JP3583430B2 - イオン交換体 - Google Patents

Description

本発明はイオン交換クロマトグラフィー用の分離材に関する。
特に生物由来の巨大分子（生体高分子）のイオン交換クロマトフラフィー用に、DE3811042はモノマー単位の全部がそれぞれのイオン構造要素を有するイオングラフトポリマーを開示している。これらのイオン交換体は性質が一般的にすぐれているにもかかわらず、ある種の用途では個々のアナライトバンド（analyte bands）はただ不適切に分かれていることが判った。本発明の目的は改善された性質をもつ分離材を提供することである。
出願DE4310964は式Ｉのモノマーが水酸基含有の保持基材にグラフトされているオキシラン含有の活性化保持材を開示している：

式中
R¹、R²およびR³は互いに獨立してＨ又はCH₃であり、R⁴はＨ、C₁−C₅アルキルまたはC₆−C₁₂アリールであり、ｎは１ないし５の整数である。
これら活性化保持材は、公知の方法で、反応してイオン交換クロマトグラフィ用の分離材を生ずることがわかっている。この結果得られる分離材は改善された性質を示す。
従って本発明はその表面上にポリマーが共有結合的に結合している水酸基含有の保持基材をベースにしたイオン交換クロマトグラフィ用の分離材に関し、この分離材は
ａ）保持基材が脂肪族水酸基を含有している、
ｂ）共有結合的に結合したポリマーが末端モノマー単位を経由して保持基材と結合している、
ｃ）ポリマーが下記式IIと式III両方のモノマー単位を含有している、
ｄ）モノマー単位は線状に結合している、
ことを特徴とする：

式中
R¹、R²およびR³は互いに獨立してＨまたはCH₃であり、R⁴はＨ、C₁−C₅アルキルまたはC₆−C₁₂アリールであり、ｎは１ないし５の整数であり、
一つのＸ基はOHであって他のＸ基はNR⁵R⁶、N⁺R⁵R⁶R⁷またはSO₃Hであり、
R⁵、R⁶およびR⁷は互いに独立してC₁−C₄アルキルであり、一つまたは両方の基R⁵および／またはR⁶がＨであることも可能である。
本発明はイオン交換クロマトグラフィーによって少なくとも二つの物質の混合物を分離する際に、特に生体高分子を分離するために、本発明の分離材を使用することに関する。
本発明はまたイオン交換クロマトグラフィー用の分離材を製造する方法に関し、この方法はDE4310964で知られたオキシラン含有の活性化保持材を亜硫酸またはその塩あるいは式IVの第一級、第二級または第三級アミンと反応させる、ことを特徴とする：
NR⁵R⁶R⁷ IV
式中
R⁵、R⁶およびR⁷は互いに獨立してC₁−C₄アルキルであり、これらの基の一つまたは二つがＨであることも可能である。
本発明は本発明の分離材を用いるイオン交換クロマトグラフィーによって少なくとも二種の物質の混合物を分離する方法、特に生体高分子の分離の方法に関する。第１図は溶離曲線（漏出曲線）を示す；実験の詳細は使用例Ａに記されている。第２図はヒト血清アルブミン、オバルブミン及びコナルブミンのクロマトグラフ分離による溶離曲線を示す；実験の詳細は使用例Ｃに記されている。
本発明によれば、スルフォニル基を含む陽イオン交換体を亜硫酸またはその塩を用いてつくることができる。陰イオン交換体の調整には、単数または複数のアルキル鎖中に１−４炭素原子をもつ第一級、第二級または第三級アルキルアミンを用いることができる。従ってR⁵、R⁶およびR⁷の基は、各々の場合互いに独立に、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、またはtert−ブチルであることができ、これらの基の一つまたは二つが水素であることもまた可能である。かくして、アミノ基を含有する陰イオン交換体の調製に、例えばメチルアミン、ジメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、エチルメチルアミン、プロピルアミン、ジプロピルアミンまたはメチルプロピルアミンを用いることができる。ジメチルアミンまたはジエチルアミンの使用が好ましい。第四級アンモニウム基を含有する陰イオン交換体の調製には、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルジメチルアミンまたはジエチルメチルアミンを用いることができるが、トリメチルアミンの使用が好ましい。
上記の化合物はオキシラン系と反応して、もし亜硫酸またはその化合物が用いられる場合は、スルフォン化陽イオン交換体を生ずる。第一級または第二級アミンを用いると、アミノ基を含有する陰イオン交換体が生じ、第三級アミンを用いると、第四級アンモニウム基を含有する陰イオン交換体が生ずる。過剰のオキシラン基は稀硫酸を用いて加水分解してジオール基にする。上記の式IIIのイオンモノマー単位の含量は５から50モル％であり、好ましくは10ないし30モル％である；残りのモノマー単位は式IIのジオール構造を有する。電荷密度は反応物の濃度、すなわち亜硫酸またはそれぞれのアミンの濃度を選ぶことによって調整できる。
これ以上何も述べなくても、当業者は上記の説明を最大限に利用することができると考えられる。従って、好ましい実施態様は単に説明のためのものと理解すべきであって、決して何らかの限定をする開示と解釈してはならない。
上記および下記の全部の出願、特許および刊行物、および1993年10月４日出願の対応出願DE4333821の全開示は引用により本出願中に組込まれるものである。
次の実施例は内容を更に詳細に説明することを意途するものである；これらの実施例は本発明の内容の制限を意図するものではない。
実施例
次の反応は攪拌機付きの500ml三つ口フラスコ中で行われる。懸濁液はガラスフリット（G2）上で濾過して洗浄する。
実施例1:フラクトゲル（Fractogel）▲Ｒ▼−TSK HW65（Ｓ）を原料としてオキシラン−活性化保持体の調製
100mlの沈降フンクトゲル（Fractogel）▲Ｒ▼−TSK HW65（Ｓ）および66mlの水の懸濁液を3gの硝酸アンモニウムセリウム（IV）（180mlの水と3gのHNO₃（65％）との混合物に溶解）と室温で激しく攪拌して混合する。１分後、44mlのジオキサン中6gの２、３エポキシプロピルメタクリレートの溶液を加える。攪拌を１時間継続する。続いて反応生成物を各々200mlの水で二度洗滌する。
実施例2:ジエチルアミン−置換保持材の合成
実施例１に従ってつくられ濾過によって分離されたゲル100gを100mlの水に懸濁し、100mlのジエチルアミンを加える。続いて混合物を20時間室温で攪拌する。次に反応生成物を各々100mlの水で二度洗滌する。
洗滌した反応生成物を100mlの0.5M硫酸溶液中に懸濁し２時間40℃でゆっくり攪拌する。次に0.25Mのリン酸塩緩衝液（pH7）で中性まで洗滌し更に水で洗滌する。このゲルに0.02％のアジ化ナトリウムを加えて水性懸濁液の形で貯蔵する。
かくして得られるDEA陰イオン交換体はゲル1ml当たり160mgのウシ血清アルブミンの容量をもつ。
実施例3:トリメチルアミン−置換保持材の合成
この保持材はジエチルアミンのかわりにトリメチルアミン水溶液（30％）100mlを用いて実施例２に記載のように調製される。
かくして得られる第四級陰イオン交換体はゲル1ml当たり130mgのウシ血清アルブミンの容量をもつ。
実施例4:スルフォン化保持材の合成
実施例１に従ってつくられ濾過によって分離されたゲル100gを20g/lリン酸ナトリウム緩衝液（pH8）中のNa₂SO₃の溶液（100g/l）中に懸濁し、懸濁液を３時間60℃で攪拌する。次に反応生成物を各々100mlの水で二度洗滌する。
洗浄した反応生成物を100mlの0.5M硫酸溶液に懸濁し懸濁液を２時間40℃でゆっくり攪拌する。次に0.25Mのリン酸塩緩衝液（pH₇）で中性まで洗浄し更に水で洗浄する。このゲルに0.02％のアジ化ナトリウムを加えて水性懸濁液の形で貯蔵する。
使用例A:ウシ血清アルブミンの結合容量の測定（漏出曲線）
実施例２に従ってつくられた保持材をスーパーフォーマンス（SuperFormancer▲Ｒ▼）ガラスカラム（50×10mm）に充填し、応用緩衝液（50mMトリス（TRIS）緩衝液、pH8.3）で平衡させる。この緩衝液中のウシ血清アルブミンの溶液（10mg/ml）を連続的にカラムに流し（流量:0.5ml/分）、溶離図を測光法によって280nmで測定する。容量は漏出曲線より求める。
急勾配の漏出曲線が得られる；容量はゲル1ml当たり158mgのウシ血清アルブミンと計算される（第１図参照）。
使用例B:IMNaOHで処理後ウシ血清アルブミンの結合容量の測定
各々実施例３に従ってつくられた保持材10mlを各々1MNaOH40mlに懸濁し、時々振盪しながら湯浴中で２時間加熱する（40、50および60℃）。続いて試料を50mMトリス（TRIS）緩衝液（pH8.3）に縣濁する。結合容量は使用例Ａに記載のように求める。

使用例C:ヒト血清アルブミン、オバルブミンおよびコナルブミンの分離
実施例２に従ってつくられた保持材をスーパーフォーマンス（SuperFormancer▲Ｒ▼）グラスカラム（50×10mm）に充填し応用緩衝液（20mMトリス（TRIS）緩衝液、pH8.0）で平衡させる。ヒト血清アルブミン、オバルブミンおよびコバルブミン（各々4mg/ml）よりなる混合物をカラムに流す（200μｌ）。溶離は1ml/分の流量で20mMトリス（TRIS）緩衝液（pH8.0）中０から1.0MNaClの勾配をもって行われる（時間100分）。溶離図を測光法によって280nmで測定する。この三種の蛋白質は完全に分離される（第２図参照）。

Claims (6)

1. 下記ステップによって得ることができるイ オン交換クロマトグラフィ−用の分離材：
   ａ）下記式Ｉのモノマ−が水酸基含有の保持基材にグラ フトされているオキシラン含有の活性化保持材を用意す るステップ：
   

   

   式中
   R ¹ 、R ² およびR ³ は互いに独立してＨまたはCH ₃ であり、R ⁴ はＨ、C ₁ −C ₅ アルキルまたはC ₆ −C ₁₂ アリ−ルであり、 そしてｎは１ないし５の整数である
   ｂ）ステップａ）からの該オキシラン含有の活性化保持 材を亜硫酸またはその塩あるいは下記式IVのアミンと反 応させるステップ：
   NR ⁵ R ⁶ R ⁷ IV
   式中
   R ⁵ 、R ⁶ およびR ⁷ は互いに独立してC ₁ −C ₄ アルキルであ り、これらの基の一つまたは二つがＨであることも可能 である
2. イオン交換クロマトグラフィ−によって少なくとも二つの物質の混合物の分離のための、請求項１に記載のステップによって得ることができるイオン交換 クロマトグラフィ−用の分離材の使用。
3. 該二つの物質の混合物が生体高分子の混合 物である、請求項２に記載のイオン交換クロマトグラフ ィ−用の分離材の使用。
4. 下記式Ｉのモノマ−が水酸基含有保持基材にグラフトされているオキシラン含有の活性化保持材
   

   

   式中
   R¹、R²およびR³は互いに独立してＨまたはCH₃であり、R⁴はＨ、C₁−C₅アルキルまたはC₆−C₁₂アリ−ルであり、そしてｎは１ないし５の整数である、
   が亜硫酸またはその塩あるいは下記式IVの第一級、第二級または第三級アミン
   NR⁵R⁶R⁷ IV
   式中
   R⁵、R⁶およびR⁷は互いに独立してC₁−C₄アルキルであり、これらの基の一つまたは二つがＨであることも可能である、
   と反応することを特徴とする、イオン交換クロマトグラフィ−用の分離材を製造する方法。
5. 請求項１に記載のステップによって得るこ とができるイオン交換クロマトグラフィ−用の分離材を用いるイオン交換クロマトグラフィ−によって少なくとも二つの物質の混合物を分離する方法。
6. 該少なくとも二つの物質の混合物が生体高 分子の混合物である、請求項５に記載の混合物の分離方 法。

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