JP3527200B2 - アンチセンスオリゴヌクレオチド組成物及びｊｎｋタンパク質のモジュレーション方法 - Google Patents

アンチセンスオリゴヌクレオチド組成物及びｊｎｋタンパク質のモジュレーション方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本出願は、１９９７年８月１３日に出願さ
れた米国特許出願第０８／９１０，６２６号の一部継続
出願である。
【０００２】
【発明の分野】本発明は、ＪＮＫ遺伝子によってコード
される酵素である、ＪｕｎＮ−末端キナーゼ（ＪＮＫタ
ンパク質）のレベルを検出及びモジュレートするための
組成物及び方法を提供する。特に、本発明は、ＪＮＫタ
ンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダイズし
得るアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。アンチ
センスオリゴヌクレオチドがこのような及び他のＪＮＫ
タンパク質の発現をモジュレートし得ることが見出され
ている。このキナーゼは、転写因子ＡＰ−１のｃ−Ｊｕ
ｎサブユニットのリン酸化を触媒してＡＰ−１活性を高
め得る能力によって初め発見された。ＡＴＦ−２のよう
な他の転写因子もＪＮＫタンパク質によって同じように
活性化され、他の様々な細胞内エフェクターがＪＮＫタ
ンパク質の基質として役立ち得る（Gupta et al., Scie
nce, 1995, 267, 389）。いずれの事象でも、転写因子
ＡＰ−１は、異常な細胞増殖、腫瘍遺伝子の形質転換、
及び腫瘍の形成、発達及び維持との関連が示唆されてき
た（Vogt, Chapter 15 In: The FOS and JUN Families
of Transcription Factors, Angel and Herrlich, Ed
s., CRC Press, Boca Raton, FL, 1994）。それ故、
（１）ある新生物及び腫瘍ではＪＮＫタンパク質が異常
に発現され、ＡＰ−１活性の増加をもたらす、及び
（２）ＪＮＫ遺伝子が異常発現してはいない異常増殖し
ている細胞においてさえ、ＪＮＫ発現を阻害すればＡＰ
−１活性が減少し、それによって異常な細胞増殖及び腫
瘍の形成、発達及び維持が阻害される、と考えられてい
る。故に本発明は、細胞の過剰増殖及び腫瘍の形成、発
達及び維持を検出する診断方法及びそれを阻害する治療
方法に向けられている。さらに本発明は、ＪＮＫ遺伝子
の異常発現に関連した病態の治療に向けられている。本
発明はまたＪＮＫタンパク質発現のモジュレーションに
応答する病態又は障害の治療薬、診断薬及び研究試薬に
関する。細胞の過剰増殖の阻害及び対応する予防、軽減
及び治療効果が本発明のオリゴヌクレオチドを用いた処
置からもたらされる。
【０００３】
【発明の背景】転写因子は、細胞外シグナルによる刺激
時の特定遺伝子の発現において中心的な役割を担ってい
て、それにより複雑な配列をした生物学的プロセスを調
節する。ＡＰ−１（活性化タンパク質−１）と呼ばれる
転写因子ファミリーのメンバーは、成長因子、サイトカ
イン、腫瘍プロモーター、発癌物質及びある種の腫瘍遺
伝子の発現上昇に応じて遺伝子発現を変化させる（Rahm
sdorf, Chapter 13, andRapp et al., Chapter 16 In:
The FOS and JUN Families of Transcription Factors,
Angel and Herrlich, Eds., CRC Press, Boca Raton,
FL, 1994）。成長因子及びサイトカインは、特定の細胞
表面受容体に結合することによりその機能を発揮する。
受容体の占有が核へのシグナル伝達カスケードの引き金
になる。このカスケードでは、ＡＰ−１のような転写因
子は、遺伝子発現をモジュレートすることにより、細胞
外の要因に対して長期にわたり応答する。細胞内の遺伝
子発現におけるそのような変化がＤＮＡ合成、及び最終
的には分化した誘導体の形成を導く（Angel and Karin,
Biochim. Biophys. Acta, 1991, 1072, 129）。一般的
に言うと、ＡＰ−１は、真核細胞又はウイルスに見出さ
れる関連のヘテロダイマー性転写因子複合体ファミリー
の１メンバーである（The FOS and JUNFamilies of Tra
nscription Factors, Angel and Herrlich, Eds., CRC
Press,Boca Raton, FL, 1994; Bohmann et al., Scienc
e, 1987, 238, 1386; Angel etal., Nature, 1988, 33
2, 166）。ｃ−Ｆｏｓ及びｃ−Ｊｕｎは、２種の比較的
よく特徴付けられたＡＰ−１サブユニットであり、これ
ら２つのタンパク質はそれぞれ、ｃ−ｆｏｓ及びｃ−ｊ
ｕｎ癌原遺伝子の産物である。ｃ−ｆｏｓ又はｃ−ｊｕ
ｎのいずれか、又は両方の癌原遺伝子の活性を抑制し、
その結果としてｃ−Ｆｏｓ及びｃ−Ｊｕｎタンパク質の
形成を阻害することは、細胞増殖、腫瘍形成及び腫瘍成
長の阻害にとって望ましい。
【０００４】タンパク質のリン酸化は細胞外シグナルの
細胞内伝達において主要な役割を担う。そのようなリン
酸化をもたらす酵素である、マイトジェン活性化プロテ
インキナーゼ（ＭＡＰＫ）は、成長因子、ホルモン及び
細胞代謝、増殖及び分化に関わる他の薬剤が作用するた
めの標的である（Cobb et al., J. Biol. Chem., 1995,
270, 14843）。ＭＡＰＫ（細胞外シグナル被調節プロ
テインキナーゼ、又はＥＲＫとも言及される）は、例え
ば、受容体チロシンキナーゼ、Ｇタンパク質共役型受容
体、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）及び明らかにＭＡ
ＰＫ専属のキナーゼであるＭＥＫ１及びＭＥＫ２により
触媒されるリン酸化によって自ら活性化される。一般
に、ＭＡＰキナーゼは、細胞外の刺激を癌原遺伝子の産
物へ伝達して細胞増殖及び／又は分化をモジュレートす
るように機能する多様なシグナル伝達経路（重なったり
併行する場合もある）に関わる（Seger et al., FASEB
J.,1995, 9, 726; Cano et al., Trends Biochem. Sc
i., 1995, 20, 117）。典型的なＭＡＰキナーゼ経路で
は、ＭＥＫＫと呼ばれる第一のＭＡＰキナーゼがＭＥＫ
と呼ばれる第二のＭＡＰキナーゼをリン酸化して活性化
し、これが次にＭＡＰＫ／ＥＲＫ又はＪＮＫ／ＳＡＰＫ
酵素（「ＳＡＰＫ」はストレス活性化プロテインキナー
ゼの省略語である）をリン酸化及び活性化する。最終的
に、活性化されたＭＡＰＫ／ＥＲＫ又はＪＮＫ／ＳＡＰ
Ｋ酵素そのものが転写因子（例えばＡＰ−１のような）
又は他の基質をリン酸化及び活性化する（Cano et al.,
Trends Biochem. Sci., 1995, 20, 117）。この規範的
なカスケードは単純に書けば以下のように表し得る：
【０００５】
【式１】 ＭＥＫＫ → ＭＥＫ → ＭＡＰＫ／ＥＲＫ又はＪＮ
Ｋ／ＳＡＰＫ → 転写因子又は他の基質
【０００６】シグナル伝達経路の１つは、ＭＡＰキナー
ゼであるＪｕｎＮ末端キナーゼ１（ＪＮＫ１）及びＪｕ
ｎＮ末端キナーゼ２（ＪＮＫ２）を含み、これらはｃ−
Ｊｕｎのアミノ端部分の特定部位（セリン６３及びセリ
ン７３）のリン酸化を担っている。これらの部位がリン
酸化されると、転写を活性化するＡＰ−１の能力が高め
られる（Binetruy et al., Nature, 1991, 351, 122; S
meal et al., Nature,1991, 354, 494）。ＪＮＫ１及び
ＪＮＫ２以外の他のＪＮＫファミリーメンバーも、ｐ４
９3F12キナーゼと初め命名されたＪＮＫ３（Gupta et a
l., EMBO Journal, 1996, 15, 2760）を包含して記載さ
れている（Mohit et al., Neuron, 1994, 14, 67）。本
明細書で使用されるように「ＪＮＫタンパク質」という
用語は、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＫＫ３及びそのイソ型
（Gupta et al., EMBO Journal, 1996, 15, 2760）及び
それ自身のＪｕｎＮ−末端キナーゼとして作用する（つ
まり、特定のアミノ末端部位でＪｕｎをリン酸化する）
かしない他のＪＮＫタンパク質ファミリーメンバーを、
限定しないが包含する、ＪＮＫキナーゼファミリーのメ
ンバーを意味する。 少なくとも１種のヒトの白血球癌
遺伝子は、ＪｕｎＮ−末端キナーゼ機能を強めることが
示された（Raitano et al., Proc. Natl.Acad. Sci.(US
A), 1995, 92, 11746）。１種又はそれ以上のＪＮＫタ
ンパク質の発現のモジュレーションが望ましいのは、細
胞の過剰増殖及び、ＡＰ−１や他のＪＮＫタンパク質の
リン酸化基質によって刺激される遺伝子の転写に干渉す
るためである。また、１種又はそれ以上の他のＪＮＫタ
ンパク質の発現のモジュレーションが望ましいのは、特
定のシグナル伝達経路での異常に由来する細胞の過剰増
殖に干渉するためである。今日まで、１種又はそれ以上
のＪＮＫタンパク質の遺伝子発現を有効に阻害する治療
薬は知られていない。従って、特定のＪＮＫタンパク質
の発現をモジュレートするための改良された組成物及び
方法に対する待望のニーズが残っている。 さらに、動
物における細胞の過剰増殖はいくつかの結果をもたらし
得る。内部のプロセスは、腫瘍が形成されないうちに、
過剰増殖性の細胞を消滅させ得る。腫瘍は細胞の過剰増
殖に由来する異常な成長物である。過剰に増殖するがそ
のままに留まる細胞は、良性腫瘍を形成するが、それは
通常局部手術によって除去され得る。対照的に、悪性腫
瘍又は癌は、転移、つまり過剰増殖性の細胞が循環又は
リンパ系を介して体内の他の部分へ広がり、その内部に
留まるプロセスを実施し得る細胞を含む（概論として、
Chapter 16 In: Molecular Biology of the Cell, Albe
rts et al., eds., Garland Publishing, Inc., New Yo
rk, 1983を参照のこと）。アンチセンスオリゴヌクレオ
チドを使用すると、驚くべきことに、転移のために必要
とされる酵素をコードするいくつかの遺伝子がＡＰ−１
によってポジティブに調節されていて、それが１種又は
それ以上のＪＮＫタンパク質を標的とするアンチセンス
オリゴヌクレオチドによってモジュレートされ得る、と
いうことが発見された。従って、本発明は、悪性腫瘍の
転移をモジュレートする改良された組成物及び方法に対
する待望のニーズを満たすものである。
【０００７】
【発明の要旨】本発明によれば、ＪＮＫタンパク質をコ
ードする核酸と特異的にハイブリダイズするオリゴヌク
レオチドが提供される。本発明のある種のオリゴヌクレ
オチドは、ＪＮＫタンパク質をコードするＪＮＫ遺伝子
から転写されるｍＲＮＡに直接結合するか又はそのＤＮ
Ａの選択される部分に結合してその発現及び／又はＪＮ
Ｋタンパク質の１種又はそれ以上の基質のリン酸化をモ
ジュレートするように設計されている。本発明のオリゴ
ヌクレオチドを含んでなる医薬組成物、及び、１つ又は
それ以上の転移事象をモジュレートする方法を包含す
る、本発明のオリゴヌクレオチドを使用する様々な方法
も本明細書に提供される。
【０００８】
【発明の具体的な説明】オリゴヌクレオチドは、特定の
核酸と特異的なハイブリダイゼーションをするのに、同
一性及び数において十分なヌクレオチド配列を含み得
る。そのようなオリゴヌクレオチドは通常「アンチセン
ス」として記載される。アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドは通常研究試薬、診断薬及び治療薬として使用され
る。ＪｕｎＮ−末端キナーゼ（ＪＮＫタンパク質）をコ
ードする遺伝子（ＪＮＫ）は、特にこのアプローチに従
うことが見出された。本発明の文脈では、「ＪｕｎＮ−
末端キナーゼ」及び「ＪＮＫタンパク質」は、ＡＰ−１
のＪｕｎサブユニットのアミノ末端（Ｎ−末端）部分を
リン酸化することが実際に知られているタンパク質、並
びに、アミノ酸配列に基づいてＪＮＫタンパク質として
一時的に同定されてはいるが、実は他の転写因子（例、
ＡＴＦ２）又は転写に関わることが知られていないキナ
ーゼ基質に、追加的又は代替的に結合及び／又はリン酸
化し得るタンパク質に言及する（Derijard et al., Cel
l, 1994, 76, 1025; Kallunki et al., Genes & Develo
pment, 1994, 8, 2996; Gupta et al., EMBO J., 1996,
15, 2760）。より特定すると、本発明はＪＮＫ１、Ｊ
ＮＫ２及びＪＮＫ３タンパク質をモジュレートするアン
チセンスオリゴヌクレオチドに向けられている。細胞増
殖とＡＰ−１、他の転写因子及び／又は他のタンパク質
の（リン酸化を介した）ＪＮＫタンパク質による活性化
との連結の結果として、１種又はそれ以上のＪＮＫタン
パク質の発現の阻害がＡＰ−１及び／又は細胞増殖に関
わる他の因子の活性化、細胞周期の進展又は転移性の事
象の阻害をもたらし、それによりこれらの活性のモジュ
レーションをもたらす。このようなモジュレーション
は、様々な癌のような、様々な過剰増殖性の障害又は疾
患を治療、軽減又は予防するのに望ましい。そのような
阻害は、そのような疾患又は障害に罹っていることが疑
われるか又は罹っていることが知られている動物におけ
るそのような疾患又は障害の進展を予防又はモジュレー
トするのにさらに望ましい。所望されるならば、１つの
ＪＮＫタンパク質の発現のモジュレーションは、ＡＰ−
１−介在性の転写に干渉するのに必要なレベルを達成す
るために、１種又はそれ以上の追加的なＪＮＫタンパク
質のモジュレーションと組み合わせ得る。
【０００９】ＪＮＫタンパク質をコードする核酸と特異
的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドに動物を
接触させることを含んでなる、ＪＮＫタンパク質の発現
をモジュレートする方法が本明細書に提供される。これ
らの方法は、キナーゼ介在性のＡＰ−１活性化と細胞増
殖との連結の結果として、治療的にも診断的にも有用で
あると考えられている。これらの方法はまた、例えば、
様々な細胞の機能及び生理学的なプロセス及び状態にお
けるキナーゼ介在性ＡＰ−１活性化の役割を検出及び決
定するためのツールとして、及びそのような発現又は活
性化に関連した病態の診断のために有用である。
【００１０】本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチ
ドを使用してＪＮＫ介在性の活性化を阻害する方法を含
む。異常又は過剰なＪＮＫ介在性の細胞増殖が起きてい
る病態を治療する方法も提供される。これらの方法は本
発明のオリゴヌクレオチドを利用し、治療的にも臨床研
究及び診断ツールとしても有用であると考えられてい
る。本発明のオリゴヌクレオチドはまた研究目的にも使
用され得る。従って、本発明のオリゴヌクレオチドによ
って示される特異的なハイブリダイゼーションは、アッ
セイ、精製、細胞産物の調製、及び当業者に理解され得
る他の方法において使用され得る。
【００１１】本発明は、タンパク質をコードするＤＮＡ
又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の機能のアンチ
センスモジュレーションに使用されるオリゴヌクレオチ
ドを利用する。そのモジュレーションは、究極的にはそ
のタンパク質の量を調節することが所望される。アンチ
センスオリゴヌクレオチドのその標的ｍＲＮＡとのハイ
ブリダイゼーションはｍＲＮＡの正常な役割に干渉し、
細胞内のその機能のモジュレーションを引き起こす。干
渉されるｍＲＮＡの機能は、タンパク質翻訳部位へのＲ
ＮＡの転座、ＲＮＡからタンパク質の実際の翻訳、１つ
又はそれ以上のｍＲＮＡ種を生じるＲＮＡスプライシン
グ、及びＲＮＡにより従事され得るおそらくは独立した
触媒活性、というような全ての本質的な機能を包含す
る。ｍＲＮＡ機能に対するそのような干渉の全体効果は
タンパク質発現のモジュレーションであり、ここで「モ
ジュレーション」はタンパク質発現の増加（刺激）又は
減少（阻害）のいずれかを意味する。本発明の文脈で
は、遺伝子発現モジュレーションの好ましい形態は阻害
である。
【００１２】アンチセンス攻撃のためには特定の遺伝子
を標的にすることが好ましい。本発明の文脈では、関連
する核酸にオリゴヌクレオチドを「標的化」すること
は、多工程の方法である。この方法は通常その機能がモ
ジュレートされるべき核酸配列を同定することから始ま
る。これは、例えば、その発現が特定の障害又は病態に
関連している細胞遺伝子（又はその遺伝子から転写され
るｍＲＮＡ）、又は感染病原体由来の異種核酸であり得
る。本発明では、標的は過剰増殖性の障害に関連した細
胞遺伝子である。標的化の方法は、所望される効果、つ
まりタンパク質発現の検出又はモジュレーションがもた
らされるようにオリゴヌクレオチド相互作用が起こるこ
の遺伝子内の部位を決定することも包含する。標的部位
が同定されれば、その標的に十分相補的である、つまり
十分強くて十分な特異性をもってハイブリダイズして所
望の効果をもたらすオリゴヌクレオチドが選択される。
一般に、アンチセンスモジュレーションの標的になり得
る遺伝子の部位は５つ存在する：５'非翻訳領域（以
後、「５'−ＵＴＲ」）、翻訳開始コドン領域（以後、
「ｔＩＲ」）、オープンリーディングフレーム（以後、
「ＯＲＦ」）、翻訳終止コドン領域（以後、「ｔＴ
Ｒ」）及び３'非翻訳領域（以後、「３'−ＵＴＲ」）で
ある。当技術分野で知られているように、これらの領域
は典型的なメッセンジャーＲＮＡ分子内では以下の順に
配置される（左から右、５'から３'へ）：５'−ＵＴ
Ｒ、ｔＩＲ、ＯＲＦ、ｔＴＲ、３'−ＵＴＲ。当技術分
野で知られているように、真核生物の転写産物のなかに
は直接翻訳されるものもあるが、多くのＯＲＦは１つ又
はそれ以上の配列、つまり翻訳される前に転写産物から
切出される「イントロン」及び「エクソン」として言及
されるＯＲＦの発現される（切出されない）部分を含有
するものである（Alberts et al., Molecular Biology
of theCell, 1983, Garland Publishing, Inc., New Yo
rk, pp. 411-415）。さらに、多くの真核ＯＲＦは１０
００ヌクレオチド又はそれ以上の長さであるので、例え
ば５'ＯＲＦ領域、中央ＯＲＦ領域及び３'ＯＲＦ領域と
いうようにＯＲＦを細分割することがしばしば便利であ
る。ある例では、ＯＲＦはin vivoにおけるある機能上
の意義により標的とされ得る１つ又はそれ以上の部位を
含有する。後者タイプの部位の例は、遺伝子内ステムル
ープ構造（例えば、米国特許第５，５１２，４３８号を
参照のこと）、及びプロセシングしないｍＲＮＡ分子内
のイントロン／エクソンスプライス部位を包含する。
【００１３】本発明の文脈内では、１つの好ましい遺伝
子内部位は、遺伝子のオープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）の翻訳開始コドンを網羅する領域である。当
技術分野で知られているように、翻訳開始コドンは典型
的には５'−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子内で；対
応するＤＮＡ分子では５'−ＡＴＧ）であるので、翻訳
開始コドンは「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」又は
「ＡＵＧ開始コドン」としても言及される。少数の遺伝
子は、５'−ＧＵＧ、５'−ＵＵＧ又は５'−ＣＵＧなる
ＲＮＡ配列を有する翻訳開始コドンを有し、５'−ＡＵ
Ａ、５'−ＡＣＧ及び５'−ＣＵＧはin vivoで機能する
ことが示された。さらに、５'−ＵＵＵはin vitroで翻
訳開始コドンとして機能する（Brigstock et al., Grow
th Factors, 1990, 4, 45; Gelbert et al., Somat. Ce
ll. Mol. Genet., 1990, 16, 173; Goldand Stormo, i
n: Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Ce
llular and Molecular Biology, Vol. 2, 1987, Neidha
rdt et al., eds., American Society for Microbiolog
y, Washington, D. C., p. 1303）。従って、「翻訳開
始コドン」及び「開始コドン」という用語は、たとえ個
々の例における開始アミノ酸が典型的にはメチオニン
（真核生物）又はホルミルメチオニン（原核生物）であ
るとしても、多くのコドン配列を網羅し得る。真核及び
原核生物の遺伝子が２種又はそれ以上の代替的な開始コ
ドンを有する場合があり、特定の細胞型又は組織、又は
特定の条件セットにおいてはそのうちの１つが選好的に
翻訳開始に利用され、異なるアミノ末端配列を有する近
縁のポリペプチドを産生する、ということも当技術分野
で知られている（Markussen et al., Development, 199
5, 121, 3723; Gao et al., Cancer Res., 1995, 55, 7
43; McDermott et al., Gene, 1992, 117, 193; Perri
et al., J. Biol. Chem., 1991, 266, 12536; French e
t al., J. Virol., 1989, 63, 3270; Pushpa-Rekha et
al., J. Biol. Chem., 1995,270, 26993; Monaco et a
l., J. Biol. Chem., 1994, 269, 347; DeVirgilio et
al., Yeast, 1992, 8, 1043; Kanagasundaram et al.,
Biochim. Biophys. Acta, 1992, 1171, 198; Olsen et
al., Mol. Endocrinol., 1991, 5, 1246; Saulet al.,
Appl. Environ. Microbiol., 1990, 56, 3117; Yaoita
et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 7090;
Rogers et al., EMBO J., 1990, 9,2273）。本発明の
文脈では、「開始コドン」及び「翻訳開始コドン」は、
そのようなコドンの配列に拘らず、ＪＮＫタンパク質を
コードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の翻訳を
in vivoで開始するために使用されるコドンに言及す
る。当技術分野では、遺伝子の翻訳終止コドン（又は
「停止コドン」）が３つの配列、即ち、５'−ＵＡＡ、
５'−ＵＡＧ及び５'−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列は、
それぞれ５'−ＴＡＡ、５'−ＴＡＧ及び５'−ＴＧＡで
ある）の１つを有し得ることが知られている。「開始コ
ドン領域」及び「翻訳開始領域」という用語は、翻訳開
始コドンから両方向（即ち、５'又は３'）にある約２５
〜約５０の連続したヌクレオチドを網羅するようなｍＲ
ＮＡ又は遺伝子の部分に言及する。同様に、「停止コド
ン領域」及び「翻訳終止領域」という用語は、翻訳終止
コドンから両方向（即ち、５'又は３'）にある約２５〜
約５０の連続したヌクレオチドを網羅するようなｍＲＮ
Ａ又は遺伝子の部分に言及する。
【００１４】「具体的な説明」の残りでは、（１）本発
明のオリゴヌクレオチド及びその（２）生物学的同等
物、（３）有用性、（４）医薬組成物及び（５）投与方
法をより詳しく述べる。 １．本発明のオリゴヌクレオチド：本発明は１種又はそ
れ以上のＪＮＫタンパク質のアンチセンスモジュレーシ
ョンに使用するオリゴヌクレオチドを利用する。本発明
の文脈では、「オリゴヌクレオチド」という用語は、リ
ボ核酸又はデオキシリボ核酸のオリゴマー又はポリマー
に言及する。この用語は、天然に存在するヌクレオベー
ス、糖及び糖間（骨格）共有結合からなるオリゴヌクレ
オチド、並びに同様に機能する天然に存在しない部分を
有するオリゴヌクレオチドを包含する。そのような修飾
されたか又は置換されたオリゴヌクレオチドがネーティ
ブな形態よりしばしば好ましいのは、強められた細胞取
込み、強められた標的結合性及びヌクレアーゼ存在下で
の高められた安定性のような所望される特性のためであ
る。
【００１５】オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドとし
て一般に知られている繰り返し単位からなるポリマーで
ある。本発明によるオリゴヌクレオチドは、好ましくは
約８〜約３０のヌクレオチドを含む。未修飾の（天然に
存在する）ヌクレオチドは３つの成分を有する：（１）
窒素を含有するへテロ環式塩基、（２）その窒素原子の
１つにより連結した５−ペントフラノシル糖及び（３）
糖の５'又は３'炭素原子の１つにエステル結合したリン
酸。このオリゴヌクレオチド鎖に取り込まれるとき、第
一ヌクレオチドのリン酸は、３'−５'リン酸結合を介し
て第二の隣接ヌクレオチドの隣の糖へもエステル結合す
る。未修飾オリゴヌクレオチドの「骨格」は（２）及び
（３）、つまり、第一のヌクレオチドの糖の５'炭素と
第二の隣接ヌクレオチドの３'炭素との間のホスホジエ
ステル結合によって連結している糖からなる。「ヌクレ
オシド」は、（１）ヌクレオベース及び（３）リン酸部
分の不在下の（２）糖を組み合わせたものである（Korn
berg,A., DNA Replication, W.H.Freeman & Co., San F
rancisco,1980,pages 4-7)。オリゴヌクレオチドの骨格
は連続した塩基を特定の順序で配置し、この連続した塩
基の書かれた表示は、従来から５'から３'へ記載される
が、ヌクレオチド配列として知られている。
【００１６】オリゴヌクレオチドは特定の核酸との特異
的なハイブリダイゼーションをもたらすのに同一性及び
数において十分なヌクレオチド配列を含み得る。遺伝子
のセンス鎖の部分に特異的にハイブリダイズするそのよ
うなオリゴヌクレオチドは、通常「アンチセンス」とし
て記載される。本発明の文脈では、「ハイブリダイゼー
ション」は、ワトソン−クリック、フーグスティーン又
は逆フーグスティーン型の水素結合であり得る、相補的
なヌクレオチド間の水素結合を意味する。例えば、アデ
ニン及びチミンは、水素結合の形成を介して対合する相
補的なヌクレオベースである。本明細書で使用されるよ
うに、「相補的」は、２つのヌクレオチド間の正確な対
合能力に言及する。例えば、オリゴヌクレオチドのある
部位のヌクレオチドがＤＮＡ又はＲＮＡ分子の同じ位置
に有るヌクレオチドと水素結合することができる場合、
このオリゴヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡはその位置
でお互いに相補的であると考えられる。オリゴヌクレオ
チドとＤＮＡ又はＲＮＡがお互いに相補的であるのは、
各分子内の対応する位置の十分な数がお互いに水素結合
し得るヌクレオチドによって占められているときであ
る。従って、「特異的にハイブリダイズし得る」及び
「相補的」とは、オリゴヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮ
Ａ標的との間に安定で特異的な結合が起こるほど十分な
程度の相補性又は正確な対合を示すことに使用される。
オリゴヌクレオチドがその標的配列に特異的にハイブリ
ダイズするのは、核酸二重鎖の内部にある特定の対とな
るヌクレオベース間の塩基対合の形成によるものであ
る。天然に存在するヌクレオベースの間では、グアニン
（Ｇ）がシトシン（Ｃ）に結合し、アデニン（Ａ）がチ
ミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）に結合する。Ａの対合相
手としてのＵ（ＲＮＡ）及びＴ（ＤＮＡ）の同等性に加
えて、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシト
シン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ及びゲンチオビオシ
ルＨＭＣ（Ｃの同等物）及び５−ヒドロキシメチルウラ
シル（Ｕの同等物）を包含する、他の天然に存在するヌ
クレオベース同等物が知られている。さらに、対合特異
性を保持する人工のヌクレオベースが当技術分野で知ら
れていて、それは例えば、Ｃに対する対合特異性を保持
する７−デアザ−グアニンを包含する。従って、標的オ
リゴヌクレオチド内の対合ヌクレオベースに対する特異
性にさして影響しない、オリゴヌクレオチドのヌクレオ
チド配列内のヌクレオベースに対するいかなる化学修飾
によっても、その標的配列に特異的にハイブリダイズす
るオリゴヌクレオチドの能力は変化しないだろう。当技
術分野では、オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリ
ダイズし得るのに、その標的ＤＮＡ配列に対して１００
％相補的である必要はないと理解されている。オリゴヌ
クレオチドが特異的にハイブリダイズし得るのは、特異
的な結合が所望される条件、即ちin vivo アッセイ又は
治療処置の場合、又はin vitroアッセイの場合の生理学
的条件、そのようなアッセイが実施される条件下で、非
標的配列に対するオリゴヌクレオチドの非特異的な結合
を回避するのに十分な程度の相補性があるときである。
【００１７】アンチセンスオリゴヌクレオチドは、研究
試薬、診断薬、治療薬として通常使用される。例えば、
強い特異性をもって遺伝子発現を阻害し得るアンチセン
スオリゴヌクレオチドは、特定遺伝子の機能を解明す
る、例えば生物学的経路の様々なメンバーの諸機能を判
別するために、当業者によってしばしば使用される。従
って、この特異的な阻害効果は、当業者により研究上の
使用のために利用されてきた。オリゴヌクレオチドの特
異性及び感度はまた当業者によって治療上の使用のため
に利用されている。
【００１８】Ａ．修飾された結合：本発明に想定されて
いる好ましい修飾オリゴヌクレオチドの特定の例は、ホ
スホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホ
ネート、短鎖アルキル又はシクロアルキル糖間結合又は
短鎖ヘテロ原子又はヘテロ環式糖間結合を含有するもの
を包含する。最も好ましいのはホスホロチオエートを有
するオリゴヌクレオチド、及びＣＨ2−ＮＨ−Ｏ−Ｃ
Ｈ2、ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｏ−ＣＨ2［メチレン（メチ
ルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られる］、ＣＨ2−
Ｏ−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2、ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｎ（Ｃ
Ｈ3）−ＣＨ2及びＯ−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2−ＣＨ2骨格
を有するものであり、ここでネーティブなホスホジエス
テル骨格は、Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ2として表される。また
好ましいのは、モルホリノ骨格の構造を有するオリゴヌ
クレオチドである（SummertonとWeller,米国特許第５，
０３４，５０６号）。さらに好ましいのは、ＮＲ−Ｃ
（＊）−ＣＨ2−ＣＨ2、ＣＨ2−ＮＲ−Ｃ（＊）−Ｃ
Ｈ2、ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲ−Ｃ（＊）、Ｃ（＊）−ＮＲ
−ＣＨ2−ＣＨ2及びＣＨ2−Ｃ（＊）−ＮＲ−ＣＨ2骨格
を有するオリゴヌクレオチドであり、ここで「＊」はＯ
又はＳを表す（アミド骨格として知られている；DeMesm
aekerら、ＷＯ９２／２０８２３号、１９９２年１１月
２６日公開）。他の好ましい態様では、ペプチド核酸
（ＰＮＡ）骨格のように、オリゴヌクレオチドのホスホ
ジエステル骨格がポリアミド骨格に置換されていて、ヌ
クレオベースはポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接又
は間接的に結合している（Nielsen et al., Science, 1
991, 254: 1497；米国特許第５，５３９，０８２号）。
【００１９】Ｂ．修飾されたヌクレオベース：本発明の
オリゴヌクレオチドはヌクレオベース修飾又は置換を追
加的又は代替的に包含し得る。本明細書で使用されるよ
うに、「未修飾の」又は「天然の」ヌクレオベースは、
アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シト
シン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を包含する。修飾された
ヌクレオベースは天然の核酸に稀に又は一時的にしか見
出されないヌクレオベース、例えば、ヒポキサンチン、
６−メチルアデニン、５−メチルシトシン、５−ヒドロ
キシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ及び
ゲンチオビオシルＨＭＣ、並びに人工のヌクレオベー
ス、例えば、２−アミノアデニン、２−チオウラシル、
２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシ
メチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニ
ン、Ｎ6（６−アミノヘキシル）アデニン及び２，６−
ジアミノプリン（Kornberg, A., DNA Replication, W.
H.Freeman & Co., San Francisco, 1980, pages 75-77;
Gebeyehu, G., et al.,Nucleic Acids Res., 1987, 1
5, 4513）を包含する。
【００２０】Ｃ．糖の修飾：本発明のオリゴヌクレオチ
ドは個々のヌクレオチドの糖部分の置換を追加的又は代
替的に含む場合がある。例えば、オリゴヌクレオチドは
また、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルのよ
うな糖模擬体を有する場合がある。他の好ましい修飾オ
リゴヌクレオチドは、２'位に以下の１つを含んでなる
１種又はそれ以上の置換された糖部分を含有し得る：Ｏ
Ｈ、ＳＨ、ＳＣＨ3、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ3ＯＣＨ3、Ｏ
ＣＨ3Ｏ（ＣＨ2）nＣＨ3、Ｏ（ＣＨ2）nＮＨ2又はＯ
（ＣＨ2）nＣＨ3（ここでｎは１〜約１０である）；Ｃ1
〜Ｃ10の低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換さ
れた低級アルキル、アルカリール又はアラルキル；Ｃ
ｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ3；ＯＣＦ3；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−
アルキル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルケニル；ＳＯＣ
Ｈ3；ＳＯ2ＣＨ3；ＯＮＯ2；ＮＯ2；Ｎ3；ＮＨ2；ヘテ
ロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノ
アルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換されたシリ
ル；ＲＮＡ開裂基；レポーター基；挿入剤；オリゴヌク
レオチドの薬力学特性を改善する基；又はオリゴヌクレ
オチドの薬物動態特性を改善する基、及び同様の特性を
有する他の置換基。好ましい修飾の例は、２'−メトキ
シエトキシ［２'−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3、２'−Ｏ−
（２−メトキシエチル）としても知られる］である（Ma
rtin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78: 486）.他
の好ましい修飾は、２'−メトキシ−（２'−Ｏ−Ｃ
Ｈ3）、２'−プロポキシ−（２'−ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3）
及び２'−フルオロ−（２'−Ｆ）を包含する。
【００２１】Ｄ．他の修飾：同様の修飾が、オリゴヌク
レオチドの他の位置、特に３'末端ヌクレオチドの糖の
３'位及び５'末端ヌクレオチドの５'位でなされ得る。
オリゴヌクレオチドの５'及び３'末端も、例えば親油性
の部分（すぐ後のパラグラフを参照）、挿入剤（Kuyavi
nら、ＷＯ９６／３２４９６号、１９９６年１０月１７
日公開；Nguyenら、米国特許第４，８３５，２６３号、
１９８９年５月３０日発行）又はヒドロキシアルキル基
（Heleneら、WO９６／３４００８号、１９９６年１０月
３１日公開）が化学結合する部位として役立つように修
飾され得る。
【００２２】本発明のオリゴヌクレオチド内の他の位置
は、１種又はそれ以上のエフェクター基を化学的に連結
してオリゴヌクレオチド結合体を形成するために使用さ
れ得る。「エフェクター基」は、特定の化学的又は生物
学的な機能を実行し得る化学部分である。そのようなエ
フェクター基の例は、限定しないが、ＲＮＡ開裂基、レ
ポーター基、挿入剤、オリゴヌクレオチドの薬力学特性
を改善する基又はオリゴヌクレオチドの薬物動態特性を
改善する基、及び同様の特性を有する他の置換基を包含
する。多種多様の化学リンカーがエフェクター基を本発
明のオリゴヌクレオチドに結合するために使用し得る。
１例として、Cookらへの米国特許第５，５７８，７１８
号は、追加的な基を包含するようにさらに誘導体化され
得るアルキルチオリンカーをリボフラノシルの位置、ヌ
クレオシド塩基の位置又はヌクレオシド間結合上に付け
る方法を開示する。オリゴヌクレオチドを様々なエフェ
クター基へ結合させるさらなる方法が当技術分野で知ら
れている。例えば、Protocols for Oligonucleotide Co
njugates (Methods in Molecular Biology, Volume26)
Agrawal, S., ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1994を
参照のこと。
【００２３】本発明のオリゴヌクレオチドの別の好まし
い追加的又は代替的な修飾は、オリゴヌクレオチドへ、
オリゴヌクレオチドの細胞取込みを増強する１種又はそ
れ以上の親油性部分を化学的に連結させることを含む。
そのような親油性部分はオリゴヌクレオチドのいくつか
の異なる位置でオリゴヌクレオチドに連結され得る。あ
る好ましい位置は、３'末端ヌクレオチドの糖の３'位、
５'末端ヌクレオチドの糖の５'位及び任意のヌクレオチ
ドの糖の２'位を包含する。プリンヌクレオベースのＮ6
位も本発明のオリゴヌクレオチドへ親油性部分を連結す
るために利用され得る（Gebeyehu, G., et al., Nuclei
c Acids Res., 1987, 15, 4513）。そのような親油性部
分は、限定しないが、コレステリル部分（Letsinger et
al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1989, 86: 65
53）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Che
m. Let., 1994, 4: 1053）、チオエステル、例えばヘキ
シル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharan et al., Ann.
N. Y. Acad. Sci., 1992 660: 306; Manoharan et a
l., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3: 2765）、チオ
コレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Re
s., 1992, 20: 533）、脂肪族の鎖、例えばドデカンジ
オール又はウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al.,
EMBO J., 1991, 10: 111; Kabanov et al., FEBS Let
t., 1990, 259: 327; Svinarchuk et al., Biochimie,
1993, 75: 49）、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−
ｒａｃ−グリセロール又は１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシ
ル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−リン酸トリエチルアン
モニウム（Manoharan et al.,Tetrahedron Lett., 199
5, 36: 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990,1
8: 3777）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖
（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 199
5, 14: 969）又はアダマンタン酢酸（Manoharanet al.,
Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651）、パルミチル部
分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1
264: 229）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミ
ノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Crooke e
t al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277: 927）
を包含する。親油性部分を含んでなるオリゴヌクレオチ
ド及びそのようなオリゴヌクレオチドを製造する方法
は、米国特許第５，１３８，０４５号、５，２１８，１
０５号及び５，４５９，２５５号に開示されている。
【００２４】本発明はまた、オリゴヌクレオチド内の特
定の位置に関して実質的にキラリティーが純粋であるオ
リゴヌクレオチドを包含する。実質的にキラリティーが
純粋であるオリゴヌクレオチドの例は、限定しないが、
少なくとも７５％Ｓｐ又はＲｐであるホスホロチオエー
ト結合を有するもの（Cookら、米国特許第５，５８７，
３６１号）及び実質的にキラリティーが純粋である（Ｓ
ｐ又はＲｐ）アルキルホスホネート、ホスホロアミダイ
ト又はホスホトリエステル結合を有するものを包含する
（Cook，米国特許第５，２１２，２９５号及び５，５２
１，３０２号）。
【００２５】Ｅ．キメラオリゴヌクレオチド：本発明は
またキメラオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチ
ドを包含する。「キメラ」オリゴヌクレオチド又は「キ
メラ」は、本発明の文脈において、それぞれ少なくとも
１つのヌクレオチドからなる、２種又はそれ以上の化学
的に異なる領域を含有するオリゴヌクレオチドである。
典型的には、これらオリゴヌクレオチドは、ヌクレアー
ゼ分解に対する増加した抵抗性、増加した細胞取込み及
び／又は標的核酸に対する増加した結合親和性をオリゴ
ヌクレオチドに与えるようにオリゴヌクレオチドが修飾
されている領域を少なくとも１つ含有する。オリゴヌク
レオチドの追加領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：Ｒ
ＮＡハイブリッドを開裂し得る酵素の基質として役立ち
得る。例えば、ＲＮアーゼＨはＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖の
ＲＮＡ鎖を開裂する細胞エンドヌクレアーゼである。従
って、ＲＮアーゼＨの活性化はＲＮＡ標的の開裂をもた
らし、それにより遺伝子発現のアンチセンス阻害の効率
を大いに高める。ＲＮＡ標的の開裂はゲル電気泳動、及
び必要ならば、当技術分野で知られている関連した核酸
ハイブリダイゼーション技術によって定常的に検出され
得る。例えば、そのような「キメラ」は「ギャップマ
ー」即ち、オリゴヌクレオチドの中央部分（「ギャッ
プ」）が、例えばＲＮアーゼＨの基質として役立ち、
５'及び３'位（「ウィング」）が標的ＲＮＡ分子に対し
てより強い親和性を有するように修飾されているが、ヌ
クレアーゼ活性を支持することはできない（例えば、
２'−フルオロ又は２'ーメトキシエトキシ−で置換され
ている）オリゴヌクレオチドで有り得る。他のキメラ
は、「ウィングマー」、即ち５'部分が例えばＲＮアー
ゼＨの基質として役立つのに対し、３'部分は標的ＲＮ
Ａ分子に対してより強い親和性を有するように修飾され
ているが、ヌクレアーゼ活性を支持することはできない
（例えば、２'−フルオロ又は２'ーメトキシエトキシ−
で置換されている）オリゴヌクレオチド、又はその逆の
オリゴヌクレオチドを包含する。
【００２６】Ｆ．合成：本発明により使用されるオリゴ
ヌクレオチドは固相合成の既知技術を介して簡便かつ定
常的に作ることが可能である。そのような合成のための
装置は、例えばアプライド・バイオシステムズ（フォス
ターシティ、ＣＡ）を包含するいくつかのベンダーによ
って販売されている。当技術分野で知られているそのよ
うな合成の他の任意の手段は、追加的又は代替的に利用
し得る。ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体のよ
うな他のオリゴヌクレオチドを製造する同様の技術を使
用することも知られている。
【００２７】１．教示 特定の修飾を施されるオリゴヌ
クレオチドの合成に関する教示は以下の米国特許又は出
願中の特許出願に見出され得るが、そのいずれも本出願
と同様に譲渡されている：米国特許第５，１３８，０４
５及び５，２１８，１０５号、ポリアミンが結合したオ
リゴヌクレオチドへ引用；米国特許第５，２１２，２９
５号、キラルなリン結合を有するオリゴヌクレオチドを
製造するためのモノマーへ引用；米国特許第５，３７
８，８２５号及び５，５４１，３０７号、修飾された骨
格を有するオリゴヌクレオチドへ引用；米国特許第５，
３８６，０２３号、骨格が修飾されたオリゴヌクレオチ
ド及び還元カップリングを介したその製造へ引用；米国
特許第５，４５７，１９１号、３−デアザプリン環シス
テムに基づいて修飾されたヌクレオベース及びその合成
法へ引用；米国特許第５，４５９，２５５号、Ｎ−２置
換されたプリンに基づいて修飾されたヌクレオベースに
引用；米国特許第５，５２１，３０２号、キラルなリン
結合を有するオリゴヌクレオチドの製造法へ引用；米国
特許第５，５３９，０８２号、ペプチド核酸へ引用；米
国特許第５，５５４，７４６号、β−ラクタム骨格を有
するオリゴヌクレオチドへ引用；米国特許第５，５７
１，９０２号、オリゴヌクレオチド合成の方法及び材料
へ引用；米国特許第５，５７８，７１８号、ヌクレオシ
ドの様々な任意の位置に結合した他の部分へのリンカー
として使用され得るアルキルチオ基を有するヌクレオシ
ドへ引用；米国特許第５，５８７，３６１号及び５，５
９９，７９７号、キラル純度の高いホスホロチオエート
結合を有するオリゴヌクレオチドへ引用；米国特許第
５，５０６，３５１号、２，６−ジアミノプリン化合物
を包含する、２'−Ｏ−アルキルグアノシン及び関連化
合物の製造方法へ引用；米国特許第５，５８７，４６９
号、Ｎ−２が置換されたプリンを有するオリゴヌクレオ
チドへ引用；米国特許第５，５８７，４７０号、３−デ
アザプリンを有するオリゴヌクレオチドへ引用；米国特
許第５，２２３，１６８号、１９９３年６月２９日発
行、及び５，６０８，０４６号、いずれも結合した４'
−デスメチルヌクレオシド類似体へ引用；米国特許第
５，６０２，２４０号及び５，６１０，２８９号、骨格
修飾したオリゴヌクレオチド類似体へ引用；及び米国特
許出願第０８／３８３，６６６号、１９９５年２月３日
出願、及び米国特許第５，４５９，２５５号、とりわけ
２'−フルオロ−オリゴヌクレオチドの合成法へ引用。
【００２８】２．５−メチル−シトシン：２'−メトキ
シエトキシ修飾オリゴヌクレオチドでは、５−メチル−
２'−メトキシエトキシ−シトシン残基が使用され、以
下のように製造される。
【００２９】（ａ）２，２’−アンヒドロ［１−β−D
−アラビノフラノシル）−５−メチルウリジン］：５−
メチルウリジン（リボシルチミン、ヤマサ、銚子、日本
の市販品）（７２．０ｇ，０．２７９Ｍ）、ジフェニル
カーボネート（９０．０ｇ，０．４２０Ｍ）及び重炭酸
ナトリウム（２．０ｇ，０．０２４Ｍ）をＤＭＦ（３０
０ｍＬ）に加えた。この混合液を撹拌しながら還流加熱
し、発生する二酸化炭素ガスを制御されたやり方で放出
させた。１時間後、やや黒ずんだ溶液を減圧濃縮した。
得られたシロップを、撹拌しながら、ジエチルエーテル
（２．５Ｌ）へ注いだ。生成物はゴムを形成した。エー
テルをデカントし、残渣を最少量のメタノール（約４０
０ｍＬ）に溶かした。この溶液を新鮮なエーテル（２．
５Ｌ）に注ぐと、堅いゴムを生じた。エーテルをデカン
トし、このゴムを真空オーブンにて乾燥させ（６０℃、
１ｍｍＨｇ、２４時間）、得られた固形物を粉砕して明
褐色の粉末にした（５７ｇ、粗収率８５％）。この物質
を以後の反応に使用した。
【００３０】（ｂ）２'−Ｏ−メトキシエチル−５−メ
チルウリジン：２，２'−アンヒドロ−５−メチルウリ
ジン（１９５ｇ，０．８１Ｍ）、ホウ酸トリス（２−メ
トキシエチル）（２３１ｇ，０．９８Ｍ）及び２−メト
キシエタノール（１．２Ｌ）を２Ｌのステンレス鋼圧力
容器へ加え、前もって１６０℃に加熱した油浴に置い
た。１５５−１６０℃で４８時間加熱した後、この容器
を開き、この溶液を蒸発乾固させ、ＭｅＯＨ（２００ｍ
Ｌ）を加えて磨砕した。残渣を温アセトン（１Ｌ）に懸
濁した。不溶性の塩を濾過し、アセトン（１５０ｍＬ）
で洗浄し、濾液を蒸発させた。残渣（２８０ｇ）をＣＨ
3ＣＮ（６００ｍＬ）に溶かし、蒸発させた。０．５％
Ｅｔ3ＮＨを含有するＣＨ2Ｃｌ2／アセトン／ＭｅＯＨ
（２０：５：３）でシリカゲルカラム（３ｋｇ）を充填
した。残渣をＣＨ2Ｃｌ2（２５０ｍＬ）に溶かし、シリ
カ（１５０ｇ）に吸着させてからカラムにロードした。
充填溶媒で生成物を溶出させ、生成物１６０ｇ（６３
％）を得た。
【００３１】（ｃ）２'−Ｏ−メトキシエチル−５'−Ｏ
−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン：２'−Ｏ
−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ｇ，
０．５０６Ｍ）をピリジン（２５０ｍＬ）と共沸させ、
残渣を乾燥させてからピリジン（１．３Ｌ）に溶かし
た。ジメトキシトリチルクロリドの第一アリコート（９
４．３ｇ，０．２７８Ｍ）を加え、この混合物を室温で
１時間撹拌した。ジメトキシトリチルクロリドの第二ア
リコート（９４．３ｇ，０．２７８Ｍ）を加え、この反
応物をさらに１時間撹拌した。次いでメタノール（１７
０ｍＬ）を加えて反応を止めた。ＨＰＬＣは、約７０％
の生成物の存在を示した。溶媒を蒸発させ、ＣＨ3ＣＮ
（２００ｍＬ）を加えて磨砕した。残渣をＣＨＣｌ
3（１．５Ｌ）に溶かし、２ｘ５００ｍＬの飽和ＮａＨ
ＣＯ3及び２ｘ５００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。
有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、濾過して、蒸発させた。
２７５ｇの残渣が得られた。この残渣を、０．５％Ｅｔ
3ＮＨを含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサン／アセトン
（５：５：１）で充填して溶出させる３．５ｋｇシリカ
ゲルカラムで精製した。純粋な分画を蒸発させて生成物
１６４ｇを得た。純度の低い分画からさらに約２０ｇを
得て、全体収量１８３ｇ（５７％）を得た。
【００３２】（ｄ）３'−Ｏ−アセチル−２'−Ｏ−メト
キシエチル−５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチ
ルウリジン：２'−Ｏ−メトキシエチル−５'−Ｏ−ジメ
トキシトリチル−５−メチルウリジン（１０６ｇ，０．
１６７Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（ＤＭＦ５６２ｍＬ及び
ピリジン１８８ｍＬから調製された３：１の混合液７５
０ｍＬ）及び無水酢酸（２４．３８ｍＬ，０．２５８
Ｍ）を合わせて室温で２４時間撹拌した。最初にｔｌｃ
サンプルをＭｅＯＨ添加で急冷し、ｔｌｃにより反応を
モニターした。ｔｌｃで判断して、反応終了後、ＭｅＯ
Ｈ（５０ｍＬ）を加え、混合液を３５℃で蒸発させた。
残渣をＣＨＣｌ3（８００ｍＬ）に溶かし、２ｘ２００
ｍＬの飽和重炭酸ナトリウム及び２ｘ２００ｍＬの飽和
ＮａＣｌで抽出した。水層はＣＨＣｌ3２００ｍＬで再
抽出した。一緒にした有機層を硫酸ナトリウムで乾燥
し、蒸発させ、残渣１２２ｇを得た（約９０％の生成
物）。この残渣を、３．５ｋｇシリカゲルカラムで精製
し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）を使用して溶出さ
た。純粋な生成物分画を蒸発させて９６ｇ（８４％）を
得た。
【００３３】（ｅ）３'−Ｏ−アセチル−２'−Ｏ−メト
キシエチル−５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチ
ル−４−トリアゾールウリジン：３'−Ｏ−アセチル−
２'−Ｏ−メトキシエチル−５'−Ｏ−ジメトキシトリチ
ル−５−メチルウリジン（９６ｇ，０．１４４Ｍ）をＣ
Ｈ3ＣＮ（７００ｍＬ）に溶かして第一の溶液を調製
し、取って置いた。トリアゾール（９０ｇ，１．３Ｍ）
のＣＨ3ＣＮ（１Ｌ）溶液へトリエチルアミン（１８９
ｍＬ，１．４４Ｍ）を加え、−５℃に冷却し、オーバー
ヘッド撹拌子を使用して０．５時間撹拌した。この溶液
を撹拌しながら、０−１０℃に保ちながら、ＰＯＣｌ3
を１滴ずつ３０分かけて加え、得られた混合液をさらに
２時間撹拌した。この溶液へ、第一の溶液を１滴ずつ４
５分間かけて加えた。得られた反応混合物を一晩冷室に
保管した。反応混合液から塩を濾過し、溶液を蒸発させ
た。残渣をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）に溶かし、不溶性の固形
物を濾過で除去した。濾液を１ｘ３００ｍＬのＮａＨＣ
Ｏ3及び２ｘ３００ｍＬの飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸
ナトリウムで乾燥し、蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃで
磨砕し、表題化合物を得た。
【００３４】（ｆ）２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−
Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン：３’−
Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−
ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウ
リジン（１０３ｇ，０．１４１Ｍ）のジオキサン（５０
０ｍＬ）溶液及びＮＨ4 ＯＨ（３０ｍＬ）を室温で２時
間撹拌した。このジオキサン溶液を蒸発させ、残渣をＭ
ｅＯＨ（２ｘ２００ｍＬ）で共沸させた。残渣をＭｅＯ
Ｈ（３００ｍＬ）に溶かし、２リットルのステンレス鋼
圧力容器へ移した。ＮＨ3 ガスが飽和したメタノール
（４００ｍＬ）を加え、容器を２時間１００℃へ加熱し
た（薄層クロマトグラフィー、ｔｌｃは完全な変換を示
した）。容器の内容物を蒸発乾固させ、残渣をＥｔＯＡ
ｃ（５００ｍＬ）に溶かし、飽和ＮａＣｌ（２００ｍ
Ｌ）で一度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥
し、溶媒を蒸発させ、表題化合物８５ｇ（９５％）を得
た。
【００３５】（ｇ）Ｎ4−ベンゾイル−２'−Ｏ−メトキ
シエチル−５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル
シチジン：２'−Ｏ−メトキシエチル−５'−Ｏ−ジメト
キシトリチル−５−メチルシチジン（８５ｇ，０．１３
４Ｍ）をＤＭＦ（８００ｍＬ）に溶かし、無水安息香酸
（３７．２ｇ，０．１６５Ｍ）を撹拌しながら加えた。
３時間撹拌した後、ｔｌｃは反応が約９５％完了したこ
とを示した。溶媒を蒸発させ、残渣をＭｅＯＨ（２００
ｍＬ）で共沸させた。残渣をＣＨＣｌ3（７００ｍＬ）
に溶かし、飽和ＮａＨＣＯ3（２ｘ３００ｍＬ）及び飽
和ＮａＣｌ（２ｘ３００ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ4で
乾燥し、蒸発させ、残渣（９６ｇ）を得た。この残渣
を、０．５％Ｅｔ3ＮＨを含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサ
ン（１：１）を溶出溶媒として使用する１．５ｋｇシリ
カゲルカラムでクロマトグラフ処理した。生成物の純粋
な分画を蒸発させて表題化合物９０ｇ（９０％）を得
た。
【００３６】（ｈ）Ｎ4−ベンゾイル−２'−Ｏ−メトキ
シエチル−５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル
シチジン−３'−アミダイト：Ｎ4−ベンゾイル−２'−
Ｏ−メトキシエチル−５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−
５−メチルシチジン（７４ｇ，０．１０Ｍ）をＣＨ2Ｃ
ｌ2（１Ｌ）に溶かした。テトラゾールジイソプロピル
アミン（７．１ｇ）及び２−シアノエトキシ−テトラ
（イソプロピル）亜リン酸塩（４０．５ｍＬ，０．１２
３Ｍ）を撹拌しながら窒素環境下で加えた。得られた混
合液を室温で２０時間撹拌した（ｔｌｃは反応が約９５
％完了したことを示した）。反応混合液を飽和ＮａＨＣ
Ｏ3（１ｘ３００ｍＬ）及び飽和ＮａＣｌ（３ｘ３００
ｍＬ）で抽出した。水性の洗浄液はＣＨ2Ｃｌ2（３００
ｍＬ）で再抽出し、抽出物を合わせ、ＭｇＳＯ4で乾燥
し、濃縮した。得られた残渣を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン
（３：１）を溶出溶媒として使用する１．５ｋｇシリカ
ゲルカラムでクロマトグラフ処理した。純粋な分画を合
わせて表題化合物９０．６ｇ（８７％）を得た。
【００３７】２．生物学的同等物：本発明の化合物は、
ヒトを包含する動物への投与時に、生物学的に活性なそ
の代謝物又は残基を（直接的又は間接的に）提供し得る
製剤的に許容される塩、エステル又はそのようなエステ
ルの塩又は他の任意の化合物を網羅する。従って、例え
ば、本発明の開示は本発明のオリゴヌクレオチドの「プ
ロドラッグ」及び「製剤的に許容される塩」、そのよう
なプロドラッグの製剤的に許容される塩及び他の生物学
的同等物へも引用される。
【００３８】Ａ．オリゴヌクレオチドプロドラッグ：本
発明のオリゴヌクレオチドは「プロドラッグ」の形態で
デリバリーされるように追加的又は代替的に製造され得
る。「プロドラッグ」という用語は、生体又はその細胞
の内部で、内因性の酵素又は他の化学品及び／又は条件
の作用によって活性形（つまり、薬物）へ変換される不
活性形で製造されている治療薬を示す。特に、本発明の
オリゴヌクレオチドのプロドラッグバージョンは、ＷＯ
９３／２４５１０号、Gosselinら、１９９３年１２月９
日公開、に開示された方法に準拠して、ＳＡＴＥ［リン
酸（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）］誘導体として製
造される。
【００３９】Ｂ．製剤的に許容される塩：「製剤的に許
容される塩」という用語は、本発明のオリゴヌクレオチ
ドの生理学的及び製剤的に許容される塩、即ち、親化合
物の所望の生物学的活性を保持し、所望されない毒性効
果をそれへ分与しない塩に言及する。
【００４０】製剤的に許容される塩基付加塩は、アルカ
リ及びアルカリ土類金属又は有機アミンのような金属又
はアミンとともに形成される。カチオンとして使用され
る金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、
カルシウム等である。好適なアミンの例は、Ｎ，Ｎ'−
ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリ
ン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エ
チレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン及びプロカイン
である（例えば、Berge et al., "Pharmaceutical Salt
s," J. of Pharma Sci., 1977, 66: 1を参照のこと）。
前記酸性化合物の塩基付加塩は、従来法で塩を産生する
ために、十分量の所望の塩基にフリーの酸を接触させる
ことによって製造される。フリーの酸は、従来法でこの
塩形態を酸に接触させ、フリーの酸を単離することによ
って再生され得る。フリーの酸形態は、極性溶媒におけ
る溶解度のようなある物理的性質においてそれぞれの塩
形態とやや異なるが、他の点では、本発明の目的にとっ
て塩はそれぞれのフリー酸と同等である。本明細書で使
用されるように、「医薬付加塩」は、本発明の組成物を
構成する成分の１つの酸形態の製剤的に許容される塩を
包含する。これらは、上記アミンの有機又は無機酸塩を
包含する。好ましい酸塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル
酸塩、硝酸塩及びリン酸塩である。他の好適な製剤的に
許容される塩は当業者によく知られていて、様々な無機
及び有機酸の塩基性塩を包含する。この酸は、例えば塩
酸、臭酸、硫酸又はリン酸のような無機酸；例えば酢
酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン
酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル
酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、
グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、ケイ
皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル
酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香
酸、エンボン酸、ニコチン酸又はイソニコチン酸といっ
た、有機カルボン酸、スルホン酸、スルホ又はホスホ酸
又はＮ−置換スルファミン酸；例えば、グルタミン酸又
はアスパラギン酸といった天然のタンパク質合成に関わ
る２０種のアルファ−アミノ酸のようなアミノ酸；フェ
ニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−
ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスル
ホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスル
ホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−
１，５−ジスルホン酸、２−又は３−ホスホグリセリン
酸エステル、グルコース−６−リン酸、Ｎ−シクロヘキ
シルスルファミン酸（シクラメートの形成とともに）、
又はアスコルビン酸のような他の酸有機化合物である。
化合物の製剤的に許容される塩はまた製剤的に許容され
るカチオンとともに製造し得る。製剤的に許容される好
適なカチオンは当業者によく知られていて、アルカリ、
アルカリ土類、アンモニウム及び４級アンモニウムカチ
オンを包含する。炭酸塩又は炭酸水素塩も可能である。
【００４１】オリゴヌクレオチドにとっては、製剤的に
許容される塩の好ましい例は、限定しないが、（ａ）ナ
トリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カ
ルシウム、スペルミン及びスペルミジンのようなポリア
ミン等のようなカチオンとともに形成される塩；（ｂ）
塩酸、臭酸、硫酸、リン酸、硝酸等の無機酸と形成され
る酸付加塩；（ｃ）例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コ
ハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン
酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン
酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナ
フタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエン
スルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロ
ン酸等のような有機酸と形成される塩；及び（ｄ）塩
素、臭素及びヨウ素のようなアニオン元素から形成され
る塩を包含する。
【００４２】３．本発明の有用性の例：本発明のオリゴ
ヌクレオチドはＪＮＫタンパク質をコードする核酸（例
えば、ｍＲＮＡ）に特異的にハイブリダイズする。本発
明のオリゴヌクレオチドは治療用化合物として、キット
へ取込まれ得る診断ツール又は研究試薬として、及び精
製及び細胞産物の調製並びに他の方法において利用さ
れ、それらは当業者により理解される。
【００４３】Ａ．アッセイ及び診断上の応用：本発明の
オリゴヌクレオチドはＪＮＫタンパク質特異的な核酸の
細胞又は組織サンプルにおける存在を検出するために使
用され得る。例えば、ポリヌクレオチドキナーゼを用い
て５'末端に32Ｐ標識化をすることにより放射標識オリ
ゴヌクレオチドを製造し得る（Sambrook et al., Molec
ular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Har
bor Laboratory Press, 1989, Volume 2, pg. 10. 5
9.）。次いで放射標識オリゴヌクレオチドを、ＪＮＫタ
ンパク質メッセージＲＮＡ（及びＪＮＫタンパク質）を
含有することが疑われる細胞又は組織サンプルに接触さ
せ、そのサンプルを洗浄して非結合オリゴヌクレオチド
を除去する。サンプルに残存する放射活性は、結合した
オリゴヌクレオチドの存在を示し、さらにオリゴヌクレ
オチドに相補的な核酸の存在を示し、シンチレーション
カウンター又は他の常法を使用して定量化され得る。こ
のように上記タンパク質をコードする核酸の発現が検出
される。
【００４４】本発明の放射標識オリゴヌクレオチドはま
た、研究、診断又は治療の目的でＪＮＫタンパク質の局
在化、分布及び定量を決定するために組織のオートラジ
オグラフィーを実施するために使用され得る。そのよう
な研究では、組織切片を放射標識オリゴヌクレオチドで
処理し、上記のように洗浄し、通常のオートラジオグラ
フィー法により写真用乳剤へ感光させる。この乳剤は、
現像すると、ＪＮＫタンパク質遺伝子を発現している領
域に銀粒子を造影する。銀粒子の定量により上記タンパ
ク質をコードするｍＲＮＡ分子の発現の検出及びこれら
エリアに対するオリゴヌクレオチドの標的化が可能にな
る。
【００４５】放射標識の代わりにフルオレセイン又は他
の蛍光性タグと結合した本発明のオリゴヌクレオチドを
使用して、ＪＮＫタンパク質核酸の発現を蛍光検出する
類似のアッセイが開発され得る。そのような結合は、蛍
光物質で標識したアミダイト又は制御孔ガラス（ＣＰ
Ｇ）カラムを使用する固相合成の間に常法により達成さ
れる。フルオレセイン標識アミダイト及びＣＰＧは、例
えばGlen Research，Sterling VAから入手可能である。
オリゴヌクレオチドを標識する他の方法が当技術分野で
知られている（例えば、Ruth, Chapter 6 In: Methods
in Molecular Biology, Volume 26: Protocols for Oli
gonucleotide Conjugates, Agrawal, ed.,Humana Press
Inc., Totowa, NJ, 1994, pages 167-185を参照のこ
と）。
【００４６】ＪＮＫタンパク質の発現の存在又は不在を
検出するキットも製造され得る。そのようなキットは、
適切な遺伝子、即ちＪＮＫタンパク質をコードする遺伝
子を標的にしたオリゴヌクレオチドを包含する。例え
ば、「サンドイッチ」アッセイのような適切なキット及
びアッセイフォーマットが当技術分野で知られていて、
本発明のオリゴヌクレオチドを用いた使用のために容易
に適用し得る。ＪＮＫタンパク質をコードしている核酸
と本発明のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーショ
ンは、当技術分野に知られている手段により検出され得
る。そのような手段は、酵素のオリゴヌクレオチドへの
結合、オリゴヌクレオチドの放射標識化又は他の適切な
検出システムを包含する。
【００４７】Ｂ．タンパク質の精製：本発明のオリゴヌ
クレオチドはまた、ポリペプチド配列及び生化学的特性
に関して互いに似ているＪＮＫタンパク質のセットを通
常発現する細胞から特定のＪｕｎキナーゼタンパク質を
精製するために有用である。１例として、ＪＮＫ１、Ｊ
ＮＫ２及びＪＮＫ３タンパク質を発現する細胞からＪＮ
Ｋ１タンパク質を精製することは、ＪＮＫ２及びＪＮＫ
３の発現を阻害するオリゴヌクレオチド及び／又はＪＮ
Ｋ１の発現を増加させるオリゴヌクレオチドでそのよう
な細胞をまず処理することによって強化され得る。なぜ
なら、そのような処理がＪＮＫ２及びＪＮＫ３に対する
ＪＮＫ１の相対比を高めるからである。結果として、そ
のように処理された細胞から調製される抽出物におけ
る、生化学的に似ている（従って混在する可能性が高
い）ＪＮＫ２及びＪＮＫ３タンパク質の量が減少するの
で、以下の精製工程におけるＪＮＫ１の収率が増加す
る。
【００４８】Ｃ．生物学的に活性なオリゴヌクレオチ
ド：本発明はまた、生物学的活性を有するオリゴヌクレ
オチドの、培養細胞、単離組織及び臓器及び動物への投
与へ引用される。「生物学的活性を有する」とは、培養
細胞、単離組織又は臓器及び／又は動物における１種ま
たはそれ以上の遺伝子の発現をモジュレートするように
オリゴヌクレオチドが機能することを意味する。そのよ
うなモジュレーションは、限定しないが、転写停止；Ｒ
ＮＡプロセシング（キャッピング、ポリアデニル化及び
スプライシング）及び輸送に対する効果；標的核酸の細
胞分解の強化；及び翻訳停止を含む、当技術分野で知ら
れている多様なメカニズムを介してアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドにより達成され得る（Crook et al., Exp.
Opin. Ther. Patents, 1996, 6: 855）。
【００４９】ヒト以外の動物において、本発明の組成物
及び方法は動物の１種またはそれ以上の遺伝子の機能を
研究するために使用され得る。例えば、アンチセンスオ
リゴヌクレオチドは、神経死におけるＮ−メチル−Ｄ−
アスパラギン酸受容体の役割を研究するためにラット
へ、プロテインキナーゼＣ−αの生物学的役割を検討す
るためにマウスへ及び不安症における神経ペプチドＹ１
受容体の役割を検証するためにラットへ、全身投与され
てきた（それぞれ、Wahlestedt et al., Nature,1993,
363: 260; Dean et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.
S. A., 1994, 91:11762; 及びWahlestedt et al., Scie
nce, 1993, 259: 528）。関連するタンパク質の複合フ
ァミリーが研究されている例では、「アンチセンスノッ
クアウト」（即ち、アンチセンスオリゴヌクレオチドの
全身投与による遺伝子の阻害）は、このファミリーの特
定メンバーを検証するための最も正確な手段を代表し得
る（概論として、Albert et al., Trends Pharmacol. S
ci., 1994, 15: 250を参照のこと）。
【００５０】本発明の組成物及び方法は、１種又はそれ
以上の核酸を用いて全体的又は部分的に治療され得る疾
患又は障害を有している（即ち、病んでいる）又は罹り
やすいことが知られているか又は疑われる、ヒトを包含
する動物における治療上の使用を有する。「治療上の使
用」という用語は、in vivo又はex vivoのいずれかで本
発明のオリゴヌクレオチドを動物の細胞と接触させる予
防、一時緩和及び治癒上の使用を網羅する。動物細胞と
ex vivoで接触させる場合、治療上の使用は、本発明の
１種又はそれ以上のオリゴヌクレオチドで処理した後で
そのような細胞を動物へ取込ませることを包含する。
【００５１】治療上の使用のために、ＪＮＫタンパク質
の発現又は活性をモジュレートすることにより治療又は
予防され得る疾患又は障害を有していると疑われる動物
は、例えば、本発明に準拠してオリゴヌクレオチドを投
与することによって治療される。本発明のオリゴヌクレ
オチドは、有効量のオリゴヌクレオチドを、例えば希釈
剤のような製剤的に許容される好適な担体へ加えること
によって、医薬組成物において利用され得る。本分野の
研究者たちは、ウイルス、真菌及び代謝性の疾患との関
連が示唆される遺伝子の発現をモジュレートし得る、ア
ンチセンス、三重鎖及び他のオリゴヌクレオチド組成物
を同定した。アンチセンスオリゴヌクレオチドはヒトに
対して安全に投与され、すでにいくつかの臨床試験が進
行している。従って、オリゴヌクレオチドが細胞、組織
及び動物、特にヒトの治療のための治療方式に有用であ
るように形成し得る、有用な治療手段となり得ることは
すでに立証されている。以下の米国特許は、アンチセン
スオリゴヌクレオチドを利用した症状改善、治療及び他
の方法を示す。米国特許第５，１３５，９１７号はヒト
インターロイキン−１受容体の発現を阻害するアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドを提供する。米国特許第５，０
９８，８９０号は、ｃ−ｍｙｂ癌遺伝子に相補的なアン
チセンスオリゴヌクレオチド及びある癌性病態に対する
アンチセンスオリゴヌクレオチド治療に向けられてい
る。米国特許第５，０８７，６１７号は、アンチセンス
オリゴヌクレオチドを用いて癌患者を治療する方法を提
供する。米国特許第５，１６６，１９５号は、ヒト免疫
不全ウイルス（ＨＩＶ）のオリゴヌクレオチド阻害剤を
提供する。米国特許第５，００４，８１０号は、単純ヘ
ルペス・ウイルスのＶｍｗ６５ｍＲＮＡにハイブリダイ
ズして複製を阻害し得るオリゴマーを提供する。米国特
許第５，１９４，４２８号は、インフルエンザ・ウイル
スに対する抗ウイルス活性を有するアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドを提供する。米国特許第４，８０６，４６
３号は、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びそれを使
用してＨＴＬＶ−ＩＩＩの複製を阻害する方法を提供す
る。米国特許第５，２８６，７１７号は、癌遺伝子の一
部に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを提供する。米国特許第５，２７６，０１９号及び米
国特許第５，２６４，４２３号は、細胞における異種核
酸の複製を阻害するために使用されるホスホロチオエー
ト・オリゴヌクレオチド類似体に向けられている。米国
特許第４，６８９，３２０号は、サイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）に特異的な抗ウイルス剤としてのアンチセン
スオリゴヌクレオチドに向けられている。米国特許第
５，０９８，８９０号は、ヒトｃ−ｍｙｂ遺伝子のｍＲ
ＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的なオリゴヌクレオ
チドを提供する。米国特許第５，２４２，９０６号は、
潜在性エプスタイン−バー・ウイルス（ＥＢＶ）感染の
治療に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供す
る。
【００５２】本明細書で使用される「疾患又は障害」と
いう用語は、（１）特に感染、生まれつきの弱さ、環境
上のストレスの結果として、正常な生理機能を損なわせ
る生物体又はその部分の異常な状態を包含し；（２）妊
娠そのものは除外するが、妊娠に関連した自己免疫及び
他の疾患は除外せず；（３）癌及び腫瘍を包含する。
「疾患又は障害に罹りやすいことが知られているか又は
疑われる」という用語は、被検動物が、その動物の一般
集団に比較して、本明細書に定義されたような特定の疾
患又は障害を発症するリスクがより高いと決定された、
又はその疑いがあるということを示している。例えば、
「疾患又は障害に罹りやすいことが知られているか又は
疑われる」被検動物は、特定の疾患又は障害の頻発を包
含する既往歴及び／又は家族歴を有し得る。他の例とし
て、「疾患又は障害に罹りやすいことが知られているか
又は疑われる」被検動物は、当技術分野で知られている
技術に準じた遺伝子スクリーニングによって決定される
罹病性を有し得る（例えば、U.S.Congress,Office of T
echnology Assessment, Chapter 5 In:Genetic Monitor
ing and Screening in the Workplace, OTA-BA-455, U.
S.Government Printing Office,Washington D.C., 199
0, pages 75-99を参照のこと）。「１種又はそれ以上の
核酸を用いて全体的又は部分的に治療され得る疾患又は
障害」という用語は、本明細書に定義される疾患又は障
害に言及し、（１）その管理、モジュレーション又は治
療及び／又は（２）その治療、一次緩和及び／又は予防
的な救済は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与を
介して提供され得る。
【００５３】４．医薬組成物：本発明のオリゴヌクレオ
チドを含んでなる医薬組成物の製剤及びその後の投与は
当業者の技術の範囲内にあると考えられる。
【００５４】Ａ．治療上の考察：一般に、治療応用のた
めには、患者（即ち、疾患又は障害を有するか又はその
素因がある、ヒトを包含する動物）へ、本発明により、
患者の年齢及び治療される障害又は病態の重症度に依存
して体重ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇの範囲の用
量で、製剤的に許容される担体において、１種又はそれ
以上のオリゴヌクレオチドが投与される。さらに、治療
方式は、特定の疾患又は障害の性質、その重症度及び患
者の全般的な状態に応じて変化し得る時間だけ続き得る
し、１日１回から２０年に１回まで拡張し得る。本発明
の文脈では、「治療方式」は、治療、症状緩和及び予防
のモダリティを網羅すると意味される。治療の後に、患
者は彼／彼女の状態変化及び障害又は病態の症状緩和に
ついてモニターされる。核酸の投与量は、現行の投与レ
ベルに対し患者が有意に反応しない場合に増加され得る
か、障害又は病態の症状緩和が認められるか又は障害又
は病態が消失すれば、用量は減少され得る。
【００５５】投与は治療される病態の重症度及び反応性
に依存し、治療期間は数日から数ヶ月、又は治療が効果
を示すか又は病態の減衰が達成されるまで続く。最適な
投与スケジュールは、患者体内の薬物蓄積量の測定から
算出され得る。当業者は、最適投与量、投与方法及び反
復率を容易に決定し得る。最適投与量は個々のオリゴヌ
クレオチドの相対効力によって変化し得るが、一般には
in vitro及びin vivo動物モデルにおいて有効とされた
ＥＣ50に基づいて推定され得る。一般に、投与量は体重
ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇであり、１日、１
週、１月又は１年につき１回又はそれ以上、又は２〜２
０年に１回でさえ与えられ得る。最適な投与スジュール
は、特定の投与形式を介して投与される治療有効量のオ
リゴヌクレオチドをデリバリーするために使用される。
【００５６】「治療有効量」という用語は、本発明の目
的のためには、（毒性、刺激又はアレルギー反応のよう
な）望まれない副作用を伴わずに意図された目的を達成
するために有効であるオリゴヌクレオチド含有医薬組成
物の量に言及する。個々のニーズは異なり得るが、有効
量の医薬組成物の最適範囲を決定することは、当技術分
野の技術内にある。ヒトへの投与量は動物試験から外挿
され得る（Katocs etal., Chapter 27 In:Remington's
Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.,Gennaro, ed., Ma
ck Publishing Co., Easton, PA, 1990）。一般に、有
効量の医薬組成物を提供するのに必要とされる投与量
は、当業者によって調整され得るが、レシピエントの年
齢、健康、身体状態、体重、疾患又は障害のタイプ及び
程度、治療頻度、（もしあれば）併用療法の性質及び所
望される効果の性質及び範囲に依存して変化する（Nies
et al., Chapter 3 In: Goodman & Gilman's The Phar
macological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardma
n et al., eds., McGraw-Hill, New York，NY,1996）。
【００５７】本明細書で使用されるように、「ハイリス
ク者」という用語は、例えば個人又は家族の病歴又は遺
伝子検査によって、疾患又は障害の発症又は再発に罹る
確率が正常より有意に高いことが決定された個人に言及
する。ハイリスク者に対する治療様式の技術として、そ
の個人は疾患又は障害の発症又は再発を防ぐために予防
的に治療され得る。「予防的に有効な量」という用語
は、疾患又は障害の発症又は再発の予防として認められ
る効果を生み出す医薬組成物の量に言及することを意味
する。医薬組成物の予防的に有効な量は、典型的には、
同様の状態にある個人へ活性薬剤のない第二の医薬組成
物を投与したときに観察される効果と比較した効果によ
って決定される。
【００５８】成功した治療の後には、患者に維持療法を
施し、病態の再発を予防することが望ましい場合があ
る。ここで核酸は、体重ｋｇあたり０．０１μｇ〜１０
０ｇの範囲で、１日１回又はそれ以上〜２０年ごとに１
回まで、維持用量で投与される。例えば、自己免疫又は
炎症疾患に罹りやすいことが知られているか又は疑われ
る個人の症例では、体重ｋｇあたり０．０１μｇ〜１０
０ｇの範囲で、１日１回又はそれ以上〜２０年ごとに１
回まで予防用量を投与することにより予防効果が達成さ
れ得る。同様のやり方で、ある医学治療の結果として起
こることが予測される炎症疾患（例えば細胞、組織又は
臓器を個人へ移植することから生じる対宿主移植片）に
対して個人は罹りにくくなり得る。
【００５９】ある症例では、治療方式の効力を高めるた
めに、本発明のオリゴヌクレオチドを他の従来治療モダ
リティと併用して治療することがより有効であり得る。
本発明の文脈では、「治療方式」という用語は、治療、
一時緩和及び予防モダリティを網羅することを意味す
る。例えば、患者は、従来の化学療法剤、特に腫瘍及び
癌の治療に使用されているものを用いて治療され得る。
そのような化学療法剤の例は、限定しないが、ダウノル
ビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソル
ビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、
ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、シ
トシンアラビノシド、ビス−クロロエチルニトロソ尿
素、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシ
ンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロ
ゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカル
バジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペン
タメチルメラミン、ミトザントロン、アムサクリン、ク
ロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソ尿素、ナ
イトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスフ
ァミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シ
タラビン（ＣＡ）、５−アザシチジン、ヒドロキシ尿
素、デオキシコフォルマイシン、４−ヒドロキシぺルオ
キシシクロホスホルアミド、５−フルオロウラシル（５
−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄ
Ｒ）、メトトレキセート（ＭＴＸ）、コルヒチン、ビン
クリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、トリメトレ
キセート、テニポシド、シスプラチン及びジエチルスチ
ルベストロール（ＤＥＳ）を包含する（一般論として
は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15t
h Ed., pp. 1206-1228, Berkow et al., eds., Rahay,
N.J., 1987を参考のこと）。本発明の化合物とともに使
用されるとき、そのような化学療法剤は別個に（例え
ば、５−ＦＵとオリゴヌクレオチド）、連続的に（例え
ば、ある期間の５−ＦＵとオリゴヌクレオチドの後でＭ
ＴＸとオリゴヌクレオチド、というように）又は１種又
はそれ以上の他の化学療法剤とともに（例えば、５−Ｆ
Ｕ、ＭＴＸ及びオリゴヌクレオチド、又は５−ＦＵ、放
射線療法及びオリゴヌクレオチド）使用され得る。
【００６０】本発明の別の好ましい態様では、第一のＪ
ＮＫタンパク質を標的にした第一のアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドは、第二のＪＮＫタンパク質を標的にした
第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドと複合して使用
され、いずれかのオリゴヌクレオチドを別々に使用する
ときより広汎な程度でＪＮＫタンパク質への標的化が達
成される。本発明の様々な態様では、そのようなオリゴ
ヌクレオチドによって標的化された第一及び第二のＪＮ
Ｋタンパク質は、同一であるか、異なるＪＮＫタンパク
質であるか又は同一ＪＮＫタンパク質の異なるイソ型で
ある。
【００６１】Ｂ．医薬組成物：オリゴヌクレオチドの非
腸管外投与用の医薬組成物は、緩衝液、希釈剤及び他の
適切な添加剤も含有する滅菌水溶液を包含し得る。非腸
管外投与に好適で、オリゴヌクレオチドとは有害に反応
しない、製剤的に許容される有機又は無機の担体物質が
使用され得る。適切な製剤的に許容され得る担体は、限
定しないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレング
リコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステア
リン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィ
ン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリド
ン等を包含する。医薬組成物は滅菌され、所望ならば、
医薬組成物のオリゴヌクレオチドとは有害に反応しない
補助剤、例えば潤滑剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳
化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝液、着色
剤、矯味矯臭剤及び／又は芳香剤等、と混合され得る。
水性懸濁液の形態の医薬組成物は、例えば、カルボキシ
メチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又は
デキストランを包含する、懸濁液の粘度を高める物質を
含有し得る。所望により、そのような懸濁液は安定化剤
をも含有し得る。
【００６２】本発明の１つの態様では、オリゴヌクレオ
チドは経直腸の形式を介して投与される。特に、直腸投
与用の医薬組成物は、泡剤、溶液（浣腸剤）及び坐剤を
包含する。成人用直腸坐剤は、普通片端又は両端が先細
になっていて、典型的には１つあたり約２ｇの重さであ
り、幼児用の直腸坐剤は、典型的にはその約半分の重量
で、通常の基剤にココア脂が使用される（Block, Chapt
er 87 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18t
h Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co.,Easton, P
A, 1990）。
【００６３】本発明の好ましい態様では、１種又はそれ
以上の核酸が経口デリバリーを介して投与される。経口
投与の医薬組成物は、散剤又は顆粒剤、水又は非水性媒
体の懸濁液又は溶液、カプセル、小袋（sachet）、トロ
ーチ、錠剤又はＳＥＣ（軟弾性のカプセル又は「カプレ
ット」）を包含する。濃縮剤、矯味矯臭剤、希釈剤、乳
化剤、分散補助剤、担体物質又は結合剤が所望によりそ
のような医薬組成物へ加え得る。そのような医薬組成物
の使用は、オリゴヌクレオチドを消化管へデリバリーし
てその粘膜へ曝す効果を有する。従って、この医薬組成
物は、胃の極端なｐＨからオリゴヌクレオチドを防御す
るか又は時間をかけてオリゴヌクレオチドを放出し特定
の粘膜部位へのそのデリバリーを最適化するのに有効な
材料から構成され得る。酸抵抗性の錠剤、カプセル及び
カプレットの腸溶コーティング剤が当技術分野で知られ
ていて、典型的には酢酸フタレート、プロピレングリコ
ール及びソルビタンモノオレアートを包含する。
【００６４】消化管デリバリー用の医薬組成物を生産す
るための様々な方法が当技術分野でよく知られている。
一般論としては、Nairn, Chapter 83; Block, Chapter
87;Rudnic et al., Chapter 89; Porter, Chapter 90:
and Longer et al., Chapter91 In: Remington's Pharm
aceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack P
ublishing Co., Easton, PA, 1990を参照のこと。本発
明のオリゴヌクレオチドは、不活性で毒性のない、製剤
的に許容される担体（賦形剤）を使用して、錠剤、被覆
された錠剤、丸剤、顆粒剤、エアゾール、シロップ、乳
剤、懸濁剤及び溶液のような通常の医薬組成物へ既知の
方法で取込まれ得る。治療活性のある化合物は、いずれ
の製剤の場合でも、全混合物の約０．５〜約９５の重量
％濃度、つまり、所定の投与量の範囲を達成するに十分
な量で存在すべきである。医薬組成物は、例えば、乳化
剤及び／又は分散剤を適宜使用して、製剤的に許容され
る担体で活性化合物を希釈することによって調製される
し、例えば水が希釈剤として使用される場合は、有機溶
媒が補助溶媒として適宜使用され得る。医薬組成物は製
剤的に許容される担体を適宜追加して使用する従来の方
法で製剤化され得る。従って、組成物は、結合剤（例、
ゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリド
ン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤
（例、ラクトース、微結晶性セルロース又はリン酸水素
カルシウム）；潤滑剤（例、ステアリン酸マグネシウ
ム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例、デンプン又はス
ターチグリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例、ラ
ウリル硫酸ナトリウム）のような追加の賦形剤を用いる
従来の手段によって調製され得る。錠剤は当技術分野で
よく知られている方法により被覆し得る。この調製物は
また矯味矯臭剤、着色剤及び／又は甘味剤を適宜含有し
得る。
【００６５】この医薬組成物は、ユニット投与量の形態
で簡便にも表され得るが、製薬業界でよく知られている
従来技術に準じて調製され得る。そのような技術は、活
性成分を製剤的に許容される担体と会合させる工程を包
含する。一般に、この医薬組成物は、活性成分を液状の
賦形剤又は微細化した固体の賦形剤と、又はその両方
と、均一かつ緊密に会合させることにより、次いで必要
ならば、生成物を成型することにより、調製される。
【００６６】経口投与に適した本発明の医薬組成物は、
カプセル剤、カシェ剤又は錠剤のようなそれぞれ一定量
の活性成分を含有する別個のユニットとして、散剤又は
顆粒剤として、水性液体又は非水性液体の溶液又は懸濁
液として、又は水中油系の乳濁液又は油中水系の液体乳
剤として表され得る。錠剤は、所望により１つ又はそれ
以上の副成分とともに、圧縮又は成型により作られ得
る。圧縮錠剤は、紛体や顆粒のような自由に流動する形
態のなかにある活性成分を、所望により結合剤、潤滑
剤、不活性希釈剤、保存剤、界面活性又は分散剤ととも
に混合して、適切な機械において圧縮することにより製
造され得る。成型錠剤は、不活性な液体希釈剤で湿らし
た紛体化した化合物の混合物を適切な機械において成型
することにより作られ得る。錠剤は所望により被覆した
り刻みを入れることが可能であり、そのなかの活性成分
の遅延又は制御された放出をもたらすように製剤化され
得る。腸管外、鞘内又は脳室内投与の医薬組成物、又は
コロイド分散系は、緩衝液、希釈剤及び他の適切な添加
剤も含有し得る滅菌水溶液を包含し得る。
【００６７】Ｃ．浸透増進剤：本発明のオリゴヌクレオ
チドを含んでなる医薬組成物は、オリゴヌクレオチドの
消化管デリバリーを増強するために浸透増進剤も包含し
得る。浸透増進剤は５つの広いカテゴリー、即ち、脂肪
酸、胆汁酸塩、キレート剤、界面活性剤及び非界面活性
剤、の１つに属するものとして分類され得る（Leeet a
l., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier S
ystems, 1991, 8:91-192; Muranishi, Critical Review
s in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7:
1）。
【００６８】１．脂肪酸：浸透増進剤として作用する様
々な脂肪酸及びその誘導体は、例えばオレイン酸、ラウ
リン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ス
テアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリレー
ト、トリカプリレート、レシンレエート、モノオレイン
（1−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロールとしても
知られる）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、
グリセリル−１−モノカプレート、１−ドデシルアザシ
クロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコ
リン、モノ及びジグリセリド、及びそれらの生理学的に
許容される塩（即ち、オレエート、ラウレート、カプレ
ート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リ
ノレエート等）を包含する（Lee et al., Critical Rev
iews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pa
ge 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic
Drug Carrier Systems, 1990, 7:1; El-Hariri et al.,
J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44:651）。
【００６９】２．胆汁酸塩：胆汁の生理学的役割は、脂
質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収の促進を包含する
（Brunton, Chapter 38 In: Goodman & Gilman's The P
harmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Har
dman et al., eds., McGraw-Hill, New York，NY,1996,
pages 934-935）。様々な天然の胆汁酸塩及びその合成
誘導体が浸透増進剤として作用する。従って、「胆汁酸
塩」という用語は、胆汁の天然に存在する成分並びにそ
の任意の合成誘導体を包含する。
【００７０】３．キレート剤：キレート剤はＤＮアーゼ
阻害剤としても役立つという追加の利点を有し、限定し
ないが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴ
Ａ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナ
トリウム、５−メトキシサリチル酸塩及びホモバニレー
ト）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９及
びベータ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミ
ン）を包含する（Lee et al., Critical Reviews in Th
erapeutic Drug Carrier Systems, 1991,page 92; Mura
nishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrie
r Systems, 1990, 7:1; Buur et al., J. Control Re
l., 1990, 14:43）。
【００７１】４．界面活性剤：界面活性剤は、例えば、
ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラ
ウリルエーテル及びポリオキシエチレン−２０−セチル
エーテル（Lee et al., Critical Reviews in Therapeu
tic Drug Carrier Systems, 1991, page 92）；及びＦ
Ｃ−４３のようなペルフルオロケミカル乳剤（Takahash
i et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40:252）を包
含する。
【００７２】５．非界面活性剤：非界面活性剤は、例え
ば、不飽和環式尿素、1−アルキル及び1−アルケニルア
ザシクロ−アルカノン誘導体（Lee et al., CriticalRe
views in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p
age 92）；及びジクロフェナクナトリウム、インドメタ
シン及びフェニルブタゾンのような非ステロイド性抗炎
症薬（Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 198
7, 39:621）を包含する。
【００７３】Ｄ．担体化合物：本明細書で使用される
「担体化合物」は、不活性である（即ち、それ自身は生
物学的活性を保有しない）が、例えば生物学的に活性の
ある核酸を分解するか又はその循環からの除去を促進す
ることによって、生物学的活性を有する核酸のバイオア
ベイラビリティを減少させるin vivoプロセスによって
核酸として認知される核酸又はその類似体に言及する。
核酸及び担体化合物の同時投与は、典型的には後者の物
質が過剰であるが、肝臓、腎臓又は他の循環外レザバー
において回収される核酸の量を実質的に減少させるが、
これは恐らく共通の受容体に対する担体化合物と核酸の
競合によるものであろう。例えば、部分的にホスホロチ
オエート化されたオリゴヌクレオチドの肝臓組織におけ
る回収は、それがポリイノシン酸、硫酸デキストラン、
ポリシチジン酸又は４−アセトアミド−４'−イソチオ
シアノ−スチルベン−２，２'−ジスルホン酸と同時投
与されるとき、減少する（Miyao et al., Antisense Re
s. Dev., 1995, 5:115; Takakura et al., Antisense &
Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6:177）。
【００７４】Ｅ．担体化合物とは対照的に、「製剤的に
許容される担体」（賦形剤）は、製剤的に許容される溶
媒、懸濁剤、又は１種又はそれ以上の核酸を動物へデリ
バリーする他の任意の薬理学的に不活性な担体である。
製剤的に許容される担体は、液体又は固体であり得て、
計画された投与方法に基づいて、規定された医薬組成物
の核酸及び他の成分とともに組み合わせたときに、所望
の大きさ、コンシステンシー等をもたらすように選択さ
れる。典型的な製剤的に許容される担体は、限定しない
が、結合剤（例、ゼラチン化トウモロコシデンプン、ポ
リビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセル
ロース等）；充填剤（例、ラクトース及び他の糖、微結
晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウ
ム、エチルセルロース、ポリアクリレート又はリン酸水
素カルシウム等）；潤滑剤（例、ステアリン酸マグネシ
ウム、タルク、シリカ、コロイダル二酸化シリコン、ス
テアリン酸、金属ステアリン酸塩、水素添加植物油、コ
ーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナト
リウム、酢酸ナトリウム等）；崩壊剤（例、デンプン、
スターチグリコール酸ナトリウム等）；又は湿潤剤（ラ
ウリル硫酸ナトリウム等）を包含する。持続放出型の経
口デリバリーシステム及び／又は経口投与剤形の腸溶コ
ーティング剤については米国特許第４，７０４，２９５
号；４，５５６，５５２号；４，３０９，４０６号；及
び４，３０９，４０４号に記載されている。
【００７５】Ｆ．他の追加成分：本発明の組成物は、医
薬組成物に従来的に見出される他の付加成分を、その現
行技術で確立された使用レベルで、追加的に含有し得
る。従って、例えば本発明の組成物は、例えば止痒剤、
収斂薬、局所麻酔剤又は抗炎症剤のような適合性のある
追加の医薬活性物質を含有し得るか又は、着色剤、矯味
矯臭剤、保存剤，抗酸化剤、混濁剤、濃化剤及び安定化
剤のような、本発明の組成物の様々な剤形を物理的に製
剤化するのに有用である追加の物質を含有し得る。しか
しながら、そのような物質は、追加されたときに、本発
明の組成物の成分の生物学的活性に不当に干渉してはな
らない。
【００７６】Ｇ．コロイド分散系：本発明のオリゴヌク
レオチドを患者へ導入する方法が何であれ、コロイド分
散系は、オリゴヌクレオチドのin vivo安定性を高める
こと及び／又は特定の臓器、組織又は細胞へオリゴヌク
レオチドを標的化するためのデリバリー担体として使用
され得る。コロイド分散系は、限定しないが、高分子複
合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水
中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを
包含する脂質をベースとするシステムを包含する。好ま
しいコロイド分散系は、生物活性剤のin vitro及びin v
ivoの細胞デリバリー担体として使用され得る、複数の
リポソーム、人工膜の小胞である（Mannino et al., Bi
otechniques, 1988, 6, 682; Blume and Cevc, Bioche
m. et Biophys. Acta, 1990, 1029, 91; Lappalainen e
t al., Antiviral Res., 1994,23, 119; Chonn and Cul
lis, Current Op. Biotech., 1995, 6, 698）。０．２
−０．４μｍのサイズ範囲をとる単膜リポソームは、巨
大分子を含有する水性緩衝液のかなりの割合を被包化し
得る。ＲＮＡ、ＤＮＡ及び生のビリオンがこの水性内膜
に被胞化され、生物学的に活性な形態で脳細胞へデリバ
リーされる（Fraley et al., Trends Biochem. Sci., 1
981, 6, 77）。リポソームの組成は、通常、脂質、特に
リン脂質、とりわけ相転移温度の高いリン脂質を１種又
はそれ以上のステロイド、特にコレステロールと通常複
合したものである。リポソーム生産に有用な脂質の例
は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリ
ン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファ
チジルエタノールアミン、セレブロシド及びガングリオ
シドのようなホスファチジル化合物を包含する。特に有
用なのはジアシルホスファチジルグリセロールであり、
ここでは脂質部分が１４−１８の炭素原子、特に１６−
１８の炭素原子を含有し、飽和している（１４−１８の
炭素原子鎖の内部に二重結合を欠いている）。代表的な
リン脂質は、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホ
スファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジル
コリンを包含する。
【００７７】リポソームを包含するコロイド分散系の標
的化は、受動的又は能動的のいずれかであり得る。受動
的な標的化は、洞様毛細血管を含有する臓器の網内系細
胞へ分布しようとするリポソーム本来の傾向を利用す
る。対照的に、能動的な標的化はウイルスのタンパク質
コート（Morishita et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
(U. S. A.), 1993, 90, 8474）、モノクローナル抗体
（又はその適切な結合部分）、糖、糖脂質又はタンパク
質（又はその適切なオリゴペプチドフラグメント）のよ
うな特定のリガンドをリポソームへカップルさせるこ
と、又は天然に存在する局在部位以外の臓器及び細胞型
への分布を達成するためにリポソームの組成を変えるこ
とによってリポソームを修飾することを含む。標的化さ
れたコロイド分散系の表面は様々なやり方で修飾され得
る。リポソームで標的したデリバリーシステムでは、脂
質二重層との緊密な会合において標的リガンドを維持す
るために、リポソームの脂質二重層へ脂質基が取込まれ
得る。脂質鎖を標的リガンドと結びつけるために様々な
連結基が使用され得る。本発明のオリゴヌクレオチドの
デリバリーが所望される細胞の上に支配的に見出される
特定の細胞表面分子に結合する標的リガンドは、例え
ば、（１）デリバリーが所望される細胞によって支配的
に発現される特定の細胞受容体と結合している、ホルモ
ン、成長因子又はその適切なオリゴペプチドフラグメン
ト、又は（２）標的細胞上で支配的に見出される抗原性
エピトープと特異的に結合する、ポリクローナル又はモ
ノクローナル抗体、又はその適切なフラグメント（例え
ば、Ｆａｂ；Ｆ（ａｂ'）2）、であり得る。２種又はそ
れ以上の生物活性剤（例えば、オリゴヌクレオチドと従
来薬；２種のオリゴヌクレオチド）は、単一のリポソー
ム内部で複合し、デリバリーされ得る。内容物の細胞内
安定性及び／又は標的化を高める薬剤をコロイド分散系
へ追加することも可能である。
【００７８】５．投与手段：本発明は、動物への投与を
意図したオリゴヌクレオチドを含んでなる組成物を提供
する。本発明の目的のためには、特に断らなければ、
「動物」という用語は、ヒト、並びに爬虫類、両生類及
び鳥類といった他の動物を網羅することを意味する。
【００７９】Ａ．腸管外デリバリー：「腸管外デリバリ
ー」という用語は、消化管を介すること以外の方法で本
発明のオリゴヌクレオチドを動物へ投与することに言及
する。腸管外医薬組成物を製造して投与する手段は当技
術分野に知られている（例えば、Avis, Chapter 84 In:
Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Ge
nnaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990,
pages 1545-1569を参照のこと）。腸管外デリバリーの
方法は、限定しないが、以下の具体例を包含する。
【００８０】１．硝子体内注射：薬物を哺乳動物の眼の
硝子体液へ直接デリバリーすることが米国特許第５，５
９１，７２０号に記載されていて、この内容は参照によ
り本明細書に組込まれている。眼科用調製物を製造・投
与する手段が当技術分野に知られている（例えば、Mull
ins et al., Chapter 84 In: Remington's Pharmaceuti
cal Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publish
ing Co., Easton,PA, 1990, pages 1581-1595 を参照の
こと）。
【００８１】２．静脈内投与：アンチセンスオリゴヌク
レオチドを様々な非ヒト哺乳動物へ静脈内投与すること
は、Iversenにより記載された（Chapter 26 In: Antise
nse Research and Applications, Crooke et al., ed
s., CRC Press, Boca Raton, FL、1993, pages 461-46
9）。腹腔内の手段を介したオリゴヌクレオチドの非ヒ
ト哺乳動物への全身投与についても記載されている（De
an et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.), 199
4, 91, 11766）。
【００８２】３．薬物の管腔内投与：管状の臓器又は組
織（例えば、動脈、静脈、尿管又は尿道）の単離された
部分へ薬物を直接デリバリーすることは、そのような臓
器又は組織の内腔を病んでいる疾患又は状態の患者の治
療に所望され得る。このオリゴヌクレオチド投与形式を
有効にするには、カテーテル又はカニューレを適切な手
段により外科的に導入する。例えば、左総頚動脈の治療
には、外頚動脈を介してそこへカニューレを挿入する。
治療が求められる管状の臓器又は組織の部分を単離した
後、本発明のオリゴヌクレオチドを含んでなる組成物
を、カニューレ又はカテーテルを介して単離部分へ注入
する。約１〜約１２０分間のインキュベーションの後、
その間にオリゴヌクレオチドは管内腔の細胞によって取
込まれ、注入カニューレ又はカテーテルを除去し、その
部分の単離をもたらした結紮糸を除去することにより管
状臓器又は組織内のフローが回復する（Morishita et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.), 1993, 90, 8
474）。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ヒド
ロゲル材料のような生体適合性マトリックスと複合さ
せ、in vivoで血管組織へ直接適用してもよい（Rosenbe
rgら、米国特許第５，５９３，９７４号、１９９７年１
月１５日発行）。
【００８３】４．薬物の脳室内投与：患者の脳へ薬物を
直接デリバリーする脳室内投与は、脳を病んでいる疾患
又は状態の患者の治療に所望され得る。このオリゴヌク
レオチド投与形式を有効にするには、シリコンカテーテ
ルをヒト患者の脳室へ外科的に導入し、腹部領域に外科
的に埋め込まれた皮下注入ポンプ（メドトロニック社、
ミネアポリス、ＭＮ）に連結させる（Zimm et al., Can
cer Research, 1984, 44, 1698; Shaw, Cancer, 1993,
72(11 Suppl.), 3416）。このポンプは、外部プログラ
ム装置の助けを借りて、オリゴヌクレオチドを注入し、
投与スケジュールにおける正確な用量調節及び変更を可
能にするために使用される。このポンプの貯留能力は１
８〜２０ｍＬで、注入速度は０．１ｍＬ／ｈ〜１ｍＬ／
ｈの範囲をとり得る。日〜月あたりの回数の範囲をとる
投与頻度、及び体重ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇ
の範囲をとる投与薬物量に依存して、ポンプレザバーは
３〜１０週間隔で再充填され得る。ポンプの再充填は、
ポンプの自己密封式隔壁へ経皮的に穿刺することにより
達成される。
【００８４】５．薬物の鞘内投与：患者の脊柱へ薬物を
導入する鞘内投与は、中枢神経系の疾患を有する患者の
治療に所望され得る。このオリゴヌクレオチド投与ルー
トを有効にするには、シリコンカテーテルをヒト患者の
Ｌ３−４腰椎間空へ外科的に埋め込み、上腹部領域に外
科的に埋め込まれた皮下注入ポンプに連結させる（Luer
and Hatton, The Annals of Pharmacotherapy, 1993,
27, 912; Ettinger et al., 1978, Cancer, 41, 1270,
1978; Yaida et al., Regul. Pept., 1995, 59, 19
3）。このポンプは、外部プログラム装置の助けを借り
て、オリゴヌクレオチドを注入し、投与スケジュールに
おける正確な用量調節及び変更を可能にするために使用
される。このポンプの貯留能力は１８〜２０ｍＬで、注
入速度は０．１ｍＬ／ｈ〜１ｍＬ／ｈの範囲をとり得
る。日〜月あたりの回数の範囲をとる投与頻度、及び体
重ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇの範囲をとる投与
薬物量に依存して、ポンプレザバーは３〜１０週間隔で
再充填され得る。ポンプの再充填は、ポンプの自己密封
式隔壁へ経皮的に単回穿刺することにより達成される。
中枢神経系内におけるオリゴヌクレオチドの分布、安定
性及び薬物動態は、既知の方法により追跡し得る（Whit
esell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1993,
90, 4665）。
【００８５】この方法を介して脳又は脊椎以外のエリア
へオリゴヌクレオチドをデリバリーするには、シリコン
カテーテルを成形して、皮下注入ポンプを、例えば肝臓
へのデリバリーのためには肝動脈へ連結するようにする
（Kemeny et al., Cancer, 1993, 71, 1964）。注入ポ
ンプはオリゴヌクレオチドの全身デリバリーを有効にす
るためにも使用され得る（Ewel et al., Cancer Resear
ch, 1992, 52, 3005;Rubenstein et al., J. Surg. Onc
ol., 1996, 62, 194）。
【００８６】６．表皮及び経皮デリバリー：薬物を含有
する医薬組成物を局所的に適用する場合、局所の真皮又
はさらなる浸透のために吸収される薬物を投与するには
表皮デリバリーが、基底組織による吸収には経皮デリバ
リーが使用され得る。局所投与用の薬剤を製造して投与
する手段が当技術分野で知られている（例えばBlock, C
hapter 87 In: Remington's Pharmaceutical Sciences,
18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., East
on, PA, 1990, pages 1596-1609を参照のこと）。
【００８７】７．膣デリバリー：このデリバリーは局所
治療を提供し、初回通過代謝、消化酵素による分解及び
可能性のある全身性の副作用を回避する。この投与形式
は、膣に通常生息している病原体、例えば Trichomonas
vaginalisを標的にしたアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドに好ましい可能性がある。他の態様では、懐妊及びそ
の後の妊娠の確率を高めるために、精子特異的な抗体を
コードする遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオ
チドがこの投与形式によってデリバリーされ得る。膣坐
剤（Block, Chapter 87 In: Remington's Pharmaceutic
al Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishi
ng Co., Easton, PA, 1990, pages1609-1614 ）又は局
所軟膏もこのデリバリー形式を有効にするために使用さ
れ得る。
【００８８】８．膀胱内デリバリー：このデリバリーは
局所治療を提供し、初回通過代謝、消化酵素による分解
及び可能性のある全身性の副作用を回避する。しかしな
がら、この方法は患者の尿道カテーテル法及び熟練スタ
ッフを要求する。それでも、この投与形式は、尿生殖管
に侵襲し得る、T. vaginalisのような病原体を標的にし
たアンチセンスオリゴヌクレオチドに好ましい可能性が
ある。
【００８９】Ｂ．消化管デリバリー：「消化管デリバリ
ー」という用語は、動物の消化管の一部へ、直接的に又
は他の方法で投与することに言及する。「消化管」とい
う用語は、食物の消化及び吸収、及び食物残渣の消去に
機能し、口から肛門に至る管状の通路、及びその部分又
はセグメント、例えば口腔、食道、胃、小腸及び大腸及
び結腸の一部又は全部、並びに、例えば胃腸管のような
それらの複合部分に言及する。従って、「消化管デリバ
リー」という用語は、限定しないが、口、直腸、内視鏡
及び舌下／頬側からの投与を包含するいくつかの投与ル
ートを網羅する。これらの投与形式に共通する必要条件
は、そのように投与される核酸が消化管の一部又は全部
に渡って吸収されること、及び効率的に粘膜を浸透すべ
きことである。
【００９０】１．頬側／舌下投与：口の粘膜を介した薬
物のデリバリーは、多くの例において、経口デリバリー
よりも薬物の血漿濃度がより速やかに上昇することを包
含する、いくつかの望ましい特徴を有する（Harvey, Ch
apter 35 In: Remington's Pharmaceutical Sciences,
18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co.,Easto
n, PA, 1990, page 711 ）。さらに、口からの静脈ドレ
ナージが上大静脈に対しているので、このルートはまた
肝臓による迅速な初回通過代謝を迂回する。これらの特
性は、いずれも舌下ルートをニトログリセリンの選好的
な投与形式にすることに貢献する（Benet et al., Chap
ter 1 In:Goodman & Gilman's ThePharmacological Bas
is of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al., eds.,
McGraw‐Hill, New York, NY, 1996, page 7）。
【００９１】２．内視鏡投与：内視鏡は消化管の内部へ
薬物を直接デリバリーするのに使用され得る。例えば、
内視鏡的逆行性胆管膵管造影法（ＥＲＣＰ）は、拡張さ
れた胃鏡検査を利用して、胆管及び膵管への選択的アク
セスを可能にする（Hirakata et al., Gan to Kagaku R
yoho, 1992, 19(10 Suppl.):1591）。しかしながら、こ
の方法は患者にとって不快であり、高度に熟練したスタ
ッフを要求する。
【００９２】３．直腸投与：経口ルートで投与される薬
物は、別のやり方では低位の腸ルートによって、即ち、
肛門から直腸又は低位の腸へ、しばしば投与され得る。
直腸坐剤、貯留浣腸剤又は直腸カテーテルがこの目的の
ために使用され、患者コンプライアンスが他の方法では
達成するのが困難であり得る（例えば、小児又は老人へ
の適用、又は患者が嘔吐したり、又は意識が無い場合）
ときに好ましい場合がある。直腸投与は経口ルートより
速やかでより高い血液レベルをもたらし得るが、逆の場
合もある（Harvey, Chapter 35 In: Remington's Pharm
aceuticalSciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Pu
blishing Co., Easton, PA, 1990,page 711 ）。直腸か
ら吸収される薬物の約５０％は肝臓を迂回するので、こ
のルートによる投与は初回通過代謝の可能性を著しく減
少させる（Benet et al.,Chapter 1 In:Goodman & Gilm
an's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9t
h Ed., Hardman et al., eds., McGraw‐Hill, New Yor
k, NY, 1996）。
【００９３】４．経口投与：経口デリバリーは好ましい
投与方法であり、典型的には体循環へアクセスするため
の最も簡便なルートである。消化管からの吸収は、一般
的に当てはまるいくつかの要因、例えば、吸収の表面
積、吸収部位への血液フロー、薬物の物理学的状態及び
その吸収部位における濃度、によって支配されている
（Benet et al., Chapter 1 In:Goodman & Gilman's Th
e Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed.,
Hardman et al., eds., McGraw‐Hill, New York, NY,
1996, pages 5-7）。薬物の経口バイオアベイラビリテ
ィを制限し得る重要な要因は「初回通過効果」の度合い
である。例えば、ある物質はあまりに早く肝臓で取込ま
れ、吸収された物質のごく一部分しか末梢血に入らない
（Van Berge-Henegouwen et al., Gastroenterology, 1
977, 73:300）。本発明の組成物及び方法は、核酸の改
善された取込みを提供し、それにより例えば肝臓の取込
みシステムを飽和させ、投与された核酸の大部分が末梢
循環に到達することを可能にすることによって、少なく
とも部分的には、そのような初回通過効果を回避する。
追加的又は代替的には、肝臓の取込みシステムは、活性
のある核酸を投与する前に、1つ又はそれ以上の不活性
な「担体」核酸で飽和される。
【００９４】以下の実施例は、本発明を具体的に示し、
それを制限することを意図しない。当業者は、定常的な
実験により、本明細書に記載される特定の物質及び方法
に対する多くの同等物を認識し、確認することができる
だろう。そのような同等物は本発明の範囲内にあると考
えられる。
【００９５】
【実施例】実施例１：オリゴヌクレオチドの合成 Ａ．一般的な合成技術：オリゴヌクレオチドは、ヨウ素
酸化を用いる標準的なホスホロアミダイト化学を使用す
る自動ＤＮＡ合成機で合成した。β−シアノエチルジイ
ソプロピルホスホロアミダイトはアプライドバイオシス
テムズ（フォスターシティ、ＣＡ）より購入した。ホス
ホロチオエートオリゴヌクレオチドのためには、亜リン
酸結合の段階的チオエート化に用いる３Ｈ−１，２−ベ
ンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシドの０．
２Ｍアセトニトリル溶液に標準酸化ボトルを置き換え
た。
【００９６】２'−Ｏ−メチル（別名、２'−メトキシ）
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成は上記の
方法によるが、標準的なホスホロアミダイトの代わりに
２'−Ｏ−メチル−β−シアノエチルジイソプロピルホ
スホロアミダイト（ケムジーンズ、ニーダム、ＭＡ）を
用いて、テトラゾール及び塩基のパルスデリバリー後の
待ちサイクルを３６０秒に高めている。同様に、２'−
Ｏ−プロピル（別名、２'−プロポキシ）ホスホロチオ
エートオリゴヌクレオチドは、上記方法をわずかに変更
し、本質的には米国特許出願第０８／３８３，６６６号
（１９９５年２月３日出願、本出願と同じ譲受人へ譲渡
されている）に開示された方法によって製造される。
【００９７】本発明の２'−フルオロ−ホスホロチオエ
ートオリゴヌクレオチドは、５'−ジメトキシトリチル
−３'−ホスホロアミダイトを使用して合成され、米国
特許出願第０８／３８３，６６６号（１９９５年２月３
日出願）及び米国特許第５，４５９，２５５号（１９９
６年１０月８日発行）（いずれも本出願と同じ譲受人へ
譲渡されている）に開示されたようにして製造される。
２'−フルオロ−オリゴヌクレオチドは、ホスホロアミ
ダイト化学及びわずかに変更した標準ＤＮＡ合成プロト
コールを使用して製造された（即ち、室温でメタノール
性アンモニアを使用して脱保護化した）。
【００９８】２'−メトキシエトキシオリゴヌクレオチ
ドは、本質的にはMartin等の方法により合成された（He
lv. Chim. Acta, 1995, 78, 486）。合成を容易にする
ために、２'−メトキシエトキシオリゴヌクレオチドの
３'ヌクレオチドはデオキシヌクレオチドとし、２'−Ｏ
−ＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3−シトシンは５−メチルシトシン
とし、これらを以下に記載の方法により合成した。ＰＮ
Ａアンチセンス類似体は、本質的には米国特許第５，５
３９，０８２号及び５，５３９，０８３号に記載された
ようにして製造される。この特許はいずれも（１）１９
９６年７月２３日に発行され、（２）本出願と同じ譲受
人へ譲渡されている。
【００９９】Ｂ．精製：制御孔ガラスカラム（アプライ
ドバイオシステムズ）から分離し、５５℃で１８時間、
濃水酸化アンモニウムにて脱保護化した後、オリゴヌク
レオチドは、０．５Ｍ ＮａＣｌと２．５倍量のエタノ
ールからの２度の沈殿によって精製した。２０％アクリ
ルアミド、８Ｍ尿素、４５ｍＭトリスホウ酸緩衝液、ｐ
Ｈ７．０において分析用ゲル電気泳動を実施した。オリ
ゴデオキシヌクレオチド及びそのホスホロチオエート類
似体は、電気泳動から、完全長の物質の８０％以上の大
きさであると判断された。
【０１００】実施例２：ヒト腫瘍細胞におけるＪＮＫ・
ｍＲＮＡ発現に対するオリゴヌクレオチド介在性阻害の
アッセイ ＪＮＫをモジュレートする可能性があるオリゴヌクレオ
チドの活性を評価するために、以下の実施例に示すよう
な、ヒト肺癌細胞系Ａ５４９（アメリカ・タイプ・カル
チャー・コレクション、ロックビル、ＭＤ Ｎｏ．ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ−１８５）細胞又は他の細胞系を増殖さ
せ、以下のようにオリゴヌクレオチド又は対照溶液で処
理した。採取後、細胞抽出物を調製し、特定のＪＮＫ・
ｍＲＮＡレベル又はＪＮＫタンパク質レベル（それぞ
れ、ノーザン又はウェスタンアッセイ）について検査し
た。いずれの場合も、「発現％」は、無処置の細胞（又
はオリゴヌクレオチドを含まない対照溶液で処理した細
胞）に対するオリゴヌクレオチド処理細胞におけるＪＮ
Ｋ特異的シグナルの量に言及し、「阻害％」は、１００
％−発現％＝阻害％として計算される。
【０１０１】ノーザンアッセイ：各ＪＮＫタンパク質の
ｍＲＮＡ発現量は、それに特異的にハイブリダイズする
核酸プローブを使用して定量した。ＪＮＫ１、ＪＮＫ２
及びＪＮＫ３に特異的な核酸プローブは、それぞれ実施
例３、４及び５に記載されている。プローブは当技術分
野でよく知られている手段によって放射標識した（例え
ば、Short Protocols in Molecular Biology, 2nd Ed.,
Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, New Yor
k, 1992, pages 3-11 to 2-3-44 and 4-17 to 4-18; Ru
th, Chapter 6 In: Methods in Molecular Biology, Vo
lume 26: Protocols for Oligonucleotide Conjugates,
Agrawal, ed., Humana Press Inc., Totowa, NJ, 199
4, pages 167-185; 及びChapter 10 In: Molecular Clo
ning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook et a
l., eds., pages 10.1-10.70を参照のこと）。ブロット
を切出し、32Ｐ−標識グリセルアルデヒド３−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）プローブ（クローンテッ
クラボラトリーズ社、パロアルト、ＣＡ）を用いて再プ
ローブし、ＲＮＡローディング量の同一性を確かめ、Ｊ
ＮＫ転写物のレベルをＧ３ＰＤＨシグナルに関して標準
化した。
【０１０２】Ａ５４９細胞をＴ−７５フラスコで８０−
９０％の集密度になるまで増殖させた。この時点で細胞
を２度媒体（ＤＭＥＭ）１０ｍＬで洗浄し、次いでＬＩ
ＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）（即ち、１：１（ｗ／ｗ）Ｄ
ＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ、ライフテクノロジーズ、ゲイサー
スバーグ、ＭＤ；ＤＯＴＭＡ＝Ｎ−［１−（２，３−ジ
オレイオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルア
ンモニウムクロリド；ＤＯＰＥ＝ジオレオイルホスファ
チジルエタノールアミン）２０μｇ／ｍＬを含有するＤ
ＭＥＭを５ｍＬ加えた。１０μＭのストック溶液からオ
リゴヌクレオチドを加えて最終濃度４００ｎＭとし、フ
ラスコを渦状に揺らして２つの溶液を混ぜた。対照とし
て、オリゴヌクレオチド処理サンプルと同一の条件及び
同一の時間で、オリゴヌクレオチドのないＬＩＰＯＦＥ
ＣＴＩＮ（商標）で細胞を処理した。３７℃で４時間
後、新鮮なＤＭＥＭ含有１０％血清に培地を代えた。細
胞を１８時間回復させた。次いで全細胞ＲＮＡをグアニ
ジニウムに抽出し、ゲル電気泳動にかけ、当技術分野で
知られている技術によりフィルターへ移した（例えば、
Chapter 7 In: Molecular Cloning: A Laboratory Manu
al, 2nd Ed., Sambrook et al., eds., pages 7.1-7.87
及びShort Protocols in Molecular Biology,2nd Ed.,
Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, New York,
1992, pages2-24 to 2-30 and 4-14 to 4-29を参照の
こと）。典型的には、このフィルターを、関心対象の特
定のＪＮＫ遺伝子に特異的なプローブとハイブリダイゼ
ーション緩衝液（２５ｍＭ ＫＰＯ4，ｐＨ７．４；５
ｘＳＳＣ；５ｘデンハート溶液；サケ精子ＤＮＡ１００
μｇ／ｍＬ；及び５０％ホルムアミド）において一晩ハ
イブリダイズさせた（Alahari et al., Nucl. Acids Re
s., 1993, 21, 4079）。次いでこれを１ｘＳＳＣ，０．
１％ＳＤＳで２回、０．２５ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ
で２回洗浄した。ハイブリダイズしたバンドは、Ｘ−Ｏ
ＭＡＴ ＡＲフィルムに露出して視覚化し、製造業者の
指示書（モレキュラーダイナミクス、サニベール、Ｃ
Ａ）にほとんど従ってＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ
（商標）を使用して定量化した。
【０１０３】ウェスタンアッセイ：上記のようにＡ５４
９細胞を増殖させ、オリゴヌクレオチドで処理した。当
技術分野で知られている手段によって、細胞を溶解し、
タンパク質抽出物を電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にか
け、ニトロセルロースフィルターに移した（例えば、Ch
apter 18 In: Molecular Cloning: A Laboratory Manua
l, 2nd Ed., Sambrook et al., eds., pages 18.34, 1
8.47-18.54 and 18.60-18.75を参照のこと）。各ＪＮＫ
タンパク質の量は、適切なＪＮＫタンパク質を特異的に
認識する一次抗体を使用して定量した。各ＪＮＫタンパ
ク質に特異的な一次抗体については以下の実施例に記載
されている。一次抗体は当技術分野でよく知られている
手段により検出され（例えば、Short Protocols in Mol
ecular Biology, 2nd Ed., Ausubel et al., eds., Joh
n Wiley & Sons, New York, 1992, pages 10-33 to 10-
35;及びChapter 18 In: Molecular Cloning: A Laborat
ory Manual, 2nd Ed., Sambrook et al., eds., pages
18.1-18.75 and 18.86-18.88を参照のこと）、製造業者
の指示書（モレキュラーダイナミクス、サニベール、Ｃ
Ａ）にほとんど従ってＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ
（商標）を使用して定量化した。
【０１０４】ＪＮＫタンパク質のレベルはまたその対応
するキナーゼ活性のレベルを測定することによっても定
量し得る。そのようなキナーゼアッセイは、in situで
ゲルにおいて（Hibi at al., Genes & Dev., 1993, 7,
2153）又は細胞抽出液からの免疫沈澱の後に（Derijard
et al., Cell, 1994, 76, 1025）なし得る。そのよう
なアッセイ用の基質及び／又はキットは、例えば、アッ
プステートバイオテクノロジー社（レークプラシッド、
ＮＹ）、ニューイングランドバイオラブズ社（ビバリ
ー、ＭＡ）及びカルビオケム−ノバビオケムバイオサイ
エンス社（ラジョラ、ＣＡ）から市販されている。
【０１０５】実施例３：ＪＮＫ１発現のオリゴヌクレオ
チド介在性阻害 Ａ．ＪＮＫ１のオリゴヌクレオチド配列：表１は、ＪＮ
Ｋ１・ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするように設
計されたオリゴヌクレオチドのセットのヌクレオチド配
列及びそれに対応するＩＳＩＳとＳＥＱ ＩＤ ＮＯを
リストする。標的遺伝子であるＪＮＫ１のヌクレオチド
座標、及び遺伝子標的領域も包含されている。ヌクレオ
チド座標は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｌ２６３１８、
遺伝子座名「ＨＵＭＪＮＫ１」に由来する（また、Deri
jard et al., Cell, 1994, 76, 1025の図１（Ａ）を参
照のこと）。遺伝子標的領域の略語は以下の通りであ
る：５'−ＵＴＲ、５'非翻訳領域；ｔＩＲ、翻訳開始領
域；ＯＲＦ、オープンリーディングフレーム；３'−Ｕ
ＴＲ、３'非翻訳領域。配列が表１に示されているオリ
ゴヌクレオチドのヌクレオチドはホスホロチオエート結
合で連結し、２'位は非修飾である（即ち、２'−デオキ
シ）。オリゴヌクレオチドが座標位置を標的にするこ
と、及び遺伝子標的領域がＪＮＫ１の関連イソ型をコー
ドするｍＲＮＡ内部で変化し得ることに留意すべきであ
る（以下のＧ節を参照のこと）。
【０１０６】ＩＳＩＳ Ｎｏ．１２５４８（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１７）及び１２５５１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２０）の完全なオリゴヌクレオチド配列は、ヒトＪ
ＮＫ１・ｍＲＮＡにハイブリダイズすることに加えて、
「ｐ５４γ」と呼ばれるストレス活性化プロテインキナ
ーゼをコードする、Rattus norvegicus 由来のｍＲＮＡ
の５'末端にハイブリダイズする（Kyriakis et al., Na
ture, 1994, 369, 156）。特定すると、ＩＳＩＳ １２
５４８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）は、ＧｅｎＢａｎ
ｋ登録番号Ｌ２７１２９、遺伝子座名「ＲＡＴＳＡＰＫ
Ｄ」の塩基４９８−５１７にハイブリダイズし、ＩＳＩ
Ｓ １２５５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）は、同一
配列の塩基８０３−８２２にハイブリダイズする。従っ
て、これらのオリゴヌクレオチドは、in vitro、即ち全
動物由来の培養細胞又は組織において、又はin vivoに
おいて、ラットｐ５４γプロテインキナーゼの役割を研
究する本発明の好ましい態様となる。
【０１０７】Ｂ．ＪＮＫ１特異的プローブ：ＪＮＫ１配
列から派生したオリゴヌクレオチドセットの生物活性に
ついての最初のスクリーニングにおいて、ＪＮＫ１のｃ
ＤＮＡクローン（Derijard et al., Cell, 1994, 76, 1
025）を放射標識し、ノーザンブロットにおけるＪＮＫ
１特異的プローブとして使用した。しかしながら、表１
の１種又はそれ以上のオリゴヌクレオチドは、別のやり
方でも検出できるように標識し、ＪＮＫ１特異的プロー
ブとして使用した。 表 １ ＪＮＫ１オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
【０１０８】
【表１】
【０１０９】Ｃ．ＪＮＫ１オリゴヌクレオチドの活性：
ＪＮＫ１特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
のセットをスクリーニングしたデータ（表２）は、以下
の結果を示す。ＪＮＫ１・ｍＲＮＡレベルの約５０％以
上〜約１００％の阻害レベルによって反映される、この
アッセイにおける活性を示すオリゴヌクレオチドは、Ｉ
ＳＩＳ Ｎｏ．１１９８２、１１９８３、１２４６３、
１２４６４、１２５３８、１２５３９、１２５４８、１
２５４９、１２５５０、１２５５２、１２５５３、１２
５５４、１２５５５、１２５５６及び１２５５７（それ
ぞれ、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：５、６、１３、１４、１５、
１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、２
５及び２６）を包含する。従って、これらのオリゴヌク
レオチドはＪＮＫ１の発現をモジュレートするための本
発明の好ましい態様である。このアッセイにおいてＪＮ
Ｋ１・ｍＲＮＡレベルの約８０％以上〜約１００％の阻
害レベルを示すオリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ Ｎ
ｏ．１１９８２、１２５３９、１２５４８、１２５５４
及び１２４６４（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、
１６、１７、２３及び１４）を包含する。従って、これ
らのオリゴヌクレオチドはＪＮＫ１の発現をモジュレー
トするための本発明のより好ましい態様である。
【０１１０】ＩＳＩＳ １２５３９（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１６）によるＪＮＫ１・ｍＲＮＡ発現阻害の時間経
過を表３に示す。ＩＳＩＳ １２５３９で処理して４時
間経過した時点（ｔ＝０ｈ）でＪＮＫ１の阻害レベルは
約８５％以上であり、ｔ＝４ｈでは約９５％阻害へ上昇
し、次いで約８０％より高いかそれに等しい（ｔ＝１２
ｈ及び４８ｈ）か、又は６０％（７２ｈ）を保った。 表 ２ ＪＮＫ１オリゴヌクレオチドの活性
【０１１１】
【表２】
【０１１２】
【表３】
【０１１３】表 ３ ＪＮＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）に
対する反応の時間経過
【０１１４】
【表４】
【０１１５】Ｄ．追加のＪＮＫ１オリゴヌクレオチド：
ＪＮＫ１特異的オリゴヌクレオチドの試験結果（表２）
は、ＪＮＫ１の発現をモジュレートする最も活性なホス
ホロチオエートオリゴヌクレオチドの１つがＩＳＩＳ
１２５３９（ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１６）であることを示
す。表４に詳しく示されるように、上記の知見を確認し
て拡張するために、このオリゴヌクレオチドに基づいた
追加のオリゴヌクレオチドを設計した。
【０１１６】オリゴヌクレオチドのＩＳＩＳ Ｎｏ．１
４３２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）及び１４３２１
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）は、それぞれ、ＩＳＩＳ
１２５３９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）に対する
２'−デオキシ−ホスホロチオエートセンス鎖対照及び
無秩序（ごた混ぜにした）対照である。ＩＳＩＳ Ｎ
ｏ．１５３４６及び１５３４７はＩＳＩＳ １２５３９
に対応する「ギャップマー」であり、いずれも２'−メ
トキシエトキシ「ウィング」（ＩＳＩＳ １５３４６の
場合はホスホロチオエート結合、ＩＳＩＳ １５３４７
の場合はホスホジエステル結合を有する）及び、標的ｍ
ＲＮＡ分子に対するＲＮアーゼＨ活性を支援するように
設計された中央の２'−デオキシ「ギャップ」を有す
る。同様に、ＩＳＩＳ Ｎｏ．１５３４８〜１５３５０
はＩＳＩＳ １２５３９に対応する「ウィングマー」で
あり、５'又は３'２'−メトキシエトキシＲＮアーゼＨ
不応性「ウィング」及び、標的ＪＮＫ１・ｍＲＮＡに対
するＲＮアーゼＨ活性を支援するように設計された、
（それぞれ）３'又は５'の２−デオキシ「ウィング」を
有する。
【０１１７】ＩＳＩＳ １２５３９（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１６）の化学修飾した誘導体を本明細書に記載され
るノーザンアッセイで１００及び４００ｎＭの濃度で試
験した。データ（表５）は以下の結果を示す。４００ｎ
Ｍでは、２'非修飾オリゴヌクレオチドであるＩＳＩＳ
１２５３９に比較して、いずれの「ギャップマー」
（ＩＳＩＳ Ｎｏ．１５３４６及び１５３４７）も少な
くとも約８０％までのＪＮＫ１・ｍＲＮＡ発現の阻害を
もたらした。同様に、４種の「ウィングマー」（ＩＳＩ
Ｓ Ｎｏ．１５３４８〜１５３５１）も少なくとも約６
０〜７０％までのＪＮＫ１発現の阻害をもたらした。 表 ４ 化学修飾したＪＮＫ１オリゴヌクレオチド
【０１１８】
【表５】
【０１１９】* 太字の残基：“Ｃ"残基、５−メチルシ
トシンを包含する２'−メトキシエトキシ残基（他は２'
−デオキシ）；“o"：ホスホジエステル結合：“s"：ホ
スホロチオエート結合。“Ｃ"残基：２'−デオキシ−５
−メチルシトシン残基。 表 ５ 化学修飾したＪＮＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド
の活性
【０１２０】
【表６】
【０１２１】* 略号：Ｐ＝Ｏ、ホスホジエステル結合；
Ｐ＝Ｓ、ホスホロチオエート結合；ＭＯＥ、メトキシエ
トキシ−
【０１２２】Ｅ．ＪＮＫ１オリゴヌクレオチドに対する
用量及び配列依存性の反応：ＩＳＩＳ １２５３９（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）に対する用量依存的な反応性
を示すために、Ａ５４９細胞におけるＪＮＫ１・ｍＲＮ
Ａレベルに対する効果について、様々な濃度（即ち、５
０、１００、２００及び４００ｎＭ）のＩＳＩＳ １２
５３９を試験した（表６）。さらに、ＩＳＩＳ １２５
３９の特異性を示すために、２種の対照オリゴヌクレオ
チド（ＩＳＩＳ １４３２０、ＳＥＱ ＩＤＮＯ：２
７、センス対照及びＩＳＩＳ １４３２１、ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：２８、無秩序対照；表４も参照のこと）もＡ
５４９細胞へ適用した。この結果（表６）は、ＩＳＩＳ
１２５３９に対するＡ５４９細胞の反応がほぼ直線形
式の用量依存的であることを示す。対照的に、対照のオ
リゴヌクレオチドはいずれもＪＮＫ１・ｍＲＮＡレベル
に対して首尾一貫した反応をしていない。
【０１２３】Ｆ．ウェスタンアッセイ：ＪＮＫ１・ｍＲ
ＮＡへ標的されたオリゴヌクレオチドのＪＮＫ１タンパ
ク質レベルに対する効果を評価するために、ほとんど上
記実施例２に記載したようにしてウェスタンアッセイを
実施したが、以下の例外及び／又は変更があった。ＪＮ
Ｋ１に特異的に結合する一次抗体（カタログ番号ｓｃ−
４７４−Ｇ）はサンタクルツ・バイオテクノロジー社
（サンタクルツ、ＣＡ）より購入したが、他のＪＮＫ１
特異抗体は、ストレスジェン・バイオテクノロジー社、
ビクトリア、ＢＣ、カナダ；及びリサーチ・ダイアグノ
シス社、フランダース、ＮＪから提供される。この実験
では、細胞を増殖させ、最初の２０時間はオリゴヌクレ
オチド３００ｎＭで処理し、次いで４時間２００ｎＭで
処理した。ｔ＝４８ｈにおいて、ノーザン及びウェスタ
ン分析のためのアリコートを除き、新鮮な培地を加え
た。分析用アリコートは、ｔ＝７２ｈでも採取した。上
記のノーザン及びウェスタンアッセイを使用して、ｔ＝
４８及びｔ＝７２ｈからのサンプルを分析した。 表 ６ ＪＮＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する用量
依存的な反応
【０１２４】
【表７】
【０１２５】このデータ（表７）は以下の結果を示す。
このアッセイでは、ｔ＝４８ｈにおいて、約７０％以上
〜約１００％までのｍＲＮＡ阻害％レベルを示すオリゴ
ヌクレオチドは、ＩＳＩＳ Ｎｏ．１２５３９（ホスホ
ロチオエート結合）、１５３４６及び１５３４７（「ギ
ャップマー」）、及び１５３４８及び１５３５１（５'
「ウィングマー」）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）を包
含する。約９０％以上〜約１００％までのＪＮＫ１・ｍ
ＲＮＡのｍＲＮＡ阻害レベルをこのアッセイで示すオリ
ゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ Ｎｏ．１２５３９、１５
３４７及び１５３４６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）を
包含する。試験したオリゴヌクレオチドはＪＮＫ１タン
パク質阻害のほぼ相似したレベルを示した。つまり、Ｉ
ＳＩＳＮｏ．１２５３９、１５３４６〜１５３４８及び
１５３５１は約４０％以上のタンパク質阻害レベルをも
たらし、ＩＳＩＳ Ｎｏ．１２５３９、１５３４６及び
１５３４７は約５５％以上のタンパク質阻害レベルをも
たらした。
【０１２６】ｔ＝７２ｈにおいて、約７０％以上〜約１
００％までのｍＲＮＡ阻害％レベルを示すオリゴヌクレ
オチドは、ＩＳＩＳ Ｎｏ．１２５３９（ホスホロチオ
エート結合）、１５３４６及び１５３４７（「ギャップ
マー」）、及び１５３４８（５'「ウィングマー」）
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）を包含する。約９０％以
上〜約１００％までのＪＮＫ１・ｍＲＮＡのｍＲＮＡ阻
害レベルをこのアッセイで示すオリゴヌクレオチドは、
ＩＳＩＳ Ｎｏ．１２５３９及び１５３４６（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１６）を包含する。全体に、試験したオリ
ゴヌクレオチドは、このアッセイのこの時点でより高い
レベルのＪＮＫ１タンパク質阻害を示した。完全に２'
−メトキシエトキシ修飾したＩＳＩＳ １５３４５を除
くと、表７のオリゴヌクレオチドは全て約４０％以上の
タンパク質阻害をもたらした。ＩＳＩＳ Ｎｏ．１２５
３９、１５３４６〜１５３４８及び１５３５１は約６０
％以上のタンパク質阻害レベルをもたらし、ＩＳＩＳ
Ｎｏ．１２５３９、１５３４６及び１５３４７は約７０
％以上のタンパク質阻害レベルをもたらした。 表 ７ 修飾されたＪＮＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチドに
よるＪＮＫ１・ｍＲＮＡ及びＪＮＫ１タンパク質レベル
のモジュレーション
【０１２７】
【表８】
【０１２８】Ｇ．ＪＮＫ１イソ型に特異的なオリゴヌク
レオチド：ＪＮＫ１に関する初期の記述（Derijard et
al., Cell, 1994, 76, 1025）に続き、ＪＮＫ１の関連
イソ型をコードするｃＤＮＡをクローニングし、それら
のヌクレオチド配列を決定した（Gupta et al., EMBO J
ournal, 1996, 15, 2760）。ＪＮＫ１のアミノ酸配列と
同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
る、ＪＮＫ１−α１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｌ２６
３１８、遺伝子座名「ＨＵＭＪＮＫ１」）だけでなく、
追加のイソ型は、ＪＮＫ１−α２（ＧｅｎＢａｎｋ登録
番号：Ｕ３４８２２、遺伝子座名「ＨＳＵ３４８２
２」）、ＪＮＫ１−β１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ
３５００４、遺伝子座名「ＨＳＵ３５００４」）及びＪ
ＮＫ１−β２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ３５００
５、遺伝子座名「ＨＳＵ３５００５」）を包含する。こ
の４種のＪＮＫ１のイソ型は、おそらく選択的ｍＲＮＡ
スプライシングから生じるが、異なる転写因子又は転写
因子のセットとそれぞれ相互作用し得る（Gupta et a
l., EMBO Journal, 1996, 15, 2760）。以下に詳しく示
すように、本発明のオリゴヌクレオチドは、これらＪＮ
Ｋ１のイソ型のある種のメンバー又はセットに対して特
異的である。
【０１２９】ＪＮＫ１／ＪＮＫ１−α１及びＪＮＫ１−
α２をコードするｍＲＮＡのＯＲＦでは、ＪＮＫ１／Ｊ
ＮＫ１−α１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｌ２６３１
８）のヌクレオチド（ｎｔ）６３１−６６５及びＪＮＫ
１−α２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ３４８２２）の
ｎｔ６２５−６５９がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３として
以下に示される配列を有するのに対し、ＪＮＫ１−β１
及びＪＮＫ１−β２をコードするｍＲＮＡのＯＲＦで
は、ＪＮＫ１−β１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ３５
００４）のｎｔ６３１−６６５及びＪＮＫ１−β２（Ｇ
ｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ３５００５）のｎｔ６２６−
６６０がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４として以下に示され
る配列を有する。説明のために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
６３及び６４を互いに並置して示す（垂直のマーク、
“｜"は、２つの配列で同一である塩基を示す）。
【０１３０】
【化１】
【０１３１】このａ及びｂのＪＮＫ１イソ型間の違いに
より、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３の逆相補体（即ち、Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、以下を参照のこと）由来のア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ１−β１及び
ＪＮＫ１−β２の発現に有意に影響することなくＪＮＫ
１／ＪＮＫ１−α１及びＪＮＫ１−α２の発現をモジュ
レートするために使用され得る。同様に、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：６４の逆相補体（即ち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
６６、以下を参照のこと）由来のアンチセンスオリゴヌ
クレオチドは、ＪＮＫ１／ＪＮＫ１−α１及びＪＮＫ１
−α２の発現に有意に影響することなくＪＮＫ１−β１
及びＪＮＫ１−β２の発現をモジュレートするために選
択され、使用され得る。１例として、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：６５由来の配列を有するがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６
６は有さないオリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ１／ＪＮＫ
１−α１及びＪＮＫ１−α２をコードするｍＲＮＡと特
異的にハイブリダイズするが、ＪＮＫ１−β１及びＪＮ
Ｋ１−β２をコードするｍＲＮＡとはハイブリダイズし
ない。
【０１３２】
【化２】
【０１３３】さらなる例として、ＪＮＫ１／ＪＮＫ１−
α１及びＪＮＫ１−α２をコードするｍＲＮＡのＯＲＦ
では、ＪＮＫ１／ＪＮＫ１−α１（ＧｅｎＢａｎｋ登録
番号：Ｌ２６３１８）のｎｔ６６８−７１１及びＪＮＫ
１−α２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ３４８２２）の
ｎｔ６６２−７０５がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７として
以下に示される配列を有するのに対し、ＪＮＫ１−β１
及びＪＮＫ１−β２をコードするｍＲＮＡのＯＲＦで
は、ＪＮＫ１−β１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ３５
００４）のｎｔ６６８−７１１及びＪＮＫ１−β２（Ｇ
ｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ３５００５）のｎｔ６６３−
７０６がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８として以下に示され
る配列を有する。説明のために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
６７及び６８を以下のように互いに並置して示す。
【０１３４】
【化３】
【０１３５】このａ及びｂのＪＮＫ１イソ型間の違いに
より、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７の逆相補体（即ち、Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９、以下を参照のこと）由来のア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ１−β１及び
ＪＮＫ１−β２の発現に有意に影響することなく、ＪＮ
Ｋ１／ＪＮＫ１−α１及びＪＮＫ１−α２をコードする
ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズし、その発現をモジ
ュレートするために選択され、使用され得る。同様に、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８の逆相補体（即ち、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：７０、以下を参照のこと）由来のアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ１／ＪＮＫ１−α１
及びＪＮＫ１−α２の発現に有意に影響することなく、
ＪＮＫ１−β１及びＪＮＫ１−β２をコードするｍＲＮ
Ａと特異的にハイブリダイズし、その発現をモジュレー
トするために選択され、使用され得る。
【０１３６】
【化４】
【０１３７】ＪＮＫ１イソ型のカルボキシル末端部分で
は、ＪＮＫ１／ＪＮＫ１−α１はＪＮＫ１−β１と同一
性を共有し、同様に、ＪＮＫ１−α２とＪＮＫ１−β２
は同一のカルボキシ末端部分を有する。上記イソ型のア
ミノ酸配列における実質的な違い（ＪＮＫ１／ＪＮＫ１
−α１及びＪＮＫ１−β１の５個のアミノ酸がＪＮＫ１
−α２及びＪＮＫ１−β２では４８個のアミノ酸に置換
されている）は、リーディングフレームをシフトさせる
ヌクレオチド配列におけるわずかな違いから生じてい
る。特定すると、ＪＮＫ１／ＪＮＫ１−α１及びＪＮＫ
１−β１をコードするｍＲＮＡのＯＲＦでは、ＪＮＫ１
／ＪＮＫ１−α１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｌ２６３
１８）及びＪＮＫ１−β１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：
Ｕ３５００４）のｎｔ１１４４−１１７５がＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：７１として以下に示される配列を有するのに
対し、ＪＮＫ１−α２及びＪＮＫ１−β２をコードする
ｍＲＮＡのＯＲＦでは、ＪＮＫ１−α２（ＧｅｎＢａｎ
ｋ登録番号：Ｕ３４８２２）のｎｔ１１３８−１１６４
及びＪＮＫ１−β２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ３５
００５）のｎｔ１１３９−１１６５がＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：７２として以下に示される配列を有する。説明のた
めに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１及び７２を互いに並置
して示す（ダッシュ、“−"は、提示された配列で欠損
している塩基を示し、太字の塩基は、ＪＮＫ１／ＪＮＫ
１−α１及びＪＮＫ１−β１のＯＲＦに対する終止コド
ンを示す）：
【０１３８】
【化５】
【０１３９】このＪＮＫ１イソ型間の違いにより、ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：７１の逆相補体（即ち、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：７３、以下を参照のこと）由来のアンチセンス
オリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ１／ＪＮＫ１−α１及び
ＪＮＫ１−β１をコードするｍＲＮＡと特異的にハイブ
リダイズし、ＪＮＫ１−α２及びＪＮＫ１−β２の発現
に有意に影響することなく、その発現をモジュレートす
るために選択され、使用され得る。同様に、ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：７２の逆相補体（即ち、ＳＥＱ ＩＤＮＯ：
７４、以下を参照のこと）由来のアンチセンスオリゴヌ
クレオチドは、ＪＮＫ１／ＪＮＫ１−α１及びＪＮＫ１
−β１の発現に有意に影響することなく、ＪＮＫ１−α
２及びＪＮＫ１−β２をコードするｍＲＮＡと特異的に
ハイブリダイズし、その発現をモジュレートするために
選択され、使用され得る：
【０１４０】
【化６】
【０１４１】好ましい態様では、そのようなイソ型特異
的オリゴヌクレオチドは、上記に記載されるように、メ
トキシエトキシ「ギャップマー」又は「ウィングマー」
であり、そこではＲＮアーゼＨ感受性の「ギャップ」又
は「ウィング」が上記アンチセンス配列、即ちＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：６５、６６、６９、７０、７３及び７４の
非同一性領域を覆うように位置付けられている。
【０１４２】実施例４：ＪＮＫ２発現のオリゴヌクレオ
チド介在性阻害 Ａ．ＪＮＫ２のオリゴヌクレオチド配列：表８は、ＪＮ
Ｋ２・ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズするように設
計されたオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列及びそ
れに対応するＩＳＩＳとＳＥＱ ＩＤ ＮＯをリストす
る。標的遺伝子のヌクレオチド座標及び遺伝子標的領域
も包含されている。ヌクレオチド座標は、ＧｅｎＢａｎ
ｋ登録番号：Ｌ３１９５１、遺伝子座名「ＨＵＭＪＮＫ
２」に由来する（また、Sluss et al., Mol. Cel. Bio
l., 1994, 14, 8376の図１（Ａ）及びKallunki et al.,
Genes & Development, 1994, 8, 2996を参照のこ
と）。遺伝子標的領域の略語は以下の通りである：５'
−ＵＴＲ、５'非翻訳領域；ｔＩＲ、翻訳開始領域；Ｏ
ＲＦ、オープンリーディングフレーム；３'−ＵＴＲ、
３'非翻訳領域。配列が表８に示されているオリゴヌク
レオチドのヌクレオチドはホスホロチオエート結合で連
結し、２'位は非修飾である（即ち、２'−デオキシ）。
オリゴヌクレオチドの標的座標位置及び遺伝子標的領域
がＪＮＫ２の関連イソ型をコードするｍＲＮＡ内部で変
化し得ることに留意すべきである（以下のＧ節を参照の
こと）。
【０１４３】ＩＳＩＳ Ｎｏ．１２５６２（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：３３）の完全なオリゴヌクレオチド配列は、
ヒトＪＮＫ２・ｍＲＮＡにハイブリダイズすることに加
えて、「ｐ５４α２」と呼ばれるストレス活性化プロテ
インキナーゼをコードする、Rattus norvegicus 由来の
ｍＲＮＡのＯＲＦにハイブリダイズする（Kyriakis et
al., Nature, 1994, 369,156）。特定すると、ＩＳＩＳ
１２５６２（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：３３）は、ＧｅｎＢ
ａｎｋ登録番号Ｌ２７１１２、遺伝子座名「ＲＡＴＳＡ
ＰＫＢ」の塩基６４９−６６８にハイブリダイズする。
従って、このオリゴヌクレオチドは、in vitro、即ち全
動物由来の培養細胞又は組織において、又はin vivoに
おいて、ラットｐ５４α２プロテインキナーゼの役割を
研究する本発明の好ましい態様となる。
【０１４４】Ｂ．ＪＮＫ２特異的プローブ：ＪＮＫ２配
列から派生したオリゴヌクレオチドセット（表９）の生
物活性についての最初のスクリーニングにおいて、ＪＮ
Ｋ２のｃＤＮＡクローン（Kallunki et al., Genes & D
evelopment, 1994, 8, 2996）を放射標識し、ノーザン
ブロットにおけるＪＮＫ２特異的プローブとして使用し
た。しかしながら、表８の１種又はそれ以上のオリゴヌ
クレオチドは、別のやり方でも検出できるように標識
し、ＪＮＫ２特異的プローブとして使用した。
【０１４５】Ｃ．ＪＮＫ２オリゴヌクレオチドの活性：
ＪＮＫ２特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
のセットをスクリーニングしたデータ（表９）は、以下
の結果を示す。ＪＮＫ２・ｍＲＮＡレベルの約５０％以
上〜約１００％の阻害レベルによって反映される、この
アッセイにおける活性を示すオリゴヌクレオチドは、Ｉ
ＳＩＳ Ｎｏ．１２５５８、１２５５９、１２５６０、
１２５６３、１２５６４、１２５６５、１２５６６、１
２５６７、１２５６８、１２５６９及び１２５７０（そ
れぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３０、３１、３
４、３５、３６、３７、３８、３９、４０及び４１）を
包含する。従って、これらのオリゴヌクレオチドはＪＮ
Ｋ２の発現をモジュレートするための本発明の好ましい
態様である。このアッセイにおいてＪＮＫ２・ｍＲＮＡ
レベルの約８０％以上〜約１００％の阻害レベルを示す
オリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ Ｎｏ．１２５５８、
１２５６０、１２５６５、１２５６７、１２５６８及び
１２５６９（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、３
１、３６、３８、３９及び４０）を包含する。従って、
これらのオリゴヌクレオチドはＪＮＫ２の発現をモジュ
レートするための本発明のより好ましい態様である。
【０１４６】ＩＳＩＳ １２５６０（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：３１）によるＪＮＫ２・ｍＲＮＡ発現阻害の時間経
過を表１０に示す。ＩＳＩＳ １２５６０で処理して４
時間経過した後、少なくとも１２時間、ＪＮＫ２の阻害
レベルは約８０％より高いかそれに等しく、少なくとも
約ｔ＝４８ｈまでは約６０％より高いかそれに等しかっ
た。 表 ８ ＪＮＫ２オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
【０１４７】
【表９】
【０１４８】表 ９ ＪＮＫ２オリゴヌクレオチドの活性
【０１４９】
【表１０】
【０１５０】表 １０ ＪＮＫ２アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する反応
の時間経過
【０１５１】
【表１１】
【０１５２】Ｄ．追加のＪＮＫ２オリゴヌクレオチド：
ＪＮＫ２特異的オリゴヌクレオチドの試験結果（表９）
は、ＪＮＫ２の発現をモジュレートする最も活性なホス
ホロチオエートオリゴヌクレオチドの１つがＩＳＩＳ
１２５６０（ＳＥＱ ＩＤＮＯ：３１）であることを示
す。表１１に詳しく示されるように、上記の知見を確認
して拡張するために、このオリゴヌクレオチドに基づい
た追加のオリゴヌクレオチドを設計した。
【０１５３】オリゴヌクレオチドのＩＳＩＳ Ｎｏ．１
４３１８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）及び１４３１９
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）は、それぞれ、ＩＳＩＳ
１２５６０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）に対する
２'−デオキシ−ホスホロチオエートセンス鎖及び無秩
序対照である。ＩＳＩＳ Ｎｏ．１５３５３及び１５３
５４はＩＳＩＳ １２５６０に対応する「ギャップマ
ー」であり、いずれも２'−メトキシエトキシ「ウィン
グ」（ＩＳＩＳ １５３５３の場合はホスホロチオエー
ト結合、ＩＳＩＳ １５３５４の場合はホスホジエステ
ル結合を有する）及び、標的ｍＲＮＡに対するＲＮアー
ゼＨ活性を支援するように設計された中央の２'−デオ
キシ「ギャップ」を有する。同様に、ＩＳＩＳ Ｎｏ．
１５３５５〜１５３５８はＩＳＩＳ １２５６０に対応
する「ウィングマー」であり、５'又は３'２'−メトキ
シエトキシＲＮアーゼＨ不応性「ウィング」及び、標的
ＪＮＫ２・ｍＲＮＡに対するＲＮアーゼＨ活性を支援す
るように設計された、（それぞれ）３'又は５'の２−デ
オキシ「ウィング」を有する。
【０１５４】ＩＳＩＳ １２５６０（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：３１）の化学修飾した誘導体を本明細書に記載され
るノーザンアッセイで１００及び４００ｎＭの濃度で試
験した。データ（表１２）は以下の結果を示す。４００
ｎＭでは、２'非修飾オリゴヌクレオチドであるＩＳＩ
Ｓ １２５６０に比較して、いずれの「ギャップマー」
（ＩＳＩＳ Ｎｏ．１５３５３及び１５３５４）も少な
くとも約８０％までのＪＮＫ２・ｍＲＮＡ発現の阻害を
もたらした。同様に、４種の「ウィングマー」（ＩＳＩ
Ｓ Ｎｏ．１５３５５〜１５３５８）も少なくとも約７
０〜９０％までのＪＮＫ２発現の阻害をもたらした。
【０１５５】Ｅ．ＪＮＫ２オリゴヌクレオチドに対する
用量及び配列依存性の反応：ＩＳＩＳ １２５６０（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）に対する用量依存的な反応性
を示すために、Ａ５４９細胞におけるＪＮＫ２・ｍＲＮ
Ａレベルに対する効果について、様々な濃度（即ち、５
０、１００、２００及び４００ｎＭ）のＩＳＩＳ １２
５６０を試験した（表１３）。さらに、ＩＳＩＳ １２
５６０の特異性を示すために、２つの対照オリゴヌクレ
オチド（ＩＳＩＳ １４３１８、ＳＥＱ ＩＤＮＯ：４
２、センス対照及びＩＳＩＳ １４３１９、ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：４３、無秩序対照；表１１も参照のこと）も
Ａ５４９細胞へ適用した。この結果（表１２）は、ＩＳ
ＩＳ １２５６０に対するＡ５４９細胞の反応がほぼ直
線形式の用量依存的であることを示す。対照的に、対照
のオリゴヌクレオチドはいずれもＪＮＫ２・ｍＲＮＡレ
ベルに対して首尾一貫した反応をしていない。 表 １１ 化学修飾したＪＮＫ２オリゴヌクレオチド
【０１５６】
【表１２】
【０１５７】* 太字の残基：“Ｃ"残基、５−メチルシ
トシンを包含する２'−メトキシエトキシ残基（他は２'
−デオキシ）；“o"：ホスホジエステル結合：“s"：ホ
スホロチオエート結合。“Ｃ"残基：２'−デオキシ−５
−メチルシトシン残基。 表 １２ 化学修飾したＪＮＫ２アンチセンスオリゴヌクレオチド
の活性
【０１５８】
【表１３】
【０１５９】表 １３ ＪＮＫ２アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する用量
依存的な反応
【０１６０】
【表１４】
【０１６１】Ｆ．ウェスタンアッセイ：ＪＮＫ２・ｍＲ
ＮＡへ標的されたオリゴヌクレオチドのＪＮＫ２タンパ
ク質レベルに対する効果を評価するために、ほとんど上
記実施例２及び３に記載したようにしてウェスタンアッ
セイを実施する。ＪＮＫ２に特異的に結合する一次抗体
は、例えばサンタクルツ・バイオテクノロジー社、サン
タクルツ、ＣＡ；アップステートバイオテクノロジー
社、レークプラシッド、ＮＹ；ストレスジェン・バイオ
テクノロジー社、ビクトリア、ＢＣ、カナダ；又はリサ
ーチ・ダイアグノシス社、フランダース、ＮＪより購入
する。
【０１６２】Ｇ．ＪＮＫ２イソ型に特異的なオリゴヌク
レオチド：ＪＮＫ２に関する初期の記述（Sluss et a
l., Mol. Cel. Biol., 1994, 14, 8376;Kallunki et a
l., Genes and Development, 1994, 8, 2996;ＧｅｎＢ
ａｎｋ登録番号ＨＳＵ０９７５９、遺伝子座名「Ｕ０９
７５９」）に続き、ＪＮＫ２の関連イソ型をコードする
ｃＤＮＡをクローニングし、それらのヌクレオチド配列
を決定した（Gupta et al., EMBO Journal, 1996, 15,
2760）。ＪＮＫ２のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列
を有するポリペプチドをコードする、ＪＮＫ２−α２
（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｌ３１９５１、遺伝子座名
「ＨＵＭＪＮＫ２」）だけでなく、追加のイソ型は、Ｊ
ＮＫ２−α１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ３４８２
１、遺伝子座名「ＨＳＵ３４８２１」）、ＪＮＫ２−β
１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ３５００２、遺伝子座
名「ＨＳＵ３５００２」）及びＪＮＫ２−β２（Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ登録番号：Ｕ３５００３、遺伝子座名「ＨＳＵ
３５００３」）を包含する。この４種のＪＮＫ２のイソ
型は、おそらく選択的ｍＲＮＡスプライシングから生じ
るが、それぞれ異なる転写因子又は転写因子のセットと
相互作用し得る（Gupta et al., EMBO Journal, 1996,
15, 2760）。以下に詳しく示すように、本発明のオリゴ
ヌクレオチドは、これらＪＮＫ２のイソ型のある種のメ
ンバー又はセットに対して特異的である。
【０１６３】ＪＮＫ２／ＪＮＫ２−α２及びＪＮＫ２−
α１をコードするｍＲＮＡのＯＲＦでは、ＪＮＫ２／Ｊ
ＮＫ２−α２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｌ３１９５
１）のヌクレオチド（ｎｔ）６８９−７４８及びＪＮＫ
２−α１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ３４８２１）の
ｎｔ６７５−７３４がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５として
以下に示される配列を有するのに対し、ＪＮＫ２−β１
及びＪＮＫ２−β２をコードするｍＲＮＡのＯＲＦで
は、ＪＮＫ２−β１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ３５
００２）のｎｔ６５３−７１２及びＪＮＫ２−β２（Ｇ
ｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ３５００３）のｎｔ６６５−
７２４がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６として以下に示され
る配列を有する。説明のために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
７５及び７６を互いに並置して示す（垂直のマーク、
“｜"は、２つの配列で同一である塩基を示す）：
【０１６４】
【化７】
【０１６５】このａ及びｂのＪＮＫ２イソ型間の違いに
より、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５の逆相補体（即ち、Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７、以下を参照のこと）から派生
したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ２−β
１及びＪＮＫ２−β２の発現に有意に影響することな
く、ＪＮＫ２／ＪＮＫ２−α２及びＪＮＫ２−α１と特
異的にハイブリダイズし、ＪＮＫ２／ＪＮＫ２−α２及
びＪＮＫ２−α１の発現をモジュレートするために選択
され使用され得る。同様に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６
の逆相補体（即ち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８、以下を
参照のこと）から派生したアンチセンスオリゴヌクレオ
チドは、ＪＮＫ２／ＪＮＫ２−α２及びＪＮＫ２−α１
の発現に有意に影響することなく、ＪＮＫ２−β１及び
ＪＮＫ２−β２と特異的にハイブリダイズし、その発現
をモジュレートするために選択され、使用され得る。１
例として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７由来の配列を有す
るがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８は有さないオリゴヌクレ
オチドは、ＪＮＫ２／ＪＮＫ２−α１及びＪＮＫ２−α
２をコードするｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズする
が、ＪＮＫ２−β１及びＪＮＫ２−β２をコードするｍ
ＲＮＡとはハイブリダイズしない：
【０１６６】
【化８】
【０１６７】ＪＮＫ２イソ型のカルボキシル末端部分で
は、ＪＮＫ２／ＪＮＫ２−α２はＪＮＫ２−β２と同一
性を共有し、同様に、ＪＮＫ２−α１とＪＮＫ２−β１
は同一のカルボキシ末端部分を有する。上記イソ型のア
ミノ酸配列における実質的な違い（ＪＮＫ２−α１及び
ＪＮＫ２−β１の５個のアミノ酸がＪＮＫ２／ＪＮＫ２
−α２及びＪＮＫ２−β２では４７個のアミノ酸に置換
されている）は、リーディングフレームをシフトさせる
ヌクレオチド配列におけるわずかな違いから生じてい
る。特定すると、ＪＮＫ２−α１及びＪＮＫ２−β１を
コードするｍＲＮＡのＯＲＦでは、ＪＮＫ２−α１（Ｇ
ｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ３４８２１）のｎｔ１１６４
−１１９８及びＪＮＫ２−β１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番
号：Ｕ３５００２）のｎｔ１１４２−１１７６がＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：７９として以下に示される配列を有する
のに対し、ＪＮＫ２／ＪＮＫ２−α２及びＪＮＫ２−β
２をコードするｍＲＮＡのＯＲＦでは、ＪＮＫ２／ＪＮ
Ｋ２−α２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｌ３１９５１）
のｎｔ１１７８−１２０７及びＪＮＫ２−β２（Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ登録番号：Ｕ３５００３）のｎｔ１１５４−１
１８３がＳＥＱ ＩＤＮＯ：８０として以下に示される
配列を有する。説明のために、ＳＥＱ ＩＤＮＯ：７９
及び８０を互いに並置して示す（ダッシュ、“−"は、
提示された配列で欠損している塩基を示し、太字の塩基
は、ＪＮＫ２−α１及びＪＮＫ２−β１のＯＲＦに対す
る終止コドンを示す）：
【０１６８】
【化９】
【０１６９】このＪＮＫ２イソ型間の違いにより、ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：７９の逆相補体（即ち、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：８１、以下を参照のこと）から派生したアンチ
センスオリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ２／ＪＮＫ２−α
２及びＪＮＫ２−β２の発現に有意に影響することな
く、ＪＮＫ２−α１及びＪＮＫ２−β１をコードするｍ
ＲＮＡと特異的にハイブリダイズし、その発現をモジュ
レートするために選択され、使用され得る。同様に、Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０の逆相補体（即ち、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：８２、以下を参照のこと）から派生したアンチ
センスオリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ２−α１及びＪＮ
Ｋ２−β１の発現に有意に影響することなく、ＪＮＫ２
／ＪＮＫ２−α２及びＪＮＫ２−β２をコードするｍＲ
ＮＡと特異的にハイブリダイズし、その発現をモジュレ
ートするために選択され、使用され得る。１例として、
ＩＳＩＳ １２５６４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２に対応するが、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：８１には対応せず、従って、ＪＮＫ２／ＪＮＫ
２−α２及びＪＮＫ２−β２をコードするｍＲＮＡと特
異的にハイブリダイズし、その発現をモジュレートする
ために使用され得るが、ＪＮＫ２−α１及びＪＮＫ２−
β１のそれとはハイブリダイズしない。
【０１７０】
【化１０】
【０１７１】好ましい態様では、そのようなイソ型特異
的オリゴヌクレオチドは、上記に記載されるように、メ
トキシエトキシ「ギャップマー」又は「ウィングマー」
であり、そこではＲＮアーゼＨ感受性の「ギャップ」又
は「ウィング」が上記アンチセンス配列、即ちＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：７７、７８、８１及び８２の非同一性領域
を覆うように位置付けられている。
【０１７２】実施例５：ＪＮＫ３発現のオリゴヌクレオ
チド介在性阻害 Ａ．ＪＮＫ３のオリゴヌクレオチド配列：表１４は、Ｊ
ＮＫ３・ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするように
設計されたオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列及び
それに対応するＩＳＩＳとＳＥＱ ＩＤ ＮＯをリスト
する。標的遺伝子のヌクレオチド座標及び遺伝子標的領
域も包含されている。ヌクレオチド座標は、ＧｅｎＢａ
ｎｋ登録番号：Ｕ０７６２０、遺伝子座名「ＨＳＵ０７
６２０」に由来する（また、Mohit et al., Neuron, 19
94, 14, 67の図４（Ａ）を参照のこと）。遺伝子標的領
域の略語は以下の通りである：５'−ＵＴＲ、５'非翻訳
領域；ｔＩＲ、翻訳開始領域；ＯＲＦ、オープンリーデ
ィングフレーム；３'−ＵＴＲ、３'非翻訳領域。オリゴ
ヌクレオチドの標的座標位置及び遺伝子標的領域がＪＮ
Ｋ３の関連イソ型をコードするｍＲＮＡ内部で変化し得
ることに留意すべきである（以下のＤ節を参照のこ
と）。
【０１７３】配列が表１４に表されるオリゴヌクレオチ
ドのヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合によって
連結され、「ギャップマー」である。特定すると、３'及
び５'末端の６つのヌクレオチドは２'−メトキシエトキ
シが修飾され、表１４で太字で示されているが、中央の
８つのヌクレオチドは２'位で非修飾（即ち、２−デオ
キシ）である。
【０１７４】ＩＳＩＳ Ｎｏ．１６６９２、１６６９
３、１６７０３、１６７０４、１６７０５、１６７０７
及び１６７０８（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
６、４７、５６、５７、５８、６０及び６１）の完全な
オリゴヌクレオチド配列は、ヒトＪＮＫ３・ｍＲＮＡと
ハイブリダイズすることに加えて、「ｐ５４β」と呼ば
れるストレス活性化プロテインキナーゼをコードする、
Rattus norvegicus 由来のｍＲＮＡに特異的にハイブリ
ダイズする（Kyriakis et al., Nature, 1994, 369,15
6;ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ２７１２８、遺伝子座名
「ＲＡＴＳＡＰＫＣ」）。さらに、１６６９２、１６６
９３、１６６９５、１６７０３、１６７０４、１６７０
５、１６７０７及び１６７０８（それぞれ、ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：４６、４７、４９、５６、５７、５８、６０
及び６１）の完全なオリゴヌクレオチド配列は、マイト
ジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ及び「ｐ４
５９3F12ＳＡＰキナーゼ」と呼ばれるストレス活性化タ
ンパク質をコードする、Mus musculus由来のｍＲＮＡに
特異的にハイブリダイズする（Martin et al., Brain R
es. Mol. Brain Res., 1996, 35,17;ＧｅｎＢａｎｋ登
録番号Ｌ３５２３６、遺伝子座名「ＭＵＳＭＡＰ
Ｋ」）。従って、これらのオリゴヌクレオチドは、in v
itro、即ち全動物由来の培養細胞又は組織において、又
はin vivoにおいて、ラット又はマウスそれぞれのｐ５
４β及びｐ４５９3F12ＳＡＰプロテインキナーゼの役割
を研究する本発明の好ましい態様となる。上記オリゴヌ
クレオチドの標的遺伝子のヌクレオチド座標及び遺伝子
標的領域は、これらＧｅｎＢａｎｋエントリーについて
定義されるように、表１５に詳しく示されている。
【０１７５】Ｂ．ＪＮＫ３特異的プローブ：ＪＮＫ３配
列から派生したオリゴヌクレオチドセットの生物活性に
ついての最初のスクリーニングにおいて、ＪＮＫ３のｃ
ＤＮＡクローン（Derijard et al., Cell, 1994, 76, 1
025）を放射標識し、ノーザンブロットにおけるＪＮＫ
３特異的プローブとして使用した。しかしながら、表１
４の１種又はそれ以上のオリゴヌクレオチドは、別のや
り方でも検出できるように標識し、ＪＮＫ３特異的プロ
ーブとして使用した。
【０１７６】Ｃ．ウェスタンアッセイ：ＪＮＫ３・ｍＲ
ＮＡへ標的されたオリゴヌクレオチドのＪＮＫ３タンパ
ク質レベルに対する効果を評価するために、ほとんど上
記実施例２〜４に記載したようにしてウェスタンアッセ
イを実施する。ＪＮＫ３に特異的に結合する一次抗体
は、例えばアップステートバイオテクノロジー社（レー
クプラシッド、ＮＹ）、ストレスジェン・バイオテクノ
ロジー社（ビクトリア、ＢＣ、カナダ）、又はニューイ
ングランドバイオラブズ社（ビバリー、ＭＡ）から購入
する。 表 １４ ＪＮＫ３オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
【０１７７】
【表１５】
【０１７８】1 太字の残基は２'−メトキシエトキシ修
飾である。 表 １５ ＪＮＫ３オリゴヌクレオチドの、ラット及びマウスの遺
伝子標的位置
【０１７９】
【表１６】
【０１８０】1 ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ２７１２８か
らの座標、遺伝子座名「ＲＡＴＳＡＰＫＣ」。2 ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ３５２３６からの座標、遺
伝子座名「ＭＵＳＭＡＰＫ」。
【０１８１】Ｄ．ＪＮＫ３イソ型に特異的なオリゴヌク
レオチド：ＪＮＫ３の２種のイソ型が記載された。ＪＮ
Ｋ３−α１はMohit et al.,（Neuron, 1995, 14, 67）
により最初にクローニングされ、「ｐ４９3F12キナー
ゼ」と命名された。次いで、ＪＮＫ３の関連イソ型をコ
ードする２種のｃＤＮＡがクローニングされ、それらの
ヌクレオチド配列が決定された（Gupta et al., EMBO J
ournal, 1996, 15, 2760）。このイソ型は、本明細書で
はＪＮＫ３−α１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ３４８
２０、遺伝子座名「ＨＳＵ３４８２０」）及びＪＮＫ３
−α２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ３４８１９、遺伝
子座名「ＨＳＵ３４８１９２」）と命名される。この２
種のＪＮＫ３のイソ型は、おそらく選択的ｍＲＮＡスプ
ライシングから生じるが、それぞれ異なる転写因子又は
転写因子のセットと相互作用し得る（Gupta et al., EM
BO Journal, 1996, 15, 2760）。以下に詳しく示すよう
に、本発明のあるオリゴヌクレオチドは、これらＪＮＫ
３の２種のイソ型のそれぞれに特異的である。
【０１８２】ＪＮＫ３−α１及びＪＮＫ３−α２はその
カルボキシル末端部分で異なる。これらイソ型のアミノ
酸の実質的な違い（ＪＮＫ３−α１の５個のアミノ酸が
ＪＮＫ３−α２では４７個のアミノ酸に置換されてい
る）は、リーディングフレームをシフトさせるヌクレオ
チド配列におけるわずかな違いから生じている。特定す
ると、ＪＮＫ３−α１をコードするｍＲＮＡのＯＲＦで
は、ＪＮＫ３−α１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ３４
８２０）のヌクレオチド（ｎｔ）１３２５−１３６２が
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３として以下に示される配列を
有するのに対し、ＪＮＫ３−α２をコードするｍＲＮＡ
のＯＲＦでは、ＪＮＫ３−α２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番
号：Ｕ３４８１９）のｎｔ１３０１−１３３３がＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：８４として以下に示される配列を有す
る。説明のために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３及び８４
を互いに並置して示す（垂直のマーク、“｜"は、２つ
の配列で同一である塩基を示す；ダッシュ、“−"は、
提示された配列で欠損している塩基を示す；太字の塩基
は、ＪＮＫ３−α１のＯＲＦに対する終止コドンを示
す）：
【０１８３】
【化１１】
【０１８４】このＪＮＫ３イソ型間の違いにより、ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：８３の逆相補体（即ち、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：８５、以下を参照のこと）由来のアンチセンス
オリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ３−α２の発現に有意に
影響することなく、ＪＮＫ３−α１をコードするｍＲＮ
Ａと特異的にハイブリダイズし、その発現をモジュレー
トするために選択され、使用され得る。同様に、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：８４の逆相補体（即ち、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：８６、以下を参照のこと）由来のアンチセンスオ
リゴヌクレオチドは、ＪＮＫ３−α１の発現に有意に影
響することなく、ＪＮＫ３−α２をコードするｍＲＮＡ
と特異的にハイブリダイズし、その発現をモジュレート
するために選択され、使用され得る：
【０１８５】
【化１２】
【０１８６】好ましい態様では、そのようなイソ型特異
的オリゴヌクレオチドは、上記に記載されるように、メ
トキシエトキシ「ギャップマー」又は「ウィングマー」
であり、そこではＲＮアーゼＨ感受性の「ギャップ」又
は「ウィング」が上記アンチセンス配列、即ちＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：８５及び８６の非同一性領域を覆うように
位置付けられている。
【０１８７】Ｅ．ＪＮＫ３オリゴヌクレオチドの活性：
ＪＮＫ３特異的ホスホロチオエート、２'−メトキシエ
トキシ「ギャップマー」オリゴヌクレオチド（表１４）
をＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＪＮＫ３・ｍＲＮＡレベ
ルに作用する能力についてスクリーニングした（Biedle
r et al., Cancer Res., 1973, 33, 2463）。ＳＨ−Ｓ
Ｙ５Ｙ細胞は、多種多様なマイトジェン活性化プロテイ
ンキナーゼ（ＭＡＰＫ；例えば、Cheng et al., J. Bio
l. Chem., 1998, 273, 14560を参照のこと）を発現す
る。細胞は以前に記載された（例えば、 Singleton et
al., J. Biol. Chem., 1996, 271, 31791; Jalava et a
l., Cancer Res., 1990, 50, 3422）ようにしてＤＭＥ
Ｍで増殖させ、実施例２に記載されたように２００ｎＭ
濃度のオリゴヌクレオチドで処理した。対照の培養物
は、オリゴヌクレオチドを含有しないＬＩＰＯＦＥＣＴ
ＩＮ（商標）のアリコートで処理した。
【０１８８】結果を表１６に示す。ＪＮＫ３・ｍＲＮＡ
レベルの約４５％以上〜約１００％の阻害レベルを示す
オリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ Ｎｏ．１６６９２、
１６６９３、１６６９４、１６６９５、１６６９６、１
６６９７、１６７０２、１６７０３、１６７０４、１６
７０５及び１６７０６（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：４６、４７、４８、４９、５０、５１、５５、５
６、５７、５８及び５９）を包含する。これらのオリゴ
ヌクレオチドはＪＮＫ３の発現をモジュレートするため
の本発明の好ましい態様である。このアッセイにおいて
ＪＮＫ３・ｍＲＮＡレベルの約６０％以上〜約１００％
の阻害レベルを示すオリゴヌクレオチドは、ここで
「約」とは±５％を示すが、ＩＳＩＳ Ｎｏ．１６６９
３、１６６９４、１６６９５、１６７０２、１６７０
３、１６７０４及び１６７０５（それぞれ、ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：４７、４８、４９、５５、５６、５７及び５
８）を包含する。従って、これらのオリゴヌクレオチド
はＪＮＫ３の発現をモジュレートするための本発明のよ
り好ましい態様である。 表１６：ＪＮＫオリゴヌクレオチドの活性
【０１８９】
【表１７】
【０１９０】1 ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）だけで処
理した細胞（オリゴヌクレオチドなし）。2 Ｎ．Ｄ．：定量不可。
【０１９１】実施例６：ＡＰ−１サブユニットを標的に
したオリゴヌクレオチドの癌転移関連酵素に対する効果 良性腫瘍、及び発達経過の初期に検出された原発性悪性
腫瘍を有する患者は、この良性又は原発の腫瘍を外科的
に除去することによりしばしば成功裡に治療される。し
かし、チェックされなければ、悪性腫瘍由来の細胞は、
侵襲及び転移のプロセスを経て患者の体内に拡散する。
侵襲とは付着した原発部位から分離して、例えば基底膜
へ浸透する癌細胞の能力に言及する。転移は、（１）癌
細胞がその細胞外マトリックスから分離する、（２）分
離した癌細胞が、しばしば循環系を介して患者の身体の
別の部分へ移動し、及び（３）遠位及び不適切な細胞外
マトリックスに付着し、そこに二次腫瘍が発生する病巣
を形成する、という一連の事象を示す。正常細胞は侵襲
や転移をする能力を有さず、及び／又は上記の事象が起
きてもアポトーシス（プログラム化された細胞死）をす
る能力を有さない（Ruoslahti, Sci. Amer., 1996, 27
5, 72）。
【０１９２】マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭ
Ｐ）は、細胞外マトリックスの成分を分解する能力を有
する酵素のファミリーである（Birkedal-Hansen, Curre
nt Op. Biol., 1995, 7, 728）。ＭＭＰファミリーの多
くのメンバーは、ヒト腫瘍並びに他の病態において上昇
した活性レベルを有することが見出されてきた（Stetle
r-Stevenson et al., Annu. Rev. Cell Biol., 1993,
9, 541; Bernhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
(U.S.A.), 1994, 91, 4293）。特に、このファミリーの
１つのメンバーである、マトリックスメタロプロテイナ
ーゼ−９（ＭＭＰ−９）は、しばしば腫瘍及び他の病的
な組織においてのみ発現されていることが見出されてい
る（Himelstein et al., Invasion & Metastasis, 199
4, 14, 246）。いくつかの研究は、ＭＭＰ−９遺伝子の
調節がＡＰ−１の転写因子によって制御される可能性を
示した（Kerr et al., Science, 1988, 242, 1242; Ker
r et. al., Cell, 1990, 61, 267; Gum et al., J. Bio
l. Chem., 1996, 271, 10672; Hua et. al., Cancer Re
s., 1996, 56, 5279）。ＭＭＰ−９の発現がＡＰ−１の
モジュレーションによって影響され得るかを決定するた
めに、正常なヒト表皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）を用
いて以下の実験を実施した。ＮＨＥＫは検出し得るＭＭ
Ｐ−９を普通は発現しないが、ＴＰＡ（１２−Ｏ−テト
ラデカノイルホルボール−１３−アセテート）を包含す
る数多くの刺激によってＭＭＰ−９が誘導され得る。ｃ
−ｊｕｎを標的にしたオリゴヌクレオチドであるＩＳＩ
Ｓ １０５８２を、ＭＭＰ−９の発現をモジュレートす
る能力について評価した（出願中の特許第０８／８３
７，２０１号、１９９７年４月１４日出願、代理人ケー
ス番号ＩＳＰＨ−０２０９を参照のこと）。試験結果
（表１７）は、ＩＳＩＳ １０５８２がＴＰＡ誘導後の
ＭＭＰ−９の発現を完全に阻害し得ることを示す。 表 １７ ＭＭＰ−９の発現に対するｃ−ｊｕｎオリゴヌクレオチ
ドの効果
【０１９３】
【表１８】
【０１９４】上記の結果は、ＴＰＡ介在性のＭＭＰ−９
の誘導にｃ−Ｊｕｎが必要とされることを証明し、ＡＰ
−１サブユニットを標的にしたオリゴヌクレオチドがＭ
ＭＰファミリーメンバーの発現を阻害し、それにより、
患者体内の他の組織を侵襲する及び／又は他の部位へ転
移する癌細胞の能力をモジュレートし得ることを示す。
ＪＮＫタンパク質はＪｕｎサブユニットのＮ末端部分を
リン酸化することによりＡＰ−１を活性化するので、本
開示のオリゴヌクレオチドによる１種又はそれ以上のＪ
ＮＫタンパク質のモジュレーションもＭＭＰファミリー
メンバーの発現をモジュレートして癌細胞の転移能力を
制限する可能性がある。
【０１９５】実施例７：ＪＮＫタンパク質を標的にした
オリゴヌクレオチドによるヒト腫瘍／マウスの処理 約５ｘ１０6個の乳腺癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細
胞系；アメリカ・タイプ・カルチャー・コレクション、
リッチモンド、ＶＡ、Ｎｏ．ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２６）
をヌードマウス（３セットのマウス各セットにつきｎ＝
６）の右内大腿の皮下に植え付けた。オリゴヌクレオチ
ドＩＳＩＳ １５３４６（ＪＮＫ１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１６）及び１５３５３（ＪＮＫ２、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３１）を生理食塩水に懸濁し、腫瘍体積が約１０
０ｍｍ3である第１日目に、２セットのマウスに対し１
日１回投与した。生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）の
みの溶液を、対照として第３のセットのマウスへ投与し
た。オリゴヌクレオチドは２５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈
内注射により投与した。腫瘍細胞接種後１２、１９、２
６及び３３日目に腫瘍サイズを測定し、腫瘍体積を算出
した。
【０１９６】この試験結果を表１８に示す。１５３４６
（ＪＮＫ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）と１５３５３
（ＪＮＫ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）はいずれも対
照の生理食塩水に比較して腫瘍の増殖を阻害した。特定
すると、第２６日及び３３日目では、オリゴヌクレオチ
ドで処理された動物内のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍は生
理食塩水で処理した動物の腫瘍より小さいサイズを有
し、オリゴヌクレオチドが腫瘍の増殖を阻害することを
示した。本発明のアンチセンス化合物は、例えばヒト頚
管上皮癌細胞（ヒーラ細胞系、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ−２）、ヒト肺癌細胞（Ａ５４９細胞系、Ａ
ＴＣＣ Ｎｏ．ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）、ヒト腺癌
細胞（ＳＷ４８０細胞系、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＡＴＣＣ
ＣＣＬ−２２８）、ヒト膀胱癌細胞（Ｔ２４細胞系、Ａ
ＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ−４）、ヒト膵臓癌細胞（ＭＩＡ
ＰａＣａ細胞系、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１４２
０）及びヒト小細胞癌細胞（ＮＣＩ−Ｈ６９細胞系、Ａ
ＴＣＣ ＨＴＢ−１１９）から生じる異種移植片の増殖
を遅延又は消滅させる能力についても試験される。上記
及び他の細胞系から生じる異種移植片は、ＭＤＡ−ＭＢ
−２３１細胞を使用する実験について使用されたものと
ほとんど同じ技術を使用して確立される。 表１８：ＪＮＫ１及びＪＮＫ２を標的にしたオリゴヌク
レオチドに対するＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍／マウスの
応答
【０１９７】
【表１９】
【０１９８】実施例８：ラットＪＮＫタンパク質をコー
ドする遺伝子を標的にしたオリゴヌクレオチド 動物モ
デルにおけるＪＮＫタンパク質の役割を試験するため
に、Rattus norvegicus のＪＮＫ１、ＪＮＫ２及びＪＮ
Ｋ３をコードする遺伝子を標的にするオリゴヌクレオチ
ドを製造した。これらのオリゴヌクレオチドは２'−メ
トキシエトキシ、ホスホジエステル／２'−ヒドロキシ
ル、ホスホロチオエート／２'−メトキシエトキシ、ホ
スホジエステル「ギャップマー」であり、各シトシン残
基は５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）である。これらアン
チセンス化合物は、本開示の方法によって合成した。こ
れらオリゴヌクレオチドのあるものは本明細書で示され
る以外の生物種由来のＪＮＫ遺伝子と追加的、特異的に
ハイブリダイズする。この実施例に記載されるオリゴヌ
クレオチドを、先の実施例に記載の方法にほとんど準拠
して、ラットのＪＮＫ・ｍＲＮＡレベルをモジュレート
する能力について試験した。但し、例外として、使用し
た細胞系はラットＡ１０大動脈平滑筋細胞（ＡＴＣＣ
Ｎｏ．ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４７６）であり、使用した
プローブはラットＪＮＫ１、ＪＮＫ２又はＪＮＫ３に特
異的であった（以下を参照）。Ａ１０細胞を増殖させ、
ほとんどCioffiら（Mol. Pharmacol., 1997, 51,383）
により記載された方法によりオリゴヌクレオチドで処理
した。
【０１９９】Ａ．ＪＮＫ１：表１９は、ヒトＪＮＫ１タ
ンパク質に相同である「ｐ５４γ」又は「ＳＡＰＫγ」
と呼ばれるストレス活性化プロテインキナーゼ（Kyriak
is et al., Nature, 1994, 369, 156；ＧｅｎＢａｎｋ
登録番号Ｌ２７１２９、遺伝子座名「ＲＡＴＳＡＰＫ
Ｄ」）をコードする Rattus norvegicus由来の核酸と特
異的にハイブリダイズするように設計された、オリゴヌ
クレオチドＩＳＩＳ Ｎｏ．２１８５７〜２１８７０
（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１〜１２４）セ
ットの配列及び構造を示す。表１９において、太字の残
基は２'−メトキシエトキシ残基であり（他は２'−デオ
キシ）；太字“Ｃ"残基は２'−メトキシエトキシ−５−
メチルシトシンで、“Ｃ"残基は５−メチルシトシンで
ある；“ｏ"はホスホジエステル結合を示す；“ｓ"はホ
スホロチオエート結合を示す。標的遺伝子の座標はＧｅ
ｎＢａｎｋ登録番号Ｌ２７１２９、遺伝子座名「ＲＡＴ
ＳＡＰＫＤ」からのものである。
【０２００】
【表２０】
【０２０１】これらのアンチセンス化合物を、Ａ１０細
胞におけるｐ５４γ（ＪＮＫ１）及びｐ５４ａ（ＪＮＫ
２）ｍＲＮＡのレベルをモジュレートする能力につい
て、ノーザンアッセイにより試験した。ヒトとラットの
遺伝子間の高度の配列同等性により、放射標識したヒト
ＪＮＫ１（実施例３）及びＪＮＫ２（実施例４）のｃＤ
ＮＡは、このラット相同体に対する特異的なプローブと
して機能した。
【０２０２】試験結果を表２０に示す。ラットＪＮＫ１
・ｍＲＮＡレベルの約７５％以上〜約１００％の阻害レ
ベルを示すオリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ Ｎｏ．２
１８５７〜２１８７０（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１１１〜１２４）を包含する。これらのオリゴヌク
レオチドは、ラットＪＮＫ１の発現をモジュレートする
本発明の好ましい態様である。ラットＪＮＫ１・ｍＲＮ
Ａレベルの約９０％以上〜約１００％の阻害レベルをこ
のアッセイで示すオリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ Ｎ
ｏ．２１８５８、２１８５９、２１８６０、２１８６
１、２１８６２、２１８６５、２１８６６及び２１８６
７（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２、１１３、
１１４、１１５、１１６、１１９、１２０及び１２１）
を包含する。従って、これらのオリゴヌクレオチドは、
ラットＪＮＫ１の発現をモジュレートする本発明のより
好ましい態様である。ＩＳＩＳ ２１８５９（ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１１３）を以降の試験での使用に選択した
（以下参照）。
【０２０３】オリゴヌクレオチドの２つ、ＩＳＩＳ Ｎ
ｏ．２１８６１及び２１８１７（それぞれ、ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１１５及び１２１）は、ＪＮＫ１とＪＮＫ２
のいずれもモジュレートする能力を示した。そのような
オリゴヌクレオチドを本明細書で「Ｐａｎ（汎）−ＪＮ
Ｋ」アンチセンス化合物として言及するのは、「汎」と
いう用語が、免疫学の文献では、例えばあるタンパク質
の全イソ型又はある細胞型の全サブタイプを認識する抗
体に言及するように使用されているからである。汎ＪＮ
Ｋオリゴヌクレオチドについては以下でより詳しく論じ
る。
【０２０４】表１９に記載されたオリゴヌクレオチドの
いくつかは、ラットＪＮＫ１をコードする核酸と特異的
にハイブリダイズし得るだけでなく、他の種由来のＪＮ
Ｋ１コード核酸とも特異的にハイブリダイズし得る。Ｉ
ＳＩＳ ２１８５９（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１１３）は、
ヒトＪＮＫ１α１及びＪＮＫ１β１（即ち、それぞれＧ
ｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ２６３１８及びＵ３５００４）
をコードするｃＤＮＡの塩基４〜２３に相補的である。
ＩＳＩＳ ２１８６２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６）
は、ヒトＪＮＫ１α１及びＪＮＫ１β１のｃＤＮＡ（即
ち、それぞれＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ２６３１８及び
Ｕ３５００４）の塩基２９４〜３１３、ＪＮＫ１β２の
ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３５００５）の塩
基２８９〜３０８及びＪＮＫ１α２のｃＤＮＡ（Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ登録番号Ｕ３４８２２）の塩基２８８〜３０７
に相補的である。最後に、ＩＳＩＳ ２１８６５は、ヒ
トＪＮＫ１α１のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ
２６３１８）の塩基６５４〜６７３及びヒトＪＮＫ１α
２のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３４８２２）
の塩基６４８〜６６７に相補的である。これらのオリゴ
ヌクレオチドを、実施例３に記載の方法により、ヒトＪ
ＮＫ１遺伝子のｍＲＮＡレベルをモジュレートする能力
について試験する。 表２０：ラットＪＮＫ１を標的にしたオリゴヌクレオチ
ドの活性
【０２０５】
【表２１】
【０２０６】1 ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）だけで処
理した細胞（オリゴヌクレオチドなし）。
【０２０７】Ｂ．ＪＮＫ２：表２１は、「ｐ５４α」又
は「ＳＡＰＫα」と呼ばれるストレス活性化プロテイン
キナーゼ（Kyriakis et al., Nature, 1994, 369, 15
6）をコードする Rattus norvegicus由来の核酸と特異
的にハイブリダイズするように設計された、オリゴヌク
レオチドＩＳＩＳ Ｎｏ．１８２５４〜１８２６７（そ
れぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５〜１３８）セット
の配列及び構造を示す。３種の対照オリゴヌクレオチ
ド、ＩＳＩＳ Ｎｏ．２１９１４〜２１９１６（それぞ
れ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９〜１４１）の構造もこ
の表に示されている。ｐ５４αの２つのイソ型が記載さ
れた：「ｐ５４α１」（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ２７
１１２、遺伝子座名「ＲＡＴＳＡＰＫＡ」及び「ｐ５４
α２」（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ２７１１１、遺伝子
座名「ＲＡＴＳＡＰＫＢ」）である。ＩＳＩＳ １８２
５７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２８）を除き、表２１に
記載のオリゴヌクレオチドは、ｐ５４α１又はｐ５４α
２のいずれかをコードする核酸に特異的にハイブリダイ
ズする。ＩＳＩＳ １８２５７は、ｐ５４α２（即ち、
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ２７１１１、遺伝子座名「Ｒ
ＡＴＳＡＰＫＢ」）をコードする核酸と特異的にハイブ
リダイズする。表２１において、太字の残基は２'−メ
トキシエトキシ残基であり（他は２'−デオキシ）；太
字“Ｃ"残基は２'−メトキシエトキシ−５−メチルシト
シンで、“Ｃ"残基は５−メチルシトシンである；“ｏ"
はホスホジエステル結合を示す；“ｓ"はホスホロチオ
エート結合を示す。標的遺伝子の座標はＧｅｎＢａｎｋ
登録番号Ｌ２７１１２、遺伝子座名「ＲＡＴＳＡＰＫ
Ｂ」からのものである。
【０２０８】
【表２２】
【０２０９】表 ２２ ラットＪＮＫ２を標的にしたオリゴヌクレオチドの活性
【表２３】
【０２１０】1 ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）だけで処
理した細胞（オリゴヌクレオチドなし）。
【０２１１】これらのアンチセンス化合物を、Ａ１０細
胞におけるｐ５４α（ＪＮＫ２）ｍＲＮＡのレベルをモ
ジュレートする能力について、以下に示すように、放射
標識したヒトＪＮＫ２のｃＤＮＡをプローブとして使用
して試験した。試験結果を表２２に示す。ラットＪＮＫ
２・ｍＲＮＡレベルの約６０％以上〜約１００％の阻害
レベルを示すオリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ Ｎｏ．
１８２５４、１８２５５、１８２５７、１８２５８、１
８２５９、１８２６０及び１８２６４（それぞれ、ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１２５、１２６、１２８、１２９、１
３０、１３１及び１３５）を包含する。これらのオリゴ
ヌクレオチドは、ラットＪＮＫ２発現をモジュレートす
る本発明の好ましい態様である。ラットＪＮＫ２・ｍＲ
ＮＡレベルの約８０％以上〜約１００％の阻害レベルを
このアッセイで示すオリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ
Ｎｏ．１８２５４、１８２５５、１８２５８及び１８２
５９（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５、１２
６、１２９及び１３０）を包含する。従って、これらの
オリゴヌクレオチドは、ラットＪＮＫ２発現をモジュレ
ートする本発明のより好ましい態様である。ＩＳＩＳ
１８２５９（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１３０）を以降の試験
での使用に選択した（以下参照）。
【０２１２】Ｃ．用量反応性：ラットＪＮＫ１（ＩＳＩ
Ｓ ２１８５９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３）及びＪ
ＮＫ２（ＩＳＩＳ １８２５９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１３０）を標的にしたヌクレオチド及びノーザンアッセ
イを使用して用量反応試験を実施した。この結果（表２
３）は、オリゴヌクレオチド濃度が上昇するにつれて増
加する効果を示し、ＩＳＩＳ Ｎｏ．２１８５９及び１
８２５９（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３及び１
３０）がそれぞれＪＮＫ１及びＪＮＫ２をコードするｍ
ＲＮＡのレベルを特異的にモジュレートすることを確認
する。 表 ２３： ラットＪＮＫアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ
Ｏ）に対する用量依存的な反応
【０２１３】
【表２４】
【０２１４】Ｄ．ＪＮＫ３：表２４は、ヒトＪＮＫ３タ
ンパク質に相同である「ｐ５４β」と呼ばれるストレス
活性化プロテインキナーゼ（Kyriakis et al., Nature,
1994, 369, 156；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ２７１２
８、遺伝子座名「ＲＡＴＳＡＰＫＣ」）をコードする R
attus norvegicus由来の核酸と特異的にハイブリダイズ
するように設計された、オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ
Ｎｏ．２１８９９〜２１９１２（それぞれ、ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１４２〜１５５）のセットの配列及び構造を
示す。表２４において、太字の残基は２'−メトキシエ
トキシ残基であり（他は２'−デオキシ）；太字“Ｃ"残
基は２'−メトキシエトキシ−５−メチルシトシンで、
“Ｃ"残基は５−メチルシトシンである；“ｏ"はホスホ
ジエステル結合を示す；“ｓ"はホスホロチオエート結
合を示す。標的遺伝子の座標はＧｅｎＢａｎｋ登録番号
Ｌ２７１２８、遺伝子座名「ＲＡＴＳＡＰＫＣ」からの
ものである。先の実施例に記載された方法にほとんど準
拠して、ラットＪＮＫ３・ｍＲＮＡのレベルをモジュレ
ートする能力について、これらオリゴヌクレオチドを試
験する。
【０２１５】表２４に記載のオリゴヌクレオチドのいく
つかは、ラットＪＮＫ３をコードする核酸に特異的にハ
イブリダイズすることに加えて、ヒト及びMus muculus
（マウス）由来のＪＮＫ３をコードする核酸とも特異的
にハイブリダイズする。表２５はこれらの関係を説明す
る。これらヌクレオチドを、実施例５に記載の方法によ
り、ヒトＪＮＫ遺伝子のｍＲＮＡレベルをモジュレート
する能力について試験する。
【０２１６】
【表２５】
【０２１７】表２５：ラットＪＮＫ３オリゴヌクレオチ
ドの交叉ハイブリダイゼーション
【表２６】
【０２１８】1 ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３４８２０、
遺伝子座名「ＨＳＵ３４８２０」（Mohit et al., Neur
on, 1995, 14, 67及びGupta et al., EMBO Journal, 19
96, 15, 2760も参照のこと）。2 ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３４８１９、遺伝子座名
「ＨＳＵ３４８１９」（Gupta et al., EMBO Journal,
1996, 15, 2760も参照のこと）。3 ｐ４５９3F12ＭＡＰＫとしても知られる；ＧｅｎＢａ
ｎｋ登録番号Ｌ３５２３６、遺伝子座名「ＭＵＳＭＡＰ
Ｋ」（Martin et al., Brain Res. Mol. Brain Res., 1
996, 35, 47も参照のこと）。
【０２１９】Ｅ．汎ＪＮＫオリゴヌクレオチド：本発明
のオリゴヌクレオチドのいくつかは２種又はそれ以上の
ＪＮＫタンパク質をモジュレートし得て、本明細書では
「汎ＪＮＫ」オリゴヌクレオチドとして言及される。例
えば、ＩＳＩＳ Ｎｏ．２１８６１及び２１８６７（そ
れぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５及び１２１）は、
ＪＮＫ１及びＪＮＫ２のいずれもモジュレートする能力
を示した（表２０）。そのようなオリゴヌクレオチド
は、いくつかのＪＮＫタンパク質の同時モジュレーショ
ンが所望されるときに有用である。
【０２２０】ヒト汎ＪＮＫオリゴヌクレオチドを表２６
に記載する。これらオリゴヌクレオチドは、ヒトＪＮＫ
１α１、ＪＮＫ１α２、ＪＮＫ２α１及びＪＮＫ２α２
をコードする核酸において、同一に保存されている配列
（即ち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５６、１５８、１５
９、１６０及び１６１）又はせいぜい１塩基のミスマッ
チを起こしている配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５７）
に対して相補的であるように設計されている。表２６に
記載のオリゴヌクレオチドは、実施例３及び４に記載の
方法及びアッセイを使用して、Ａ５４９細胞におけるＪ
ＮＫ１及びＪＮＫ２のｍＲＮＡレベルをモジュレートす
る能力について、評価される。
【０２２１】そのような共通配列が、モジュレートする
ことが所望されるＪＮＫ遺伝子の間の１つ又はそれ以上
の塩基の違いを網羅する例では、ヒポキサンチン（イノ
シン）をそのような塩基の違いに対応するオリゴヌクレ
オチドの位置へ取込み得る（「ヒポキサンチン」はヌク
レオシドのイノシンに対応する塩基について当技術分野
で受入れられている用語であるが、「イノシン」は、本
明細書では、ヌクレオチド配列に関するＵ．Ｓ．及びＰ
ＣＴの規約に一致して使用されている。当技術分野で知
られているように、イノシン（Ｉ）は、様々なヌクレオ
ベース水素結合し、故にハイブリダイゼーションの目的
の「汎用」塩基として機能する。例えば、１つのイノシ
ン置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５７の誘導体で
ある配列（ＴＡＧＧＡＩＡＴＴＣＴＴＴＣＡＴＧＡＴ
Ｃ，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６２）を有するオリゴヌク
レオチドは、ヒトＪＮＫ１α１、ＪＮＫ１α２、ＪＮＫ
２α２及びＪＮＫ２α２をコードする核酸とミスマッチ
塩基を有さずに結合すると予測される。もう１つの例と
して、１つのイノシン置換を有するＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１６１の誘導体である配列（ＧＧＴＴＧＣＡＩＴＴ
ＴＣＴＴＣＡＴＧＡＡ，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６３）
を有するオリゴヌクレオチドは、ＪＮＫ１α１、ＪＮＫ
１α２、ＪＮＫ２α２及びＪＮＫ２α２に加えて、ヒト
ＪＮＫ３α１及びＪＮＫ３α２をコードする核酸とミス
マッチ塩基を有さずに結合すると予測される。そのよう
なオリゴヌクレオチドは、実施例３、４及び５に記載の
方法及びアッセイを使用して、Ａ５４９細胞におけるＪ
ＮＫ１及びＪＮＫ２のｍＲＮＡレベルを、及びＳＨ−Ｓ
Ｙ５Ｙ細胞におけるＪＮＫ３のｍＲＮＡレベルをモジュ
レートする能力について評価される。 表２６：ヒト汎ＪＮＫオリゴヌクレオチド
【０２２２】
【表２７】
【０２２３】* 太字の残基：２'−メトキシエトキシ残
基（他は２'−デオキシ）；全ての“Ｃ"残基：５−メチ
ルシトシン残基；“o"：ホスホジエステル結合：“s"：
ホスホロチオエート結合。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 19/34 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ディーン，ニコラス アメリカ合衆国カリフォルニア州92024, エンシニタス，ランドクゥイスト・ドラ イブ 1614 (72)発明者 モニア，ブレット・ピー アメリカ合衆国カリフォルニア州92009, ラ・コスタ，ヌエヴァ・カスティージ ャ・ウェイ 7605 (72)発明者 ネロ，パメラ・スコット アメリカ合衆国カリフォルニア州92054, オーシャンサイド，サウス・ネバダ・ス トリート 1010 (72)発明者 ガアーデ，ウィリアム・エイ アメリカ合衆国カリフォルニア州92009, カールズバッド，ケブラダ・サークル 3105 (56)参考文献 特表 平９−507384（ＪＰ，Ａ) ＥＭＢＯ Ｊ．， Ｖｏｌ．15 （11）， ｐ．2760−2770 （1996) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/09 C12P 19/34 A61K 31/7088 A61K 48/00 A61P 35/00 ＢＩＯＳＩＳ／ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／Ｒ ＥＧＩＳＴＲＹ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)

Claims (24)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 SEQ ID NO: 5、6、14〜19および21〜26
    からなる群から選択される配列を含み、共有結合により
    連結した20〜30のヌクレオチドを含んでなるオリゴヌク
    レオチドであって、JNK1タンパク質をコードする核酸と
    特異的にハイブリダイズする配列を有し、前記JNK1タン
    パク質の発現を阻害するオリゴヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 共有結合により連結した20〜30のヌクレ
    オチドを含んでなるオリゴヌクレオチドであって、JNK1
    タンパク質をコードする核酸の開始コドンと特異的にハ
    イブリダイズする配列を有し、前記JNK1タンパク質の発
    現を阻害し、そして前記配列がSEQ ID NO:13を含むオリ
    ゴヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 SEQ ID NO: 29〜31および34〜41からな
    る群から選択される配列を含み、共有結合により連結し
    た20〜30のヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチ
    ドであって、JNK2タンパク質をコードする核酸と特異的
    にハイブリダイズする配列を有し、前記JNK2タンパク質
    の発現を阻害するオリゴヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 SEQ ID NO: 46〜51および55〜59からな
    る群から選択される配列を含み、共有結合により連結し
    た20〜30のヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチ
    ドであって、JNK3タンパク質をコードする核酸と特異的
    にハイブリダイズする配列を有し、そして前記JNK3タン
    パク質の発現を阻害するオリゴヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 オリゴヌクレオチドの共有結合の少なく
    とも1つが修飾された共有結合である、請求項1〜4のい
    ずれか1項のオリゴヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 ヌクレオチドの少なくとも1つが修飾さ
    れたヌクレオベースを有する、請求項1〜5のいずれか1
    項のオリゴヌクレオチド。
  7. 【請求項７】 修飾されたヌクレオベースが5-メチルシ
    トシンである、請求項6のオリゴヌクレオチド。
  8. 【請求項８】 ヌクレオチドの少なくとも1つが修飾さ
    れた糖部分である、請求項1〜7のいずれか1項のオリゴ
    ヌクレオチド。
  9. 【請求項９】 修飾された糖部分を有する少なくとも2
    つの非隣接ヌクレオチドを有する、請求項8のオリゴヌ
    クレオチド。
  10. 【請求項１０】 修飾された糖部分が2'-修飾された糖
    部分である、請求項8または9のいずれかのオリゴヌクレ
    オチド。
  11. 【請求項１１】 2'-修飾糖部分が2'-メトキシエトキシ
    修飾された糖部分である、請求項10のオリゴヌクレオチ
    ド。
  12. 【請求項１２】 請求項1〜11のいずれか1項のオリゴヌ
    クレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドの細胞取
    込みを増強する少なくとも1つの親油性部分をさらに含
    んでなるオリゴヌクレオチド。
  13. 【請求項１３】 JNKタンパク質の異なるイソ型をコー
    ドする2種またはそれ以上の核酸と特異的にハイブリダ
    イズする配列を有し、そして前記JNKタンパク質の前記2
    種またはそれ以上のイソ型の発現を阻害する、請求項1
    〜12のいずれかのオリゴヌクレオチド。
  14. 【請求項１４】 JNKタンパク質の第一のイソ型をコー
    ドする核酸と特異的にハイブリダイズする配列を有し、
    前記配列は前記JNKタンパク質の第二のイソ型をコード
    する核酸と特異的にはハイブリダイズせず、そして前記
    JNKタンパク質の前記第一のイソ型の発現を阻害するが
    前記JNKタンパク質の前記第二のイソ型の発現を阻害し
    ない、請求項1〜12のいずれかのオリゴヌクレオチド。
  15. 【請求項１５】 JNKタンパク質が哺乳動物のものであ
    る、請求項1〜14のいずれかのオリゴヌクレオチド。
  16. 【請求項１６】 細胞または組織におけるJNKタンパク
    質の発現をin vitroで阻害する方法であって、前記細胞
    または組織を請求項1〜15のいずれか1項のオリゴヌクレ
    オチドと接触させることを含んでなる方法。
  17. 【請求項１７】 培養細胞またはヒトを除く動物の細胞
    における細胞周期の進行を阻害する方法であって、前記
    細胞に有効量の請求項1〜15のいずれか1項のオリゴヌク
    レオチドを投与することを含んでなる方法。
  18. 【請求項１８】 培養細胞またはヒトを除く動物の細胞
    において、JNKタンパク質によりリン酸化されたタンパ
    ク質のリン酸化を阻害する方法であって、前記細胞に有
    効量の請求項1〜15のいずれか1項のオリゴヌクレオチド
    を投与することを含んでなる方法。
  19. 【請求項１９】 培養細胞またはヒトを除く動物の細胞
    において、1種またはそれ以上の転移事象を促進する細
    胞タンパク質の発現を阻害する方法であって、前記細胞
    に有効量の請求項1〜15のいずれかのオリゴヌクレオチ
    ドを投与することを含んでなる方法。
  20. 【請求項２０】 請求項1〜15のいずれか1項のオリゴヌ
    クレオチドまたはその生物学的同等物、および製剤的に
    許容される担体を含んでなる医薬組成物であって、前記
    生物学的同等物がオリゴヌクレオチドのプロドラッグ、
    もしくはオリゴヌクレオチドまたはプロドラッグの医薬
    的に許容可能な塩である前記医薬組成物。
  21. 【請求項２１】 安定化剤、浸透増進剤、担体化合物お
    よび化学療法剤からなる群からの1種またはそれ以上の
    化合物をさらに含んでなる、請求項20の医薬組成物。
  22. 【請求項２２】 請求項1〜15のいずれか1項の複数のオ
    リゴヌクレオチドまたはその生物学的同等物、および製
    剤的に許容される担体を含んでなる医薬組成物であっ
    て、前記生物学的同等物がオリゴヌクレオチドのプロド
    ラッグ、もしくはオリゴヌクレオチドまたはプロドラッ
    グの医薬的に許容可能な塩である前記医薬組成物。
  23. 【請求項２３】 過剰増殖性の疾患を有するか、有する
    と疑われるか、または有する傾向のある、ヒトを除く動
    物を治療する方法であって、前記動物に予防的または治
    療的有効量の請求項20〜22のいずれか1項の医薬組成物
    を投与することを含んでなる方法。
  24. 【請求項２４】 ヒトを除く動物における腫瘍の増殖を
    阻害する方法であって、前記動物に有効量の請求項20〜
    22のいずれか1項の医薬組成物を投与することを含んで
    なる方法。
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