JP3519407B2 - 高等真核細胞へ外来ｄｎａを導入するためのアデノウイルス - Google Patents
高等真核細胞へ外来ｄｎａを導入するためのアデノウイルスInfo
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- C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、高等真核細胞への核酸の導入に関する。
遺伝子療法においては、特に生きた細胞に核酸を導入
する有効な系が必要である。このことは、治療に有効な
遺伝子生成物の合成を体内で達成するために、例えば、
遺伝子の欠損がある場合に欠損のある遺伝子を置き換え
るために、細胞に遺伝子を導入することを示している。
する有効な系が必要である。このことは、治療に有効な
遺伝子生成物の合成を体内で達成するために、例えば、
遺伝子の欠損がある場合に欠損のある遺伝子を置き換え
るために、細胞に遺伝子を導入することを示している。
細胞内への遺伝子の導入のために、例えば、起源のウ
イルスの有効な侵入機構を使用するウイルスベクターが
用いられる。これは、細胞内で発現される遺伝子が、組
み換え法によってゲノム中に組み込まれたウイルスを意
味している。この方法は、試験管内及び生体内での非常
に有効な遺伝子導入を得るために、組み換えレトロウイ
ルス及びアデノウイルスのベクターの構築において使用
された。遺伝子療法の中で核酸を使用する最も先進的技
術では、細胞内に遺伝子を導入するレトロウイルス系を
使用する（Wilson et al.,1990;Kasid et al.,1990）。
それゆえ、レトロウイルス系の適用可能性を拡大するた
め又は、例えばウイルスの親和性を変えることなどで、
定められた細胞集団に特異的にするための方法が既に開
発されている。
イルスの有効な侵入機構を使用するウイルスベクターが
用いられる。これは、細胞内で発現される遺伝子が、組
み換え法によってゲノム中に組み込まれたウイルスを意
味している。この方法は、試験管内及び生体内での非常
に有効な遺伝子導入を得るために、組み換えレトロウイ
ルス及びアデノウイルスのベクターの構築において使用
された。遺伝子療法の中で核酸を使用する最も先進的技
術では、細胞内に遺伝子を導入するレトロウイルス系を
使用する（Wilson et al.,1990;Kasid et al.,1990）。
それゆえ、レトロウイルス系の適用可能性を拡大するた
め又は、例えばウイルスの親和性を変えることなどで、
定められた細胞集団に特異的にするための方法が既に開
発されている。
フランス特許出願第2 649 119号と同じくRoux et a
l.,1889では、一方ではウイルスコートに対する抗体を
含み、及び他方では標的細胞に特異的な細胞膜マーカー
を含み、そしてウイルスと宿主細胞との間に結合を生じ
る複機能性の複合体によりレトロウイルスの親和性を変
える系が述べられている。
l.,1889では、一方ではウイルスコートに対する抗体を
含み、及び他方では標的細胞に特異的な細胞膜マーカー
を含み、そしてウイルスと宿主細胞との間に結合を生じ
る複機能性の複合体によりレトロウイルスの親和性を変
える系が述べられている。
Goud et al.,1988により提案された方法もまた複機能
性の複合体の原理をもとにしている。これらの複合体
は、２つのモノクローナル抗体から構成され、この抗体
の一方はヒトトランスフェリン受容体に対するものであ
り、他方がモロニー（Moloney）レトロウイルスのgp70
コートタンパク質に対するものである。これらの複合体
とともに、標的細胞内に侵入することができるが、レト
ロウイルスは細胞内で複製はできない。
性の複合体の原理をもとにしている。これらの複合体
は、２つのモノクローナル抗体から構成され、この抗体
の一方はヒトトランスフェリン受容体に対するものであ
り、他方がモロニー（Moloney）レトロウイルスのgp70
コートタンパク質に対するものである。これらの複合体
とともに、標的細胞内に侵入することができるが、レト
ロウイルスは細胞内で複製はできない。
国際出願WO 92/06180号に述べられているウイルスの
親和性を変える方法は、標的細胞の表面受容体に結合す
る分子をウイルス表面に供給することであり、それによ
り、自然には存在しない標的細胞のための特異性をウイ
ルスに与えることである。国際出願WO 92/06180号は、
アシアログリコプロテイン受容体に結合する炭水化物分
子によるレトロウイルス及びＢ型肝炎ウイルスの修飾に
ついて述べている。
親和性を変える方法は、標的細胞の表面受容体に結合す
る分子をウイルス表面に供給することであり、それによ
り、自然には存在しない標的細胞のための特異性をウイ
ルスに与えることである。国際出願WO 92/06180号は、
アシアログリコプロテイン受容体に結合する炭水化物分
子によるレトロウイルス及びＢ型肝炎ウイルスの修飾に
ついて述べている。
遺伝子療法で使用するために、最近では組み換えアデ
ノウイルスが、組み換えレトロウイルスと次第に置き換
わりつつある（Berkner,1988;Stratford−Perricaudet
et al.,1990;Rosenfeld et al.,1991;Rosenfeld et a
l.,1992;Stratford−Perricaudet et al.,1992）。
ノウイルスが、組み換えレトロウイルスと次第に置き換
わりつつある（Berkner,1988;Stratford−Perricaudet
et al.,1990;Rosenfeld et al.,1991;Rosenfeld et a
l.,1992;Stratford−Perricaudet et al.,1992）。
アデノウイルスベクターは、非分裂細胞に侵入し、8.
5kb程度までの外来DNA配列を吸収する有益な能力を有し
ている。さらに、アデノウイルス粒子は、ほとんど安定
性を失うことなく十分に精製することができ、1011PFUs
/mより大きい力価で製造される。
5kb程度までの外来DNA配列を吸収する有益な能力を有し
ている。さらに、アデノウイルス粒子は、ほとんど安定
性を失うことなく十分に精製することができ、1011PFUs
/mより大きい力価で製造される。
アデノウイルスAd2及びAd5に由来する組み換えベクタ
ーの使用上の制限は、血液細胞中に侵入する能力が制限
されることにある。しかしながら、血液細胞は容易に利
用できるので、遺伝子療法における利用のためには好ま
しい標的であり、患者に再導入されることができ、さら
に、血液細胞を獲得又は培養する方法が十分に確立され
ている。血液細胞中のアデノウイルスの能力が低い理由
は、これら細胞上のアデノウイルスのための受容体数が
明らかに少ないことにある（Horvath and Weber 1988;S
ilver and Anderson,1988）。これら細胞へのウイルス
の結合が２から５の要因により減少させられるときに、
その結合したウイルスの受容体依存性エンドサイトーシ
ス（Internalisation）はさらに少ない。最初に受容体
数が少ないことは、利用できる受容体の受容体依存性エ
ンドサイトーシスが大きく減少することを伴うことがわ
かる。
ーの使用上の制限は、血液細胞中に侵入する能力が制限
されることにある。しかしながら、血液細胞は容易に利
用できるので、遺伝子療法における利用のためには好ま
しい標的であり、患者に再導入されることができ、さら
に、血液細胞を獲得又は培養する方法が十分に確立され
ている。血液細胞中のアデノウイルスの能力が低い理由
は、これら細胞上のアデノウイルスのための受容体数が
明らかに少ないことにある（Horvath and Weber 1988;S
ilver and Anderson,1988）。これら細胞へのウイルス
の結合が２から５の要因により減少させられるときに、
その結合したウイルスの受容体依存性エンドサイトーシ
ス（Internalisation）はさらに少ない。最初に受容体
数が少ないことは、利用できる受容体の受容体依存性エ
ンドサイトーシスが大きく減少することを伴うことがわ
かる。
最近では、多くの研究において、エンドソーム含有物
を放出するアデノウイルスの能力を考慮して、受容体依
存性エンドサイトーシスによってDNA複合体とともに遺
伝子導入用の非組み換えアデノウイルスを使用すること
が提案されている。アデノウイルスの使用は、細胞内に
取り込まれたリソソーム中のDNA複合体の分解を回避す
ることにより、遺伝子導入効率を増加させる（Curiel e
t al.,1991;Curiel et al.,1992a;Zatloukal et al.,19
92;Cotten et al.,1992;Wagner et al.,1992;Curiel et
al.,1992b;Yoshimura et al.,1993;WO 93/07283）。中
でも、ポリリシンと結合することによりアデノウイルス
を改良することが提案されている。アデノウイルス−ポ
リリシン−複合体は、DNAとともにトランスフェリン−
ポリリシンの複合体と複合されることができ、それによ
り、トランスフェリン−ポリリシン／アデノウイルス−
ポリリシン/DNA三成分複合体を得ている（Wagner et a
l.,1992）。この研究の中で、トランスフェリン−ポリ
リン−複合体を伴う感染において、遊離アデノウイルス
の存在下では、K562細胞は導入レポーター遺伝子の極め
て低い発現率を示すことが見出された。ところが、ポリ
リシン結合アデノウイルスでは、三成分複合体を形成す
るためにトランスフェリン−ポリリシンと共にレポータ
ーDNAと複合し、極めて良好な結果が得られている。こ
の現象は、恐らく、アデノウイルス受容体数が少ない血
液細胞におけるDNA複合体の受容体依存性エンドサイト
ーシスが、血液細胞が多数有しているトランスフェリン
受容体を通じて起きていることに帰することができる。
を放出するアデノウイルスの能力を考慮して、受容体依
存性エンドサイトーシスによってDNA複合体とともに遺
伝子導入用の非組み換えアデノウイルスを使用すること
が提案されている。アデノウイルスの使用は、細胞内に
取り込まれたリソソーム中のDNA複合体の分解を回避す
ることにより、遺伝子導入効率を増加させる（Curiel e
t al.,1991;Curiel et al.,1992a;Zatloukal et al.,19
92;Cotten et al.,1992;Wagner et al.,1992;Curiel et
al.,1992b;Yoshimura et al.,1993;WO 93/07283）。中
でも、ポリリシンと結合することによりアデノウイルス
を改良することが提案されている。アデノウイルス−ポ
リリシン−複合体は、DNAとともにトランスフェリン−
ポリリシンの複合体と複合されることができ、それによ
り、トランスフェリン−ポリリシン／アデノウイルス−
ポリリシン/DNA三成分複合体を得ている（Wagner et a
l.,1992）。この研究の中で、トランスフェリン−ポリ
リン−複合体を伴う感染において、遊離アデノウイルス
の存在下では、K562細胞は導入レポーター遺伝子の極め
て低い発現率を示すことが見出された。ところが、ポリ
リシン結合アデノウイルスでは、三成分複合体を形成す
るためにトランスフェリン−ポリリシンと共にレポータ
ーDNAと複合し、極めて良好な結果が得られている。こ
の現象は、恐らく、アデノウイルス受容体数が少ない血
液細胞におけるDNA複合体の受容体依存性エンドサイト
ーシスが、血液細胞が多数有しているトランスフェリン
受容体を通じて起きていることに帰することができる。
アデノウイルスは、アデノウイルス受容体を持たない
又は有効な受容体依存性エンドサイトーシスを十分有さ
ない細胞内に侵入することはできず、又は、生体内での
使用が重要であるので、例えば抗体などによってウイル
スの結合部位がブロックされることにより妨げられる。
又は有効な受容体依存性エンドサイトーシスを十分有さ
ない細胞内に侵入することはできず、又は、生体内での
使用が重要であるので、例えば抗体などによってウイル
スの結合部位がブロックされることにより妨げられる。
本発明の目的は、細胞の遺伝子発現のための能力及び
／又はそのエンドソームの特性を保持しつつ、通常では
侵入することができない細胞中に有効に侵入するための
能力をアデノウイルスに与えることである。
／又はそのエンドソームの特性を保持しつつ、通常では
侵入することができない細胞中に有効に侵入するための
能力をアデノウイルスに与えることである。
それゆえ本発明は、高等真核細胞中に外来DNAを導入
するためのウイルス、即ち、細胞に結合するように標的
細胞表面受容体のリガンドでウイルス表面が修飾され、
及び細胞内で外来DNAが発現されるように取り込まれる
ウイルスに関する。該ウイルスはアデノウイルスであ
り、リガンドがトランスフェリンであるということを特
徴としている。
するためのウイルス、即ち、細胞に結合するように標的
細胞表面受容体のリガンドでウイルス表面が修飾され、
及び細胞内で外来DNAが発現されるように取り込まれる
ウイルスに関する。該ウイルスはアデノウイルスであ
り、リガンドがトランスフェリンであるということを特
徴としている。
驚くべきことに、非修飾アデノウイルスの吸収に敏感
でない血液細胞において、トランスフェリン修飾アデノ
ウイルスにより、外来DNAが取り込まれ、有効に発現で
きることが見出されている。細胞がウイルスにより感染
されるとき、多くの複合過程が、異なるウイルスに異な
る方法で行われている。例えば、ウイルスが受容体へ結
合する際に受ける形状の変化が、取り込み及び複製の過
程に実質的に必須であるかもしれないが、ウイルスの生
産的な侵入は受容体へのウイルスの結合に関連した様々
な事柄を含んでいるので、ウイルスが修飾を受けるとき
に感染に必要な上記の事柄の間の関連性が維持されてい
るかどうか予想することはできない。
でない血液細胞において、トランスフェリン修飾アデノ
ウイルスにより、外来DNAが取り込まれ、有効に発現で
きることが見出されている。細胞がウイルスにより感染
されるとき、多くの複合過程が、異なるウイルスに異な
る方法で行われている。例えば、ウイルスが受容体へ結
合する際に受ける形状の変化が、取り込み及び複製の過
程に実質的に必須であるかもしれないが、ウイルスの生
産的な侵入は受容体へのウイルスの結合に関連した様々
な事柄を含んでいるので、ウイルスが修飾を受けるとき
に感染に必要な上記の事柄の間の関連性が維持されてい
るかどうか予想することはできない。
ウイルス受容体での非修飾ウイルス（Ａ）の侵入と比
較した、トランスフェリン受容体（Ｂ）でのトランスフ
ェリン修飾アデノウイルスの侵入を、図１に図形的に示
した。
較した、トランスフェリン受容体（Ｂ）でのトランスフ
ェリン修飾アデノウイルスの侵入を、図１に図形的に示
した。
アデノウイルス受容体を持たない又は十分に持たない
がトランスフェリン受容体を持つ細胞内への、トランス
フェリン−ポリリシン/DNA複合体の吸収を改善するため
に、途中で、本発明のトランスフェリン修飾アデノウイ
ルスを使用することができる。途中で使用されるとき、
修飾されたアデノウイルスは、トランスフェリン−ポリ
リシン/DNA複合体と共に感染される細胞に対して利用さ
れ、DNA複合体と共に細胞内へ吸収され、そしてエンド
ソームの性質によって、エンドソームからのDNA複合体
の放出を行うために利用される（Curiel et al.,199
1）。
がトランスフェリン受容体を持つ細胞内への、トランス
フェリン−ポリリシン/DNA複合体の吸収を改善するため
に、途中で、本発明のトランスフェリン修飾アデノウイ
ルスを使用することができる。途中で使用されるとき、
修飾されたアデノウイルスは、トランスフェリン−ポリ
リシン/DNA複合体と共に感染される細胞に対して利用さ
れ、DNA複合体と共に細胞内へ吸収され、そしてエンド
ソームの性質によって、エンドソームからのDNA複合体
の放出を行うために利用される（Curiel et al.,199
1）。
修飾されたアデノウイルスは、三成分の組成又は組み
合わされた複合体として（Zatloukal et al.,1992）、
これら複合体の能力を増加するために使用されることも
できる。この目的のために本発明のトランスフェリン修
飾ウイルスは、例えばビオチン−ストレプタビジンのブ
リッジによって、ポリリシン/DNA複合体と組み合わされ
る。その際、ポリリシンはまた任意にトランスフェリン
と複合される。トランスフェリンがアデノウイルスと結
合した結果、トランスフェリン受容体を持つ細胞におい
て、この場合のウイルスは、エンドソームの機能に加え
て、組み合わされた複合体を取り込む因子としての機能
を有している。
合わされた複合体として（Zatloukal et al.,1992）、
これら複合体の能力を増加するために使用されることも
できる。この目的のために本発明のトランスフェリン修
飾ウイルスは、例えばビオチン−ストレプタビジンのブ
リッジによって、ポリリシン/DNA複合体と組み合わされ
る。その際、ポリリシンはまた任意にトランスフェリン
と複合される。トランスフェリンがアデノウイルスと結
合した結果、トランスフェリン受容体を持つ細胞におい
て、この場合のウイルスは、エンドソームの機能に加え
て、組み合わされた複合体を取り込む因子としての機能
を有している。
本発明のアデノウイルス複合体は、アデノウイルスが
遺伝子導入での増加をもたらすために使用される、いか
なる利用においても使用することができる（Curiel et
al.,1991;Curiel et al.,1992a;Zatloukal et al.,199
2;Cotten et al.,1992;Wagner et al.,1992;Curiel et
al.,1992b;Yoshimura et al.,1993）。
遺伝子導入での増加をもたらすために使用される、いか
なる利用においても使用することができる（Curiel et
al.,1991;Curiel et al.,1992a;Zatloukal et al.,199
2;Cotten et al.,1992;Wagner et al.,1992;Curiel et
al.,1992b;Yoshimura et al.,1993）。
本発明のある実施態様では、アデノウイルスは組み換
えアデノウイルス、即ち、組み換え法によりゲノム中に
組み込まれた外来配列を含むアデノウイルスである。第
一の興味深い配列は、例えば欠陥のある遺伝子を置き換
えたDNAのような、標的細胞における発現が所望の生物
学的効果をもたらすものである。この実施態様におい
て、本発明は、遺伝子療法のために組み換えアデノウイ
ルスの他への上手い使用が制限されている親和性を克服
し、より広く利用できる系をつくるのに有利である。
えアデノウイルス、即ち、組み換え法によりゲノム中に
組み込まれた外来配列を含むアデノウイルスである。第
一の興味深い配列は、例えば欠陥のある遺伝子を置き換
えたDNAのような、標的細胞における発現が所望の生物
学的効果をもたらすものである。この実施態様におい
て、本発明は、遺伝子療法のために組み換えアデノウイ
ルスの他への上手い使用が制限されている親和性を克服
し、より広く利用できる系をつくるのに有利である。
本発明のウイルス複合体のためには、アデノウイルス
の構成成分に関して何ら制限はない。表面上にトランス
フェリンと結合することができる基を有するいずれかの
アデノウイルスも適している。例えば、Berkner,1988;S
tratford−Perricaudet et al.,1990;Rosenfeld et a
l.,1991;Rosenfeld et al.,1992;Stratford−Perricaud
et et al.,1992で述べられているアデノウイルスであ
る。このウイルスは、ヒト細胞内にDNAを導入するため
に、特に遺伝子療法のための、ベクターとして提供され
たものであり、生体内又は生体外において標的細胞内に
DNAを選択的に導入するために修飾することもできる。
の構成成分に関して何ら制限はない。表面上にトランス
フェリンと結合することができる基を有するいずれかの
アデノウイルスも適している。例えば、Berkner,1988;S
tratford−Perricaudet et al.,1990;Rosenfeld et a
l.,1991;Rosenfeld et al.,1992;Stratford−Perricaud
et et al.,1992で述べられているアデノウイルスであ
る。このウイルスは、ヒト細胞内にDNAを導入するため
に、特に遺伝子療法のための、ベクターとして提供され
たものであり、生体内又は生体外において標的細胞内に
DNAを選択的に導入するために修飾することもできる。
ヒトにおける使用に関しては、特に、ヒトトランスフ
ェリンはトランスフェリンの構成成分として使用され
る。トランスフェリンは受容体依存性エンドサイトーシ
スにより極めて有効に細胞内に吸収される鉄輸送タンパ
クである。その結果、例えば、様々な複合体の形態で細
胞内に毒素、低分子物質又は遺伝子を輸送するような多
くの利用ために輸送ビヒクルとして既に使用されてい
る。
ェリンはトランスフェリンの構成成分として使用され
る。トランスフェリンは受容体依存性エンドサイトーシ
スにより極めて有効に細胞内に吸収される鉄輸送タンパ
クである。その結果、例えば、様々な複合体の形態で細
胞内に毒素、低分子物質又は遺伝子を輸送するような多
くの利用ために輸送ビヒクルとして既に使用されてい
る。
トランスフェリン受容体によってトランスフェリンの
受容体依存性エンドサイトーシスの間に起こる過程は、
中でも、トランスフェリン受容体が高い代謝回転で再循
環されるということにより、他のリガンド／受容体の対
合とは異なっている。
受容体依存性エンドサイトーシスの間に起こる過程は、
中でも、トランスフェリン受容体が高い代謝回転で再循
環されるということにより、他のリガンド／受容体の対
合とは異なっている。
外来DNAに関しては、本発明によって、いかなる種類
にも制限されない。そのDNAは、任意の遺伝子又は、例
えば、RNAを阻害するためにコードされている因子を含
むプラスミド構造であってもよい。遺伝子療法において
有効である配列は、当該技術分野において周知である。
一般に療法に有望であると考えられている配列の実施例
としては、中でも、Anderson,1992により公表された概
略に見出すことができる。
にも制限されない。そのDNAは、任意の遺伝子又は、例
えば、RNAを阻害するためにコードされている因子を含
むプラスミド構造であってもよい。遺伝子療法において
有効である配列は、当該技術分野において周知である。
一般に療法に有望であると考えられている配列の実施例
としては、中でも、Anderson,1992により公表された概
略に見出すことができる。
さらに、本発明は、アデノウイルス受容体を全く又は
殆ど持たない、又はアデノウイルス受容体が全体又は部
分的にブロックされているヒト細胞内に外来DNAを導入
する方法に関するものであり、その際に、該細胞が生体
外又は生体内において適した製剤中で本発明のウイルス
とともに処理される導入方法に関する。
殆ど持たない、又はアデノウイルス受容体が全体又は部
分的にブロックされているヒト細胞内に外来DNAを導入
する方法に関するものであり、その際に、該細胞が生体
外又は生体内において適した製剤中で本発明のウイルス
とともに処理される導入方法に関する。
特に、該細胞は、血液細胞である。
本発明の修飾されたウイルスを投与する製剤で必要と
されることは、個々の利用により定められる。即ち、当
該技術分野において技能を有するいずれの者も、製剤に
使用される多くのキャリアー及び添加剤を見出すため
に、関連する薬剤の使用説明（例えば、Remington's Ph
armaceutical Sciences,1980）を学習することができ
る。実質的に必要とされることは、本発明のウイルス−
トランスフェリン複合体の輸送機能に影響を与えず、又
は細胞内で発現されるタンパク質の生体内利用可能性
（bioavailability）を損なわない製剤である。
されることは、個々の利用により定められる。即ち、当
該技術分野において技能を有するいずれの者も、製剤に
使用される多くのキャリアー及び添加剤を見出すため
に、関連する薬剤の使用説明（例えば、Remington's Ph
armaceutical Sciences,1980）を学習することができ
る。実質的に必要とされることは、本発明のウイルス−
トランスフェリン複合体の輸送機能に影響を与えず、又
は細胞内で発現されるタンパク質の生体内利用可能性
（bioavailability）を損なわない製剤である。
ウイルスはペプチドを結合するそれ自身知られた方法
でトランスフェリンと結合することができるが、好まし
くはアデノウイルスは、トランスフェリンの炭水化物側
鎖を経てトランスフェリンと結合する。この結合の形式
は、DE−A1 41 150 38においてトランスフェリン−ポリ
リシン複合体が述べられており、これによりその開示内
容が明確に述べられている。
でトランスフェリンと結合することができるが、好まし
くはアデノウイルスは、トランスフェリンの炭水化物側
鎖を経てトランスフェリンと結合する。この結合の形式
は、DE−A1 41 150 38においてトランスフェリン−ポリ
リシン複合体が述べられており、これによりその開示内
容が明確に述べられている。
驚くべきことに、この結合形式は、他の方法では輸送
ビヒクルアデノウイルスを受入れられない又は十分には
受け入れられない細胞内に外来DNAを導入するための、
トランスフェリンによるアデノウイルスの修飾に非常に
適していることが見出されている。
ビヒクルアデノウイルスを受入れられない又は十分には
受け入れられない細胞内に外来DNAを導入するための、
トランスフェリンによるアデノウイルスの修飾に非常に
適していることが見出されている。
トランスフェリンの炭水化物側鎖に結合するためのウ
イルスの能力に必要なことは、ウイルス表面にアミノ基
が存在することである。この考えに拘束されるものでは
ないが、トランスフェリンの炭水化物側鎖がトランスフ
ェリンとウイルスとの間に自然のスペーサーを形成する
ことが有利であるのが適当である。このことは、一方で
は、トランスフェリンと結合及び取り込む能力を維持す
るのに適当であり、他方ではアデノウイルスのエンドソ
ームの能力を維持するのに適当であり、また、組み合わ
される複合物の成分としての本発明の複合体の使用にお
いて重要である。
イルスの能力に必要なことは、ウイルス表面にアミノ基
が存在することである。この考えに拘束されるものでは
ないが、トランスフェリンの炭水化物側鎖がトランスフ
ェリンとウイルスとの間に自然のスペーサーを形成する
ことが有利であるのが適当である。このことは、一方で
は、トランスフェリンと結合及び取り込む能力を維持す
るのに適当であり、他方ではアデノウイルスのエンドソ
ームの能力を維持するのに適当であり、また、組み合わ
される複合物の成分としての本発明の複合体の使用にお
いて重要である。
本発明の主題でもある、本発明のアデノウイルス−ト
ランスフェリン複合体の好ましい製造方法は、緩やかな
条件下においてトランスフェリンを、炭水化物の一部に
アルデヒド基を含む形態に酸化し、還元条件下でアデノ
ウイルスと酸化されたトランスフェリンを結合すること
である。
ランスフェリン複合体の好ましい製造方法は、緩やかな
条件下においてトランスフェリンを、炭水化物の一部に
アルデヒド基を含む形態に酸化し、還元条件下でアデノ
ウイルスと酸化されたトランスフェリンを結合すること
である。
好ましくは、過ヨウ素酸塩又は特に過ヨウ素酸ナトリ
ウムは、トランスフェリンの炭水化物鎖末端のシアル酸
をアルデヒドの形態に酸化する酸化段階の酸化剤として
使用される。
ウムは、トランスフェリンの炭水化物鎖末端のシアル酸
をアルデヒドの形態に酸化する酸化段階の酸化剤として
使用される。
アデノウイルスとトランスフェリンがアルデヒド形態
で結合する際の還元条件をつくるのに好適な物質は、緩
やかな条件下で選択的にシッフ塩基を還元する還元剤で
ある。本発明の方法においては、シアノホウ水素化ナト
リウム又は三級ブチルアミノボランが、還元剤として好
ましい。
で結合する際の還元条件をつくるのに好適な物質は、緩
やかな条件下で選択的にシッフ塩基を還元する還元剤で
ある。本発明の方法においては、シアノホウ水素化ナト
リウム又は三級ブチルアミノボランが、還元剤として好
ましい。
好ましくは該方法は、低温、好ましくは０℃から周囲
温度で実施される。
温度で実施される。
各反応段階の機構は、当該技術分野において技能を有
する平均的な者に良く知られている。それゆえ、その範
囲にある者は各必要とされる過程の各段階のための条件
に適合できる。ある実例においては、取り込みの性能と
エンドソームの特性との間の最適な均衡を得るために、
本発明の範囲内で実施される実験において、より少ない
トランスフェリン分子をウイルス粒子に供給することが
望まれることもある。種々の量のトランスフェリンが結
合した修飾されたアデノウイルス粒子は、試薬に対する
アデノウイルスの比を実験的に変えることにより得るこ
とができる。
する平均的な者に良く知られている。それゆえ、その範
囲にある者は各必要とされる過程の各段階のための条件
に適合できる。ある実例においては、取り込みの性能と
エンドソームの特性との間の最適な均衡を得るために、
本発明の範囲内で実施される実験において、より少ない
トランスフェリン分子をウイルス粒子に供給することが
望まれることもある。種々の量のトランスフェリンが結
合した修飾されたアデノウイルス粒子は、試薬に対する
アデノウイルスの比を実験的に変えることにより得るこ
とができる。
図面の概要
図1:細胞へのウイルス侵入の図解説明。A:非修飾アデ
ノウイルス。B:トランスフェリン修飾されたアデノウイ
ルス。
ノウイルス。B:トランスフェリン修飾されたアデノウイ
ルス。
図2:ニトロセルロース膜ブロット上のアデノウイルス
に結合したトランスフェリンの定量。
に結合したトランスフェリンの定量。
図3:組み換えアデノウイルスでの感染後、K562細胞に
おけるβ−ガラクトシダーゼの発現。A:非修飾アデノウ
イルス。B:トランスフェリン修飾アデノウイルス。C:対
照（非感染細胞）。
おけるβ−ガラクトシダーゼの発現。A:非修飾アデノウ
イルス。B:トランスフェリン修飾アデノウイルス。C:対
照（非感染細胞）。
図4:K562細胞への遺伝子導入の発光法による定量的比
較。
較。
本発明を、次の実施例により説明する。
実施例
ａ）アデノウイルスの調製
５×106個の293細胞（ATCC No.1573;Geaham et al.,1
977）を、10％のFCs及び１％のグルタミンを加え、抗生
物質（ペニシリン、ストレプトマイシン）を添加した60
mのDMEM培地の入った175cm2のフラスコ中で、37℃及
び５％のCO2の下、３日間、コンフレントの約80〜100％
である約２×107個になるまで培養した。次いで培地を
取り除き、細胞をアデノウイルスAd.RSVβgal（「RSVプ
ロモーター／エンハンサーの調節下で、E.coliのガラク
トシダーゼ遺伝子を運搬する,E1−,E3−非感染アデノウ
イルスタイプ５」,Stratford−Perricaudet et al.,199
2）（２％のFCSを含む5mの培地中に約２×109個の粒
子）で感染させた。37℃下で２日間インキュベートした
後、細胞を増加させ、底からほぼ完全に細胞を引き離し
た。次に細胞を、ソルバール（Sorvall）社のGSAロータ
ーにより3000rpmで10分間遠心分離し、細胞ペレットを5
0mのテストチューブ中にPBSとともに移し、ヒラウス
（Heraeus）社の遠心分離機により1000rpmで10分間遠心
分離した。ペレットを２から３倍の体積の10mMのHEPES/
1mMのEDTA（HE）中に取り出し、液体窒素中で瞬間冷凍
させて、−70℃下で保存した。細胞を破壊するために凍
結と融解の反復（液体窒素/37℃の水浴）を４回行い、1
0分間遠心分離（ヒラウス社、4000rpm）した。次にその
細胞溶解物を超遠心した（vTI−50 47,000rpm/l時間/20
℃;CsCl密度勾配:HE中に1.33g/cm3のCsClを含む溶液20m
、HE中に1.45g/cm3のCsClを含む溶液10mを載せ、細
胞溶解物10mで覆った）。乳白光を出すウイルスのバ
ンドを集め、２回目の超遠心を行った（vTI−50 63,000
rpm/4時間/20℃;CsCl平衡勾配:HE中に1.33g/cm3のCsCl
を含む溶液2.5m、2.56mのウイルスのバンドと混合
した）。各細胞培養フラスコとしては、40％（v/v）の
グリセロール中に−70℃下で保存された１−３×1011個
のウイルス粒子が得られた。ウイルス粒子の濃度は、1m
g/mのウイルスタンパク質＝1.34×1012個のウイルス
粒子（Lemay et al.,1980）という比率を用いて、ブラ
ッドフォード分析法（Bradford assay）（標準としてBS
A、Fraction V、BMB）によりタンパク質含有量から測定
した。
977）を、10％のFCs及び１％のグルタミンを加え、抗生
物質（ペニシリン、ストレプトマイシン）を添加した60
mのDMEM培地の入った175cm2のフラスコ中で、37℃及
び５％のCO2の下、３日間、コンフレントの約80〜100％
である約２×107個になるまで培養した。次いで培地を
取り除き、細胞をアデノウイルスAd.RSVβgal（「RSVプ
ロモーター／エンハンサーの調節下で、E.coliのガラク
トシダーゼ遺伝子を運搬する,E1−,E3−非感染アデノウ
イルスタイプ５」,Stratford−Perricaudet et al.,199
2）（２％のFCSを含む5mの培地中に約２×109個の粒
子）で感染させた。37℃下で２日間インキュベートした
後、細胞を増加させ、底からほぼ完全に細胞を引き離し
た。次に細胞を、ソルバール（Sorvall）社のGSAロータ
ーにより3000rpmで10分間遠心分離し、細胞ペレットを5
0mのテストチューブ中にPBSとともに移し、ヒラウス
（Heraeus）社の遠心分離機により1000rpmで10分間遠心
分離した。ペレットを２から３倍の体積の10mMのHEPES/
1mMのEDTA（HE）中に取り出し、液体窒素中で瞬間冷凍
させて、−70℃下で保存した。細胞を破壊するために凍
結と融解の反復（液体窒素/37℃の水浴）を４回行い、1
0分間遠心分離（ヒラウス社、4000rpm）した。次にその
細胞溶解物を超遠心した（vTI−50 47,000rpm/l時間/20
℃;CsCl密度勾配:HE中に1.33g/cm3のCsClを含む溶液20m
、HE中に1.45g/cm3のCsClを含む溶液10mを載せ、細
胞溶解物10mで覆った）。乳白光を出すウイルスのバ
ンドを集め、２回目の超遠心を行った（vTI−50 63,000
rpm/4時間/20℃;CsCl平衡勾配:HE中に1.33g/cm3のCsCl
を含む溶液2.5m、2.56mのウイルスのバンドと混合
した）。各細胞培養フラスコとしては、40％（v/v）の
グリセロール中に−70℃下で保存された１−３×1011個
のウイルス粒子が得られた。ウイルス粒子の濃度は、1m
g/mのウイルスタンパク質＝1.34×1012個のウイルス
粒子（Lemay et al.,1980）という比率を用いて、ブラ
ッドフォード分析法（Bradford assay）（標準としてBS
A、Fraction V、BMB）によりタンパク質含有量から測定
した。
ｂ）トランスフェリンによるアデノウイルスの修飾
1mの30mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5）中に105mg
（1.30μmol）のトランスフェリン（ヒト，シグマ（Sig
ma））を含む溶液を、同じ緩衝液を用いてSephadex G−
25 PD10カラム（ファルマシア（Pharmacia））により、
ゲル濾過した。80mg（1.0μmol）のトランスフェリン
（トランスフェリン含有量は280nmの紫外線測定及びニ
ンヒドリン分析により測定した）を含む得られた溶液2m
を、Speedvac（サーバント（Savant））で1mに濃縮
し、０℃に冷却して、1.1mg（５μmol）の過ヨウ素酸ナ
トリウムを含む30mMの酢酸ナトリウム緩衝液（pH5）50
μで処理した。混合液は、暗黒下で氷浴中に90分間放
置した。次に別のゲル濾過を行った（Sephadex G−25 P
D10カラム，ファルマシア,150mMのNaCl,10mMのHEPES,pH
7.3）。その結果、66mg（0.82μmol）の酸化トランスフ
ェリンを含む1mの溶液が得られた（Wanger et al.,19
91に述べられているように、トランスフェリンの酸化ア
ルデヒド含有形態の含有量は、アニスアルデヒド試薬に
よる着色により測定した）。修飾されたトランスフェリ
ン溶液（0.6m;0.5μmol）を、300μのHBS中に25μ
ｇ（タンパク質をもとにした値）のアデノウイルスを含
む溶液に素早く加えた。周囲温度で１時間後、1mg（15
μmol）のシアノホウ水素化ナトリウム溶液を加えた。
周囲温度で24時間後、過剰の遊離トランスフェリンを取
り除くために、トランスフェリン複合アデノウイルスを
精製した。その精製は、同体積のHBS（150m NaCl,20m
M HEPES,pH7.4）でウイルスを希釈し、CsClの階段勾配
で物質を遠心することにより行った。vTi−65チューブ
（ベックマン（Beckman））中に、1.33g/cm3のCsCl溶液
3m及び1.45g/cm3のCsCl溶液1m（両方とも、1mM EDT
A,20mM HEPES,pH7.4のCsCl溶液）とともに約1.5mの修
飾したウイルスを置いた。サンプルを、vTi−65ロータ
ー（ベックマン）により１時間、63,000rpmで遠心し
た。乳白光を示すウイルスのバンドを採取し、同体積の
HBSで希釈して、２回目の同一のCsCl勾配精製を行っ
た。代わりに、第１のウイルスのバンドを1.33g/cm3のC
sCl溶液、20mM HEPES,1mM EDTA,pH7.4により5.5mに調
節して、サンプルが平衡になるまで遠心した（４時間、
63,000rpm、vTi−65ローター）。精製された修飾ウイル
スを採取し、同体積の96％グリセロール（フルカ（Fluk
a））で希釈して、使用するまで−70℃で保存した。平
行したカップリングを鉄を含まないトランスフェリン、
1mM、pH7.5の鉄（III）クエン酸緩衝液１μと混合し
た精製ウイルスと行った。
（1.30μmol）のトランスフェリン（ヒト，シグマ（Sig
ma））を含む溶液を、同じ緩衝液を用いてSephadex G−
25 PD10カラム（ファルマシア（Pharmacia））により、
ゲル濾過した。80mg（1.0μmol）のトランスフェリン
（トランスフェリン含有量は280nmの紫外線測定及びニ
ンヒドリン分析により測定した）を含む得られた溶液2m
を、Speedvac（サーバント（Savant））で1mに濃縮
し、０℃に冷却して、1.1mg（５μmol）の過ヨウ素酸ナ
トリウムを含む30mMの酢酸ナトリウム緩衝液（pH5）50
μで処理した。混合液は、暗黒下で氷浴中に90分間放
置した。次に別のゲル濾過を行った（Sephadex G−25 P
D10カラム，ファルマシア,150mMのNaCl,10mMのHEPES,pH
7.3）。その結果、66mg（0.82μmol）の酸化トランスフ
ェリンを含む1mの溶液が得られた（Wanger et al.,19
91に述べられているように、トランスフェリンの酸化ア
ルデヒド含有形態の含有量は、アニスアルデヒド試薬に
よる着色により測定した）。修飾されたトランスフェリ
ン溶液（0.6m;0.5μmol）を、300μのHBS中に25μ
ｇ（タンパク質をもとにした値）のアデノウイルスを含
む溶液に素早く加えた。周囲温度で１時間後、1mg（15
μmol）のシアノホウ水素化ナトリウム溶液を加えた。
周囲温度で24時間後、過剰の遊離トランスフェリンを取
り除くために、トランスフェリン複合アデノウイルスを
精製した。その精製は、同体積のHBS（150m NaCl,20m
M HEPES,pH7.4）でウイルスを希釈し、CsClの階段勾配
で物質を遠心することにより行った。vTi−65チューブ
（ベックマン（Beckman））中に、1.33g/cm3のCsCl溶液
3m及び1.45g/cm3のCsCl溶液1m（両方とも、1mM EDT
A,20mM HEPES,pH7.4のCsCl溶液）とともに約1.5mの修
飾したウイルスを置いた。サンプルを、vTi−65ロータ
ー（ベックマン）により１時間、63,000rpmで遠心し
た。乳白光を示すウイルスのバンドを採取し、同体積の
HBSで希釈して、２回目の同一のCsCl勾配精製を行っ
た。代わりに、第１のウイルスのバンドを1.33g/cm3のC
sCl溶液、20mM HEPES,1mM EDTA,pH7.4により5.5mに調
節して、サンプルが平衡になるまで遠心した（４時間、
63,000rpm、vTi−65ローター）。精製された修飾ウイル
スを採取し、同体積の96％グリセロール（フルカ（Fluk
a））で希釈して、使用するまで−70℃で保存した。平
行したカップリングを鉄を含まないトランスフェリン、
1mM、pH7.5の鉄（III）クエン酸緩衝液１μと混合し
た精製ウイルスと行った。
ｃ）アデノウイルスに結合したトランスフェリンの定量
測定 トランスフェリン修飾アデノウイルス、非修飾アデノ
ウイルス及び標準トランスフェリン（それぞれHBS中に
あり、ウイルス粒子又はトランスフェリン分子の使用さ
れる数は図２に見ることができる）の希釈系列はニトロ
セルロース膜（Schleicher ＆ Schuell、口径0.1mm）に
結合した。ブロットは、一晩、４℃で、HBS（10m）中
の３％（W/V）の粉末スキムミルクとプレハイブリダイ
ズされた。各サンプルのヒトトランスフェリンと認めら
れるトランスフェリン含有量は、周囲温度で４時間、膜
をマウスの抗体にさらすことにより測定した（Chemicon
MAB 033−19/1、HBS/ミルクで1:2000に希釈、10m
）。次に（130mのHBS/ミルクで４回洗浄して２時間
後）、125Iでラベルした第２の抗体（sheep−anti−mou
se−Ig、Amersham、カタログNo.L52215、20mのHBS/ミ
ルク中に２μCi）に１時間さらした。膜のリン酸現像分
析（phosphoimager analysis）により、非修飾アデノウ
イルスにおいてはシグナルはないが、修飾アデノウイル
スのプローブ中にトランスフェリンの存在がみられた。
標準トランスフェリンとともに修飾されたウイルスで得
られたシグナルを比較することにより、ウイルス粒子と
結合したトランスフェリンの量を測定することができ
る。３×109個のウイルス粒子が、４×1012個のトラン
スフェリン分子のシグナルと比較し得るシグナルを与え
ることが見出された。これは、およそ1000個のトランス
フェリン分子が、１個のアデノウイルス粒子に結合して
いることを示している。２つのCsCl密度勾配によりアデ
ノウイルス粒子とトランスフェリン分子の結合は、ウイ
ルスのキャプシドタンパク質とトランスフェリン分子と
の間の共有結合であることを示している。これは、SDS
−PAGEを用いたウイルスのキャプシドタンパク質の分析
結果とも一致し、結合したトランスフェリンの大部分が
ヘキソンと結合していることを示している。
測定 トランスフェリン修飾アデノウイルス、非修飾アデノ
ウイルス及び標準トランスフェリン（それぞれHBS中に
あり、ウイルス粒子又はトランスフェリン分子の使用さ
れる数は図２に見ることができる）の希釈系列はニトロ
セルロース膜（Schleicher ＆ Schuell、口径0.1mm）に
結合した。ブロットは、一晩、４℃で、HBS（10m）中
の３％（W/V）の粉末スキムミルクとプレハイブリダイ
ズされた。各サンプルのヒトトランスフェリンと認めら
れるトランスフェリン含有量は、周囲温度で４時間、膜
をマウスの抗体にさらすことにより測定した（Chemicon
MAB 033−19/1、HBS/ミルクで1:2000に希釈、10m
）。次に（130mのHBS/ミルクで４回洗浄して２時間
後）、125Iでラベルした第２の抗体（sheep−anti−mou
se−Ig、Amersham、カタログNo.L52215、20mのHBS/ミ
ルク中に２μCi）に１時間さらした。膜のリン酸現像分
析（phosphoimager analysis）により、非修飾アデノウ
イルスにおいてはシグナルはないが、修飾アデノウイル
スのプローブ中にトランスフェリンの存在がみられた。
標準トランスフェリンとともに修飾されたウイルスで得
られたシグナルを比較することにより、ウイルス粒子と
結合したトランスフェリンの量を測定することができ
る。３×109個のウイルス粒子が、４×1012個のトラン
スフェリン分子のシグナルと比較し得るシグナルを与え
ることが見出された。これは、およそ1000個のトランス
フェリン分子が、１個のアデノウイルス粒子に結合して
いることを示している。２つのCsCl密度勾配によりアデ
ノウイルス粒子とトランスフェリン分子の結合は、ウイ
ルスのキャプシドタンパク質とトランスフェリン分子と
の間の共有結合であることを示している。これは、SDS
−PAGEを用いたウイルスのキャプシドタンパク質の分析
結果とも一致し、結合したトランスフェリンの大部分が
ヘキソンと結合していることを示している。
ｄ）外来DNAとしてβ−ガラクトシダーゼを含有するト
ランスフェリン修飾組み換えアデノウイルスによるK562
細胞への感染 K562細胞（ATCC No.CCL 243）は、10％のFCS、100UNI
T/mのペニシリン、100μg/mのストレプトマイシン
及び2mMのグルタミンを添加したRPMI 1640培地（ギブコ
（Gibco））中に懸濁して培養した。感染の20時間前、
トランスフェリン受容体の数を増加させるために、50μ
Ｍのデスフェリオキサミン（desferrioxamine）（Cotte
n et al.,1990）を含む新鮮培地中に細胞を移した。感
染は、同じ培地（50μＭのデスフェリオキサミンを添
加）中で250,000cell/mの密度で実行した。同量（300
0ウイルス粒子／細胞から300ウイルス粒子／細胞まで）
の非修飾アデノウイルス（Ad.RSVβgal）又は修飾アデ
ノウイルス（Tf−Ad.RSVβgal）のいずれかをK562細胞
に利用した。感染の48時間後、100〜200μの体積中の
約25,000個の細胞を、丸底の96穴プレートのウエル中に
移して、ベックマンGH3.7ローターにより800rpmで10分
間遠心した。上清を注意深く取り除き、0.5％のグルタ
ルジアルデヒドを含む100μのHBSで置き換えた。細胞
を、ピペッティングにより分散させ、次いで再び遠心を
行った。次いで定着剤を取り除き、細胞を洗浄した。次
に200μの染色溶液（10mMのリン酸緩衝液、pH7.0、15
0mMのNaCl、1mMのMgCl2、3.3mMのK4Fe（CN）63H2O、3.3
mMのK3Fe（CN）６及び0.2％の５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド）を、20分
から３時間、37℃でインキュベートした（Lim and Cha
e,1989）。細胞は、38℃で、５時間インキュベートし
た。次いで２回洗浄し、平底の96穴プレートのウェルに
移して、写真撮影をした。
ランスフェリン修飾組み換えアデノウイルスによるK562
細胞への感染 K562細胞（ATCC No.CCL 243）は、10％のFCS、100UNI
T/mのペニシリン、100μg/mのストレプトマイシン
及び2mMのグルタミンを添加したRPMI 1640培地（ギブコ
（Gibco））中に懸濁して培養した。感染の20時間前、
トランスフェリン受容体の数を増加させるために、50μ
Ｍのデスフェリオキサミン（desferrioxamine）（Cotte
n et al.,1990）を含む新鮮培地中に細胞を移した。感
染は、同じ培地（50μＭのデスフェリオキサミンを添
加）中で250,000cell/mの密度で実行した。同量（300
0ウイルス粒子／細胞から300ウイルス粒子／細胞まで）
の非修飾アデノウイルス（Ad.RSVβgal）又は修飾アデ
ノウイルス（Tf−Ad.RSVβgal）のいずれかをK562細胞
に利用した。感染の48時間後、100〜200μの体積中の
約25,000個の細胞を、丸底の96穴プレートのウエル中に
移して、ベックマンGH3.7ローターにより800rpmで10分
間遠心した。上清を注意深く取り除き、0.5％のグルタ
ルジアルデヒドを含む100μのHBSで置き換えた。細胞
を、ピペッティングにより分散させ、次いで再び遠心を
行った。次いで定着剤を取り除き、細胞を洗浄した。次
に200μの染色溶液（10mMのリン酸緩衝液、pH7.0、15
0mMのNaCl、1mMのMgCl2、3.3mMのK4Fe（CN）63H2O、3.3
mMのK3Fe（CN）６及び0.2％の５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド）を、20分
から３時間、37℃でインキュベートした（Lim and Cha
e,1989）。細胞は、38℃で、５時間インキュベートし
た。次いで２回洗浄し、平底の96穴プレートのウェルに
移して、写真撮影をした。
感染の結果を図３に示す。細胞に対するウイルスの比
率が最大のときに、非修飾ウイルスは約５％の効率で細
胞に形質導入できることが見出されている。しかしなが
ら、細胞に対するウイルスの比率が同じときに、トラン
スフェリン修飾ウイルスは細胞集団の90％以上に形質導
入しており、また細胞当たり生産されるβ−ガラクトシ
ダーゼの実際の量もより高い。非修飾及び修飾のいずれ
のアデノウイルスも、同じ効率レベルでHeLa細胞に侵入
できることが対照試験により明らかとなった。
率が最大のときに、非修飾ウイルスは約５％の効率で細
胞に形質導入できることが見出されている。しかしなが
ら、細胞に対するウイルスの比率が同じときに、トラン
スフェリン修飾ウイルスは細胞集団の90％以上に形質導
入しており、また細胞当たり生産されるβ−ガラクトシ
ダーゼの実際の量もより高い。非修飾及び修飾のいずれ
のアデノウイルスも、同じ効率レベルでHeLa細胞に侵入
できることが対照試験により明らかとなった。
さらに、β−ガラクトシダーゼ活性が、Jain and Mag
ratz,1991に述べられている方法を用いて、発光法（lum
inometry）により分析した。これを行うために、K562細
胞を、50μＭのデスフェリオキサミンを含むRPMI/10％F
CS培地中で18時間培養した。細胞を、感染前に素早く、
デスフェリオキサミンを含む新鮮培地中に入れた（250,
000cell/m、96穴プレートに１ウェル当たり50,000セ
ル）。対照及びトランスフェリン修飾アデノウイルスA
d.RSVβgalを含むサンプルの希釈は、RPMI/2％熱不活性
ウマ血清で準備し、図４に示した細胞当たりのウイルス
粒子数を含むウイルス（50μ）アリコートを細胞上に
置いた。37℃で４時間後に、細胞を新鮮培地（デスフェ
リオキサミンを含まない）で洗浄した。37℃で24時間後
に、50,000個の感染又は対照細胞を含むアリコートを、
発光法測定のために遠心分離により選択し、0.25M pH7.
5のトリス100μ中に置き、３回の凍結／融解の反復
（液体窒素/37℃）によって破壊した。細胞の破片は、
遠心（14,000×ｇ、エッペンドルフ（Eppendorf））す
ることにより取り除き、タンパク質含有量のために標準
化された上清のアリコートを化学発光性基質であるAMPG
D及びエメラルド発光増感剤（Emerald Luminescence In
tensifier）（Tropix）を用いて分析した。測定結果を
図４に示す。
ratz,1991に述べられている方法を用いて、発光法（lum
inometry）により分析した。これを行うために、K562細
胞を、50μＭのデスフェリオキサミンを含むRPMI/10％F
CS培地中で18時間培養した。細胞を、感染前に素早く、
デスフェリオキサミンを含む新鮮培地中に入れた（250,
000cell/m、96穴プレートに１ウェル当たり50,000セ
ル）。対照及びトランスフェリン修飾アデノウイルスA
d.RSVβgalを含むサンプルの希釈は、RPMI/2％熱不活性
ウマ血清で準備し、図４に示した細胞当たりのウイルス
粒子数を含むウイルス（50μ）アリコートを細胞上に
置いた。37℃で４時間後に、細胞を新鮮培地（デスフェ
リオキサミンを含まない）で洗浄した。37℃で24時間後
に、50,000個の感染又は対照細胞を含むアリコートを、
発光法測定のために遠心分離により選択し、0.25M pH7.
5のトリス100μ中に置き、３回の凍結／融解の反復
（液体窒素/37℃）によって破壊した。細胞の破片は、
遠心（14,000×ｇ、エッペンドルフ（Eppendorf））す
ることにより取り除き、タンパク質含有量のために標準
化された上清のアリコートを化学発光性基質であるAMPG
D及びエメラルド発光増感剤（Emerald Luminescence In
tensifier）（Tropix）を用いて分析した。測定結果を
図４に示す。
引用文献
Anderson,F.W.,1992,Science 256,808.
Berkner,K.L.,1988,BioTechniques 6,616−629.
Cotten,M.,Wagner,E.,Zatloukal,K.,Phillips,S.,Curie
l,D.T.及びBirnstiel,M.L.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 89,6094−6098. Cotten,M.,Laengle−Rouault,F.,Kirlappos.,H.,Wagne
r,E.,Mechtler,K.,Zenke,M.,Beug,H.,及びBirnstiel,M.
L.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,4033−4037. Curiel,D.T.,Agarwal,S.,Wagner,E.及びCoten,M.,1991,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,8850−8854. Curiel,D.T.,Agarwal,S.,Romer,M.U.,Wagner,E.,Cotte
n,M.,Birnstiel,M.L.及びBoucher,R.C.,1992a,Am.J.Res
pir.Cell及びMol.Biol.6,247−252. Curiel,D.T.,Wagner,E.,Cotten,M.,Birnstiel,M.L.,Aga
rwal,S.,Li,Ch.−M.,Loechel,S.及びHu,P.−H.,1992b,H
uman Gene Therapie 3,147−154. Goud,B.,Legrain,P.及びButtin,G.,1988,Virology 163,
251−254. Graham,F.,Smiley,J.,Russel,W.C.及びNairu,R.,1977,
J,Gen.Virol.36,59−72. Horvath,J.及びWeber,J.,1988,J.Virol.62,341−345. Jain,V.K.及びMagrath,I.T.,1992,Anal.Biochem.199,11
9−124. Kasid,A.,Morecki,S.,Aebersold,P.,Cornetta,K.,Culve
r,K.,Freeman,S.,Director,E.,Lotze,M.T.,Blaese,R.
M.,Anderson,W.F.及びRosenberg,S.A.,1990,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 87,473−477. Lemay,P.,Boudin,M.,Milleville,M.及びBoulanger,P.,1
980,Virology 101,131−143. Lim,K.及びChae,C.B.,1989,BioTechniques 7,576−579. Rosenfeld,M.A.,Siegfried,W.,Yoshimura,K.,Yoneyama,
K.,Fukayama,M.,Stier,L.E.,Paakko,P.K.,Gilardi,P.,S
tratford−Perricaudet,L.D.,Perricaudet,M.et al.,19
91,Science 252,431−434. Rosenfeld,M.A.,Yoshimura,K.,Trapnell,B.,Yoneyama,
K.,Rosenthal,E.,Dalemans,W.,Fukayama,M.,Bargon,J.,
Stier,L.,Stratford−Perricaudet,L.D.et al.,1992,Ce
ll 68,143−155. Roux,P.,Jeanteur,P.及びPiechaczyk,M.,1989,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 86,9079−9083 Stratford−Perricaudet,L.,Levrero,M.,Chasse,J.−
F.,Perricaudet,M.及びBriand,P.,1990,Hum.Gene Ther.
1,241−256. Stratford−Perricaudet,L.,Makeh,I.,Perricaudet,M.
及びBriand,P.,1992,J.Clin.Invest.90,626−630. Wagner,E.,Cotten,M.,Mechtler,K.,Kirlappos,H.及びBi
rnstiel,M.L.,1991,Bioconjugate Chemistry 2,226−23
1. Wagner,E.,Zatloukal,K.,Cotten,M.,Kirlappos,H.,Mech
tler,K.,Curiel,D.T.及びBirnstiel,M.L.,1992,Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 89,6099−6103. Wilson,J.M.,Danos,O.,Grossman,M.,Raulet,D.H.及びMu
lligan,R.C.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,439−44
3. Yoshimura,K.,Rosenfeld,M.A.,Seth,P.及びCyrstal,R.
G.,1993,J.Biol.Chem.288,2300−2303. Zatloukal,K.,Wagner,E.,Cotten,M.,Phillips,S,.Plan
k,C.,Steinlein,P.,Curiel,D.及びBirnstiel,M.L.,199
2,Ann.New York Acad.Sci.660,136−153. Remington's Pharmaceutical Sciences,1980,Mack Pub
l.Co.,Easton,PA,Osol（ed.）．
l,D.T.及びBirnstiel,M.L.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 89,6094−6098. Cotten,M.,Laengle−Rouault,F.,Kirlappos.,H.,Wagne
r,E.,Mechtler,K.,Zenke,M.,Beug,H.,及びBirnstiel,M.
L.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,4033−4037. Curiel,D.T.,Agarwal,S.,Wagner,E.及びCoten,M.,1991,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,8850−8854. Curiel,D.T.,Agarwal,S.,Romer,M.U.,Wagner,E.,Cotte
n,M.,Birnstiel,M.L.及びBoucher,R.C.,1992a,Am.J.Res
pir.Cell及びMol.Biol.6,247−252. Curiel,D.T.,Wagner,E.,Cotten,M.,Birnstiel,M.L.,Aga
rwal,S.,Li,Ch.−M.,Loechel,S.及びHu,P.−H.,1992b,H
uman Gene Therapie 3,147−154. Goud,B.,Legrain,P.及びButtin,G.,1988,Virology 163,
251−254. Graham,F.,Smiley,J.,Russel,W.C.及びNairu,R.,1977,
J,Gen.Virol.36,59−72. Horvath,J.及びWeber,J.,1988,J.Virol.62,341−345. Jain,V.K.及びMagrath,I.T.,1992,Anal.Biochem.199,11
9−124. Kasid,A.,Morecki,S.,Aebersold,P.,Cornetta,K.,Culve
r,K.,Freeman,S.,Director,E.,Lotze,M.T.,Blaese,R.
M.,Anderson,W.F.及びRosenberg,S.A.,1990,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 87,473−477. Lemay,P.,Boudin,M.,Milleville,M.及びBoulanger,P.,1
980,Virology 101,131−143. Lim,K.及びChae,C.B.,1989,BioTechniques 7,576−579. Rosenfeld,M.A.,Siegfried,W.,Yoshimura,K.,Yoneyama,
K.,Fukayama,M.,Stier,L.E.,Paakko,P.K.,Gilardi,P.,S
tratford−Perricaudet,L.D.,Perricaudet,M.et al.,19
91,Science 252,431−434. Rosenfeld,M.A.,Yoshimura,K.,Trapnell,B.,Yoneyama,
K.,Rosenthal,E.,Dalemans,W.,Fukayama,M.,Bargon,J.,
Stier,L.,Stratford−Perricaudet,L.D.et al.,1992,Ce
ll 68,143−155. Roux,P.,Jeanteur,P.及びPiechaczyk,M.,1989,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 86,9079−9083 Stratford−Perricaudet,L.,Levrero,M.,Chasse,J.−
F.,Perricaudet,M.及びBriand,P.,1990,Hum.Gene Ther.
1,241−256. Stratford−Perricaudet,L.,Makeh,I.,Perricaudet,M.
及びBriand,P.,1992,J.Clin.Invest.90,626−630. Wagner,E.,Cotten,M.,Mechtler,K.,Kirlappos,H.及びBi
rnstiel,M.L.,1991,Bioconjugate Chemistry 2,226−23
1. Wagner,E.,Zatloukal,K.,Cotten,M.,Kirlappos,H.,Mech
tler,K.,Curiel,D.T.及びBirnstiel,M.L.,1992,Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 89,6099−6103. Wilson,J.M.,Danos,O.,Grossman,M.,Raulet,D.H.及びMu
lligan,R.C.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,439−44
3. Yoshimura,K.,Rosenfeld,M.A.,Seth,P.及びCyrstal,R.
G.,1993,J.Biol.Chem.288,2300−2303. Zatloukal,K.,Wagner,E.,Cotten,M.,Phillips,S,.Plan
k,C.,Steinlein,P.,Curiel,D.及びBirnstiel,M.L.,199
2,Ann.New York Acad.Sci.660,136−153. Remington's Pharmaceutical Sciences,1980,Mack Pub
l.Co.,Easton,PA,Osol（ed.）．
フロントページの続き
(72)発明者 コッテン マシュー
オーストリア アー1130 ウィーン マ
キシングシュトラーセ 22―24―３―８
(72)発明者 ヴァーグナー エルンシュト
オーストリア アー2103 ランゲンツェ
ルスドルフ ヴィーナー シュトラーセ
201
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (12)
- 【請求項１】高等真核細胞内に外来DNAを導入するため
のウイルスであって、該ウイルス表面が、標的細胞に結
合するように該細胞の表面受容体のリガンドで修飾さ
れ、及び外来DNAが該細胞内で発現するように取り込ま
れるウイルスであり、該ウイルスがアデノウイルスであ
り、リガンドがトランスフェリンであり、ウイルス及び
トランスフェリンがトランスフェリンの炭水化物側鎖で
結合されていることを特徴とするウイルス。 - 【請求項２】ウイルスがタイプ２のアデノウイルスであ
ることを特徴とする、請求項１に記載の修飾されたウイ
ルス。 - 【請求項３】ウイルスがタイプ５のアデノウイルスであ
ることを特徴とする、請求項１に記載の修飾されたウイ
ルス。 - 【請求項４】ウイルスが、外来DNAとして遺伝子療法に
有効なDNA配列を含む組み換えアデノウイルスであるこ
とを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の
修飾されたウイルス。 - 【請求項５】トランスフェリンがヒトトランスフェリン
であることを特徴とする、請求項１〜４いずれか１項に
記載の修飾されたウイルス。 - 【請求項６】トランスフェリンを温和な条件下で炭水化
物基にアルデヒド基を含む形態に酸化し、及び酸化され
たトランスフェリンを還元条件下でアデノウイルスと結
合することを特徴とする、請求項１に記載のアデノウイ
ルス−トランスフェリン複合体の製造方法。 - 【請求項７】トランスフェリンが過ヨウ素酸塩に酸化さ
れることを特徴とする、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】結合が、トランスフェリンのために温和な
条件で選択的にシッフ塩基を還元する物質の存在下、還
元条件下で実施されることを特徴とする、請求項６又は
７に記載の方法。 - 【請求項９】結合が、シアノホウ水素化ナトリウムの存
在下で実施されることを特徴とする、請求項８に記載の
方法。 - 【請求項１０】アデノウイルス受容体を持たない又は僅
かしか持たない、又は全体又は一部がブロックされたア
デノウイルス受容体を持つヒト細胞内に、ヒトアデノウ
イルスによって外来DNAを導入する方法であって、請求
項４又は５に記載されたウイルスと細胞を接触させるこ
とを特徴とする方法。 - 【請求項１１】アデノウイルス受容体を持たない又は僅
かしか持たない、又は全体又は一部がブロックされたア
デノウイルス受容体を持つヒト細胞内に、ヒトアデノウ
イルスによって外来DNAを導入する方法であって、請求
項１、２、３又は５に記載され、ポリリシンがウイルス
及び任意にトランスフェリンとも結合し、外来DNAと結
合している複合体の構成成分としてのウイルスと、ヒト
細胞を接触させることを特徴とする方法。 - 【請求項１２】細胞が血液細胞であることを特徴とす
る、請求項10又は11に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4311651.5 | 1993-04-08 | ||
| DE4311651A DE4311651A1 (de) | 1993-04-08 | 1993-04-08 | Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen |
| PCT/EP1994/001065 WO1994024299A1 (de) | 1993-04-08 | 1994-04-06 | Adenovirus für den transport von fremd-dna in höhere eukariotische zellen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08508648A JPH08508648A (ja) | 1996-09-17 |
| JP3519407B2 true JP3519407B2 (ja) | 2004-04-12 |
Family
ID=6485102
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP52269794A Expired - Lifetime JP3519407B2 (ja) | 1993-04-08 | 1994-04-06 | 高等真核細胞へ外来ｄｎａを導入するためのアデノウイルス |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5693509A (ja) |
| EP (1) | EP0694071B1 (ja) |
| JP (1) | JP3519407B2 (ja) |
| AT (1) | ATE214102T1 (ja) |
| DE (2) | DE4311651A1 (ja) |
| DK (1) | DK0694071T3 (ja) |
| ES (1) | ES2171167T3 (ja) |
| PT (1) | PT694071E (ja) |
| WO (1) | WO1994024299A1 (ja) |
Families Citing this family (87)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ244306A (en) | 1991-09-30 | 1995-07-26 | Boehringer Ingelheim Int | Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation |
| JP3606870B2 (ja) * | 1993-04-14 | 2005-01-05 | コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼーション | 組換えトリアデノウイルスベクター |
| US6989434B1 (en) | 1994-02-11 | 2006-01-24 | Invitrogen Corporation | Reagents for intracellular delivery of macromolecules |
| DE4426429A1 (de) * | 1994-07-26 | 1996-02-01 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zum Einführen von DNA in höhere eukaryotische Zellen |
| US5525606A (en) * | 1994-08-01 | 1996-06-11 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Substituted 06-benzylguanines and 6(4)-benzyloxypyrimidines |
| US5846782A (en) * | 1995-11-28 | 1998-12-08 | Genvec, Inc. | Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs |
| US6465253B1 (en) | 1994-09-08 | 2002-10-15 | Genvec, Inc. | Vectors and methods for gene transfer to cells |
| US5559099A (en) * | 1994-09-08 | 1996-09-24 | Genvec, Inc. | Penton base protein and methods of using same |
| US5795587A (en) | 1995-01-23 | 1998-08-18 | University Of Pittsburgh | Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production |
| US6127525A (en) * | 1995-02-21 | 2000-10-03 | Cornell Research Foundation, Inc. | Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same |
| US5770442A (en) | 1995-02-21 | 1998-06-23 | Cornell Research Foundation, Inc. | Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same |
| US5756283A (en) * | 1995-06-05 | 1998-05-26 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method for improved production of recombinant adeno-associated viruses for gene therapy |
| US6281010B1 (en) | 1995-06-05 | 2001-08-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adenovirus gene therapy vehicle and cell line |
| US20030069173A1 (en) * | 1998-03-16 | 2003-04-10 | Life Technologies, Inc. | Peptide-enhanced transfections |
| SI0833934T2 (sl) | 1995-06-15 | 2013-04-30 | Crucell Holland B.V. | Pakirni sistemi za humani rekombinantni adenovirus za uporabo v genski terapiji |
| DE19615803A1 (de) | 1996-04-20 | 1997-10-23 | Boehringer Ingelheim Int | CELO-Virus |
| US6544523B1 (en) | 1996-11-13 | 2003-04-08 | Chiron Corporation | Mutant forms of Fas ligand and uses thereof |
| ATE476508T1 (de) | 1997-11-06 | 2010-08-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Neisseriale antigene |
| EP2210945B1 (en) | 1998-01-14 | 2013-06-26 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Neisseria meningitidis antigens |
| AU4070499A (en) | 1998-04-30 | 1999-11-16 | Cornell Research Foundation Inc. | Adenoviral vectors with tandem fiber proteins |
| NZ508366A (en) | 1998-05-01 | 2004-03-26 | Chiron Corp | Neisseria meningitidis antigens and compositions |
| WO1999060110A2 (en) | 1998-05-20 | 1999-11-25 | The University Of Tennessee Research Corporation | Stable envelope proteins for retroviral, viral and liposome vectors and use in gene and drug therapy |
| US20030017138A1 (en) | 1998-07-08 | 2003-01-23 | Menzo Havenga | Chimeric adenoviruses |
| AU767975B2 (en) | 1998-09-11 | 2003-11-27 | Genvec, Inc. | Alternatively targeted adenovirus |
| EP2298728A1 (en) | 1998-11-12 | 2011-03-23 | Life Technologies Corporation | Transfection reagents |
| US20050063950A1 (en) * | 1998-11-19 | 2005-03-24 | Georgetown University | Systemic viral/ligand gene delivery system and gene therapy |
| JP5448283B2 (ja) | 1998-11-19 | 2014-03-19 | ジョージタウン・ユニバーシティ | 全身性ウイルス／リガンド遺伝子送達システムおよび遺伝子治療 |
| US6929946B1 (en) | 1998-11-20 | 2005-08-16 | Crucell Holland B.V. | Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells |
| GB9908195D0 (en) | 1999-04-09 | 1999-06-02 | Microbiological Res Authority | Treatment of intracellular infection |
| US7368261B1 (en) | 1999-04-30 | 2008-05-06 | Novartis Vaccines And Diagnostics Srl | Conserved Neisserial antigens |
| US20050232900A1 (en) * | 1999-05-18 | 2005-10-20 | Crucell Holland B.V. | Serotype of adenovirus and uses thereof |
| US6913922B1 (en) * | 1999-05-18 | 2005-07-05 | Crucell Holland B.V. | Serotype of adenovirus and uses thereof |
| US6492169B1 (en) | 1999-05-18 | 2002-12-10 | Crucell Holland, B.V. | Complementing cell lines |
| GB9911683D0 (en) | 1999-05-19 | 1999-07-21 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
| GB9916529D0 (en) | 1999-07-14 | 1999-09-15 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
| MXPA02004283A (es) | 1999-10-29 | 2002-10-17 | Chiron Spa | Peptidos antigenicos neisseriales. |
| DK1248647T3 (da) | 2000-01-17 | 2010-09-27 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Ydre membranvesikel (OMV) vaccine omfattende N. meningitidis serogruppe B ydre membranproteiner |
| DE60131146T2 (de) * | 2000-02-25 | 2008-03-06 | Ludwig Institute For Cancer Research | Material und verfahren die hybridvaskularendothelwachstumfaktoren dns und proteine enthalten und screeningverfahren für modulatoren |
| JP2003534806A (ja) * | 2000-05-31 | 2003-11-25 | ジェンベク、インコーポレイティッド | アデノウイルスベクターのターゲティングの方法および組成物 |
| DE60138403D1 (de) | 2000-09-26 | 2009-05-28 | Crucell Holland Bv | Adenovirale vektoren für die übertragung von genen in zellen der skelettmuskulatur oder myoblasten |
| MXPA03003690A (es) | 2000-10-27 | 2004-05-05 | Chiron Spa | Acidos nucleicos y proteinas de los grupos a y b de estreptococos. |
| NZ525440A (en) * | 2000-10-27 | 2005-03-24 | Invitrogen Corp | Method for introducing antisense oligonucleotides into eucaryotic cells using cationic lipids |
| GB0107658D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Streptococcus pneumoniae |
| GB0107661D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Staphylococcus aureus |
| NZ562929A (en) | 2001-12-12 | 2009-07-31 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Immunisation against chlamydia trachomatis |
| WO2003078576A2 (en) * | 2002-03-12 | 2003-09-25 | Nitto Denko Corporation | Vector for transfection of eukaryotic cells |
| CA2477954C (en) | 2002-04-25 | 2012-07-10 | Crucell Holland B.V. | Means and methods for the production of adenovirus vectors |
| WO2004022716A2 (en) * | 2002-09-09 | 2004-03-18 | University Of Tennessee Research Foundation | Recombinatant mutants of rhabdovirus and methods of use thereof |
| GB0308198D0 (en) | 2003-04-09 | 2003-05-14 | Chiron Srl | ADP-ribosylating bacterial toxin |
| WO2004104032A2 (en) * | 2003-05-14 | 2004-12-02 | The University Of Iowa Research Foundation | Methods and compositions related to high-titer pseudotyped retroviruses |
| AU2004272114B2 (en) * | 2003-09-12 | 2010-11-04 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Animal model for protease activity and liver damage |
| US20050100890A1 (en) * | 2003-10-15 | 2005-05-12 | Davidson Beverly L. | Methods for producing and using in vivo pseudotyped retroviruses |
| US20070258993A1 (en) * | 2003-11-12 | 2007-11-08 | The Austin Research Institute | Dna-Carrier Conjugate |
| US7135339B2 (en) | 2003-11-20 | 2006-11-14 | University Of Iowa Research Foundation | Methods for producing and using in vivo pseudotyped retroviruses using envelope glycoproteins from lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) |
| US7422741B2 (en) | 2004-03-05 | 2008-09-09 | Vegenics Limited | VEGFR-3 fusion proteins |
| US7319015B2 (en) * | 2004-03-16 | 2008-01-15 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and compositions for using alveolar macrophage phospholipase A2 |
| US7582442B2 (en) * | 2004-03-16 | 2009-09-01 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and compositions for using aleveolar macrophage phospholipase A2 |
| US8268324B2 (en) | 2004-03-29 | 2012-09-18 | Galpharma Co., Ltd. | Modified galectin 9 proteins and use thereof |
| US20090233986A1 (en) * | 2004-07-27 | 2009-09-17 | Mount Sinai School Of Medicine | Methods and compositions for using sax2 |
| FI20050753A (fi) | 2004-09-03 | 2006-03-04 | Licentia Oy | Uudet peptidit |
| US7833513B2 (en) | 2004-12-03 | 2010-11-16 | Rhode Island Hospital | Treatment of Alzheimer's Disease |
| WO2006101629A2 (en) * | 2005-02-17 | 2006-09-28 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | SODIUM CHANNEL PROTEIN TYPE III α-SUBUNIT SPLICE VARIANT |
| WO2007022287A2 (en) | 2005-08-15 | 2007-02-22 | Vegenics Limited | Modified vegf and pdgf with improved angiogenic properties |
| US20080200408A1 (en) * | 2005-09-30 | 2008-08-21 | Mccormack Kenneth | Deletion mutants of tetrodotoxin-resistant sodium channel alpha subunit |
| US7972813B2 (en) * | 2005-09-30 | 2011-07-05 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Tetrodotoxin-resistant sodium channel alpha subunit |
| EP1947181A4 (en) * | 2005-11-24 | 2010-09-22 | Genomidea Inc | MUTANT PARAMYXOVIRUS AND METHOD FOR THE MANUFACTURE THEREOF |
| CA2633468C (en) | 2005-12-14 | 2014-02-18 | Licentia Ltd | Novel neurotrophic factor protein and uses thereof |
| US20090214496A1 (en) * | 2006-01-30 | 2009-08-27 | Licentia Ltd. | Bmx/etk tyrosine kinase gene therapy materials and methods |
| EP2009990B1 (en) * | 2006-04-07 | 2016-09-21 | The Board of Regents of The University of Texas System | Methods and compositions related to adenoassociated virus-phage particles |
| EP2548578B1 (en) | 2006-05-17 | 2014-08-20 | The Ludwig Institute for Cancer Research | Targeting VEGF-B regulation of fatty acid transporters to modulate human diseases |
| EP2054431B1 (en) | 2006-06-09 | 2011-08-31 | Novartis AG | Conformers of bacterial adhesins |
| JP2010502719A (ja) | 2006-09-08 | 2010-01-28 | ロード アイランド ホスピタル | アルコール誘発性脳疾患の治療、予防および回復 |
| JP5864077B2 (ja) | 2006-09-08 | 2016-02-17 | ロード アイランド ホスピタル | アルコール誘発性肝疾患の治療、予防および回復 |
| FI20070808A0 (fi) | 2007-10-25 | 2007-10-25 | Mart Saarma | GDNF:n silmukointivariantit ja niiden käytöt |
| US20090196854A1 (en) * | 2008-02-04 | 2009-08-06 | Kytos Biosystems S.A. | Methods and compositions for use of crl 5803 cells for expression of biotherapeutics and encapsulated cell-based delivery |
| US20100076061A1 (en) * | 2008-04-30 | 2010-03-25 | University Of Iowa Research Foundation | Repeated administration of lentiviral vectors to respiratory cells |
| FI20080326A0 (fi) | 2008-04-30 | 2008-04-30 | Licentia Oy | Neurotroofinen tekijä MANF ja sen käytöt |
| US8052970B2 (en) * | 2008-06-30 | 2011-11-08 | The Regents Of The University Of Michigan | Lysosomal phospholipase A2 (LPLA2) activity as a diagnostic and therapeutic target for identifying and treating systemic lupus erythematosis |
| ES2748577T3 (es) | 2011-05-19 | 2020-03-17 | Univ Michigan Regents | Agentes de fijación de la integrina alfa-2 y uso de los mismos para inhibir la proliferación de las células de cáncer |
| EP2785683B1 (en) | 2011-11-30 | 2020-02-05 | Ludwig Institute for Cancer Research Ltd. | Inkt cell modulators and methods of using the same |
| GB201120860D0 (en) | 2011-12-05 | 2012-01-18 | Cambridge Entpr Ltd | Cancer immunotherapy |
| WO2013184209A1 (en) | 2012-06-04 | 2013-12-12 | Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. | Mif for use in methods of treating subjects with a neurodegenerative disorder |
| PT2892617T (pt) | 2012-09-06 | 2018-10-18 | Univ Chicago | Polinucleótidos antisenso para induzir o salto de exão e métodos de tratamentos de distrofias |
| CA2901226C (en) | 2013-02-18 | 2020-11-17 | Vegenics Pty Limited | Vascular endothelial growth factor binding proteins |
| WO2014191630A2 (en) | 2013-05-28 | 2014-12-04 | Helsingin Yliopisto | Non-human animal model encoding a non-functional manf gene |
| US10195280B2 (en) | 2014-07-15 | 2019-02-05 | Life Technologies Corporation | Compositions and methods for efficient delivery of molecules to cells |
| ES2846902T3 (es) | 2015-04-08 | 2021-07-30 | Univ Chicago | Composiciones y procedimientos para corregir la distrofia muscular de cinturas tipo 2C mediante omisión de exones |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5192553A (en) * | 1987-11-12 | 1993-03-09 | Biocyte Corporation | Isolation and preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood and methods of therapeutic use |
| US5354844A (en) * | 1989-03-16 | 1994-10-11 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Protein-polycation conjugates |
| AU660629B2 (en) * | 1990-10-01 | 1995-07-06 | University Of Connecticut, The | Targeting viruses and cells for selective internalization by cells |
| NZ244306A (en) * | 1991-09-30 | 1995-07-26 | Boehringer Ingelheim Int | Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation |
| SE503225C2 (sv) * | 1991-10-30 | 1996-04-22 | Leif Lindholm Konsult Ab | Virus-antikroppskomplex för införing av virus i mammalieceller |
| WO1994006923A1 (en) * | 1992-09-24 | 1994-03-31 | The University Of Connecticut | Modification of a virus to redirect infectivity and enhance targeted delivery of polynucleotides to cells |
| GB9223084D0 (en) * | 1992-11-04 | 1992-12-16 | Imp Cancer Res Tech | Compounds to target cells |
-
1993
- 1993-04-08 DE DE4311651A patent/DE4311651A1/de not_active Withdrawn
-
1994
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