JP3571975B2 - 4位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−3−オール類の製造方法 - Google Patents
4位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−3−オール類の製造方法 Download PDFInfo
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、4位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−3−オール類の製造方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
フラバン−3−オール類は植物中に広く存在し、その中には有用な特性を有する化合物が数多く含まれている。例えば、フラバン−3−オール類の代表的な化合物として知られるカテキン類は、抗酸化作用、抗菌作用、抗ウイルス作用、抗突然変異作用、抗腫瘍性、コレステロール上昇抑制作用、血圧上昇抑制作用等、ヒトの健康維持、増進に対して優れた効果を有することが報告されており、近年カテキン類を有効成分とする健康食品や医薬品の開発が活発に行われている。
【0003】
ところで、ヒトの体内におけるフラバン−3−オール類の動態やヒトに対する様々な生理活性の作用機序に関しては、依然として不明な点が多い。そこで、これらを明らかにするため、これまでにフラバン−3−オール類の水素原子や炭素原子をそれらの同位体で置換した標識化合物を得る試みがなされてきた。
例えば、Biochemical Journal 、105 、p.73〜77 (1967) には、植物(Uncaria Gambir) を用いて14Cを標識した(+)−カテキン(以下、カテキンをCと略記することがある。)を得る方法が記載され、また Biochemical Journal、115 、 p.831〜836 (1969)には、14Cを標識した(+)−Cを用いた体内動態に関する報告がなされている。
【0004】
しかし、フラバン−3−オール骨格を形成している炭素原子を同位体で標識化するには、前駆体からの複雑な合成過程、あるいは植物などの生体を用いた合成などを行うため、多大な労力と費用を要する。
そのため、上記の炭素原子を同位体で標識化する方法よりも比較的容易にフラバン−3−オール類を標識化する方法として、この化合物の水素原子を同位体で標識化する方法が検討されている。
例えば、Carcinogenesis、19(10)、p.1771〜1776 (1998) には、(−)−エピガロカテキンガレート(以下、EGCgと略記することがある。)の2’、6’、2”、6”位の水素のうち、少なくとも1個をトリチウムで標識した(−)−EGCgをマウスに経口投与し、(−)−EGCgの体内分布を調べたことが報告されている。
【0005】
しかし、(−)−EGCgの2’、6’、2”、6”位に結合したトリチウムは、水中において水の水素原子と容易に置換される可能性がある。また、(−)−EGCgの2’、6’、2”、6”位の水素原子は、メチルメルカプタンのような求核性の化合物と置換反応を起こすことが知られており、このような置換反応は生体内でも容易に起こることが予想される。
したがって、2’、6’、2”、6”位の水素原子をトリチウムで標識した(−)−EGCgは、(−)−EGCgの生体内動態を調べる試験には適さない。
【0006】
また、Radioisotopes 、32、 p.225〜230 (1983)には、3位をトリチウムで標識した(+)−Cの製造法が記載されている。しかしながら、この標識化合物の合成方法は、3位の水酸基の酸化還元反応を利用しているために、(−)−EGCgや(−)−エピカテキンガレート(以下、ECgと略記することがある。)のような3位にエステル構造を持つフラバン−3−オール類に適用することができない。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、合成が比較的容易で、かつ標識に用いた同位体が容易に離脱しないなど、フラバン−3−オール類の生体内動態や様々な生理活性の作用機序等を解明するのに適した標識化合物の製造法を提供することである。
【0008】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる標識化合物を得るため、鋭意研究を行った。その結果、フラバン−3−オール類の4位の水素原子を重水素あるいはトリチウムで置換することによって、目的とする化合物が得られることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成した。
【0009】
請求項1記載の本発明は、下記の工程よりなることを特徴とする一般式(1A)で表される4位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−3−オール類の製造方法である。
【化4】
(式中、R1'はアシル基を、R2 は重水素あるいはトリチウムを、R5 とR7 はそれぞれ独立して水素原子あるいは水酸基を示し、ベンゾピラン環の2位と3位の立体配置はそれぞれR配置またはS配置のいずれであってもよい。)
工程1:下記の一般式(1B)で表されるフラバン−3−オール類を塩基触媒の存在下に無水酢酸と反応させて、すべての水酸基をアセチル化する工程
【化5】
(式中、R1'はアシル基を、R5 とR7 はそれぞれ独立して水素原子あるいは水酸基を示し、ベンゾピラン環の2位と3位の立体配置はそれぞれR配置またはS配置のいずれであってもよい。)
工程2:工程1で得たフラバン−3−オール類のアセチル化物の4位の水素の1個をハロゲン化する工程
工程3:工程2で得た生成物に重水素化ホウ素ナトリウムあるいはトリチウム化ホウ素ナトリウムを作用させて、4位のハロゲン原子を重水素又はトリチウムと置換すると同時に、工程1で導入したアセチル基のすべてを脱アセチル化して水酸基に戻す工程
【0010】
請求項2記載の本発明は、下記の工程よりなることを特徴とする一般式(1C)で表される4位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−3−オール類の製造方法である。
【化6】
(式中、R 1'' は水素原子を、R2 は重水素あるいはトリチウムを、R5 とR7 はそれぞれ独立して水素原子あるいは水酸基を示し、ベンゾピラン環の2位と3位の立体配置はそれぞれR配置またはS配置のいずれであってもよい。)
工程1:請求項1記載の一般式(1B)で表されるフラバン−3−オール類を塩基触媒の存在下に無水酢酸と反応させて、すべての水酸基をアセチル化する工程
工程2:工程1で得たフラバン−3−オール類のアセチル化物の4位の水素の1個をハロゲン化する工程
工程3:工程2で得た生成物に重水素化ホウ素ナトリウムあるいはトリチウム化ホウ素ナトリウムを作用させて、4位のハロゲン原子を重水素又はトリチウムと置換すると同時に、工程1で導入したアセチル基のすべてを脱アセチル化して水酸基に戻し、請求項1記載の一般式(1A)で表されるフラバン−3−オール類を得る工程
工程4:工程3で得た一般式(1A)で表されるフラバン−3−オール類又は一般式(1A)においてR1'のアシル基がガロイル基であるフラバン−3−オール類にエステラーゼを作用させて3位のアシル基またはガロイル基を加水分解する工程
【0011】
【発明の実施の形態】
一般に、フラバン−3−オールとは、次式で表される化合物の総称である。
【0012】
【化7】
【0013】
これに対し、本発明においてフラバン−3−オール類とは、前記一般式(1A)において、R2 は水素原子を示し、他は前記と同じものを示す化合物の総称である。
【0014】
本発明は、該フラバン−3−オール類の4位が重水素又はトリチウムで標識された化合物の製造方法を提供するものであり、これらの具体例としては、前記一般式(1A)において式中のR1'がアシル基であり、R2 が重水素又はトリチウムである場合の化合物には、R5 、R7 がそれぞれ水素原子である3−O−アシル(+)及び(−)−アフゼレキン(afzelechin) 、3−O−アシル(+)及び(−)−エピアフゼレキン(epiafzelechin)の標識化合物、R5 、R7 のうち一方が水素原子、他方が水酸基である3−O−アシル(+)及び(−)−C、3−O−アシル(+)及び(−)−エピカテキン(epicatechin)(以下、ECと略記することがある。)の標識化合物、R5 、R7 が共に水酸基である3−O−アシル(+)及び(−)−ガロカテキン(gallocatechin)(以下、GCと略記することがある。)、3−O−アシル(+)及び(−)−エピガロカテキン(epigallocatechin) (以下、EGCと略記することがある。)の標識化合物などを挙げることができる。
【0015】
なお、式中のR1'がアシル基であるときの具体例としては、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、ヘキサノイル基、ヘプタノイル基、オクタノイル基などの直鎖脂肪酸残基や、ベンゾイル基、ガロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、ジニトロベンゾイル基、シクロペンチルオキシカルボニル基などのアロイル基等を挙げることができる。
【0016】
また、式中のアシル基を示すR1'がガロイル基であり、R2 が重水素又はトリチウムである場合の化合物には、R5 、R7 がそれぞれ水素原子である(+)及び(−)−アフゼレキンガレート(afzelechin gallate) 、(+)及び(−)−エピアフゼレキンガレート(epiafzelechin gallate)の標識化合物、R5 、R7 のうち一方が水素原子、他方が水酸基である(+)及び(−)−カテキンガレート(catechin gallate) 、(+)及び(−)−ECgの標識化合物、R5 、R7 が共に水酸基である(+)及び(−)−ガロカテキンガレート(gallocatechin gallate)(以下、GCgと略記することがある。)、(+)及び(−)−EGCgの標識化合物などを挙げることができる。
【0017】
さらに、一般式(1C)において式中のR1"が水素原子であり、R2 が重水素又はトリチウムである場合の化合物には、R5 、R7 がそれぞれ水素原子である(+)及び(−)−アフゼレキン(afzelechin) 、(+)及び(−)−エピアフゼレキン(epiafzelechin)の標識化合物、R5 、R7 のうち一方が水素原子、他方が水酸基である(+)及び(−)−C、(+)及び(−)−ECの標識化合物、R5 、R7 が共に水酸基である(+)及び(−)−GC、(+)及び(−)−EGCの標識化合物を挙げることができる。
【0018】
次に、本発明の4位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−3−オール類の製造方法について説明する。
まず、一般式(1B)で表される化合物(式中、R1'はアシル基を、R5 とR7 はそれぞれ独立して水素原子あるいは水酸基を示し、ベンゾピラン環の2位と3位の立体配置はそれぞれR配置またはS配置のいずれであってもよい。)のすべての水酸基に保護基を導入する。
保護基としては、アセチル基、ベンゾイル基、テトラヒドロピラニル基、メトキシメチル基等を挙げることができる。これらの中では、アセチル基が脱保護のし易さの点で最も好ましい。
【0019】
アセチル基の導入には、無水塩化アルミニウムなどのルイス酸存在下で無水酢酸、酢酸クロリド、塩化アセチルなどの化合物を用いることができるが、その中では、無水酢酸が最も好ましい。アセチル基を導入する際の好ましい反応条件としては、塩基触媒であるピリジンを含む無水酢酸中で、反応温度20〜60℃、好ましくは40〜50℃、より好ましくは45℃、反応時間3〜48時間、好ましくは15〜25時間、より好ましくは20時間である。また、反応中は攪拌を続ける。
このようにして、上記一般式(1B)の化合物のすべての水酸基に保護基を導入した化合物は、必要に応じて溶媒抽出、各種クロマトグラフィー等の公知の方法により、所望の純度に精製することができる。
【0020】
次に、上記保護基を導入した一般式(1B)の化合物の4位の水素原子をハロゲン原子に置換する。このハロゲン化には、塩素化、ヨウ素化、臭素化、フッ素化がある。ハロゲン化の方法としては、例えば塩素化には、塩化トリクロルメタンスルホニル又は塩化スルフリル又は次亜塩素酸t−ブチル中で、過酸化ベンゾイル又はアゾビスイソブチロニトリル(AIBN)又はテトラフェニルホスフィンパラジウムを用いる方法、あるいは四塩化炭素中で黄赤色ガス(Cl2 O) を用いる方法を挙げることができる。
また、ヨウ素化には、四塩化炭素中で次亜塩素酸t−ブチルとヨウ化水銀(HgI2)を用いる方法が、臭素化には、過酸化t−ブチル存在下で無水酢酸中、臭化銅(CuBr2)を用いる方法又はブロモトリクロロメタン中で光反応させる方法がある。
【0021】
本発明においては、ハロゲン化として臭素化を行うことが、物質の安定性の面から特に好ましい。臭素化の具体的な方法を示すと、N−ブロモサクシニイミド(NBS)と触媒量のAIBNまたは過酸化ベンゾイルを非極性の有機溶媒に懸濁して還流し、4位を臭素化する方法がある。このとき使用する非極性有機溶媒としては、四塩化炭素、クロロホルム、ベンゼン、トルエン等が挙げられるが、この中では、四塩化炭素が最も好ましい。NBSの使用量は、前駆体に対してモル比で1.1の割合で用いることが好ましい。還流時間は、30分から6時間、好ましくは1時間である。
【0022】
以上の方法により、前記一般式(1B)のすべての水酸基に保護基が導入され、さらに4位にハロゲン原子が導入された化合物を得ることができる。なお、該化合物は、必要に応じて溶媒抽出、各種クロマトグラフィー等の公知の方法を適用することにより、所望の純度に精製することができる。
【0023】
次に、上記4位にハロゲン原子が導入された一般式(1B)の化合物の該ハロゲン原子を水素の同位体と置換する。その方法としては、重水素化ホウ素ナトリウム、トリチウム化ホウ素ナトリウム、重水素化アルミニウムリチウム、トリチウム化アルミニウムリチウム、シアン化重水素化ホウ素ナトリウム、シアン化トリチウム化ホウ素ナトリウム、重水素化トリエチルホウ素リチウム、トリチウム化トリエチルホウ素リチウム、重水素化トリブチルスズ、トリチウム化トリブチルスズ等で4位のハロゲン原子を水素の同位体と置換する方法、あるいはパラジウム、白金、ロジウム、ルテニウム、イリジウム、ラネーニッケルなどを触媒として重水素ガス又はトリチウムガスで接触還元することにより、4位の臭素原子などのハロゲン原子を水素の同位体と置換する方法がある。
【0024】
このようにして、前記一般式(1B)のすべての水酸基に保護基が導入され、さらに4位に水素の同位体が導入された化合物を得ることができる。なお、該化合物は、前記と同様に、必要に応じて溶媒抽出、各種クロマトグラフィー等の公知の方法を適用して、所望の純度に精製することができる。
【0025】
次いで、該化合物から常法にしたがって保護基をはずし、目的とする一般式(1A)で表される4位を重水素又はトリチウムで標識したフラバン−3−オール類(式中、R1'はアシル基を、R2 は重水素あるいはトリチウムを、R5 とR7 はそれぞれ独立して水素原子あるいは水酸基を示し、ベンゾピラン環の2位と3位の立体配置はそれぞれR配置またはS配置のいずれであってもよい。)を得る。
【0026】
特に、保護基がアセチル基である場合は、重水素化ホウ素ナトリウム、トリチウム化ホウ素ナトリウム、重水素化アルミニウムリチウム又はトリチウム化アルミニウムリチウムを用いることによって、4位の水素同位体標識化と脱保護が同時に完了し、目的とする一般式(1A)(式中、R1'はアシル基を、R2 は重水素あるいはトリチウムを、R5 とR7 はそれぞれ独立して水素原子あるいは水酸基を示し、ベンゾピラン環の2位と3位の立体配置はそれぞれR配置またはS配置のいずれであってもよい。)で表される化合物を得ることができる。
【0027】
上記の方法における反応条件としては、前駆体に対して重水素化ホウ素ナトリウム、トリチウム化ホウ素ナトリウム、重水素化アルミニウムリチウム又はトリチウム化アルミニウムリチウムをモル比で10倍量から1000倍量用い、反応溶媒としてメタノール、2−プロパノール、ピリジン、THF等を用いる。これらの溶媒中では、無水メタノールが最も好ましい。また、反応時間は、30分から24時間の間で適宜調節すればよい。
【0028】
一方、一般式(1A)(式中、R1'はアシル基を、R2 は重水素あるいはトリチウムを、R5 とR7 はそれぞれ独立して水素原子あるいは水酸基を示し、ベンゾピラン環の2位と3位の立体配置はそれぞれR配置またはS配置のいずれであってもよい。)で表される化合物から一般式(1C)(式中、R1"は水素原子を、R2 は重水素あるいはトリチウムを、R5 とR7 はそれぞれ独立して水素原子あるいは水酸基を示し、ベンゾピラン環の2位と3位の立体配置はそれぞれR配置またはS配置のいずれであってもよい。)で表される化合物を得るには、上記一般式(1A)で表される化合物にエステラーゼを作用させて3位のアシル基を加水分解すればよい。例えば、3位のアシル基がアセチル基、プロピオニル基などである場合は、エステラーゼとしてカルボキシエステラーゼを使用し、アシル基がガロイル基である場合は、エステラーゼとしてタンナーゼを使用する。なお、このとき用いる酵素は、市販の製剤を利用することもできる。
【0029】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によって詳しく説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【0030】
実施例1
[4−2H] −(−)−EGCgの製造
(1)(−)−EGCgのアセチル化
ナスフラスコに、無水酢酸33mlとピリジン27mlをスターラーバーと共に入れて混和した。次に、攪拌しながら(−)−EGCg2g(4.37mmol)を加え、オイルバス中で45℃に保温しながら、20時間反応させた。
その後、冷水中に反応液を少しずつ加えることにより、白い沈殿を生じさせ、濾紙フィルターで該沈殿物を回収した。さらに、濾紙フィルター上で、純水を用いて沈殿物を洗浄した後、これを乾燥器で乾固させた。
次いで、乾固した反応物を、n−ヘキサン:酢酸エチル=1:3の混合比の溶媒で充填したシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒 n−ヘキサン:酢酸エチル=1:3)に供することにより、精製物3.4gを得た。
【0031】
次に、質量分析(EI−MS)及び 1H−NMRにより、この精製物が(−)−EGCgオクタアセテートであることを確認した。以下に、質量分析のデータ及び 1H−NMRのデータを示す。
【0032】
質量分析(EI−MS):794(M+ )
1H−NMR(CDCl3)δ:2.2-2.4(24H 、アセチル基×8)、3.0(dd、2H、H-4a、b 、J=4.1Hz)、5.2(s 、1H、H-2)、5.6(m 、1H、H-3)、6.6(d、1H、H-8 、J6、8=2.1Hz)、6.7(d、1H、H-6 、J6、8=2.1Hz)、7.2(s、2H、H-2'、6')、7.6(s、2H、H-2"、6")
【0033】
(2)(−)−EGCgオクタアセテートの4位臭素化
上記の(−)−EGCgオクタアセテート1.2g(1.51mmol)を150mlの脱水四塩化炭素に加熱、溶解した。次に、N−ブロモサクシニイミド290mg(1.63mmol)及びアゾビスイソブチロニトリル3mgを添加し、1時間加熱還流した。
反応液を冷却後、減圧濃縮・乾固した。得られた反応物をn−ヘキサン:酢酸エチル=1:3の混合比の溶媒で充填したシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒 n−ヘキサン:酢酸エチル=1:3)に供して目的物の粗精製を行った後、さらに下記のHPLC条件下で目的物を精製した。
【0034】
HPLC条件1:
カラム:資生堂Capcell Pak 、UG120、20mmφ×250mm
移動相:50% アセトニトリル水(0.01% TFAを含む)
流速:9.9ml/min
カラム温度:35℃
【0035】
次に、質量分析(高性能CI−MS)及び 1H−NMR及び13C−NMRにより、この精製物が4位臭素化−(−)−EGCgオクタアセテートであることを確認した。以下に、質量分析、 1H−NMR及び13C−NMRのデータを示す。
【0036】
質量分析(高性能CI−MS):
計算値 873.0878、 実測値 873.0935(+5.7 mmass)
1H−NMR(CDCl3 )δ:2.24(s、6H、アセチル基×2)、2.26(s、3H、アセチル基) 、2.27(s、3H、アセチル基) 、2.28(s、6H、アセチル基×2)、2.29(s、3H、アセチル基) 、2.37(s、3H、アセチル基) 、5.4(d 、1H、H-4 、J=2.0Hz)、5.6(dd、1H、H-3 、J=0.8 、2.0Hz)、5.9(s 、1H、H-2)、6.7(d 、1H、H-8 、J=1.5Hz)、6.8(d 、1H、H-6 、J=1.5Hz)、7.3(s 、2H、H-2'、6') 、7.6(s 、2H、H-2"、6")
13C−NMR(CDCl3 )δ:14.1(CH3−アセチル基)、20.2(CH3−アセチル基)、20.6(CH3−アセチル基×2)、21.12(CH3 −アセチル基) 、21.14(CH3 −アセチル基) 、22.7(CH3−アセチル基) 、31.6(CH3−アセチル基) 、37.2(C-4) 、72.4(C-3) 、72.7(C-2) 、108.1(C-8)、109.9(C-6)、110.4(C-4a) 、118.8(C-2"、6") 、122.5(C-2'、6') 、126.6(C-1") 、134.1(C-4') 、134.7(C-1') 、139.3(C-4") 、143.4(C-3"、5") 、143.6(C-3'、5') 、150.1(C-7)、151.9(C-8a) 、154.3(C-5)、163.2(C=O)、166.1(C=O −アセチル基) 、166.7(C=O −アセチル基) 、167.4(C=O −アセチル基×2)、167.6(C=O −アセチル基×2)、167.9(C=O −アセチル基) 、168.5(C=O −アセチル基)
【0037】
(3)4位臭素化−(−)−EGCgオクタアセテートの4位重水素置換及び脱保護
上記の4位臭素化−(−)−EGCgオクタアセテート20mg(22.9μmol)を30mlの脱水メタノールに溶解した後、重水素化ホウ素ナトリウム303mgを添加し、室温(24℃)で80分反応後、10%リン酸水15mlと水85mlを添加して反応を停止した。
次に、反応液中のメタノール分を減圧留去した後、水で平衡化したダイアイオンHP−20(三菱化学(株)製)を充填したカラムに反応液を供した。純水でカラムを洗浄した後、アセトニトリルで目的物を溶出し、乾固した。さらに、以下のHPLC条件下で目的物を精製した。
【0038】
HPLC条件2:
カラム:資生堂Capcell Pak 、UG120、20mmφ×250mm
移動相:アセトニトリル:酢酸エチル:0.05%リン酸水=12:0.6:90(体積比)
流速:9.9ml/min
検出:UV280nm
カラム温度:室温(24℃)
【0039】
次いで、上記精製物をHPLCで分析した結果、無標識(−)−EGCgと保持時間及びUVスペクトルが一致し、重水素ラベル化(−)−EGCgが合成されていることが示唆された。
さらに、質量分析(FAB−MS)、 1H−NMR、13C−NMR及び元素分析(重量法)により、上記の精製物は [4-2H] −(−)−EGCg、すなわち以下に示す一般式(2A)(式中、R 1''' はガロイル基を、R2 は重水素を、R5 とR7 は水酸基を示し、ベンゾピラン環の2位、3位の立体配置はそれぞれR配置である。)で表される、4位が重水素で標識された(−)−EGCgであることが確認された。
【化8】
【0040】
HPLC条件3:
カラム:資生堂Capcell Pak 、UG120、4.6mmφ×250mm
移動相:アセトニトリル:酢酸エチル:0.05%リン酸水=12:0.6:90(体積比)
流速:1ml/min
検出:UV200〜400nm
カラム温度:40℃
【0041】
以下に、 1H−NMR、13C−NMR、質量分析及び元素分析のデータを示す。
1H−NMR(CD3 OD)δ:2.8(d 、1H、H-4 、J=2.7Hz)、5.0(s 、1H、H-2)、5.5(dd、1H、H-3 、J=1.5 、2.7Hz)、5.9(s 、2H、H-6 、8)、6.5(s 、2H、H-2'、6') 、6.9(s 、2H、H-2"、6")
13C−NMR(CD3 OD)δ:28.1(C-4) 、69.9(C-3) 、78.7(C-2) 、95.9(C-8) 、96.6(C-6) 、99.4(C-4a)、106.9(C-2"、6") 、110.3(C-2'、6') 、121.5(C-1") 、130.9(C-4') 、133.8(C-1') 、139.9(C-4") 、146.4(C-3"、5") 、146.7(C-3'、5') 、157.3(C-8a or 7)、157.9(C-8a or 7)、158.0(C-5)、167.7(C=O)
【0042】
質量分析(FAB−MS):m/z 460に[M+H]+ (positive)
質量分析(FAB−MS):m/z 458に[M−H]- (negative)
元素分析(重量法): C22H17D1O11・2H2O (MW: 495.396); 計算値 C 53.34% 、H(+D) 4.68% 、実測値 C 53.42% 、H(+D) 4.63%
【0043】
実施例2
[4−3H] −(−)−EGCgの製造
実施例1の(−)−EGCgオクタアセテートの4位臭素化で得られた4位臭素化−(−)−EGCgオクタアセテート10mgを0.7mlの脱水メタノールに溶解し、この溶液を予め17Ciのトリチウム化ホウ素ナトリウム(比放射活性60Ci/mmol)を添加したフラスコに加え、室温で一晩反応させた。 その後、水素化ホウ素ナトリウム8mgを反応液に加え、さらに3時間反応させた。次に、4mlの5%リン酸水を加えて反応を停止した。この反応液は、約半分の容量になるまで減圧濃縮した。これを3mlの酢酸エチルで4回抽出し、これら酢酸エチル層を合わせ、10mlの純水で該酢酸エチル層を3回洗浄した。その結果、酢酸エチル層の放射線量は80mCiであった。
次に、下記のHPLC条件下で目的物の精製を行った。
【0044】
HPLC条件4:
カラム:Prodigy ODS-2
移動相:メタノール:水:酢酸=20:80:0.1
流速:3ml/min
検出:UV(280nm)及びラジオアイソトープ
【0045】
次に、上記精製物を下記条件のHPLCで分析した結果、ラジオアイソトープ検出器で一本のピークが検出され、その保持時間とUV検出器における非標識(−)−EGCgのピークの保持時間が一致し、トリチウムラベル化(−)−EGCgが合成されていることが示唆された。
さらに、質量分析(FAB−MS)及び 3H−NMRにより、上記の精製物は [4-3H] −(−)−EGCg、すなわち一般式(2A)(式中、R 1''' はガロイル基を、R2 はトリチウムを、R5 とR7 は水酸基を示し、ベンゾピラン環の2位、3位の立体配置はそれぞれR配置である。)で表される、4位がトリチウムで標識された(−)−EGCgが合成されていることが確認された。
また、HPLCによる分析結果から、放射化学的純度は99.5%であることが示された。以下に、質量分析(FAB−MS)と 3H−NMRの結果を示す。
【0046】
質量分析(FAB−MS):[M+H]+ イオン m/z 461.3 (positive)
3H−NMR(CH3 OH)δ: 2.97
なお、質量分析(FAB−MS)の結果から計算された該標識化合物の比放射活性は、13Ci/mmolであった。
【0047】
HPLC条件5:
カラム:資生堂Capcell Pak 、UG120、4.6mmφ×250mm
移動相:アセトニトリル:酢酸エチル:0.05%リン酸水=12:0.6:90(体積比)
流速:1ml/min
検出:UV280nm及びラジオアイソトープ
カラム温度:40℃
【0048】
実施例3
[4−2H] −(−)−EGCの製造
(−)−EGCgの4位の水素原子のうち1つが重水素標識された実施例1で得られる[4−2H] −(−)−EGCg(21.8μM)をタンナーゼ(三共(株)製)水溶液1ml(タンナーゼ25mg/1000mlリン酸緩衝液)に溶かし、37℃で2時間反応させた。
続いて、前記実施例1のHPLC条件2により目的物を精製した。
【0049】
この精製物は、前記実施例1のHPLC条件3において無標識(−)−EGCと保持時間及びUVスペクトルが一致することを確認した。
このことから、上記の精製物は、[4−2H] −(−)−EGCgのガロイル基が水酸基に変換した[4−2H] −(−)−EGC、すなわち以下に示す一般式(2B)(式中、R 1'''' は水素原子を、R2 は重水素を、R5 とR7 は水酸基を示し、ベンゾピラン環の2位、3位の立体配置はそれぞれR配置である。)で表される、4位が重水素で標識された(−)−EGCであることが確認された。
【化9】
【0050】
実施例4
[4−3H] −(−)−EGCの製造
(−)−EGCgの4位の水素原子のうち1つがトリチウム標識された実施例2で得られる[4−3H] −(−)−EGCg 10mCiをタンナーゼ(三共(株)製)水溶液1ml(タンナーゼ25mg/1000mlリン酸緩衝液)に溶かし、37℃で2時間反応させた。
続いて、前記実施例2のHPLC条件4により目的物を精製した。
【0051】
次に、この精製物を、前記実施例2のHPLC条件5で分析した。その結果、ラジオアイソトープ検出器で一本のピークが検出され、その保持時間と非標識(−)−EGCのUV検出器におけるピークの保持時間が一致した。
このことから、[4−3H] −(−)−EGCgのガロイル基が水酸基に変換した[4−3H] −(−)−EGC、すなわち一般式(2B)(式中、R 1'''' は水素原子を、R 2 はトリチウムを、R5 とR7 は水酸基を示し、ベンゾピラン環の2位、3位の立体配置はそれぞれR配置である。)で表される、4位がトリチウムで標識された(−)−EGCが合成されていることが確認された。
【0052】
実施例5
[4−2H] −(−)−GCg及び[4−2H] −(−)−GCの製造
前記実施例1で得られた10mgの[4−2H] −(−)−EGCg及び実施例3で得られた10mgの[4−2H] −(−)−EGCをそれぞれ1mlのMacIlvaine buffer (pH5.0)に溶解し、120℃で30分間オートクレーブにかけた。続いて、実施例1のHPLC条件2により目的物を精製した。
【0053】
各精製物は、実施例1のHPLC条件3において、それぞれ無標識(−)−GCg、無標識(−)−GCの保持時間及びUVスペクトルが一致した。
このことから、上記の各精製物は、[4−2H] −(−)−GCg、すなわち一般式(2A)(式中、R 1''' はガロイル基を、R2 は重水素を、R5 とR7 は水酸基を示し、ベンゾピラン環の2位、3位の立体配置はそれぞれS配置、R配置である。)で表される、4位が重水素で標識された(−)−GCg及び[4−2H] −(−)−GC、すなわち一般式(2B)(式中、R 1'''' は水素原子を、R2 は重水素を、R5 とR7 は水酸基を示し、ベンゾピラン環の2位、3位の立体配置はそれぞれS配置、R配置である。)で表される、4位が重水素で標識された(−)−GCが合成されていることが確認された。
【0054】
実施例6
[4−3H] −(−)−GCg及び[4−3H] −(−)−GCの製造
前記実施例2で得られた5mCiの[4−3H] −(−)−EGCg及び実施例4で得られた5mCiの[4−3H] −(−)−EGCをそれぞれ1mlのMacIlvaine buffer (pH5.0)に溶解し、120℃で30分間オートクレーブにかけた。続いて、実施例2のHPLC条件4により目的物を精製した。
【0055】
次に、これらを前記実施例2のHPLC条件5で分析した。その結果、それぞれラジオアイソトープ検出器で一本のピークが検出され、その保持時間は非標識(−)−GCg及び非標識(−)−GCのUV検出器におけるピークの保持時間と一致した。
このことから、これらは、それぞれ[4−3H] −(−)−GCg、すなわち一般式(2A)(式中、R 1''' はガロイル基を、R2 はトリチウムを、R5 とR7 は水酸基を示し、ベンゾピラン環の2位、3位の立体配置はそれぞれS配置、R配置である。)で表される、4位がトリチウムで標識された(−)−GCg及び[4−3H] −(−)−GC、すなわち一般式(2B)(式中、R 1'''' は水素原子を、R2 はトリチウムを、R5 とR7 は水酸基を示し、ベンゾピラン環の2位、3位の立体配置はそれぞれR配置である。)で表される、4位がトリチウムで標識された(−)−GCが合成されていることが確認された。
【0056】
【発明の効果】
本発明により、4位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−3−オール類の製造法が提供される。フラバン−3−オール類の4位に結合した重水素あるいはトリチウムは、生体内での置換反応を受け難い。
したがって、本発明に係る4位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−3−オール類は、生体内におけるフラバン−3−オール類の挙動や、様々な生理活性の作用機序を解明する上で極めて有用である。
しかも、本発明によれば、該化合物を効率的に製造することができるので、フラバン−3−オール類の研究や用途開発等の進展に貢献することができる。
Claims (2)
- 下記の工程よりなることを特徴とする一般式(1A)で表される4位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−3−オール類の製造方法。
工程1:下記の一般式(1B)で表されるフラバン−3−オール類を塩基触媒の存在下に無水酢酸と反応させて、すべての水酸基をアセチル化する工程
工程2:工程1で得たフラバン−3−オール類のアセチル化物の4位の水素の1個をハロゲン化する工程
工程3:工程2で得た生成物に重水素化ホウ素ナトリウムあるいはトリチウム化ホウ素ナトリウムを作用させて、4位のハロゲン原子を重水素又はトリチウムと置換すると同時に、工程1で導入したアセチル基のすべてを脱アセチル化して水酸基に戻す工程 - 下記の工程よりなることを特徴とする一般式(1C)で表される4位を重水素あるいはトリチウムで標識したフラバン−3−オール類の製造方法。
工程1:請求項1記載の一般式(1B)で表されるフラバン−3−オール類を塩基触媒の存在下に無水酢酸と反応させて、すべての水酸基をアセチル化する工程
工程2:工程1で得たフラバン−3−オール類のアセチル化物の4位の水素の1個をハロゲン化する工程
工程3:工程2で得た生成物に重水素化ホウ素ナトリウムあるいはトリチウム化ホウ素ナトリウムを作用させて、4位のハロゲン原子を重水素又はトリチウムと置換すると同時に、工程1で導入したアセチル基のすべてを脱アセチル化して水酸基に戻し、請求項1記載の一般式(1A)で表されるフラバン−3−オール類を得る工程
工程4:工程3で得た一般式(1A)で表されるフラバン−3−オール類又は一般式(1A)においてR1'のアシル基がガロイル基であるフラバン−3−オール類にエステラーゼを作用させて3位のアシル基またはガロイル基を加水分解する工程
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