JP3555950B2 - 乳酸ｌｄｈ遺伝子を発現する酵母菌株，及びその菌株を得るために使用可能なベクター - Google Patents
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Description
この発明は、アルコール／乳酸混合発酵を発現する酵母の構築に関するものである。
砂糖の発酵におけるこれらの両方の主なタイプが、伝統的に農業食品産業に使用されている。すなわち、サツカロミセス属の酵母によって行われるアルコール発酵により、エタノールと二酸化炭素が主に形成され、乳酸発酵（乳酸菌による）により、乳酸が形成される。
アルコール発酵と乳酸発酵は、ピルビン酸まではほとんど一致する代謝経路を持っている。この段階で、この中間体は、二つの最終電子受容体システムにより異なって処理される。アルコール発酵においては、ピルビン酸はアセトアルデヒドに脱カルボキシル化され、アセトアルデヒドはアルコール脱水素酵素によってエタノールに還元される。乳酸発酵においては、ピルビン酸は乳酸脱水素酵素（LDH）によって直接乳酸に還元される。
農業食品に利用されている微生物は、これら２つの代謝経路の一方を持っており、これらの２つの発酵の一方をもっぱら利用している。
発明者らは、アルコール発酵と乳酸発酵の両方の発酵を行なうことができる酵母菌株を構築することに着手し、これらの２つのタイプを仲介する結果となる発酵を得た。
発明者らの行った構築の原理は、GRAS乳酸菌〔カセイ菌（Lactobacillus casei）〕の乳酸脱水素酵素遺伝子をクローニングし、カーボンフラックスの終わりで野生型システムと競合する電子受容体系を確立するように、サッカロミセス属中でこの遺伝子を発現させることからなる。
そのような構築は、従来技術においては提案されたことがなかった。その理由は、それらを機能化する方法において、３つの主要な障害；すなわち、
−サッカロミセス属中でのバクテリア遺伝子の無又は不充分な発現；
−導入された受容体系における非競合的な機能化；
−その系の機能化と、例えば乳酸の膜輸送の問題から生じるサッカロミセス属の生存性や発酵活性との間の不適合性；
が存在するということが一般に知られていたからである。
驚くべきことに、発明者らは、乳酸へのカーボンフラックスの大部分の転換を行なう生育可能でかつ機能的な系を得ることに成功した。
この発明の主題は、酵母中で乳酸菌LDHをコードする遺伝子の発現を調節する配列の制御下で、その遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む酵母菌株である。
“遺伝子の発現を調節する配列”とは、酵母中で活性を示すプロモーター及びターミネータータイプの配列を意味するものと理解すべきである。異なる遺伝子のプロモーターやターミネーターが、異なる組み合わせで用いられてもよい。アルコール脱水素酵素Ｉ（ADH I）、ホスホグリセラートキナーゼ（PGK）及びグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（GAPDH）遺伝子のそれ自体公知のプロモーターやターミネーターが、その例として挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、この発明は、前記調節配列とLDH遺伝子とを組み合わせることによって得られる発現カセットからなる。このカセットは、プラスミドによって保有されてもよく、又は宿主酵母の染色体DNAに組み込まれてもよい。
この発明の好ましい具体例によれば、前記酵母はサッカロミセス属に属する。
この発明の別の好ましい具体例によれば、発現される遺伝子は、カセイ菌（Lactobacillus casei）LDHの遺伝子である。
酵母中で発現される組込み遺伝子のために、GTG開始コドンは、予めATGに修飾される。
この発明は、上記で定義された発現カセットからなる発現ベクターも包含している。この発現ベクターは、この発明による形質転換酵母菌株を得るために用いることができる。
これらのベクターは、発現カセットを構築する調節要素の性質及び強度に基づいて選択される。上記のように定義されたプロモーターやターミネーター、あるいは酵母中で遺伝子の発現を制御することができる他のいずれかの配列を選択することができる。
ベクターを選択する別の基準は、複製起点の選択によって条件付けられるベクターのコピー数にある。
制限配列を備えたLDH遺伝子を酵母のゲノム内に組込むことを選択することができる。この場合には、例えば、酵母中における複製起点を持たない組込みベクター（YIp）を選択することができる。また、他の技術、例えば共形質転換を用いてこの遺伝子を組込むことも可能である。
LDH遺伝子は、プラスミドによって保有されるのが好ましいが、以下のベクターの中から選択することが可能である。
・酵母中における複製起点として内因性２μプラスミドの一部分を持つ高コピー数の複製ベクター（YEp）；
・複製起点として染色体ARS配列を持つ高コピー数の複製ベクター（YRp）；
・複製起点として末端小粒（テロメア）配列を持つ線状の高コピー数の複製ベクター（YLp）；
・染色体ARS配列及び動原体配列を持つ低コピー数の複製ベクター（YCp）。
また、この発明によるベクターは、URA3、LEU2、HIS3、TRP1、ADE等の栄養要求性突然変異体（auxotrophy）用のマーカー、及び／又は抗生物質（G418、ハイグロマイシンＢ、クロラムフェニコール、フレオマイシン）、殺草剤〔スルホメチユロンメチル（sulfometuronmethyl）〕、銅等に耐性用のマーカーのような、酵母において選択可能なマーカーを含むのが好ましい。
また、この発明によるベクターとしては、細菌の複製起点と細菌において選択可能なマーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）とを持つシャトルベクターが有利である。
乳酸菌のLDHをコードする遺伝子を保有するこの発明によるプラスミドは、異なる形質転換技術によって、あらゆる酵母菌株に導入することができる。
最も一般的な形質転換技術としては、プロトプラス法、細胞にリチウム塩透過性を与える技術及びエレクトロポレーションを挙げることができる。
LDHをコードする遺伝子の発現レベルは、調節可能である。その結果、特に酵母に導入されたLDH遺伝子のコピー数及び／又はそれに結合した調節要素の強度を変化させることによって、エタノールと乳酸との割合を調節することができる。
様々な程度でLDHを発現するこの発明による異なる菌株の構築は、所望のエタノール／乳酸の割合を決定する所望の用途に応じて行うことができる。
いずれの場合においても、この構築法は、以下の工程からなる；すなわち、
−LDH遺伝子と、所望のエタノール／乳酸の割合に応じて変化しうる強度を持つ調節要素とからなる発現カセットの構築；
−（所望エタノール／乳酸の割合に応じて、）単一又は多コピーのいずれかでのこのカセットの酵母内への導入。
この発明による酵母菌株は、農業食品において多くの応用がある。アルコール発酵が、生物学的酸性化（例えば、不十分な酸性リンゴからのりんご酒の生産、いわゆる酸性パン粉の生産、ケフィールタイプのミルク製品等）、あるいはそのエタノール産出の低下によって達せられる限りは、酵母菌株を使用することができる。
このことは、ぶどう酒醸造学の分野において；即ち、
・特に熱帯地域における増大する量のワインの酸度不足を補うために；
・かなり広範な脱酸性化になっても、酸性化を補うことにより、マロー乳酸発酵（生産物の生物学的安定化）の利点からの利益を得ることが可能であるために；
・低エタノール含有量のワインや飲料を生産するために；
特に利点がある。
加えて、アルコール発酵からの過度の逸脱を考慮して、この発明によるサッカロミセス属の形質転換酵母により、乳酸発酵を行う細菌を置換することが可能となるであろう。これらの酵母は、以下の利点を有するであろう。すなわし、ファージに対する無反応、栄養源の貧弱な培地での生育、酸性培地での生育低温度での生育である。それらはまた、乳酸の工業生産にも利用することが可能であろう。
この発明は、この発明による形質転換酵母菌株の構築の実施例、並びにその発酵活性の例証に関する以下の追加記載から、さらによく理解されるであろう。
しかしながら、これらの実施は、単にこの発明の主題を例証するものとしてのみ与えられており、この発明は、決してこれらに限定されるものではないことはいうまでもない。
実施例１−カセイ菌（L.casei）Ｌ−LDH遺伝子のクローニング
A.−大腸菌におけるカセイ菌DNAライブラリーの構築
ａ）カセイ菌DNAの抽出
ラクトバチルス・カセイ菌株ATCC393を使用した。それをMRS培地で培養した。この培地の組成は、以下のようである。ポリペプトン10g/l、酵母抽出物5g/l、肉抽出物10g/l、グルコース2g/l、リン酸水素二カリウム2g/l、酢酸ナトリウム5g/l、クエン酸アンモニウム2g/l、硫酸マグネシウム0.2g/l、硫酸マンガン0.05g/l、ツイーン80 1ml/l。
15mlのMRS培地にカセイ菌を植え付け、一晩37℃で培養する。同培地の500mlに、前培養して得られた培養物の15mlを接種し、3.9の吸光度（OD）（550nm）になるまでゆっくり撹拌しながら37℃で培養する。
DNAを、LERCHら〔Yeast,7:253−263,（1989）〕に従って抽出し、臭化エチジウムの存在下で、塩化セシウム密度勾配で精製する〔MANIATISら,Molecular cloning:A laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）〕。
臭化エチジウムを、イソブタノール（２回）とイソアミルアルコール（２回）で抽出する。２倍容の水で希釈した後、DNAを６倍容のエタノールで沈殿させる。
沈殿物を、ロッドを用いて回収し、2mlのTE（10mMトリス,1mM EDTA,pH7.5）に溶解する。
溶液中のDNAの濃度を、260nmでODを測定することによって決定する。
ｂ）カセイ菌DNAの消化
60μｇのカセイ菌DNAを、37℃で40分間８単位のSau3A酵素で部分的に消化する。
混合物を、フェノール、フェノール／クロロホルム及びクロロホルムで抽出し、アルコールで沈殿させる。
遠心分離後、DNAを300μｌのTEに溶解し、そのフラグメントを25000rpmで15時間のショ糖密度勾配で分離する。
0.5mlのフラクションを採取し、0.8％アガロースゲルで分析する。２〜4kbのフラグメントを含むフラクションを、４時間TEに対して透析する。
ｃ）ベクターpUC18への消化DNAの結合
次いで、消化したDNAを、以下の条件下でライブラリーの生産のために脱リン酸化ベクターpUC18BamHI（アプリジーン）に結合する。
pUC18Bdp ５μｌ（250ng）
消化されたDNA 10μｌ（１μｇ）
アプリジーンTpリゲーション５× 10μｌ
アプリジーンリガーゼ ５μｌ
水 20μｌ
この混合物を、14℃で18時間培養する。
ｄ）大腸菌の形質転換
次の遺伝子型:F-;endA1;hsdR17（K-,mK-）;supE44;Thi−1;λ−;recA1;gyrA96;relA1の大腸菌株DH5α（GIBCO BRL）を使用した。
受容能力を有する細菌の作製に用いられたプロトコールと形質転換のために用いられたプロトコールは、HANAHAN〔DNA cloning,vol.1 DM Glover（ed）IRL Press,109−135（1985）〕に記載されている。
結合混合物を、受容能力を有するDH5α細菌を形質転換するために用いた。得られたコロニーを、LBディッシュ（バクトトリプトン）10g/l,酵母抽出物5g/l,塩化ナトリウム10g/l）とアンピシリン（50μg/ml）上で選択した。92％のクローンが、予想されたサイズ（２−4kb）の挿入断片を有していた。
B.−PCRによるLDH遺伝子フラグメントの増幅
HENSELらによって発表〔Eur.J.Biochem134:503−511,（1983）〕されたラクトバチス・カセイのＬ−LDHのタンパク質配列に基づいて、オリゴヌクレオチドの２つの混合物を合成した。プライマー4122は、アミノ酸５−10:Asp−Lys−Asp−His−Gln−Lysに由来し、プライマー5036は、アミノ酸262−267:Tyr−Met−Asp−Gly−Gln−Tyrに由来するものである（Kim et al.1991）
4122:
5'−GA（C,T）−AA（G,A）−GA（C,T）−CA（C,T）−CA（G,A）−Ａ−（Ａ）−3'
5036:
5'−TA（C,T）TG−（ACTG）CC−（G,A）TC−CAT−（G,A）TA−3'
２つのプライマーを、この菌株から単離された全DNAからのカセイ菌Ｌ−LDH遺伝子のフラグメントを増幅するのに使用した。増幅したフラグメントの大きさは、785塩基対である。
増幅は、以下のように行った。
プライマー4122 ５μｌ（100pmol）
プライマー5036 7.2μｌ（100pmol）
Taq緩衝液10× 10μｌ
Taq（BECKMAN）5u/μｌ 0.5μｌ
dNTP（2mM） 10μｌ
カセイ菌DNA（10ng/μｌ） 10μｌ
水 57μｌ
Taq緩衝液１×:100mMトリス塩酸塩,pH8.3,500mM塩化カリウム,15mM 塩化マグネシウム
増幅状態:TECHNE PHC2増幅器で、30サイクル、94℃で１分間、55℃で１分間、72℃で２分間
増幅産物を、1.5％アガロースゲルで分析し、対応するバンド（785dp）を除去する。DNAを、ミリポアウルトラフリーカラムを用いて溶出し、フェノールを用いて通常の抽出法によって精製し、アルコールを用いて沈殿させ、次いで遠心分離し、TE緩衝液に溶解する。
C.−ライブラリーのスクリーニング
ａ）785−dpフラグメントのラベル化
増幅したフラグメントを、“高速ハイブリッド形成システム−マルチプライム”キット（AMERSHAM）を用いてマルチプライム技術により、32Pでラベル化する。DNAを、３分間100℃で変性させ、次いで氷中で急速に冷却する。ラベル化は、以下の条件下で行った。
785塩基DNA 12μｌ（100ng）
ラベル化緩衝液 10μｌ
ヘキサヌクレオチド ５μｌ
［32P］dCTP（3000Ci/mmol） ４μｌ
クレノウ（Klenow） ２μｌ
水 17μｌ
37℃で２時間
ラベル化されたプローブを、ネンソルブ（NENSORB）カラム（NEN）を通して濾過することによってヌクレオチドから分離する。溶出されたフラクションの放射活性を、シンチレーションカウンターで計数することによって測定する。
ｂ）フィルターの準備
ライブラリーを構成する結合混合物のアリコートを用いてDH5α細菌を形質転換した後、4000Amprクローンが、LB＋アンピシリンディッシュ上で得られた。それは、ゲノムのおよそ３倍の大きさである。
細菌コロニーをナイロン膜（HYBOND N,AMERSHAM）上に移し、DNAを、GRUNSTEIN及びHOGNESSの技術〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72:3961−3965（1975）〕に従って変性させる。次いで、その膜を、80℃で２時間培養する。
ｃ）ハイブリッド形成
供給業者（AMERSHAM）によって記載されたプロトコールに従って、“高速ハイブリッド形成システム−マルチプライム”キットを用いてハイブリッド化を行う。膜を、65℃で15分間ハイブリッド形成緩衝液中で、前ハイブリッド化する。変性したプローブを、106cpm/mlを基礎として緩衝液に加える。
65℃で一晩、ハイブリッド化を行う。
ハイブリッド化後、膜を洗浄する：
−２×SSPE,0.1％ SDSを用いて65℃で10分間２回
−１×SSPE,0.1％ SDSを用いて65℃で15分間１回
−0.7×SSPE,0.1％ SDSを用いて65℃で15分間２回
（20×SSPE:3.6M NaCl;0.2M NaH2PO4;0.02M EDTA）
膜を、Ｘ線フィルム（FUJI）を用いて、−80℃で12時間オートラジオグラフィーに付す。
ハイブリッド化の終わりに、pG4と称す陽性クローンが得られた。このプラスミドを、ミニプレプ（miniprep）（MANIATIS,1989,上記参照）によってこのクローンから抽出し、制限酵素で消化することによって分析した。プラスミドpG4は、カセイ菌DNAの3.5−Kbの挿入断片を含有する。
大腸菌中での乳酸の産生を、クローンpG4に関して測定した。37℃で１％のグルコースとアンピシリン（50mg/ml）を含む10mlのLB中でpG4を増殖させた後、乳酸の産生を、Ｌ−ラクテートキット（BOEHRINGER）を用いて酵素アッセイによって例証した。
これによって、カセイ菌Ｌ−LDH遺伝子の全てが、単離された3.5−Kbのフラグメント上に存在することが、確認される。
実施例２−突然変異誘発による遺伝子の修飾
カセイ菌LDH遺伝子の配列は、近年発表されている〔KIM et al.,Appl.Environ.Microbiol.56:2413−2417（1991）〕。
発表された配列から推定された制限地図が、プラスミドpG4の3.5−Kb挿入断片の中心フラグメントの配列と一致することが、証明された。
カセイ菌LDH遺伝子の翻訳開始コドンは、GTGであり、これは、開始コドンとしてサッカロミセス・セレビシエに用いられないコドンであるので、GTGを、突然変異誘発によって、ATGに置換した。
詳細な突然変異誘発法は、図１に要約されている。
1.突然変異を誘発させたフラグメントの獲得
プラスミドpG4に含まれる3.5−Kb挿入断片は、LDH遺伝子のコーディング領域とともに、図１に示されている（GTG開始コドン、TAA停止コドン）。
GTGのATGでの置換を、プラスミドpG4からの遺伝子の5'フラグメントのPCR増幅により、二つのプライマーを用いて行った。二つのプライマーの位置と配列は、図１に示されている：すなわち、
−プライマー１は、5'末端でのコーディング領域に相補的な13の塩基と９つの異なる塩基からなる。その１つは、GTGをATGで置換するためにＡであり、他の８つは、開始コドンの5'側にXho I部位を作ることを可能にする；
−プライマー２は、その遺伝子に存在するBgl II部位からなるコーディング領域の内部の領域に相補的な22の塩基からなる。
これらの２つのプライマーは、335−塩基フラグメントの増幅を可能にする。
増幅は、以下の手法によって行われた。
手法：
プライマー１ ４μｌ（20pmol）
プライマー２ ４μｌ（20pmol）
Taq緩衝液 10× 10μｌ
Taq 5u/μｌ 0.5μｌ
dNTP（2mM） 10μｌ
pG4a 10μｌ 100ng
水 70.5μｌ
増幅条件:30サイクル、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で１分
増幅フラグメントの大きさを、1.5％アガロースゲル上でアリコートを分析することによって、証明した（335塩基）。
増幅産物の1.5μｌを、Xho I/Bgl IIで消化し、消化したフラグメントを、下記のようにしてプラスミドpBSLDH3にサブクローン化した（2.b）。
2.遺伝子の再構築
この構築における異なる工程を、図２に図式で示す。
ａ）プラスミドpBSLDH3の構築
TAA停止コドンの下流部位及びプラスミドpG4のポリリンカーにおける部位によって結合されたXba Iフラグメント（2.2Kb）を、pG4のXba I消化、NIUSIEVE低融解温度アガロースゲル（FMC）上でのフラグメントの分離、及び2.2Kbのバンドの切り離しによって単離した。
このフラグメントを、200ngのXba Iフラグメント（65℃に加熱されたNIUSIEVEにおける）を50ngのXba Iで消化しかつ脱リン酸化したプラスミドpBSに結合することによって、プラスミドpBS（pBluescript II SK＋,STRATAGENE）にサブクローン化した。得られた組換えプラスミドを、pPSLDH3と命名する。
ｂ）修飾フラグメントの導入
プラスミドpBSLDH3を、Bal II（コーディング領域において）及びXho I（ポリリンカー部位）で消化し、次いで脱リン酸化した。
PCRによって増幅され、かつBal II/Xho Iで消化された（上記１で記載のように）フラグメントの100ngを、処理したpBSLDH3の50ngに結合した。
得られたプラスミドpBSLDH＊１は、ATGの隣接した上流のXho I部位及びTAA停止コドンの隣接した下流のXba I部位によって結合された、開始コドンとしてのATGコドンを有する再構築されたLDH遺伝子のコーディング領域を持っている。
このプラスミドのXho I/Bal IIフラグメントを、一方ではGTGのATGでの置換を、他方では増幅間でのTaqポリメラーゼによるミスが全くなかったことを証明するために、配列した。
実施例３−修飾された遺伝子の発現ベクターへの導入
突然変異を誘発されたカセイ菌遺伝子の酵母中での発現を得るために、つくられたATGコドンを含むコーディング領域を酵母／大腸菌シャトルベクター中に酵母調節要素の制御下で配置した。
１）LDH遺伝子の多コピープラスミドpVT100−Ｕ（図３）への導入
使用された発現プラスミドは、２μ起点、URA3マーカー、及び強ADH調節要素（プロモーター及びターミネーター）、ならびに細菌要素（起点及びアンピシリン耐性遺伝子）を含むプラスミドpVT100−Ｕである。
このプラスミドは、VERNETらによって報告されている〔Gene 52:225−233,（1987）〕。
プラスミドpBSLDH＊１のXho I−Xba Iフラグメントを、Xho I−Xba I消化及びNIUSIEVE低融解温度アガロースゲル上でのフラグメントの分離によって、単離した。その遺伝子に対応するXho I−Xba Iフラグメント（1Kb）を、切断した。
このフラグメントの100ngを、ベクターpVT−100−Ｕの50ngに結合した。ベクターpVT−100−Ｕは、Xba I及びXho I（ポリリンカーに存在する部位）で消化され、脱リン酸化されている。
組換えベクターpVT−100−ULDH＊が得られた。
２）LDH遺伝子の単一コピープラスミドYCp50（図４）への導入
単一コピー動原体プラスミドYCp50は、ROSEによって記載されている〔S.L.BERGER and A.R.KIMMEL（Ed）,Academic Press,481−504（1987）〕。
このベクターは、ARS配列と動原体配列とURA3マーカー、並びに細菌要素（複製起点及びアンピシリン耐性）を有する。
pADH−LDH＊−tADH発現カセットを含むpVT 100−Ｕ−LDH＊のSph Iフラグメントを、Sph I消化及びNIUSIEVE低融解温度アガロースゲル上でのフラグメントの分離によって、単離した。発現カセットを含むSph Iフラグメント（1.7Kb）を、切断した。このフラグメントの100ngを、ベクターYCp50の50ngに結合した。ベクターYCp50は、Sph Iで消化され、脱リン酸化されている。組換えベクターYCp50−LDH＊が得られた。
実施例４−酵母の形質転換
サッカロミセス・セレビシエ酵母菌株SCV5Mを、一方ではプラスミドpVT100−Ｕ−LDH＊を用いて、他方ではプラスミドYCp50−LDH＊を用いて形質転換した。
菌株SCV5Mは、番号Ｉ−1222として、パスツール研究所によるCollection Nationale de Cultures de Microorganismes〔National Collection of Microorganism Cultures〕に、1992年６月18日に寄託された。この生物は、ぶどう酒醸造学用の菌株に由来する半数体実験株で、ウラシル（ura3）に対する栄養要求性突然変異体である。MAT aである。この菌株は、工業用菌株に匹敵するぶどう酒醸造条件下で発酵を行うことができる。
使用した形質転換法は、GIETZ及びSCHIESTLによって記載されたリチウムアセテート法である〔Yeast,7:253−263,（1991）〕。
使用した選択培地は、YNBである（酵母窒素塩基7g/l DIFCO,グルコース 20g/l）。ウラシルの欠如により、プラスミドの保存を可能にする選択圧となる。
実施例５−発酵テスト
１）多コピープラスミドpVT100−Ｕ−LDH＊
発酵テストを以下の菌株を用いて行った。
−V5/pVT100−U:対照として、挿入断片なしにプラスミドpVT100−Ｕを用いて形質転換された菌株SCV5M
−V5/pVT100−Ｕ−LDH＊：修飾されたLDH遺伝子を含む多コピープラスミドpVT100−Ｕを用いて形質転換された菌株SCV5M。いくつかの形質転換細胞を別々にテストした。
発酵を、YNB（酵母窒素塩基7g/l DIFCO）最小合成培地（50g/lのグルコースを含有し、6.3g/lのクエン酸と水酸化ナトリウムでpH51に緩衝化されている）上で行った。
菌株V5/pVT100−Ｕ及びV5/pVT100−Ｕ−LDH＊の前培養を、28℃で10mlの培地中で20時間行った。
培養は、前培養物からの７×105細胞/mlを接種することによって、50ml中で行った。細胞の数を、コールターカウンターモデルZBI型装置で測定した。
培養物を、時々棒磁石で撹拌しながら、28℃でインキュベートした。
初期pHを測定した。V5/pVT100−Ｕでは５、及びV5/pVT100−Ｕ−LDH＊では4.9であった。
サンプル1mlを、次の測定を行うために、定間隔で採取した。
−細胞測定器（コールターカウンター）による細胞の数；
−培地のpH;
−酵素アッセイによる、培地のグルコース、エタノール、乳酸の濃度（BOEHRINGER assay kits）；
乳酸脱水素酵素の比活性：この活性は、以下のようにして得られた粗細胞抽出物で測定された。:108細胞を採取し、6000rpmで５分間遠心分離し、5mlの80mM酢酸塩緩衝液pH5.5（0.2M酢酸塩緩衝液：酢酸ナトリウム2.73g/水100ml、酢酸でpH5.5に調製）で洗浄した。細胞ペレットを同じ緩衝液0.5mlに溶解する。細胞を、低温状態で、１分間に４回、ガラスビーズを用いてヴォルテックスミキサーで粉砕する。粉砕品を、15000rpmで５分間遠心分離し、得られた上清を粗抽出物として用いる。LDHアッセイを、HENSELらの記載に従って行う〔Arch.Microbiol.112,81−93（1977）〕。LDH活性は、抽出物におけるタンパクのU/mgで示される。
行われたアッセイの結果は、以下の通りである。
−エタノール及び乳酸の産生：
V5/pVT100−Ｕ−LDH＊の乳酸産生は、処理した形質転換細胞によって６〜25g/l乳酸の間で変動し、ほとんどの場合10g/lのオーダーの産生量である。以下で詳細にされ、かつ図５に示されている実験結果は、約10g/lの乳酸を産生する形質転換細胞V5/pVT100−Ｕ−LDH＊で得られたものである。対照菌株は、エタノールを産生し、検出可能な乳酸産生を示さないのに対し（図5D）、形質転換細胞は、同時に乳酸とエタノールを産生し（図5C）、これは、培地に存在するグルコースの25〜30％の乳酸への分解に相当する。
さらに、乳酸とエタノールの同時産生は、指数的成長相の間及び定常期の初期にみられる。定常期の間は、乳酸産出は停止する。
−細胞増殖：
形質転換細胞V5/pVT100−Ｕ−LDH＊の増殖（図5A）は、対照菌株（図5B）の増殖に匹敵する。しかしながら、増殖の停止（定常期の開始）は、対照より形質転換された菌株の方が早く、最終の細胞数は、対照菌株で観察されるものより約20％低い。
−培地のpH測定：
増殖の停止は、培地の実質的な酸性化によって説明することができる。pHのより大幅な低下が、対照菌株の場合（図5B）より形質転換された菌株の場合（図5A）において、効果的に観察される。この実質的な酸性化は、観察された乳酸産生と密接に相関している。
−LDH活性のアッセイ：
形質転換された菌株の粗抽出物で得られた結果（図5E）は、LDH比活性が、細胞が定常期に入るとき最大になり、次いで定常期の間に減少することを示している。
−他の培地：
さらに、YNB培地で得られた結果は、グレープジュース（185g/lグルコース）とアップルジュース（93g/lグルコース）に関して確認された。
従って、乳酸／エタノール混合産生の獲得は、種々のグルコース濃度を含む異なる培地（合成、最小又は完全、天然）で、かつ開始pHに関係なく達せられうる。使用できる温度範囲は、酵母の成育を許容しうる温度（約14〜35℃）である。
２）単一コピープラスミドYCp50−LDH＊
発酵テストを、pH5.1に緩衝化された50g/lのグルコースを含むYNB培地上で、菌株V5/YCp50−LDH＊を用いて行った。
1g/lオーダーの乳酸産生が、この菌株に関して得られた。
上記のようにして測定されたLDH比活性は、多コピー形質転換細胞で観察されたものに類似する変化を示す。これに対して、指数的成長相の末期／定常期の初期に観察された最大活性は、1.5U/mgタンパクのオーダーであり、これは、多コピー形質転換細胞で得られた最大活性（10U/mgタンパク）の７分の１に等しい。
従って、単一コピー形質転換細胞による乳酸産生は、LDH比活性のレベルと相関する。
このことは、乳酸産生が、特に酵母に導入されるLDH遺伝子の数に応じて調節されることを示している。
上記から明らかなように、この発明は、さらに明白に記載された実施と応用に関する実施例及び方法になんら制限されず、逆に、当該分野において、専門家に生じうるあらゆる変形を、この発明の範囲を逸脱することなく、包含するものである。
砂糖の発酵におけるこれらの両方の主なタイプが、伝統的に農業食品産業に使用されている。すなわち、サツカロミセス属の酵母によって行われるアルコール発酵により、エタノールと二酸化炭素が主に形成され、乳酸発酵（乳酸菌による）により、乳酸が形成される。
アルコール発酵と乳酸発酵は、ピルビン酸まではほとんど一致する代謝経路を持っている。この段階で、この中間体は、二つの最終電子受容体システムにより異なって処理される。アルコール発酵においては、ピルビン酸はアセトアルデヒドに脱カルボキシル化され、アセトアルデヒドはアルコール脱水素酵素によってエタノールに還元される。乳酸発酵においては、ピルビン酸は乳酸脱水素酵素（LDH）によって直接乳酸に還元される。
農業食品に利用されている微生物は、これら２つの代謝経路の一方を持っており、これらの２つの発酵の一方をもっぱら利用している。
発明者らは、アルコール発酵と乳酸発酵の両方の発酵を行なうことができる酵母菌株を構築することに着手し、これらの２つのタイプを仲介する結果となる発酵を得た。
発明者らの行った構築の原理は、GRAS乳酸菌〔カセイ菌（Lactobacillus casei）〕の乳酸脱水素酵素遺伝子をクローニングし、カーボンフラックスの終わりで野生型システムと競合する電子受容体系を確立するように、サッカロミセス属中でこの遺伝子を発現させることからなる。
そのような構築は、従来技術においては提案されたことがなかった。その理由は、それらを機能化する方法において、３つの主要な障害；すなわち、
−サッカロミセス属中でのバクテリア遺伝子の無又は不充分な発現；
−導入された受容体系における非競合的な機能化；
−その系の機能化と、例えば乳酸の膜輸送の問題から生じるサッカロミセス属の生存性や発酵活性との間の不適合性；
が存在するということが一般に知られていたからである。
驚くべきことに、発明者らは、乳酸へのカーボンフラックスの大部分の転換を行なう生育可能でかつ機能的な系を得ることに成功した。
この発明の主題は、酵母中で乳酸菌LDHをコードする遺伝子の発現を調節する配列の制御下で、その遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む酵母菌株である。
“遺伝子の発現を調節する配列”とは、酵母中で活性を示すプロモーター及びターミネータータイプの配列を意味するものと理解すべきである。異なる遺伝子のプロモーターやターミネーターが、異なる組み合わせで用いられてもよい。アルコール脱水素酵素Ｉ（ADH I）、ホスホグリセラートキナーゼ（PGK）及びグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（GAPDH）遺伝子のそれ自体公知のプロモーターやターミネーターが、その例として挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、この発明は、前記調節配列とLDH遺伝子とを組み合わせることによって得られる発現カセットからなる。このカセットは、プラスミドによって保有されてもよく、又は宿主酵母の染色体DNAに組み込まれてもよい。
この発明の好ましい具体例によれば、前記酵母はサッカロミセス属に属する。
この発明の別の好ましい具体例によれば、発現される遺伝子は、カセイ菌（Lactobacillus casei）LDHの遺伝子である。
酵母中で発現される組込み遺伝子のために、GTG開始コドンは、予めATGに修飾される。
この発明は、上記で定義された発現カセットからなる発現ベクターも包含している。この発現ベクターは、この発明による形質転換酵母菌株を得るために用いることができる。
これらのベクターは、発現カセットを構築する調節要素の性質及び強度に基づいて選択される。上記のように定義されたプロモーターやターミネーター、あるいは酵母中で遺伝子の発現を制御することができる他のいずれかの配列を選択することができる。
ベクターを選択する別の基準は、複製起点の選択によって条件付けられるベクターのコピー数にある。
制限配列を備えたLDH遺伝子を酵母のゲノム内に組込むことを選択することができる。この場合には、例えば、酵母中における複製起点を持たない組込みベクター（YIp）を選択することができる。また、他の技術、例えば共形質転換を用いてこの遺伝子を組込むことも可能である。
LDH遺伝子は、プラスミドによって保有されるのが好ましいが、以下のベクターの中から選択することが可能である。
・酵母中における複製起点として内因性２μプラスミドの一部分を持つ高コピー数の複製ベクター（YEp）；
・複製起点として染色体ARS配列を持つ高コピー数の複製ベクター（YRp）；
・複製起点として末端小粒（テロメア）配列を持つ線状の高コピー数の複製ベクター（YLp）；
・染色体ARS配列及び動原体配列を持つ低コピー数の複製ベクター（YCp）。
また、この発明によるベクターは、URA3、LEU2、HIS3、TRP1、ADE等の栄養要求性突然変異体（auxotrophy）用のマーカー、及び／又は抗生物質（G418、ハイグロマイシンＢ、クロラムフェニコール、フレオマイシン）、殺草剤〔スルホメチユロンメチル（sulfometuronmethyl）〕、銅等に耐性用のマーカーのような、酵母において選択可能なマーカーを含むのが好ましい。
また、この発明によるベクターとしては、細菌の複製起点と細菌において選択可能なマーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）とを持つシャトルベクターが有利である。
乳酸菌のLDHをコードする遺伝子を保有するこの発明によるプラスミドは、異なる形質転換技術によって、あらゆる酵母菌株に導入することができる。
最も一般的な形質転換技術としては、プロトプラス法、細胞にリチウム塩透過性を与える技術及びエレクトロポレーションを挙げることができる。
LDHをコードする遺伝子の発現レベルは、調節可能である。その結果、特に酵母に導入されたLDH遺伝子のコピー数及び／又はそれに結合した調節要素の強度を変化させることによって、エタノールと乳酸との割合を調節することができる。
様々な程度でLDHを発現するこの発明による異なる菌株の構築は、所望のエタノール／乳酸の割合を決定する所望の用途に応じて行うことができる。
いずれの場合においても、この構築法は、以下の工程からなる；すなわち、
−LDH遺伝子と、所望のエタノール／乳酸の割合に応じて変化しうる強度を持つ調節要素とからなる発現カセットの構築；
−（所望エタノール／乳酸の割合に応じて、）単一又は多コピーのいずれかでのこのカセットの酵母内への導入。
この発明による酵母菌株は、農業食品において多くの応用がある。アルコール発酵が、生物学的酸性化（例えば、不十分な酸性リンゴからのりんご酒の生産、いわゆる酸性パン粉の生産、ケフィールタイプのミルク製品等）、あるいはそのエタノール産出の低下によって達せられる限りは、酵母菌株を使用することができる。
このことは、ぶどう酒醸造学の分野において；即ち、
・特に熱帯地域における増大する量のワインの酸度不足を補うために；
・かなり広範な脱酸性化になっても、酸性化を補うことにより、マロー乳酸発酵（生産物の生物学的安定化）の利点からの利益を得ることが可能であるために；
・低エタノール含有量のワインや飲料を生産するために；
特に利点がある。
加えて、アルコール発酵からの過度の逸脱を考慮して、この発明によるサッカロミセス属の形質転換酵母により、乳酸発酵を行う細菌を置換することが可能となるであろう。これらの酵母は、以下の利点を有するであろう。すなわし、ファージに対する無反応、栄養源の貧弱な培地での生育、酸性培地での生育低温度での生育である。それらはまた、乳酸の工業生産にも利用することが可能であろう。
この発明は、この発明による形質転換酵母菌株の構築の実施例、並びにその発酵活性の例証に関する以下の追加記載から、さらによく理解されるであろう。
しかしながら、これらの実施は、単にこの発明の主題を例証するものとしてのみ与えられており、この発明は、決してこれらに限定されるものではないことはいうまでもない。
実施例１−カセイ菌（L.casei）Ｌ−LDH遺伝子のクローニング
A.−大腸菌におけるカセイ菌DNAライブラリーの構築
ａ）カセイ菌DNAの抽出
ラクトバチルス・カセイ菌株ATCC393を使用した。それをMRS培地で培養した。この培地の組成は、以下のようである。ポリペプトン10g/l、酵母抽出物5g/l、肉抽出物10g/l、グルコース2g/l、リン酸水素二カリウム2g/l、酢酸ナトリウム5g/l、クエン酸アンモニウム2g/l、硫酸マグネシウム0.2g/l、硫酸マンガン0.05g/l、ツイーン80 1ml/l。
15mlのMRS培地にカセイ菌を植え付け、一晩37℃で培養する。同培地の500mlに、前培養して得られた培養物の15mlを接種し、3.9の吸光度（OD）（550nm）になるまでゆっくり撹拌しながら37℃で培養する。
DNAを、LERCHら〔Yeast,7:253−263,（1989）〕に従って抽出し、臭化エチジウムの存在下で、塩化セシウム密度勾配で精製する〔MANIATISら,Molecular cloning:A laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）〕。
臭化エチジウムを、イソブタノール（２回）とイソアミルアルコール（２回）で抽出する。２倍容の水で希釈した後、DNAを６倍容のエタノールで沈殿させる。
沈殿物を、ロッドを用いて回収し、2mlのTE（10mMトリス,1mM EDTA,pH7.5）に溶解する。
溶液中のDNAの濃度を、260nmでODを測定することによって決定する。
ｂ）カセイ菌DNAの消化
60μｇのカセイ菌DNAを、37℃で40分間８単位のSau3A酵素で部分的に消化する。
混合物を、フェノール、フェノール／クロロホルム及びクロロホルムで抽出し、アルコールで沈殿させる。
遠心分離後、DNAを300μｌのTEに溶解し、そのフラグメントを25000rpmで15時間のショ糖密度勾配で分離する。
0.5mlのフラクションを採取し、0.8％アガロースゲルで分析する。２〜4kbのフラグメントを含むフラクションを、４時間TEに対して透析する。
ｃ）ベクターpUC18への消化DNAの結合
次いで、消化したDNAを、以下の条件下でライブラリーの生産のために脱リン酸化ベクターpUC18BamHI（アプリジーン）に結合する。
pUC18Bdp ５μｌ（250ng）
消化されたDNA 10μｌ（１μｇ）
アプリジーンTpリゲーション５× 10μｌ
アプリジーンリガーゼ ５μｌ
水 20μｌ
この混合物を、14℃で18時間培養する。
ｄ）大腸菌の形質転換
次の遺伝子型:F-;endA1;hsdR17（K-,mK-）;supE44;Thi−1;λ−;recA1;gyrA96;relA1の大腸菌株DH5α（GIBCO BRL）を使用した。
受容能力を有する細菌の作製に用いられたプロトコールと形質転換のために用いられたプロトコールは、HANAHAN〔DNA cloning,vol.1 DM Glover（ed）IRL Press,109−135（1985）〕に記載されている。
結合混合物を、受容能力を有するDH5α細菌を形質転換するために用いた。得られたコロニーを、LBディッシュ（バクトトリプトン）10g/l,酵母抽出物5g/l,塩化ナトリウム10g/l）とアンピシリン（50μg/ml）上で選択した。92％のクローンが、予想されたサイズ（２−4kb）の挿入断片を有していた。
B.−PCRによるLDH遺伝子フラグメントの増幅
HENSELらによって発表〔Eur.J.Biochem134:503−511,（1983）〕されたラクトバチス・カセイのＬ−LDHのタンパク質配列に基づいて、オリゴヌクレオチドの２つの混合物を合成した。プライマー4122は、アミノ酸５−10:Asp−Lys−Asp−His−Gln−Lysに由来し、プライマー5036は、アミノ酸262−267:Tyr−Met−Asp−Gly−Gln−Tyrに由来するものである（Kim et al.1991）
4122:
5'−GA（C,T）−AA（G,A）−GA（C,T）−CA（C,T）−CA（G,A）−Ａ−（Ａ）−3'
5036:
5'−TA（C,T）TG−（ACTG）CC−（G,A）TC−CAT−（G,A）TA−3'
２つのプライマーを、この菌株から単離された全DNAからのカセイ菌Ｌ−LDH遺伝子のフラグメントを増幅するのに使用した。増幅したフラグメントの大きさは、785塩基対である。
増幅は、以下のように行った。
プライマー4122 ５μｌ（100pmol）
プライマー5036 7.2μｌ（100pmol）
Taq緩衝液10× 10μｌ
Taq（BECKMAN）5u/μｌ 0.5μｌ
dNTP（2mM） 10μｌ
カセイ菌DNA（10ng/μｌ） 10μｌ
水 57μｌ
Taq緩衝液１×:100mMトリス塩酸塩,pH8.3,500mM塩化カリウム,15mM 塩化マグネシウム
増幅状態:TECHNE PHC2増幅器で、30サイクル、94℃で１分間、55℃で１分間、72℃で２分間
増幅産物を、1.5％アガロースゲルで分析し、対応するバンド（785dp）を除去する。DNAを、ミリポアウルトラフリーカラムを用いて溶出し、フェノールを用いて通常の抽出法によって精製し、アルコールを用いて沈殿させ、次いで遠心分離し、TE緩衝液に溶解する。
C.−ライブラリーのスクリーニング
ａ）785−dpフラグメントのラベル化
増幅したフラグメントを、“高速ハイブリッド形成システム−マルチプライム”キット（AMERSHAM）を用いてマルチプライム技術により、32Pでラベル化する。DNAを、３分間100℃で変性させ、次いで氷中で急速に冷却する。ラベル化は、以下の条件下で行った。
785塩基DNA 12μｌ（100ng）
ラベル化緩衝液 10μｌ
ヘキサヌクレオチド ５μｌ
［32P］dCTP（3000Ci/mmol） ４μｌ
クレノウ（Klenow） ２μｌ
水 17μｌ
37℃で２時間
ラベル化されたプローブを、ネンソルブ（NENSORB）カラム（NEN）を通して濾過することによってヌクレオチドから分離する。溶出されたフラクションの放射活性を、シンチレーションカウンターで計数することによって測定する。
ｂ）フィルターの準備
ライブラリーを構成する結合混合物のアリコートを用いてDH5α細菌を形質転換した後、4000Amprクローンが、LB＋アンピシリンディッシュ上で得られた。それは、ゲノムのおよそ３倍の大きさである。
細菌コロニーをナイロン膜（HYBOND N,AMERSHAM）上に移し、DNAを、GRUNSTEIN及びHOGNESSの技術〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72:3961−3965（1975）〕に従って変性させる。次いで、その膜を、80℃で２時間培養する。
ｃ）ハイブリッド形成
供給業者（AMERSHAM）によって記載されたプロトコールに従って、“高速ハイブリッド形成システム−マルチプライム”キットを用いてハイブリッド化を行う。膜を、65℃で15分間ハイブリッド形成緩衝液中で、前ハイブリッド化する。変性したプローブを、106cpm/mlを基礎として緩衝液に加える。
65℃で一晩、ハイブリッド化を行う。
ハイブリッド化後、膜を洗浄する：
−２×SSPE,0.1％ SDSを用いて65℃で10分間２回
−１×SSPE,0.1％ SDSを用いて65℃で15分間１回
−0.7×SSPE,0.1％ SDSを用いて65℃で15分間２回
（20×SSPE:3.6M NaCl;0.2M NaH2PO4;0.02M EDTA）
膜を、Ｘ線フィルム（FUJI）を用いて、−80℃で12時間オートラジオグラフィーに付す。
ハイブリッド化の終わりに、pG4と称す陽性クローンが得られた。このプラスミドを、ミニプレプ（miniprep）（MANIATIS,1989,上記参照）によってこのクローンから抽出し、制限酵素で消化することによって分析した。プラスミドpG4は、カセイ菌DNAの3.5−Kbの挿入断片を含有する。
大腸菌中での乳酸の産生を、クローンpG4に関して測定した。37℃で１％のグルコースとアンピシリン（50mg/ml）を含む10mlのLB中でpG4を増殖させた後、乳酸の産生を、Ｌ−ラクテートキット（BOEHRINGER）を用いて酵素アッセイによって例証した。
これによって、カセイ菌Ｌ−LDH遺伝子の全てが、単離された3.5−Kbのフラグメント上に存在することが、確認される。
実施例２−突然変異誘発による遺伝子の修飾
カセイ菌LDH遺伝子の配列は、近年発表されている〔KIM et al.,Appl.Environ.Microbiol.56:2413−2417（1991）〕。
発表された配列から推定された制限地図が、プラスミドpG4の3.5−Kb挿入断片の中心フラグメントの配列と一致することが、証明された。
カセイ菌LDH遺伝子の翻訳開始コドンは、GTGであり、これは、開始コドンとしてサッカロミセス・セレビシエに用いられないコドンであるので、GTGを、突然変異誘発によって、ATGに置換した。
詳細な突然変異誘発法は、図１に要約されている。
1.突然変異を誘発させたフラグメントの獲得
プラスミドpG4に含まれる3.5−Kb挿入断片は、LDH遺伝子のコーディング領域とともに、図１に示されている（GTG開始コドン、TAA停止コドン）。
GTGのATGでの置換を、プラスミドpG4からの遺伝子の5'フラグメントのPCR増幅により、二つのプライマーを用いて行った。二つのプライマーの位置と配列は、図１に示されている：すなわち、
−プライマー１は、5'末端でのコーディング領域に相補的な13の塩基と９つの異なる塩基からなる。その１つは、GTGをATGで置換するためにＡであり、他の８つは、開始コドンの5'側にXho I部位を作ることを可能にする；
−プライマー２は、その遺伝子に存在するBgl II部位からなるコーディング領域の内部の領域に相補的な22の塩基からなる。
これらの２つのプライマーは、335−塩基フラグメントの増幅を可能にする。
増幅は、以下の手法によって行われた。
手法：
プライマー１ ４μｌ（20pmol）
プライマー２ ４μｌ（20pmol）
Taq緩衝液 10× 10μｌ
Taq 5u/μｌ 0.5μｌ
dNTP（2mM） 10μｌ
pG4a 10μｌ 100ng
水 70.5μｌ
増幅条件:30サイクル、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で１分
増幅フラグメントの大きさを、1.5％アガロースゲル上でアリコートを分析することによって、証明した（335塩基）。
増幅産物の1.5μｌを、Xho I/Bgl IIで消化し、消化したフラグメントを、下記のようにしてプラスミドpBSLDH3にサブクローン化した（2.b）。
2.遺伝子の再構築
この構築における異なる工程を、図２に図式で示す。
ａ）プラスミドpBSLDH3の構築
TAA停止コドンの下流部位及びプラスミドpG4のポリリンカーにおける部位によって結合されたXba Iフラグメント（2.2Kb）を、pG4のXba I消化、NIUSIEVE低融解温度アガロースゲル（FMC）上でのフラグメントの分離、及び2.2Kbのバンドの切り離しによって単離した。
このフラグメントを、200ngのXba Iフラグメント（65℃に加熱されたNIUSIEVEにおける）を50ngのXba Iで消化しかつ脱リン酸化したプラスミドpBSに結合することによって、プラスミドpBS（pBluescript II SK＋,STRATAGENE）にサブクローン化した。得られた組換えプラスミドを、pPSLDH3と命名する。
ｂ）修飾フラグメントの導入
プラスミドpBSLDH3を、Bal II（コーディング領域において）及びXho I（ポリリンカー部位）で消化し、次いで脱リン酸化した。
PCRによって増幅され、かつBal II/Xho Iで消化された（上記１で記載のように）フラグメントの100ngを、処理したpBSLDH3の50ngに結合した。
得られたプラスミドpBSLDH＊１は、ATGの隣接した上流のXho I部位及びTAA停止コドンの隣接した下流のXba I部位によって結合された、開始コドンとしてのATGコドンを有する再構築されたLDH遺伝子のコーディング領域を持っている。
このプラスミドのXho I/Bal IIフラグメントを、一方ではGTGのATGでの置換を、他方では増幅間でのTaqポリメラーゼによるミスが全くなかったことを証明するために、配列した。
実施例３−修飾された遺伝子の発現ベクターへの導入
突然変異を誘発されたカセイ菌遺伝子の酵母中での発現を得るために、つくられたATGコドンを含むコーディング領域を酵母／大腸菌シャトルベクター中に酵母調節要素の制御下で配置した。
１）LDH遺伝子の多コピープラスミドpVT100−Ｕ（図３）への導入
使用された発現プラスミドは、２μ起点、URA3マーカー、及び強ADH調節要素（プロモーター及びターミネーター）、ならびに細菌要素（起点及びアンピシリン耐性遺伝子）を含むプラスミドpVT100−Ｕである。
このプラスミドは、VERNETらによって報告されている〔Gene 52:225−233,（1987）〕。
プラスミドpBSLDH＊１のXho I−Xba Iフラグメントを、Xho I−Xba I消化及びNIUSIEVE低融解温度アガロースゲル上でのフラグメントの分離によって、単離した。その遺伝子に対応するXho I−Xba Iフラグメント（1Kb）を、切断した。
このフラグメントの100ngを、ベクターpVT−100−Ｕの50ngに結合した。ベクターpVT−100−Ｕは、Xba I及びXho I（ポリリンカーに存在する部位）で消化され、脱リン酸化されている。
組換えベクターpVT−100−ULDH＊が得られた。
２）LDH遺伝子の単一コピープラスミドYCp50（図４）への導入
単一コピー動原体プラスミドYCp50は、ROSEによって記載されている〔S.L.BERGER and A.R.KIMMEL（Ed）,Academic Press,481−504（1987）〕。
このベクターは、ARS配列と動原体配列とURA3マーカー、並びに細菌要素（複製起点及びアンピシリン耐性）を有する。
pADH−LDH＊−tADH発現カセットを含むpVT 100−Ｕ−LDH＊のSph Iフラグメントを、Sph I消化及びNIUSIEVE低融解温度アガロースゲル上でのフラグメントの分離によって、単離した。発現カセットを含むSph Iフラグメント（1.7Kb）を、切断した。このフラグメントの100ngを、ベクターYCp50の50ngに結合した。ベクターYCp50は、Sph Iで消化され、脱リン酸化されている。組換えベクターYCp50−LDH＊が得られた。
実施例４−酵母の形質転換
サッカロミセス・セレビシエ酵母菌株SCV5Mを、一方ではプラスミドpVT100−Ｕ−LDH＊を用いて、他方ではプラスミドYCp50−LDH＊を用いて形質転換した。
菌株SCV5Mは、番号Ｉ−1222として、パスツール研究所によるCollection Nationale de Cultures de Microorganismes〔National Collection of Microorganism Cultures〕に、1992年６月18日に寄託された。この生物は、ぶどう酒醸造学用の菌株に由来する半数体実験株で、ウラシル（ura3）に対する栄養要求性突然変異体である。MAT aである。この菌株は、工業用菌株に匹敵するぶどう酒醸造条件下で発酵を行うことができる。
使用した形質転換法は、GIETZ及びSCHIESTLによって記載されたリチウムアセテート法である〔Yeast,7:253−263,（1991）〕。
使用した選択培地は、YNBである（酵母窒素塩基7g/l DIFCO,グルコース 20g/l）。ウラシルの欠如により、プラスミドの保存を可能にする選択圧となる。
実施例５−発酵テスト
１）多コピープラスミドpVT100−Ｕ−LDH＊
発酵テストを以下の菌株を用いて行った。
−V5/pVT100−U:対照として、挿入断片なしにプラスミドpVT100−Ｕを用いて形質転換された菌株SCV5M
−V5/pVT100−Ｕ−LDH＊：修飾されたLDH遺伝子を含む多コピープラスミドpVT100−Ｕを用いて形質転換された菌株SCV5M。いくつかの形質転換細胞を別々にテストした。
発酵を、YNB（酵母窒素塩基7g/l DIFCO）最小合成培地（50g/lのグルコースを含有し、6.3g/lのクエン酸と水酸化ナトリウムでpH51に緩衝化されている）上で行った。
菌株V5/pVT100−Ｕ及びV5/pVT100−Ｕ−LDH＊の前培養を、28℃で10mlの培地中で20時間行った。
培養は、前培養物からの７×105細胞/mlを接種することによって、50ml中で行った。細胞の数を、コールターカウンターモデルZBI型装置で測定した。
培養物を、時々棒磁石で撹拌しながら、28℃でインキュベートした。
初期pHを測定した。V5/pVT100−Ｕでは５、及びV5/pVT100−Ｕ−LDH＊では4.9であった。
サンプル1mlを、次の測定を行うために、定間隔で採取した。
−細胞測定器（コールターカウンター）による細胞の数；
−培地のpH;
−酵素アッセイによる、培地のグルコース、エタノール、乳酸の濃度（BOEHRINGER assay kits）；
乳酸脱水素酵素の比活性：この活性は、以下のようにして得られた粗細胞抽出物で測定された。:108細胞を採取し、6000rpmで５分間遠心分離し、5mlの80mM酢酸塩緩衝液pH5.5（0.2M酢酸塩緩衝液：酢酸ナトリウム2.73g/水100ml、酢酸でpH5.5に調製）で洗浄した。細胞ペレットを同じ緩衝液0.5mlに溶解する。細胞を、低温状態で、１分間に４回、ガラスビーズを用いてヴォルテックスミキサーで粉砕する。粉砕品を、15000rpmで５分間遠心分離し、得られた上清を粗抽出物として用いる。LDHアッセイを、HENSELらの記載に従って行う〔Arch.Microbiol.112,81−93（1977）〕。LDH活性は、抽出物におけるタンパクのU/mgで示される。
行われたアッセイの結果は、以下の通りである。
−エタノール及び乳酸の産生：
V5/pVT100−Ｕ−LDH＊の乳酸産生は、処理した形質転換細胞によって６〜25g/l乳酸の間で変動し、ほとんどの場合10g/lのオーダーの産生量である。以下で詳細にされ、かつ図５に示されている実験結果は、約10g/lの乳酸を産生する形質転換細胞V5/pVT100−Ｕ−LDH＊で得られたものである。対照菌株は、エタノールを産生し、検出可能な乳酸産生を示さないのに対し（図5D）、形質転換細胞は、同時に乳酸とエタノールを産生し（図5C）、これは、培地に存在するグルコースの25〜30％の乳酸への分解に相当する。
さらに、乳酸とエタノールの同時産生は、指数的成長相の間及び定常期の初期にみられる。定常期の間は、乳酸産出は停止する。
−細胞増殖：
形質転換細胞V5/pVT100−Ｕ−LDH＊の増殖（図5A）は、対照菌株（図5B）の増殖に匹敵する。しかしながら、増殖の停止（定常期の開始）は、対照より形質転換された菌株の方が早く、最終の細胞数は、対照菌株で観察されるものより約20％低い。
−培地のpH測定：
増殖の停止は、培地の実質的な酸性化によって説明することができる。pHのより大幅な低下が、対照菌株の場合（図5B）より形質転換された菌株の場合（図5A）において、効果的に観察される。この実質的な酸性化は、観察された乳酸産生と密接に相関している。
−LDH活性のアッセイ：
形質転換された菌株の粗抽出物で得られた結果（図5E）は、LDH比活性が、細胞が定常期に入るとき最大になり、次いで定常期の間に減少することを示している。
−他の培地：
さらに、YNB培地で得られた結果は、グレープジュース（185g/lグルコース）とアップルジュース（93g/lグルコース）に関して確認された。
従って、乳酸／エタノール混合産生の獲得は、種々のグルコース濃度を含む異なる培地（合成、最小又は完全、天然）で、かつ開始pHに関係なく達せられうる。使用できる温度範囲は、酵母の成育を許容しうる温度（約14〜35℃）である。
２）単一コピープラスミドYCp50−LDH＊
発酵テストを、pH5.1に緩衝化された50g/lのグルコースを含むYNB培地上で、菌株V5/YCp50−LDH＊を用いて行った。
1g/lオーダーの乳酸産生が、この菌株に関して得られた。
上記のようにして測定されたLDH比活性は、多コピー形質転換細胞で観察されたものに類似する変化を示す。これに対して、指数的成長相の末期／定常期の初期に観察された最大活性は、1.5U/mgタンパクのオーダーであり、これは、多コピー形質転換細胞で得られた最大活性（10U/mgタンパク）の７分の１に等しい。
従って、単一コピー形質転換細胞による乳酸産生は、LDH比活性のレベルと相関する。
このことは、乳酸産生が、特に酵母に導入されるLDH遺伝子の数に応じて調節されることを示している。
上記から明らかなように、この発明は、さらに明白に記載された実施と応用に関する実施例及び方法になんら制限されず、逆に、当該分野において、専門家に生じうるあらゆる変形を、この発明の範囲を逸脱することなく、包含するものである。
Claims (6)
- 酵母中で乳酸菌由来の乳酸脱水素酵素（LDH）をコードする遺伝子の発現を調節する配列の制御下で、乳酸菌LDHをコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む、アルコール発酵で用いるための酵母菌株。
- 酵母がサッカロミセス属に属する請求項１に記載の菌株。
- 乳酸菌がカセイ菌である請求項１又は２に記載の菌株。
- 酵母中で活性を示す調節配列と組み合わされた乳酸菌LDHの遺伝子からなる発現カセット。
- 請求項４に記載の発現カセットからなり、かつ請求項１に記載の形質転換酵母を得るのに使用可能な発現ベクター。
- さらに、細菌の複製起点と細菌中で選択可能なマーカーを有するシャトルベクターである請求項５に記載のベクター。
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