体サンプル調製装置１００によれば、１０倍の逐次希釈列を４列（１倍、１０倍、１００倍、１０００倍）作成することができる。
【００３１】
最終的にリザーバ集合体５１、５２、５３、５４に含まれる調製済液体サンプルは公知のＰＣＲリアクタに搬送される。従って、ＰＣＲ−ＭＰＮ法の作業における大幅な時間および労力の削減ができる。多重ＰＣＲ測定における前処理工程を、マイクロ流路での輸送、混合および分配の形式（以下マイクロ流路化と呼ぶ）を取ることにより自動処理化できるので、ＤＮＡ定量をハイスループットで行うことができる。さらに結果的にヒューマンエラーを少なくできる。また、既存のマイクロリアクタと結合することにより、上記のＤＮＡの抽出逐次希釈からＰＣＲ反応装置へのセットまでの工程が大幅に省力化できる。その結果、さまざまな生体サンプルのＤＮＡ定量解析に大きく貢献できる。
【００３２】
図３は本発明の第二の実施形態に基づくマイクロ流路の構成を示す図である。前述した第一の実施形態においては厳密に二等分するために高精度な流路加工技術を必要とする分岐部を採用しているが、本実施形態においては少なくとも二つに等分するための弁を含んでいる。図３を参照することにより、１０倍の逐次希釈列を４列（１倍、１０倍、１００倍、１０００倍）作成し、各希釈列が八つのリザーバを含む場合の液体サンプル調製装置のマイクロ流路機構を説明する。
【００３３】
図３において本発明に基づく液体サンプル調製装置１１０は液体サンプル／空気注入口５を備えており、前述した実施形態と同様にこの液体サンプル／空気注入口５は空気圧によって液体サンプルを流路７に通してディスペンサ６内に導入する。
【００３４】
図３に示されるように、流路７の下流には弁６０が設けられており、この弁６０から複数、本実施形態においては四つの流路６１、６２、６３、６４が延びている。これら流路のうちの流路６２には混合部７６が設けられている。前述した実施形態と同様にこの混合部７６はディスペンサ７５を介して希釈液供給部７４に接続されている。混合部７６よりも下流に位置する流路６２および流路６１には混合部６６および混合部６５がそれぞれ設けられている。これら混合部６５、６６はディスペンサ８２を介してＰＣＲ試薬供給部８１に接続されている。図３に示されるように、ディスペンサ８２と混合部６５、６６との間には弁８３が設けられている。この弁８３によって、ＰＣＲ試薬供給部８１からのＰＣＲ試薬を混合部６５、６６の一方にのみ供給することができる。本実施形態におけるディスペンサ、混合部、弁および希釈液供給部は前述した第一の実施形態におけるディスペンサ、混合部、弁および希釈液供給部と同様の構成である。
【００３５】
さらに流路６１、６２の混合部６５、６６よりも液体サンプルの流れに対して下流にはディスペンサ９１、９２が設けられており、これらディスペンサ９１、９２のさらに下流には弁９５、９６がそれぞれ設けられている。図３に示されるように、これら弁は複数のリザーバを含むリザーバ集合体５５、５６にそれぞれ接続されている。本実施形態における希釈液供給部７４は１０倍希釈用の希釈液、例えば水またはバッファを供給するようになっている。
【００３６】
弁６０から延びる流路６３には混合部７９が設けられており、この混合部７９はディスペンサ７８を介して希釈液供給部７７に接続されている。さらに弁６０から延びる流路６４には混合部７３が設けられており、この混合部７３はディスペンサ７２を介して希釈液供給部７１に接続されている。混合部７３、７９よりも下流に位置する流路６３および流路６４には混合部６７および混合部６８がそれぞれ設けられている。これら混合部６７、６８はディスペンサ８５を介してＰＣＲ試薬供給部８４に接続されている。図３に示されるように、ディスペンサ８５と混合部６７、６８との間には弁８６が同様に設けられている。この弁８６によって、ＰＣＲ試薬供給部８４からのＰＣＲ試薬を混合部６７、６８の一方にのみ供給することができる。
【００３７】
流路６３、６４の混合部６７、６８よりも液体サンプルの流れに対して下流にはディスペンサ９３、９４が同様に設けられており、これらディスペンサ９３、９４のさらに下流には弁９７、９８がそれぞれ設けられている。図３に示されるように、これら弁は複数のリザーバを含むリザーバ集合体５７、５８に接続されている。本実施形態における希釈液供給部７７は１００倍希釈用の希釈液、例えば水またはバッファ、希釈液供給部７１は１０００倍希釈用の希釈液、例えば水またはバッファをそれぞれ供給するようになっている。
【００３８】
動作時、本実施形態においては液体サンプル／空気注入口５から試料、すなわち液体サンプルがディスペンサ６により定量されつつ流路７に進入する。初期には弁６０はディスペンサ６と混合部６５とを接続するように設定されているので、液体サンプルは流路６１を通って混合部６５に進入する。弁８３は初期にはディスペンサ８２と混合部６５とを接続するよう設置されているので、液体サンプルは混合部６５内においてＰＣＲ試薬と混合される。次いで、この液体サンプルはディスペンサ９１により定量される。弁９５はディスペンサ９１とリザーバ集合体５５の一つのリザーバとを接続するよう設定されており、液体サンプルはこのリザーバを充填する。次いで、弁９５がディスペンサ９１と他のリザーバとを接続するように設定された後、液体サンプルはこのリザーバを充填する。この操作をリザーバ集合体５５に含まれるリザーバの数に応じた回数だけ行うことにより、リザーバ集合体５５内の全てのリザーバを充填する。従って、本発明の液体サンプル調製装置１１０によれば、リザーバ集合体５５において１倍希釈の液体サンプルをテンプレートとしたＰＣＲ試薬を調製することができる。なお、ディスペンサ９１によりリザーバ集合体５５内のリザーバの数に相当する回数だけ定量を行うのに足りる量の液体サンプルをディスペンサ６により定量する必要がある。
【００３９】
次いで、弁６０の設定を変更してディスペンサ６と混合部７６とが接続されるようにする。これによりディスペンサ６により定量された液体サンプルが流路６２を通って混合部７６に進入する。希釈液供給部７４内の１０倍希釈用希釈液がディスペンサ７５を介して混合部７６内に進入して液体サンプルと共に混合される。次いで、液体サンプルは混合部６６に進入して、ＰＣＲ試薬供給部８１からのＰＣＲ試薬と混合される。当然のことながら、この場合には弁８３はディスペンサ８２と混合部６６とが接続するように設定されている。次いでリザーバ集合体５５の場合と同様に、液体サンプルがディスペンサ９２により定量されて、弁９６によりリザーバ集合体５６の一つのリザーバを充填する。この操作をリザーバ集合体５６に含まれるリザーバの数に応じた回数だけ行うことにより、リザーバ集合体５６内の全てのリザーバを充填する。従って、本発明の液体サンプル調製装置１１０によれば、１０倍希釈の液体サンプルをテンプレートとしたＰＣＲ試薬を調製することができる。
【００４０】
次いで、弁６０の設定を変更してディスペンサ６と混合部７９とが接続されるようにする。これによりディスペンサ６により定量された液体サンプルが流路６３を通って混合部７９に進入する。希釈液供給部７７内の１００倍希釈用希釈液がディスペンサ７８を介して混合部７９内に進入して液体サンプルと共に混合される。次いで、液体サンプルは混合部６７に進入する。弁８６は初期にはディスペンサ８５と混合部６７とが接続されるように設定されているので、ＰＣＲ試薬供給部８１からのＰＣＲ試薬と混合される。次いでリザーバ集合体５５の場合と同様に、液体サンプルがディスペンサ９３により定量されて、弁９７によりリザーバ集合体５７の一つのリザーバを充填する。この操作をリザーバ集合体５７に含まれるリザーバの数に応じた回数だけ行うことにより、リザーバ集合体５７内の全てのリザーバを充填する。従って、本発明の液体サンプル調製装置１１０によれば、リザーバ集合体５７において１００倍希釈の液体サンプルをテンプレートとしたＰＣＲ試薬を調製することができる。
【００４１】
次いで、弁６０の設定を変更してディスペンサ６と混合部７３とが接続されるようにする。これによりディスペンサ６により定量された液体サンプルが流路６４を通って混合部７３に進入する。希釈液供給部７１内の１０００倍希釈用希釈液がディスペンサ７２を介して混合部７３内に進入して液体サンプルと共に混合される。次いで、液体サンプルは混合部６８に進入して、ＰＣＲ試薬供給部８４からのＰＣＲ試薬と混合される。当然のことながら、この場合には弁８６はディスペンサ８５と混合部６８とが接続するように設定されている。次いでリザーバ集合体５５の場合と同様に、液体サンプルがディスペンサ９４により定量されて、弁９８によりリザーバ集合体５８の一つのリザーバを充填する。この操作をリザーバ集合体５８に含まれるリザーバの数に応じた回数だけ行うことにより、リザーバ集合体５８内の全てのリザーバを充填する。従って、本発明の液体サンプル調製装置１１０によれば、１０倍希釈の液体サンプルをテンプレートとしたＰＣＲ試薬を調製することができる。
【００４２】
このようにして、本発明の液体サンプル調製装置１１０により、１０倍の逐次希釈列を４列（１倍、１０倍、１００倍、１０００倍）作成することができる。
【００４３】
最終的にリザーバ集合体５５、５６、５７、５８に含まれる調製済液体サンプルは公知のＰＣＲリアクタに搬送される。従って、ＰＣＲ−ＭＰＮ法の作業における大幅な時間および労力の削減ができる。多重ＰＣＲ測定における前処理工程を、マイクロ流路での輸送、混合および分配の形式（以下マイクロ流路化と呼ぶ）を取ることにより自動処理化できるので、ＤＮＡ定量をハイスループットで行うことができる。さらに結果的にヒューマンエラーを少なくできる。また、既存のマイクロリアクタと結合することにより、上記のＤＮＡの抽出逐次希釈からＰＣＲ反応装置へのセットまでの工程が大幅に省力化できる。その結果、さまざまな生体サンプルのＤＮＡ定量解析に大きく貢献できる。
【００４４】
希釈液供給量の関係から、ディスペンサ９２、９３、９４においては、弁９６、９７、９８により使用されえない無駄な液体サンプルが生じ、その結果液体サンプル調製装置１１０全体が大型化する可能性がある。従って、弁６０と混合部７６、７９、７３との間に追加のディスペンサを設けてこれら混合部への液体サンプルの進入量を制限することにより、希釈液供給部７４、７７、７１を小型化できると共に、これら混合部およびディスペンサ７５、７８、７２を小型化できる。それゆえ液体サンプル調製装置１１０全体を小型化することができる。
【００４５】
当然のことながら、本発明において前述した希釈率とは異なる希釈率の希釈液供給部を含むことは本発明の範囲に含まれる。この場合にはさらに複数種類の希釈率のサンプルを作成することができる。また第一の実施形態の場合において、四つ以上の段を含んでいてもよく、この場合にも、段内に追加の希釈液供給部を備えることにより、複数種類の希釈率のサンプルを作成することができる。さらに、第一および第二の実施形態において液体サンプルまたは希釈液が混合部に進入する順番が逆であっても良く、また同時であってもよい。また、本発明においては希釈液およびＰＣＲ試薬をディスペンサにより混合部に供給しているが、本発明の液体サンプル調製装置の形成時に、これら希釈液および／またはＰＣＲ試薬を混合部内に所定の量だけ予め封入してもよい。このような場合にはＰＣＲ試薬が固体であってもよく、ならびに希釈液供給部および／またはＰＣＲ試薬供給部を排除できる。さらに本発明においては一つのＰＣＲ試薬供給部によってＰＣＲ試薬を二つの混合部に供給しているが、一つのＰＣＲ試薬供給部によってＰＣＲ試薬を一つの混合部のみに供給すること、および三つ以上の混合部に供給（例えば立体的な流路を用いる）することもできる。一つのＰＣＲ試薬供給部を二つ以上の流路に接続する場合には、液体サンプル調製装置全体を小型にすることができる。また、本発明は前述した第一および第二の実施形態により制限されるものではなく、希釈の順序を変更することは本発明の範囲に含まれる。当然のことながら、本発明のサンプル調製装置をＰＣＲ−ＭＰＮ法以外にも適用することができる。
【００４６】
【発明の効果】
各請求項に記載の発明によれば、本発明の装置によりＰＣＲ−ＭＰＮ法の作業時における時間および労力の大幅な削減を可能でき、スループットを格段に向上させると共にヒューマンエラーを少なくでき、その結果、さまざまな生体サンプルのＤＮＡ定量解析に大きく貢献できるという共通の効果を奏しうる。
【００４７】
さらに、請求項２に記載の発明によれば、追加の希釈液供給部を備えることにより、複数種類の希釈率のサンプルを作成することができるという効果を奏しうる。
さらに、請求項３および６に記載の発明によれば、さらに複数種類の希釈率のサンプルを作成することができるという効果を奏しうる。
さらに、請求項４および７に記載の発明によれば、定量供給部の弁と光学センサの検出点との間の液体サンプルを供給できるので、定量作用を比較的容易に行うことができるという効果を奏しうる。
【００４８】
さらに、請求項５に記載の発明によれば、弁から延びる複数の流路を備えることにより、高精度な流路加工技術を必要とすることなしに、比較的容易に液体サンプルを等分することができるという効果を奏しうる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第一の実施形態に基づくマイクロ流路の構成を示す図である。
【図２】（ａ）ディスペンサの構成を示す図である。
（ｂ）ディスペンサの別の構成を示す図である。
【図３】本発明の第二の実施形態に基づくマイクロ流路の構成を示す図である。
【図４】ＤＮＡサンプルをＰＣＲ−ＭＰＮ法により定量する処理の流れを示す工程系統図である。
【符号の説明】
５…液体サンプル／空気注入口
６…ディスペンサ
７…流路
１０、２０、３０…分岐部
１１、１２、２１、２２、３１、３２…流路
１３、２３、３３…希釈液供給部
１４、２４、３４…ディスペンサ
１５、２５、３５…混合部
１６、２６、３６…ディスペンサ
２７、２８、３７、３８…混合部
４１、４４、８１、８４…ＰＣＲ試薬供給部
４２、４５、８２、８５…ディスペンサ
４３、４６、８３、８６…弁
５１、５２、５３、５４…リザーバ集合体
５５、５６、５７、５８…リザーバ集合体
６０…弁
６１、６２、６３、６４…流路
６５、６６、６７、６８…混合部
７１、７４、７７…希釈液供給部
７２、７５、７８…ディスペンサ
７３、７６、７９…混合部
９１、９２、９３、９４…ディスペンサ
９５、９６、９７、９８…弁
１００、１１０…液体サンプル調製装置
１０１…バルブ
１０２…空気注入口
１０４…光学センサ
１０５…検出点
Claims (7)
- 液体サンプル源と、
該液体サンプル源からの液体サンプルの流れに対して下流に位置する定量供給部と、
該定量供給部の下流に位置する段とを具備し、該段は等量分岐部と、該等量分岐部から延びる二つの流路とを含み、該二つの流路のうちの一方の流路は希釈液供給部からの希釈液と合流する合流部と該合流部の下流に位置する段用定量供給部とを含んでおり、
さらに、
前記段の下流において前記二つの流路に合流するための少なくとも一つの試薬供給部と、
該試薬供給部の下流において前記二つの流路に接続される少なくとも一つの等量リザーバとを具備する液体サンプル調製装置。 - さらに、前記二つの流路のうちの少なくとも一方に接続される少なくとも一つの追加の段を前記段の下流に具備し、該追加の段は追加の等量分岐部と、該追加の等量分岐部から延びる二つの追加の流路とを含み、該二つの追加の流路のうちの一方の追加の流路は追加の希釈液供給部からの希釈液と合流する追加の合流部と該追加の合流部の下流に位置する追加の段用定量供給部とを含んでおり、
前記試薬供給部が最も下流に延びうる流路に合流している請求項１に記載の液体サンプル調製装置。 - 前記希釈液供給部と前記追加の希釈液供給部における希釈率が異なるようにした請求項２に記載の液体サンプル調製装置。
- 前記定量供給部が少なくとも一つの弁と空気注入口と液溜めと光学センサとを含む請求項１から３のいずれか一項に記載の液体サンプル調製装置。
- 液体サンプル源と、
該液体サンプル源からの液体サンプルの流れに対して下流に位置する第一の定量供給部と、
該第一の定量供給部の下流に位置する第一の弁と、
該弁から延びる複数の流路とを具備し、該複数の流路のうちの少なくとも一つの流路は希釈液供給部からの希釈液と合流する合流部をそれぞれ含んでおり、
さらに、
該合流部の下流において前記複数の流路に合流するための試薬供給部と、
該試薬供給部の下流に位置する第二の定量供給部と、
該第二の定量供給部の下流に位置する第二の弁に接続される少なくとも一つの等量リザーバとを具備する液体サンプル調製装置。 - 前記希釈液供給部が複数存在する場合には前記各希釈液供給部における希釈率が異なるようにした請求項５に記載の液体サンプル調製装置。
- 前記定量供給部が少なくとも一つの弁と空気注入口と液溜めと光学センサとを含む請求項５または６に記載の液体サンプル調製装置。
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