JP3516950B2 - 組換えｐｃｒ法を用いるキメラ抗体の調製 - Google Patents
組換えｐｃｒ法を用いるキメラ抗体の調製Info
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- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
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Description
【発明の詳細な説明】
この発明はキメラ抗体の調製に関する。この発明は、
典型的には、ヒト化抗体（humanised antibodies）の産
生に適用可能である。
典型的には、ヒト化抗体（humanised antibodies）の産
生に適用可能である。
抗体は、典型的には、ジスルフィド結合によって互い
に連結する２つのＨ鎖および２つのＬ鎖を含む。各Ｌ鎖
はジスルフィド結合によって各々のＨ鎖に連結してい
る。各Ｈ鎖は、その一端に、可変部ドメイン、それに続
く多数の定常部ドメインを有する。各Ｌ鎖は、その一端
に可変部ドメイン、および他端に定常部ドメインを有し
ている。このＬ鎖可変部ドメインは、Ｈ鎖の定常部ドメ
インに並列している。Ｌ鎖定常部ドメインは、Ｈ鎖の第
１定常部ドメインに並列している。Ｌ鎖およびＨ鎖の定
常部ドメインは、抗体の抗原への結合には直接は影響し
ない。
に連結する２つのＨ鎖および２つのＬ鎖を含む。各Ｌ鎖
はジスルフィド結合によって各々のＨ鎖に連結してい
る。各Ｈ鎖は、その一端に、可変部ドメイン、それに続
く多数の定常部ドメインを有する。各Ｌ鎖は、その一端
に可変部ドメイン、および他端に定常部ドメインを有し
ている。このＬ鎖可変部ドメインは、Ｈ鎖の定常部ドメ
インに並列している。Ｌ鎖定常部ドメインは、Ｈ鎖の第
１定常部ドメインに並列している。Ｌ鎖およびＨ鎖の定
常部ドメインは、抗体の抗原への結合には直接は影響し
ない。
Ｌ鎖およびＨ鎖の各対の可変部ドメインは、抗原結合
部位を形成する。Ｌ鎖およびＨ鎖のこれらドメインは同
じ一般構造を有し、各ドメインは、その配列が比較的保
全され、３つの相補性決定領域（CDRs）によって結合さ
れた、４つの領域からなるフレームワークを含む。４つ
のフレームワーク領域は主としてβ−シート構造をと
り、CDRsはこのβ−シート構造に結合し、時にはその一
部を形成するループを形成する。CDRsはフレームワーク
領域により非常に接近して保持され、他方のドメインか
らのCDRsと一緒に、抗原結合部位の形成に寄与する。抗
体のCDRsおよびフレームワーク領域は、Kabatら（“Seq
uences of proteins of immunological interest"US De
pt.of Health and Human Services,US Government Prin
ting Office,1987）を参照することにより決定すること
ができる。
部位を形成する。Ｌ鎖およびＨ鎖のこれらドメインは同
じ一般構造を有し、各ドメインは、その配列が比較的保
全され、３つの相補性決定領域（CDRs）によって結合さ
れた、４つの領域からなるフレームワークを含む。４つ
のフレームワーク領域は主としてβ−シート構造をと
り、CDRsはこのβ−シート構造に結合し、時にはその一
部を形成するループを形成する。CDRsはフレームワーク
領域により非常に接近して保持され、他方のドメインか
らのCDRsと一緒に、抗原結合部位の形成に寄与する。抗
体のCDRsおよびフレームワーク領域は、Kabatら（“Seq
uences of proteins of immunological interest"US De
pt.of Health and Human Services,US Government Prin
ting Office,1987）を参照することにより決定すること
ができる。
CDRsが可変部ドメインフレームワーク領域とは異なる
種に由来する可変抗体（altered antibody）の調製がEP
−Ａ−0239400に開示されている。CDRsはラットもしく
はマウスのモノクローナル抗体であってもよい。改変抗
体の可変部ドメイン、および定常部ドメイン、のフレー
ムワークは、ヒト抗体由来であってもよい。そのような
ヒト化抗体は、ヒトに投与された場合に、ラットもしく
はマウス抗体に対するヒトの免疫応答と比較して、無視
し得る免疫応答しか誘発しない。ヒト化CAMPATH−１抗
体がEP−Ａ−0328404に開示されている。
種に由来する可変抗体（altered antibody）の調製がEP
−Ａ−0239400に開示されている。CDRsはラットもしく
はマウスのモノクローナル抗体であってもよい。改変抗
体の可変部ドメイン、および定常部ドメイン、のフレー
ムワークは、ヒト抗体由来であってもよい。そのような
ヒト化抗体は、ヒトに投与された場合に、ラットもしく
はマウス抗体に対するヒトの免疫応答と比較して、無視
し得る免疫応答しか誘発しない。ヒト化CAMPATH−１抗
体がEP−Ａ−0328404に開示されている。
「オーバーラップ伸長（overlap extension）」の技
法には、テンプレート・ヌクレオチドは配列に相補的な
オリゴヌクレオチドプライマーの使用および重複末端を
有するDNA断片を生成するポリメラーゼ・チェイン・リ
アクション（PCR）が含まれる。これらの断片は、各鎖
の３′重複を相補鎖の３′伸長のプライマーとして機能
させることを可能にする重複末端アニールである「融
合」反応において結合される。Hoら（Gene、77、51−5
9、（1989））は、重複オリゴプライマーへのヌクレオ
チド変更の組み込みによるヌクレオチド配列への特定の
改変の導入にこの技法を用いることを記述している。部
位指向（site−directed）変異生成であるこの技法を使
用して、マウス主要組織適合遺伝子複合体クラス−Ｉ遺
伝子のそれらの変異を生成させ、クローニングし、分析
する。
法には、テンプレート・ヌクレオチドは配列に相補的な
オリゴヌクレオチドプライマーの使用および重複末端を
有するDNA断片を生成するポリメラーゼ・チェイン・リ
アクション（PCR）が含まれる。これらの断片は、各鎖
の３′重複を相補鎖の３′伸長のプライマーとして機能
させることを可能にする重複末端アニールである「融
合」反応において結合される。Hoら（Gene、77、51−5
9、（1989））は、重複オリゴプライマーへのヌクレオ
チド変更の組み込みによるヌクレオチド配列への特定の
改変の導入にこの技法を用いることを記述している。部
位指向（site−directed）変異生成であるこの技法を使
用して、マウス主要組織適合遺伝子複合体クラス−Ｉ遺
伝子のそれらの変異を生成させ、クローニングし、分析
する。
Hortonら（Gene、77、61−68（1989））は、重複伸張
による遺伝子スプライシング（SOE）の技法を記述して
いる。この技法は、プライマーＡ、Ｂ、ＣおよびＤを用
いるPCRによって生成される２つのDNA片、ABおよびCD、
を結合させることによる、ハイブリッド長さのDNA、A
D、の生成を可能にする。プライマーＢおよびＣの少な
くとも一部は、互いに相補的である。PCRによって生成
した断片ABおよびCDは、ポジ鎖（positive strand）で
あるABがネガ鎖（negative strand）であるCDのアニー
ルを可能ならしめるよう混合される。BC間の重複は２本
の鎖が互いの伸長を開始させることを可能にする。プラ
イマーＡおよびＤは、伸長した鎖のPCR反応の開始に用
いられる。
による遺伝子スプライシング（SOE）の技法を記述して
いる。この技法は、プライマーＡ、Ｂ、ＣおよびＤを用
いるPCRによって生成される２つのDNA片、ABおよびCD、
を結合させることによる、ハイブリッド長さのDNA、A
D、の生成を可能にする。プライマーＢおよびＣの少な
くとも一部は、互いに相補的である。PCRによって生成
した断片ABおよびCDは、ポジ鎖（positive strand）で
あるABがネガ鎖（negative strand）であるCDのアニー
ルを可能ならしめるよう混合される。BC間の重複は２本
の鎖が互いの伸長を開始させることを可能にする。プラ
イマーＡおよびＤは、伸長した鎖のPCR反応の開始に用
いられる。
マウスＨ−2Kbの一部（CD）の、Ｈ−2Ld遺伝子の対応
する上流および下流部分である上流および下流領域（そ
れぞれABおよびEF）間への結合に、上記技法が用いられ
た。これら全ての断片、AB、CDおよびEFは、プライマー
ＡないしＦを用いるPCRにより生成された。３種の断片
は、最初に断片AD（すなわち、AB−CD）、次いで生成物
AF（すなわち、AB−CD−EF）を生成するSOEを２回行な
うことにより、結合させた。
する上流および下流部分である上流および下流領域（そ
れぞれABおよびEF）間への結合に、上記技法が用いられ
た。これら全ての断片、AB、CDおよびEFは、プライマー
ＡないしＦを用いるPCRにより生成された。３種の断片
は、最初に断片AD（すなわち、AB−CD）、次いで生成物
AF（すなわち、AB−CD−EF）を生成するSOEを２回行な
うことにより、結合させた。
この発明によると、第１抗体のCDRが第２抗体のフレ
ームワーク領域間に結合されるキメラ抗体の製造方法が
創案されている。
ームワーク領域間に結合されるキメラ抗体の製造方法が
創案されている。
一般に、この発明の技法は、２種のフレームワーク領
域、ABおよびCD、およびそれらの間にドナーCDRによっ
て置き換えられるCDRを含むテンプレートを用いて行な
われる。プライマーＡおよびＢはフレームワーク領域AB
の増幅に用いられ、プライマーＣおよびＤはフレームワ
ーク領域CDの増幅に用いられる。しかしながら、プライ
マーＢおよびＣもまたそれらの５′末端に、ドナーCDR
配列の全てもしくは少なくとも一部に対応するさらなる
配列を有している。プライマーＢおよびＣは、ポリメラ
ーゼ・チェイン・リアクション（PCR）を実施し、それ
により全てのドナーCDR配列を組み込むことを可能にす
る条件下において、互いにそれらの５′末端のアニーリ
ングを可能にするに十分な長さで重複する。増幅された
領域ABおよびCDは、単一反応においてSOEを行ない、キ
メラ生成物を生成させることもできる。
域、ABおよびCD、およびそれらの間にドナーCDRによっ
て置き換えられるCDRを含むテンプレートを用いて行な
われる。プライマーＡおよびＢはフレームワーク領域AB
の増幅に用いられ、プライマーＣおよびＤはフレームワ
ーク領域CDの増幅に用いられる。しかしながら、プライ
マーＢおよびＣもまたそれらの５′末端に、ドナーCDR
配列の全てもしくは少なくとも一部に対応するさらなる
配列を有している。プライマーＢおよびＣは、ポリメラ
ーゼ・チェイン・リアクション（PCR）を実施し、それ
により全てのドナーCDR配列を組み込むことを可能にす
る条件下において、互いにそれらの５′末端のアニーリ
ングを可能にするに十分な長さで重複する。増幅された
領域ABおよびCDは、単一反応においてSOEを行ない、キ
メラ生成物を生成させることもできる。
この発明の１つの面によると、抗体鎖もしくはそれら
の断片をコードし、この抗体鎖の可変部領域の相補性決
定領域（CDRs）の少なくとも１つが第１の哺乳動物抗体
に由来し、かつ可変領域のフレームワークが第２の異な
る哺乳動物抗体に由来するものである、下記式で表わさ
れる二本鎖もしくは一本鎖DNAの製造方法であって、 ５′F1−Ｍ−F2 ３′ ここで、Ｍは第１の抗体のCDRをコードするDNAを含み、
かつF1およびF2はＭの側方に位置する配列をコードし、 （ｉ） 下記式で表わされる一本鎖もしくは二本鎖DNA
テンプレートを調製し、 ５′f1−Ｈ−f2 ３′ ここで、ＨはＭとは異なる特異性のCDRをコードするDNA
を含み、かつf1およびf2は各々F1およびF2に実質的に相
同であり、 （ii） DNAオリゴヌクレオチドプライマーＡ、Ｂ、Ｃ
およびＤを得、ここで、 Ａは、F1の５′末端に対応する５′末端を有し、かつ配
列F1の対応長さに等しい配列a1を含み、 Ｈに向かって５′から３′の方向に指向し； Ｂは、配列 ５′b1−b2 ３′ からなり、ここで、 b1はＭの対応長さに相補的であり、かつＭの５′末端
に相補的な３′末端を有する配列を含み、 b2はF1における対応長さの配列に相補的であり、かつ
F1の３′末端に相補的なヌクレオチドから始まる５′末
端を有し； Ｃは、配列 ５′c1−c2 ３′ からなり、ここで、 c1は、Ｍの対応長さに等しく、かつＭの３′末端に対
応する３′末端を有する配列を含み、 c2は、F2における対応長さの配列に等しく、かつF2の
５′末端に対応するヌクレオチドから始まる５′末端を
有し； Ｄは、F2の３′末端に相補的な５′末端を有し、かつF2
の対応長さに相補的である配列d1を含み、および Ｈに向かって５′から３′の方向に指向し； 並びに、b1およびc1は、PCRを実施可能な条件下におい
て、それらの５′末端を互いにアニールし得るに十分な
長さで重複しており、 （iii）所望の順番で、プライマー対Ａ、ＢおよびＣ、
Ｄを用いて、上記（ｉ）において調製されるテンプレー
トに対するPCR反応を行ない、および （iv） 上記（iii）において得られる生成物を混合
し、プライマーＡおよびＤを用いてPCR反応を行なう、 ことを包含する方法が提供される。
の断片をコードし、この抗体鎖の可変部領域の相補性決
定領域（CDRs）の少なくとも１つが第１の哺乳動物抗体
に由来し、かつ可変領域のフレームワークが第２の異な
る哺乳動物抗体に由来するものである、下記式で表わさ
れる二本鎖もしくは一本鎖DNAの製造方法であって、 ５′F1−Ｍ−F2 ３′ ここで、Ｍは第１の抗体のCDRをコードするDNAを含み、
かつF1およびF2はＭの側方に位置する配列をコードし、 （ｉ） 下記式で表わされる一本鎖もしくは二本鎖DNA
テンプレートを調製し、 ５′f1−Ｈ−f2 ３′ ここで、ＨはＭとは異なる特異性のCDRをコードするDNA
を含み、かつf1およびf2は各々F1およびF2に実質的に相
同であり、 （ii） DNAオリゴヌクレオチドプライマーＡ、Ｂ、Ｃ
およびＤを得、ここで、 Ａは、F1の５′末端に対応する５′末端を有し、かつ配
列F1の対応長さに等しい配列a1を含み、 Ｈに向かって５′から３′の方向に指向し； Ｂは、配列 ５′b1−b2 ３′ からなり、ここで、 b1はＭの対応長さに相補的であり、かつＭの５′末端
に相補的な３′末端を有する配列を含み、 b2はF1における対応長さの配列に相補的であり、かつ
F1の３′末端に相補的なヌクレオチドから始まる５′末
端を有し； Ｃは、配列 ５′c1−c2 ３′ からなり、ここで、 c1は、Ｍの対応長さに等しく、かつＭの３′末端に対
応する３′末端を有する配列を含み、 c2は、F2における対応長さの配列に等しく、かつF2の
５′末端に対応するヌクレオチドから始まる５′末端を
有し； Ｄは、F2の３′末端に相補的な５′末端を有し、かつF2
の対応長さに相補的である配列d1を含み、および Ｈに向かって５′から３′の方向に指向し； 並びに、b1およびc1は、PCRを実施可能な条件下におい
て、それらの５′末端を互いにアニールし得るに十分な
長さで重複しており、 （iii）所望の順番で、プライマー対Ａ、ＢおよびＣ、
Ｄを用いて、上記（ｉ）において調製されるテンプレー
トに対するPCR反応を行ない、および （iv） 上記（iii）において得られる生成物を混合
し、プライマーＡおよびＤを用いてPCR反応を行なう、 ことを包含する方法が提供される。
オリゴヌクレオチドは都合のよい大きさであればよ
い。
い。
好ましくは、F1およびF2は、各々少なくとも１種のヒ
ト抗体フレームワーク領域をコードし、さらに、任意
に、CDRsをコードする。好ましくは、Ｈは前記第１抗体
のCDRをコードする。好ましくは、Ｍは、非ヒトCDR領域
をコードし、最も好ましくは、ネズミ科動物もしくは齧
歯類動物CDRをコードする。
ト抗体フレームワーク領域をコードし、さらに、任意
に、CDRsをコードする。好ましくは、Ｈは前記第１抗体
のCDRをコードする。好ましくは、Ｍは、非ヒトCDR領域
をコードし、最も好ましくは、ネズミ科動物もしくは齧
歯類動物CDRをコードする。
プライマーＡおよびＤは、通常少なくとも12、例えば
少なくとも15ヌクレオチド、より一般的には20ないし30
ヌクレオチドの長さである。所望であれば、プライマー
ＡおよびＤは、それらの５′末端ヌクレオチド内に少な
くとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むこ
とができる。プライマーＢおよびＣは、通常少なくとも
20、例えば少なくとも30ヌクレオチドの長さである。よ
り一般的には、これらのプライマーは40をこえ、例えば
45ないし60ヌクレオチドの長さである。一般に、200ヌ
クレオチド長さまでのオリゴヌクレオチドを合成するこ
とが可能である。したがって、一般にプライマーＡ、
Ｂ、ＣおよびＤは、各々15ないし200ヌクレオチド長さ
である。
少なくとも15ヌクレオチド、より一般的には20ないし30
ヌクレオチドの長さである。所望であれば、プライマー
ＡおよびＤは、それらの５′末端ヌクレオチド内に少な
くとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むこ
とができる。プライマーＢおよびＣは、通常少なくとも
20、例えば少なくとも30ヌクレオチドの長さである。よ
り一般的には、これらのプライマーは40をこえ、例えば
45ないし60ヌクレオチドの長さである。一般に、200ヌ
クレオチド長さまでのオリゴヌクレオチドを合成するこ
とが可能である。したがって、一般にプライマーＡ、
Ｂ、ＣおよびＤは、各々15ないし200ヌクレオチド長さ
である。
b1およびc1の間の重複の長さは、ＢおよびＣの全長並
びに重複領域の特定の塩基組成を含む多数の因子に依存
し得る。しかしながら、重複は通常少なくとも12、例え
ば少なくとも15ヌクレオチドである。実施態様の１つに
よると、プライマーＢおよびＣ内の配列b1およびc1は、
同じ数のヌクレオチド長さである。この発明の好ましい
態様によると、b1およびc1は両者ともにＭの長さであ
り、そのため、重複もまたこの長さである。
びに重複領域の特定の塩基組成を含む多数の因子に依存
し得る。しかしながら、重複は通常少なくとも12、例え
ば少なくとも15ヌクレオチドである。実施態様の１つに
よると、プライマーＢおよびＣ内の配列b1およびc1は、
同じ数のヌクレオチド長さである。この発明の好ましい
態様によると、b1およびc1は両者ともにＭの長さであ
り、そのため、重複もまたこの長さである。
通常、プライマーＡの３′末端とＨの５′末端との距
離は少なくとも15ヌクレオチドである。より一般的に
は、この距離は、f1の長さからＡそれ自身の長さを減じ
たものである。同様に、Ｄの３′末端と領域Ｈとの距離
も少なくとも15ヌクレオチドであり、より一般的には、
f2の長さからＤそれ自身の長さを減じたものである。実
施態様の１つによると、プライマーＡ、Ｂ、ＣおよびＤ
の各々の配列a1、b2、c2およびd1は、それぞれ15ないし
30ヌクレオチドの長さである。
離は少なくとも15ヌクレオチドである。より一般的に
は、この距離は、f1の長さからＡそれ自身の長さを減じ
たものである。同様に、Ｄの３′末端と領域Ｈとの距離
も少なくとも15ヌクレオチドであり、より一般的には、
f2の長さからＤそれ自身の長さを減じたものである。実
施態様の１つによると、プライマーＡ、Ｂ、ＣおよびＤ
の各々の配列a1、b2、c2およびd1は、それぞれ15ないし
30ヌクレオチドの長さである。
Ｍ、並びにF1およびF2の５′および３′領域の全配列
が、プライマーＡ、Ｂ、ＣおよびＤの配列によって決定
されることは認識されるであろう。
が、プライマーＡ、Ｂ、ＣおよびＤの配列によって決定
されることは認識されるであろう。
したがって、この状況において、これらのプライマー
と配列F1、ＭまたはF2のどの一部とでもあっても、その
間の「相同性」に言及することは適当ではないと考えら
れる。その代わり、ここで用いられるように、「対応長
さ（corresponding length）」という用語が、ヌクレオ
チド数が等しく、かつ同一の（または相補的な）配列を
有する配列を意味する。
と配列F1、ＭまたはF2のどの一部とでもあっても、その
間の「相同性」に言及することは適当ではないと考えら
れる。その代わり、ここで用いられるように、「対応長
さ（corresponding length）」という用語が、ヌクレオ
チド数が等しく、かつ同一の（または相補的な）配列を
有する配列を意味する。
上記（ｉ）に関して、配列f1およびf2はF1およびF2の
各々に実質的に相同であり、ここでは、プライマーＡな
いしＤは、これらのプライマー配列の領域内でのf1およ
びf2への小変更の導入に用いることができる。
各々に実質的に相同であり、ここでは、プライマーＡな
いしＤは、これらのプライマー配列の領域内でのf1およ
びf2への小変更の導入に用いることができる。
領域F1およびF2は、CDR Ｍのいずれかの側方のフレ
ームワーク領域の少なくとも一部をコードするDNAを含
む。F1およびF2はこれらの配列の側方に位置する領域、
例えば、さらなるCDRsをコードするDNAの内部もしくは
それをこえた領域をコードしてもよい。
ームワーク領域の少なくとも一部をコードするDNAを含
む。F1およびF2はこれらの配列の側方に位置する領域、
例えば、さらなるCDRsをコードするDNAの内部もしくは
それをこえた領域をコードしてもよい。
他の面によると、この発明は、下記配列からなる、長
さが30ないし110ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを
提供する。
さが30ないし110ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを
提供する。
５′o1−o2 ３′
（ここで、o1は非ヒト起源のCDR領域の少なくとも15ヌ
クレオチドの配列を含み、かつo2はヒト起源のフレーム
ワーク領域の少なくとも15ヌクレオチドを含む） このオリゴヌクレオチドは、上述の方法におけるプライ
マーとしての使用に適している。
クレオチドの配列を含み、かつo2はヒト起源のフレーム
ワーク領域の少なくとも15ヌクレオチドを含む） このオリゴヌクレオチドは、上述の方法におけるプライ
マーとしての使用に適している。
さらなる面によると、この発明は、抗体鎖もしくはそ
れらの断片をコードし、この抗体鎖の可変部領域の３つ
の相補性決定領域（CDRs）が第１の哺乳動物抗体に由来
し、かつ可変部ドメインの４つのフレームワーク領域が
第２の異なる哺乳動物抗体に由来するものである、下記
式で表わされる二本鎖もしくは一本鎖DNAの製造方法で
あって、 ５′F1−M1−F2−M2−F3−M3−F4 ３′ ここで、M1、M2およびM3は第１の抗体のCDRをコードす
るDNAを含み、かつF1、F2、F3およびF4はCDRs M1、M2
およびM3の側方に位置するフレームワーク配列を含み、 （ｉ） 下記式で表わされる一本鎖もしくは二本鎖DNA
テンプレートを調製し、 ５′f1−H1−f2−H2−f3−H3−f4 ３′ ここで、H1、H2およびH3はM1、M2およびM3とは異なる特
異性のCDRsをコードするDNAを含み、かつf1、f2、f3お
よびf4は各々F1、F2、F3およびF4と実質的に相同であ
り、 （ii） DNAオリゴヌクレオチドプライマーＡ、Ｂ、
Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨを得、ここで、 Ａは、F1の５′末端に対応する５′末端を有し、かつ配
列F1の対応長さに等しい配列a1を含み、 H1に向かって５′から３′の方向に指向し； Ｂは、配列 ５′b1−b2 ３′ からなり、ここで、 b1はM1の対応長さに相補的であり、かつM1の５′末端
に相補的な３′末端を有する配列を含み、 b2はF1における対応長さの配列に相補的であり、かつ
F1の３′末端に相補的なヌクレオチドから始まる５′末
端を有し； Ｃは、配列 ５′c1−c2 ３′ からなり、ここで、 c1は、M1の対応長さに等しく、かつM1の３′末端に対
応する３′末端を有する配列を含み、 c2は、F2における対応長さの配列に等しく、かつF2の
５′末端に対応するヌクレオチドから始まる５′末端を
有し； Ｄは、配列 ５′d1−d2 ３′ からなり、ここで、 d1は、M2の対応長さに相補的であり、かつM2の５′末
端に相補的な３′末端を有する配列を含み、 d2は、F2における対応長さの配列に相補的であり、か
つF2の３′末端に相補的なヌクレオチドから始まる５′
末端を有し； Ｅは、配列 ５′e1−e2 ３′ からなり、ここで、 e1は、M2の対応長さに等しく、かつM2の３′末端に対
応する３′末端を有する配列を含み、 e2は、F3における対応長さの配列に等しく、かつF3の
５′末端に対応するヌクレオチドから始まる５′末端を
有し； Ｆは、配列 ５′f1−f2 ３′ からなり、ここで、 f1は、M3の対応長さに相補的であり、かつM3の５′末
端に相補的な３′末端を有する配列を含み、 f2は、F3における対応長さの配列に相補的であり、か
つF3の３′末端に相補的なヌクレオチドから始まる５′
末端を有し； Ｇは、配列 ５′g1−g2 ３′ からなり、ここで、 g1は、M3の対応長さに等しく、かつM3の３′末端に対
応する３′末端を有する配列を含み、 g2は、F4における対応長さの配列に等しく、かつF4の
５′末端に対応するヌクレオチドから始まる５′末端を
有し； Ｈは、F4の３′末端に相補的な５′末端を有し、かつ
F4の対応長さに相補的である配列h1を含み、および H3に向かって５′から３′の方向に指向し； 並びに、対b1およびc1、d1およびe1、およびf1およびg1
は、PCRを実施可能な条件下において、それらの５′末
端を互いにアニールし得るに十分な長さで重複してお
り、（iii）所望の順番で、プライマー対Ａ、B;C、D;
E、ＦおよびＧ、Ｈを用いて、上記（ｉ）において調製
されるテンプレートに対するPCR反応を行ない、DNA断片
AB、CD、EFおよびGHを得、 （iv） 上記（iii）において得られる断片を結合さ
せ、所望のDNAを得る、ことを包含する方法が提供され
る。
れらの断片をコードし、この抗体鎖の可変部領域の３つ
の相補性決定領域（CDRs）が第１の哺乳動物抗体に由来
し、かつ可変部ドメインの４つのフレームワーク領域が
第２の異なる哺乳動物抗体に由来するものである、下記
式で表わされる二本鎖もしくは一本鎖DNAの製造方法で
あって、 ５′F1−M1−F2−M2−F3−M3−F4 ３′ ここで、M1、M2およびM3は第１の抗体のCDRをコードす
るDNAを含み、かつF1、F2、F3およびF4はCDRs M1、M2
およびM3の側方に位置するフレームワーク配列を含み、 （ｉ） 下記式で表わされる一本鎖もしくは二本鎖DNA
テンプレートを調製し、 ５′f1−H1−f2−H2−f3−H3−f4 ３′ ここで、H1、H2およびH3はM1、M2およびM3とは異なる特
異性のCDRsをコードするDNAを含み、かつf1、f2、f3お
よびf4は各々F1、F2、F3およびF4と実質的に相同であ
り、 （ii） DNAオリゴヌクレオチドプライマーＡ、Ｂ、
Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨを得、ここで、 Ａは、F1の５′末端に対応する５′末端を有し、かつ配
列F1の対応長さに等しい配列a1を含み、 H1に向かって５′から３′の方向に指向し； Ｂは、配列 ５′b1−b2 ３′ からなり、ここで、 b1はM1の対応長さに相補的であり、かつM1の５′末端
に相補的な３′末端を有する配列を含み、 b2はF1における対応長さの配列に相補的であり、かつ
F1の３′末端に相補的なヌクレオチドから始まる５′末
端を有し； Ｃは、配列 ５′c1−c2 ３′ からなり、ここで、 c1は、M1の対応長さに等しく、かつM1の３′末端に対
応する３′末端を有する配列を含み、 c2は、F2における対応長さの配列に等しく、かつF2の
５′末端に対応するヌクレオチドから始まる５′末端を
有し； Ｄは、配列 ５′d1−d2 ３′ からなり、ここで、 d1は、M2の対応長さに相補的であり、かつM2の５′末
端に相補的な３′末端を有する配列を含み、 d2は、F2における対応長さの配列に相補的であり、か
つF2の３′末端に相補的なヌクレオチドから始まる５′
末端を有し； Ｅは、配列 ５′e1−e2 ３′ からなり、ここで、 e1は、M2の対応長さに等しく、かつM2の３′末端に対
応する３′末端を有する配列を含み、 e2は、F3における対応長さの配列に等しく、かつF3の
５′末端に対応するヌクレオチドから始まる５′末端を
有し； Ｆは、配列 ５′f1−f2 ３′ からなり、ここで、 f1は、M3の対応長さに相補的であり、かつM3の５′末
端に相補的な３′末端を有する配列を含み、 f2は、F3における対応長さの配列に相補的であり、か
つF3の３′末端に相補的なヌクレオチドから始まる５′
末端を有し； Ｇは、配列 ５′g1−g2 ３′ からなり、ここで、 g1は、M3の対応長さに等しく、かつM3の３′末端に対
応する３′末端を有する配列を含み、 g2は、F4における対応長さの配列に等しく、かつF4の
５′末端に対応するヌクレオチドから始まる５′末端を
有し； Ｈは、F4の３′末端に相補的な５′末端を有し、かつ
F4の対応長さに相補的である配列h1を含み、および H3に向かって５′から３′の方向に指向し； 並びに、対b1およびc1、d1およびe1、およびf1およびg1
は、PCRを実施可能な条件下において、それらの５′末
端を互いにアニールし得るに十分な長さで重複してお
り、（iii）所望の順番で、プライマー対Ａ、B;C、D;
E、ＦおよびＧ、Ｈを用いて、上記（ｉ）において調製
されるテンプレートに対するPCR反応を行ない、DNA断片
AB、CD、EFおよびGHを得、 （iv） 上記（iii）において得られる断片を結合さ
せ、所望のDNAを得る、ことを包含する方法が提供され
る。
実施態様の１つによると、F4はCDR M3の側方に位置
するフレームワーク配列および抗体鎖の定常部領域の全
てもしくは一部をコードするDNAを含む。
するフレームワーク配列および抗体鎖の定常部領域の全
てもしくは一部をコードするDNAを含む。
工程（iv）は、
（iv a） 断片ABおよびCDをプライマーＡおよびＤと混
合し、PCRを行なってDNA断片ADを得； （iv b） 上記工程（iv a）の前、その間またはそれに
続いて、断片EFおよびGHをプライマーＥおよびＨと混合
し、PCRを行なってDNA断片EHを得、並びに （iv c） 断片ADおよびEHをプライマーＡおよびＨと混
合し、所望のDNAを得る、 ことにより行なうこともできる。
合し、PCRを行なってDNA断片ADを得； （iv b） 上記工程（iv a）の前、その間またはそれに
続いて、断片EFおよびGHをプライマーＥおよびＨと混合
し、PCRを行なってDNA断片EHを得、並びに （iv c） 断片ADおよびEHをプライマーＡおよびＨと混
合し、所望のDNAを得る、 ことにより行なうこともできる。
変わりに、工程（iv）は、
（iv a） 断片CDおよびEFをプライマーＣおよびＦと混
合し、PCRを行なってDNA断片CFを得、並びに （iv b−１）断片ABおよびCFをプライマーＡおよびＦと
混合し、PCRを行なってDNA断片AFを得、かつ （iv c−１）断片AFおよびGHをプライマーＡおよびＨと
混合し、所望のDNAを得るか、あるいは （iv b−２）断片CFおよびGHをプライマーＣおよびＨと
混合し、PCRを行なってDNA断片CHを得、かつ （iv c−２）断片ABおよびCHをプライマーＡおよびＨと
混合し、所望のDNAを得る、 ことにより行なうこともできる。
合し、PCRを行なってDNA断片CFを得、並びに （iv b−１）断片ABおよびCFをプライマーＡおよびＦと
混合し、PCRを行なってDNA断片AFを得、かつ （iv c−１）断片AFおよびGHをプライマーＡおよびＨと
混合し、所望のDNAを得るか、あるいは （iv b−２）断片CFおよびGHをプライマーＣおよびＨと
混合し、PCRを行なってDNA断片CHを得、かつ （iv c−２）断片ABおよびCHをプライマーＡおよびＨと
混合し、所望のDNAを得る、 ことにより行なうこともできる。
図面の説明
図１は、この発明による方法を説明する。黒塗りのボ
ックスは、CAMPATH抗体のフレームワーク領域の間に挿
入され、本来のCDR（白抜きのボックス）に置き換わ
る、ネズミ科動物のCDR領域からのDNA配列を示す。Ａ、
Ｂ、ＣおよびＤは、用いられたPCRプライマーを、それ
らの５′から３′への方向を示す半矢印（half−arro
w）と共に示す。
ックスは、CAMPATH抗体のフレームワーク領域の間に挿
入され、本来のCDR（白抜きのボックス）に置き換わ
る、ネズミ科動物のCDR領域からのDNA配列を示す。Ａ、
Ｂ、ＣおよびＤは、用いられたPCRプライマーを、それ
らの５′から３′への方向を示す半矢印（half−arro
w）と共に示す。
図２は、図１に示される方法に関わるキー配列を詳細
に示す。
に示す。
図３は、この発明の方法が、抗体の３つのCDR領域の
全ての置き換えにどのように用いられ得るのかを模式的
に示す図。
全ての置き換えにどのように用いられ得るのかを模式的
に示す図。
図４は、この発明に用いることができるプライマーの
１つの取合わせをさらに詳細に説明する。
１つの取合わせをさらに詳細に説明する。
F1およびF2DNA領域における可能な変異は、図１およ
び３に説明されるこの発明の態様を対比することにより
明らかである。
び３に説明されるこの発明の態様を対比することにより
明らかである。
図１において、単一のCDR DNAの置換を示すこの発明
による方法が図示される。図１における領域F2は、プラ
イマー“C"および“D"の間にあって、上で定義したc2の
５′末端から始まり、“D"の５′末端の補足物までであ
る。この領域は、全体で、３つのフレームワーク領域、
２つのCDRsおよびプライマーＤ内の停止コドンを組み込
んでいる全Ｈ鎖定常部領域をコードする。対称的に、
５′からCDRまでが置換されたF1のDNAは、単一のフレー
ムワークを含み、CDRsは有していない。
による方法が図示される。図１における領域F2は、プラ
イマー“C"および“D"の間にあって、上で定義したc2の
５′末端から始まり、“D"の５′末端の補足物までであ
る。この領域は、全体で、３つのフレームワーク領域、
２つのCDRsおよびプライマーＤ内の停止コドンを組み込
んでいる全Ｈ鎖定常部領域をコードする。対称的に、
５′からCDRまでが置換されたF1のDNAは、単一のフレー
ムワークを含み、CDRsは有していない。
図３において、プライマー“C"および“D"の間のDNA
は、単一のフレームワーク領域をコードする。これは、
図示される方法が、抗体の可変部領域をコードするDNA
の３つのCDRsの全ての置換を示すためである。この取合
わせに関して、プライマー“D"はd1の配列だけではな
く、第２のCDR領域の一部をコードするさらなる５′配
列をも含むことに注意すべきである。
は、単一のフレームワーク領域をコードする。これは、
図示される方法が、抗体の可変部領域をコードするDNA
の３つのCDRsの全ての置換を示すためである。この取合
わせに関して、プライマー“D"はd1の配列だけではな
く、第２のCDR領域の一部をコードするさらなる５′配
列をも含むことに注意すべきである。
抗体鎖の３つのCDRsの全てをコードするDNAが置換さ
れる場合には、図３の取合わせを用いることができる。
れる場合には、図３の取合わせを用いることができる。
したがって、４種のプライマー“A"、“B"、“C"およ
び“D"（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに対して上で定義した通
り）からなる第１セットが、全ての第1CDR（CDR1）およ
び第2CDR（CDR2）の少なくとも一部の置き換えに用いら
れる。プライマー“E"、“F"、“G"および“H"（各々
Ａ、Ｂ、ＣおよびＤと同様の定義）からなる第２セット
が、第3CDR（CDR3）およびCDR2の少なくとも一部の置き
換えに用いられる。CDR2の置換を確実にするために、プ
ライマー“D"および“E"はPCRの実施を可能にする条件
下においてそれらの５′末端を互いにアニールし得るに
十分な長さで重複しなければならない。本質的に、CDR2
の置き換えは、各々Ａ、Ｂ、ＣおよびＤと同様に定義さ
れている４種のプライマー“C"、“D"、“E"および“F"
のセットにより達成される。
び“D"（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに対して上で定義した通
り）からなる第１セットが、全ての第1CDR（CDR1）およ
び第2CDR（CDR2）の少なくとも一部の置き換えに用いら
れる。プライマー“E"、“F"、“G"および“H"（各々
Ａ、Ｂ、ＣおよびＤと同様の定義）からなる第２セット
が、第3CDR（CDR3）およびCDR2の少なくとも一部の置き
換えに用いられる。CDR2の置換を確実にするために、プ
ライマー“D"および“E"はPCRの実施を可能にする条件
下においてそれらの５′末端を互いにアニールし得るに
十分な長さで重複しなければならない。本質的に、CDR2
の置き換えは、各々Ａ、Ｂ、ＣおよびＤと同様に定義さ
れている４種のプライマー“C"、“D"、“E"および“F"
のセットにより達成される。
図３に図示されるこの発明の態様において、断片ABお
よびCDがアニールされて断片ADが得られ、断片EFおよび
GHが結合して断片EHが得られる。最後に、ADがEHと結合
して、３つのCDRs全てが置き換えられた可変部領域をコ
ードする断片AHが得られる。
よびCDがアニールされて断片ADが得られ、断片EFおよび
GHが結合して断片EHが得られる。最後に、ADがEHと結合
して、３つのCDRs全てが置き換えられた可変部領域をコ
ードする断片AHが得られる。
それにより、可変部領域をコードするDNAにおいて、
図３に図示されるようなプライマー“A"ないし“H"を用
いて、３つのCDR DNAの全てを置き換え得る他の取合わ
せには、図３（１）に示されるようにプライマー対“A"
＋“B"、“C"＋“D"、“E"＋“F"および“G"＋“H"を用
いて反応を行ない、断片CDおよびEFを一緒に結合させて
断片CFを生成させ、およびこの断片を第１断片AB、次に
GH、またはその逆のいずれかで結合させることが含まれ
る。
図３に図示されるようなプライマー“A"ないし“H"を用
いて、３つのCDR DNAの全てを置き換え得る他の取合わ
せには、図３（１）に示されるようにプライマー対“A"
＋“B"、“C"＋“D"、“E"＋“F"および“G"＋“H"を用
いて反応を行ない、断片CDおよびEFを一緒に結合させて
断片CFを生成させ、およびこの断片を第１断片AB、次に
GH、またはその逆のいずれかで結合させることが含まれ
る。
その代わりに、３つのCDRsをコードするDNAは連続的
に置き換えることもできる。プライマー“A"、“B"、
“C"および“H"を用いる第１反応（図３に示す通りであ
り、プライマーＡないしＤと同様の定義）を、この発明
に従ってCDR1の置き換えに用いることができる。プライ
マー“A"、“E"、“D"および“H"を用いる反応からなる
第２セット（図３に示す通りであり、プライマーＡない
しＤと同様の定義）はCDR2を置き換える。プライマー
“A"、“F"、“G"および“H"を用いる反応からなる最後
のセットはCDR3を置き換える。
に置き換えることもできる。プライマー“A"、“B"、
“C"および“H"を用いる第１反応（図３に示す通りであ
り、プライマーＡないしＤと同様の定義）を、この発明
に従ってCDR1の置き換えに用いることができる。プライ
マー“A"、“E"、“D"および“H"を用いる反応からなる
第２セット（図３に示す通りであり、プライマーＡない
しＤと同様の定義）はCDR2を置き換える。プライマー
“A"、“F"、“G"および“H"を用いる反応からなる最後
のセットはCDR3を置き換える。
プライマーＡおよびＤは、それらの５′末端に、例え
ばf1またはf2には表現されない制限エンドヌクレアーゼ
認識配列を表わすさらなる配列を有していてもよい。
ばf1またはf2には表現されない制限エンドヌクレアーゼ
認識配列を表わすさらなる配列を有していてもよい。
ＡおよびＤの配列、５′からa1およびd1は、f1とF1お
よびf2とF2との間の相同性の程度を考慮する場合、無視
される。同様に、F1および／またはF2がそれぞれf1およ
び／またはf2よりも短かければ、相同性の程度を測定す
る際に、F1/F2に対になる相手が存在しないf1/f2のさら
なる配列も無視される。
よびf2とF2との間の相同性の程度を考慮する場合、無視
される。同様に、F1および／またはF2がそれぞれf1およ
び／またはf2よりも短かければ、相同性の程度を測定す
る際に、F1/F2に対になる相手が存在しないf1/f2のさら
なる配列も無視される。
全てのプライマーには、f1/f2配列および対応する、
もしくは相補的なプライマー配列との間に、２ないし５
のヌクレオチド不適合のような数、例えば１ないし10が
含まれていてもよい。これらの不適合は、f1およびf2と
比較したときに、F1およびF2の配列における所望のコー
ディング変更の設計に用いることができる。
もしくは相補的なプライマー配列との間に、２ないし５
のヌクレオチド不適合のような数、例えば１ないし10が
含まれていてもよい。これらの不適合は、f1およびf2と
比較したときに、F1およびF2の配列における所望のコー
ディング変更の設計に用いることができる。
この発明の方法は、CDR領域のいずれか１つが置き換
えられているキメラ抗体またはそれらの断片の製造に用
いることができる。また、これは、抗体可変部領域のCD
R領域のいずれか２つ、もしくは３つ全ての置き換えに
も用いることもできる。
えられているキメラ抗体またはそれらの断片の製造に用
いることができる。また、これは、抗体可変部領域のCD
R領域のいずれか２つ、もしくは３つ全ての置き換えに
も用いることもできる。
この発明の方法は、完全抗体ＬもしくはＨ鎖の１以上
のCDRsをコードするDNAの置き換えに用いることができ
る。少なくとも１つのCDR領域をコードするDNA断片を用
いてもよい。例えば、ＬもしくはＨ鎖の一方もしくは両
方をコードするDNAがこの発明の方法により処理されて
いる、Fab、Ｆ（ab）２またはFv断片のような抗体断片
を製造することが可能である。
のCDRsをコードするDNAの置き換えに用いることができ
る。少なくとも１つのCDR領域をコードするDNA断片を用
いてもよい。例えば、ＬもしくはＨ鎖の一方もしくは両
方をコードするDNAがこの発明の方法により処理されて
いる、Fab、Ｆ（ab）２またはFv断片のような抗体断片
を製造することが可能である。
抗体のフレームワーク領域およびCDRsをコードするDN
Aはしばしばベクター、例えば発現ベクター内に存在す
る。幾つかのケースでは、プライマーＡおよびＤ（また
は少なくともそれらの領域a1およびd1）の一方もしくは
両方が、置き換えられているCDRの側方に位置するフレ
ームワーク領域の１つの配列よりも、むしろベクター配
列に対応することが必要であるか、もしくは望ましい。
Aはしばしばベクター、例えば発現ベクター内に存在す
る。幾つかのケースでは、プライマーＡおよびＤ（また
は少なくともそれらの領域a1およびd1）の一方もしくは
両方が、置き換えられているCDRの側方に位置するフレ
ームワーク領域の１つの配列よりも、むしろベクター配
列に対応することが必要であるか、もしくは望ましい。
この発明によって製造されたDNAは、適切な複製もし
くは発現ベクターにクローンし、バクテリア、イース
ト、昆虫または哺乳動物細胞に導入してキメラ抗体を製
造することができる。適切な発現系の例を以下に記載す
る。
くは発現ベクターにクローンし、バクテリア、イース
ト、昆虫または哺乳動物細胞に導入してキメラ抗体を製
造することができる。適切な発現系の例を以下に記載す
る。
抗体鎖は相補的抗体鎖と共に共発現（co−expresse
d）し得る。少なくとも、相補的鎖の可変部領域および
／または各定常部領域のフレームワークは、一般に、前
記第２の種に由来するものである。Ｌ鎖およびＨ鎖は共
発現し得る。いずれか、もしくは両方の鎖は、この発明
の方法により調製されている。好ましくは、両鎖のCDRs
は選択された同一の抗体に由来する。両発現鎖を含む抗
体を回収することができる。
d）し得る。少なくとも、相補的鎖の可変部領域および
／または各定常部領域のフレームワークは、一般に、前
記第２の種に由来するものである。Ｌ鎖およびＨ鎖は共
発現し得る。いずれか、もしくは両方の鎖は、この発明
の方法により調製されている。好ましくは、両鎖のCDRs
は選択された同一の抗体に由来する。両発現鎖を含む抗
体を回収することができる。
抗体は、天然抗体またはそれらの断片の構造を有して
いることが好ましい。したがって、抗体には、完全抗
体、（Fab′）２断片、Fab断片、Ｌ鎖二量体またはＨ鎖
を含み得る。抗体は、IgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4の
ようなIgG、IgM、IgA、IgEまたはIgDであってもよい。
その代わりに、抗体は、WO86/01533に記載されている型
のキメラ抗体であってもよい。
いることが好ましい。したがって、抗体には、完全抗
体、（Fab′）２断片、Fab断片、Ｌ鎖二量体またはＨ鎖
を含み得る。抗体は、IgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4の
ようなIgG、IgM、IgA、IgEまたはIgDであってもよい。
その代わりに、抗体は、WO86/01533に記載されている型
のキメラ抗体であってもよい。
WO86/01533によるキメラ抗体には、抗原結合領域およ
び非免疫グロブリン領域が含まれる。この抗原結合領域
は、抗体Ｌ鎖可変部領域またはＨ鎖可変部領域である。
典型的には、キメラ抗体は、ＬおよびＨ鎖可変部領域の
両者を含む。非免疫グロブリン領域は、そのＣ末端で抗
原結合領域に融合している。非免疫グロブリン領域は、
典型的には、非免疫グロブリンタンパク質であり、酵素
領域、公知の結合特異性を有するタンパク質由来の領
域、タンパク毒由来の領域、または実に遺伝子によって
発現したいかなるタンパク質に由来する領域であっても
よい。キメラ抗体の２つの領域は、切断可能なリンカー
配列によって接続されていてもよい。
び非免疫グロブリン領域が含まれる。この抗原結合領域
は、抗体Ｌ鎖可変部領域またはＨ鎖可変部領域である。
典型的には、キメラ抗体は、ＬおよびＨ鎖可変部領域の
両者を含む。非免疫グロブリン領域は、そのＣ末端で抗
原結合領域に融合している。非免疫グロブリン領域は、
典型的には、非免疫グロブリンタンパク質であり、酵素
領域、公知の結合特異性を有するタンパク質由来の領
域、タンパク毒由来の領域、または実に遺伝子によって
発現したいかなるタンパク質に由来する領域であっても
よい。キメラ抗体の２つの領域は、切断可能なリンカー
配列によって接続されていてもよい。
この発明は、抗体、典型的にはモノクローナル抗体、
例えばラットまたはマウス抗体のヒト化に好ましく用い
られる。したがって、得られた抗体のフレームワークお
よび定常領域は、抗体のＬおよび／またはＨ鎖のCDRsが
ラットもしくはマウスCDRsであるにもかかわらず、ヒト
フレームワークおよび定常領域である。好ましくは、全
てのCDRsはラットまたはマウスCDRsである。この発明に
従って製造される抗体は、ラットまたはマウスCDRsをの
せたIgG1、IgG2、IgG3、IgG4のようなヒトIgG;IgM;IgA;
IgEまたはIgDであり得る。
例えばラットまたはマウス抗体のヒト化に好ましく用い
られる。したがって、得られた抗体のフレームワークお
よび定常領域は、抗体のＬおよび／またはＨ鎖のCDRsが
ラットもしくはマウスCDRsであるにもかかわらず、ヒト
フレームワークおよび定常領域である。好ましくは、全
てのCDRsはラットまたはマウスCDRsである。この発明に
従って製造される抗体は、ラットまたはマウスCDRsをの
せたIgG1、IgG2、IgG3、IgG4のようなヒトIgG;IgM;IgA;
IgEまたはIgDであり得る。
この発明の方法は、得られるキメラ抗体が、CDR領域
（複数）の起源である非ヒト抗体の抗原結合能力を保持
するような方法で行なわれる。
（複数）の起源である非ヒト抗体の抗原結合能力を保持
するような方法で行なわれる。
出発抗体は、典型的には、選択された特異性を有する
抗体である。この特異性の保持を確実にするために、こ
の抗体の可変部領域フレームワークは、最も近い他の種
の抗体の可変部領域フレームワークであることが好まし
い。「概ね最も近い」とは、アミノ酸配列に関して概ね
最も相同性が高いことを意味する。２つの可変部領域の
間で、少なくとも50％の相同性があることが好ましい。
抗体である。この特異性の保持を確実にするために、こ
の抗体の可変部領域フレームワークは、最も近い他の種
の抗体の可変部領域フレームワークであることが好まし
い。「概ね最も近い」とは、アミノ酸配列に関して概ね
最も相同性が高いことを意味する。２つの可変部領域の
間で、少なくとも50％の相同性があることが好ましい。
この発明による方法によってヒト化抗体を製造するた
めの４つの一般的な工程がある。
めの４つの一般的な工程がある。
（１）出発抗体ＬおよびＨ鎖可変部領域のヌクレオチド
および予想されるアミノ酸配列の決定； （２）キメラ抗体の設計、すなわち、どの抗体フレーム
ワーク領域をこの方法で用いるかの決定； （３）オリゴヌクレオチドＡ、Ｂ、ＣおよびＤの同定、
およびヒト化抗体をコードするDNAを製造するための一
連のPCR反応におけるこれらのプライマーの使用；並び
に （４）このDNAの適切な宿主細胞系への形質導入および
ヒト化抗体の発現。
および予想されるアミノ酸配列の決定； （２）キメラ抗体の設計、すなわち、どの抗体フレーム
ワーク領域をこの方法で用いるかの決定； （３）オリゴヌクレオチドＡ、Ｂ、ＣおよびＤの同定、
およびヒト化抗体をコードするDNAを製造するための一
連のPCR反応におけるこれらのプライマーの使用；並び
に （４）このDNAの適切な宿主細胞系への形質導入および
ヒト化抗体の発現。
これら４つの工程を、抗体のヒト化に関連して以下に
説明する。しかしながら、それらは、非ヒト種の抗体に
改変する場合にも等しく良好に適用可能である。
説明する。しかしながら、それらは、非ヒト種の抗体に
改変する場合にも等しく良好に適用可能である。
工程1:抗体ＬおよびＨ鎖可変部領域のヌクレオチドおよ
び予想されるアミノ酸配列の決定 キメラ抗体を作製するために、抗体のＨおよびＬ鎖可
変部領域のアミノ酸配列のみを知る必要がある。定常部
領域の配列は、これらがヒト化策に寄与しないので、無
関係である。抗体の可変部領域アミノ酸配列を決定する
最も簡単な方法は、ＨおよびＬ鎖可変部領域をコードす
るクローン化cDNAからのものである。
び予想されるアミノ酸配列の決定 キメラ抗体を作製するために、抗体のＨおよびＬ鎖可
変部領域のアミノ酸配列のみを知る必要がある。定常部
領域の配列は、これらがヒト化策に寄与しないので、無
関係である。抗体の可変部領域アミノ酸配列を決定する
最も簡単な方法は、ＨおよびＬ鎖可変部領域をコードす
るクローン化cDNAからのものである。
与えられた抗体のＨおよびＬ鎖可変部領域cDNAをクロ
ーニングする２つの一般法：（１）通常のcDNAライブラ
リーから、または（２）PCRによる方法が存在する。こ
れら両者の方法は広く知られている。cDNAのヌクレオチ
ド配列が与えられれば、この情報を抗体可変部領域の予
想されるアミノ酸配列に翻訳することは簡単なことであ
る。
ーニングする２つの一般法：（１）通常のcDNAライブラ
リーから、または（２）PCRによる方法が存在する。こ
れら両者の方法は広く知られている。cDNAのヌクレオチ
ド配列が与えられれば、この情報を抗体可変部領域の予
想されるアミノ酸配列に翻訳することは簡単なことであ
る。
工程2:キメラ抗体の設計
ヒト化の工程でどのヒト抗体配列を用いるかを決定す
るにあたり、考慮すべき幾つかの因子がある。Ｌおよび
Ｈ鎖のヒト化は互いに独立に考慮されるが、その議論の
道筋は基本的には互いに似ている。
るにあたり、考慮すべき幾つかの因子がある。Ｌおよび
Ｈ鎖のヒト化は互いに独立に考慮されるが、その議論の
道筋は基本的には互いに似ている。
この選択工程は、以下の根拠に基づいている：与えら
れた抗体の抗原特異性および親和性は、主として、可変
部領域CDRsのアミノ酸配列によって決定される。可変部
領域フレームワーク残基はほとんど、もしくは直接は寄
与しない。フレームワーク領域の主な機能は、CDRsを、
抗原を認識するための正しい空間方位に保持することが
できる。このため、ヒト可変部領域フレームワークへの
齧歯類動物のCDRsの置換は、ヒト可変部領域がそれらの
起源である齧歯類動物の可変部領域と高い相同性を有し
ている場合に、それらの正確な空間方位が最も保持され
る結果となるようである。したがって、好ましくは、ヒ
ト可変部領域は齧歯類動物の可変領域（複数）と高い相
同性を有するものが選ばれるべきである。
れた抗体の抗原特異性および親和性は、主として、可変
部領域CDRsのアミノ酸配列によって決定される。可変部
領域フレームワーク残基はほとんど、もしくは直接は寄
与しない。フレームワーク領域の主な機能は、CDRsを、
抗原を認識するための正しい空間方位に保持することが
できる。このため、ヒト可変部領域フレームワークへの
齧歯類動物のCDRsの置換は、ヒト可変部領域がそれらの
起源である齧歯類動物の可変部領域と高い相同性を有し
ている場合に、それらの正確な空間方位が最も保持され
る結果となるようである。したがって、好ましくは、ヒ
ト可変部領域は齧歯類動物の可変領域（複数）と高い相
同性を有するものが選ばれるべきである。
適切なヒト抗体可変領域配列は以下のようにして選択
することができる： 1.コンピュータ・プログラムを用い、全ての利用可能な
タンパク質（およびDNA）データベースを、齧歯類動物
の抗体可変部領域と最も相同のヒト抗体可変領域配列に
ついて検索する。適切なプログラムの出力は、齧歯類動
物の抗体と最も相同な配列、各配列の相同性のパーセン
ト、および齧歯類動物の配列に対する各配列のアライン
メントのリストである。これは、ＨおよびＬ鎖可変部領
域の両方について独立に行なわれる。上記分析は、ヒト
免疫グロブリン配列のみが含まれている場合には、より
簡単に遂行される。
することができる： 1.コンピュータ・プログラムを用い、全ての利用可能な
タンパク質（およびDNA）データベースを、齧歯類動物
の抗体可変部領域と最も相同のヒト抗体可変領域配列に
ついて検索する。適切なプログラムの出力は、齧歯類動
物の抗体と最も相同な配列、各配列の相同性のパーセン
ト、および齧歯類動物の配列に対する各配列のアライン
メントのリストである。これは、ＨおよびＬ鎖可変部領
域の両方について独立に行なわれる。上記分析は、ヒト
免疫グロブリン配列のみが含まれている場合には、より
簡単に遂行される。
2.ヒト抗体可変部領域配列を挙げ、相同性の比較を行な
う。最初に、非常に変わりやすいＨ鎖のCDR3を除いて、
CDRsの長さについて比較を行なう。ヒトＨ鎖並びにκお
よびλＬ鎖はサブグループに分けることができる;H鎖３
サブグループ、κ鎖４サブグループ、λ鎖サブグループ
６サブグループ。各サブグループ内のCDRの大きさは似
ているが、サブグループ間で変化する。通常、相同性の
第１の近似値として、齧歯類動物Ab CDRをヒト・サブ
グループと合わせることができる。その後、同じ長さの
CDRsを有する抗体のアミノ酸配列相同性について、特に
CDRs内、しかしそれだけではなく周囲のフレームワーク
領域においても、比較を行なう。最も相同のCDRsを有す
るヒト可変部領域をヒト化のためのフレームワークとし
て選択する。
う。最初に、非常に変わりやすいＨ鎖のCDR3を除いて、
CDRsの長さについて比較を行なう。ヒトＨ鎖並びにκお
よびλＬ鎖はサブグループに分けることができる;H鎖３
サブグループ、κ鎖４サブグループ、λ鎖サブグループ
６サブグループ。各サブグループ内のCDRの大きさは似
ているが、サブグループ間で変化する。通常、相同性の
第１の近似値として、齧歯類動物Ab CDRをヒト・サブ
グループと合わせることができる。その後、同じ長さの
CDRsを有する抗体のアミノ酸配列相同性について、特に
CDRs内、しかしそれだけではなく周囲のフレームワーク
領域においても、比較を行なう。最も相同のCDRsを有す
るヒト可変部領域をヒト化のためのフレームワークとし
て選択する。
工程3:オリゴヌクレオチドＡ、Ｂ、ＣおよびＤの同定お
よび使用 例えば、R.K.Saiki（“The Design and Optimisation
of the PCR"in“PCR Technology"、Ed H.A.Erlich,Sto
ckton Press、（1989））によって記載されているよう
に、PCR用のプライマーを設計する一般的な原理はよく
知られている。加えて、各CDR置換に対して、特別な要
素を考慮することができる。必要または所望であるなら
ば、Ａおよび／またはＤの５′末端は、第２および／ま
たは第3CDRの一部または全てをコードする。このプライ
マー、ＡおよびＤは、それらの５′末端に、制限酵素部
位を含むこともできる。これらの部位は、最終PCR反応
からのヒト化抗体のクローニングに用いられるベクター
に従って設計することができる。プライマーＢおよびＣ
は、PCRを実施可能にする条件下でそれらの５′末端を
互いにアニールし得るに十分な長さで少なくとも重複す
ることを満足させる長さでなければならない。これに
は、通常、少なくとも12、好ましくは少なくとも15ヌク
レオチドの重複が必要とされる。４種のプライマーのう
ちの１種以上が、それらのテンプレート配列とヌクレオ
チド１個以上が異なっていてもよい。これらの相違は、
抗体のフレームワーク領域への所望のコーディング変更
の導入に利用することができる。
よび使用 例えば、R.K.Saiki（“The Design and Optimisation
of the PCR"in“PCR Technology"、Ed H.A.Erlich,Sto
ckton Press、（1989））によって記載されているよう
に、PCR用のプライマーを設計する一般的な原理はよく
知られている。加えて、各CDR置換に対して、特別な要
素を考慮することができる。必要または所望であるなら
ば、Ａおよび／またはＤの５′末端は、第２および／ま
たは第3CDRの一部または全てをコードする。このプライ
マー、ＡおよびＤは、それらの５′末端に、制限酵素部
位を含むこともできる。これらの部位は、最終PCR反応
からのヒト化抗体のクローニングに用いられるベクター
に従って設計することができる。プライマーＢおよびＣ
は、PCRを実施可能にする条件下でそれらの５′末端を
互いにアニールし得るに十分な長さで少なくとも重複す
ることを満足させる長さでなければならない。これに
は、通常、少なくとも12、好ましくは少なくとも15ヌク
レオチドの重複が必要とされる。４種のプライマーのう
ちの１種以上が、それらのテンプレート配列とヌクレオ
チド１個以上が異なっていてもよい。これらの相違は、
抗体のフレームワーク領域への所望のコーディング変更
の導入に利用することができる。
これらのプライマーは、その後、ヒト化抗体をコード
するDNAを生成するために、適当なテンプレートを用い
る一連のPCR反応に用いられる。PCR反応は、Saikiら、S
cience、239、487−491（1988）の記載の通りに行なう
ことができる。各段階で、PCR反応の所望の生成物を、
例えば選択濾過を用いて、必要に応じて精製することが
でき、必要であれば、生成物の同一性を、例えばゲル電
気永動により、確立することができる。
するDNAを生成するために、適当なテンプレートを用い
る一連のPCR反応に用いられる。PCR反応は、Saikiら、S
cience、239、487−491（1988）の記載の通りに行なう
ことができる。各段階で、PCR反応の所望の生成物を、
例えば選択濾過を用いて、必要に応じて精製することが
でき、必要であれば、生成物の同一性を、例えばゲル電
気永動により、確立することができる。
工程4:改変抗体の形質導入および発現
キメラ抗体をコードするDNAを製造する反応に続い
て、このDNAを、ＬまたはＨ鎖定常部領域をコードする
適当なDNAに結合させ、発現ベクターにクローニング
し、適当な宿主細胞系、好ましくは哺乳動物細胞系に形
質導入する。これらの工程は、ルーチン方式で行なうこ
とができる。したがって、キメラ抗体は、 ａ）少なくともIg ＨまたはＬ鎖の可変部領域をコード
するDNA配列に動作可能に結合する、適当なプロモータ
を含む第１の増殖可能な発現ベクターであって、前記可
変部領域が第１の抗体からのフレームワーク領域および
異なる特異性を有する第２の抗体からのCDRsを含むベク
ターを調製し、 ｂ）必要であれば、少なくとも相補的Ig ＬまたはＨ鎖
各々の可変部領域をコードするDNA配列に動作可能に結
合する、適当なプロモータを含む第２の複製可能な発現
ベクターを調製し、 ｃ）前記第１ベクターまたは調製されたベクターの両方
を用いて細胞系を形質転換し、 ｄ）前記形質転換細胞系を培養して前記改変抗体を製造
する、 ことを包含する方法によって調製することができる。
て、このDNAを、ＬまたはＨ鎖定常部領域をコードする
適当なDNAに結合させ、発現ベクターにクローニング
し、適当な宿主細胞系、好ましくは哺乳動物細胞系に形
質導入する。これらの工程は、ルーチン方式で行なうこ
とができる。したがって、キメラ抗体は、 ａ）少なくともIg ＨまたはＬ鎖の可変部領域をコード
するDNA配列に動作可能に結合する、適当なプロモータ
を含む第１の増殖可能な発現ベクターであって、前記可
変部領域が第１の抗体からのフレームワーク領域および
異なる特異性を有する第２の抗体からのCDRsを含むベク
ターを調製し、 ｂ）必要であれば、少なくとも相補的Ig ＬまたはＨ鎖
各々の可変部領域をコードするDNA配列に動作可能に結
合する、適当なプロモータを含む第２の複製可能な発現
ベクターを調製し、 ｃ）前記第１ベクターまたは調製されたベクターの両方
を用いて細胞系を形質転換し、 ｄ）前記形質転換細胞系を培養して前記改変抗体を製造
する、 ことを包含する方法によって調製することができる。
好ましくは、工程ａ）におけるDNA配列は、抗体鎖の
可変部領域および、または各定常部領域の両方をコード
する。抗体は回収し、精製することができる。改変抗体
を製造するために形質転換された細胞系は、チャイニー
ズハムスター卵巣（CHO）細胞系またはミエローマ、ハ
イブリドーマ、トリオーマまたはクアドローマのよう
な、有利にリンパ系起源の不死化哺乳動物細胞系であっ
てもよい。この細胞系は、エプスタイン・バールウイル
スのようなウイルスを用いた形質転換により不死化され
ている、Ｂ細胞のような正常リンパ球であってもよい。
最も好ましくは、不死化細胞系はミエローマ細胞系また
はそれらの誘導細胞系である。
可変部領域および、または各定常部領域の両方をコード
する。抗体は回収し、精製することができる。改変抗体
を製造するために形質転換された細胞系は、チャイニー
ズハムスター卵巣（CHO）細胞系またはミエローマ、ハ
イブリドーマ、トリオーマまたはクアドローマのよう
な、有利にリンパ系起源の不死化哺乳動物細胞系であっ
てもよい。この細胞系は、エプスタイン・バールウイル
スのようなウイルスを用いた形質転換により不死化され
ている、Ｂ細胞のような正常リンパ球であってもよい。
最も好ましくは、不死化細胞系はミエローマ細胞系また
はそれらの誘導細胞系である。
キメラ抗体の製造に用いられる細胞系は好ましくは哺
乳動物細胞系ではあるが、バクテリア細胞系またはイー
スト細胞系のような他の適当な細胞系を代わりに用いる
ことができる。特に、E.coli由来バクテリア株が使用可
能であることが期待される。
乳動物細胞系ではあるが、バクテリア細胞系またはイー
スト細胞系のような他の適当な細胞系を代わりに用いる
ことができる。特に、E.coli由来バクテリア株が使用可
能であることが期待される。
ミエローマ細胞系のような不死化細胞系の幾つかが、
それらの正常状態において、単離されたIg ＬまたはＨ
鎖を分泌することが知られている。そのような細胞系が
工程ａ）で調製されたベクターで形質転換された場合に
は、通常分泌される鎖が、工程ａ）において調製される
ベクターによってコードされるIg鎖の可変部領域に相補
的である限りにおいて、方法の工程ｂ）を行なう必要は
ない。
それらの正常状態において、単離されたIg ＬまたはＨ
鎖を分泌することが知られている。そのような細胞系が
工程ａ）で調製されたベクターで形質転換された場合に
は、通常分泌される鎖が、工程ａ）において調製される
ベクターによってコードされるIg鎖の可変部領域に相補
的である限りにおいて、方法の工程ｂ）を行なう必要は
ない。
しかしながら、不死化細胞系が分泌を行なわないか、
もしくは相補的鎖を分泌しない場合には、工程ｂ）を行
なう必要がある。この工程は、工程ａ）において製造さ
れたベクターを、キメラ抗体のＬまたはＨ鎖の可変部領
域だけではなく、相補的な可変部領域をコードするよう
にさらに操作することにより行なうことができる。
もしくは相補的鎖を分泌しない場合には、工程ｂ）を行
なう必要がある。この工程は、工程ａ）において製造さ
れたベクターを、キメラ抗体のＬまたはＨ鎖の可変部領
域だけではなく、相補的な可変部領域をコードするよう
にさらに操作することにより行なうことができる。
代わりに、工程ｂ）は、不死化細胞系の形質転換に用
いられる第２のベクターを調製することにより行なわれ
る。この代替法は調製品のより簡便な構築をもたらす
が、抗体製造の効率に劣り、第１の代替法ほど好ましい
ものではない。
いられる第２のベクターを調製することにより行なわれ
る。この代替法は調製品のより簡便な構築をもたらす
が、抗体製造の効率に劣り、第１の代替法ほど好ましい
ものではない。
不死化細胞系が相補的ＬまたはＨ鎖を分泌する場合に
は、例えば、適当なバクテリア細胞をベクターで形質転
換し、次いでバクテリア細胞をスフェロプラスト融合に
より不死化細胞系と融合させることにより、形質転換細
胞系を製造することができる。代わりに、エレクトロポ
レーションもしくは他の適切な方法により、DNAを不死
化細胞系内に直接導入することもできる。
は、例えば、適当なバクテリア細胞をベクターで形質転
換し、次いでバクテリア細胞をスフェロプラスト融合に
より不死化細胞系と融合させることにより、形質転換細
胞系を製造することができる。代わりに、エレクトロポ
レーションもしくは他の適切な方法により、DNAを不死
化細胞系内に直接導入することもできる。
その結果、抗体鎖の可変部領域のCDRsが第１の哺乳動
物種の抗体の対応するCDRsと相同であり、かつ抗体の可
変部領域のフレームワークおよび定常部領域が第２の異
なる哺乳動物種の抗体の対応するフレームワークおよび
定常部領域と相同である抗体が製造される。典型的に
は、ＬもしくはＨ鎖の可変部領域の３つのCDRs全てが第
１の種に由来する。
物種の抗体の対応するCDRsと相同であり、かつ抗体の可
変部領域のフレームワークおよび定常部領域が第２の異
なる哺乳動物種の抗体の対応するフレームワークおよび
定常部領域と相同である抗体が製造される。典型的に
は、ＬもしくはＨ鎖の可変部領域の３つのCDRs全てが第
１の種に由来する。
抗体は、IgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4のようなIg
G、IgM、IgA、IgEまたはIgDであってもよい。代わり
に、抗体はWO86/01533に記載される型のキメラ抗体であ
ってもよい。
G、IgM、IgA、IgEまたはIgDであってもよい。代わり
に、抗体はWO86/01533に記載される型のキメラ抗体であ
ってもよい。
この発明の組換えPCR技法は、３回のPCR反応を用いて
わずか２日で完全にヒト化されたMAb DNA配列の生成を
可能にする。従来、部位指向変異誘発（Jonesら、Natur
e、321、522−525（1986）;Riechmannら、Nature、33
2、323−327（1988））およびオリゴヌクレオチド遺伝
子合成（Queenら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、86、10
029−10033（1989））が抗体のヒト化に用いられてい
る。上記方法は、多数のヒトIgGサブグループIII H鎖
（Clearyら、Cell、44、97−106（1986））に存在する1
9アミノ酸CDRH2のような大きなCDRsを移相するにも拘ら
ず、手順の中でより少ないオリゴヌクレオチドしか必要
としないという、これらの技法を凌駕する利点を有す
る。例えば、図４に示されるように、第１のPCR生成物
がCDRの中央部で15bp重複するように設計されている場
合には、FR標的配列に対応する15bpの相同性を推測する
と、57bpのCDRの適当なFR上への移送には最大51bpのオ
リゴヌクレオチドが必要となる（Higuchi,Using PCR to
engineer DNA,in“PCR Technology"Ed.H.A.Erlich,Sto
ckton Press（1989））。
わずか２日で完全にヒト化されたMAb DNA配列の生成を
可能にする。従来、部位指向変異誘発（Jonesら、Natur
e、321、522−525（1986）;Riechmannら、Nature、33
2、323−327（1988））およびオリゴヌクレオチド遺伝
子合成（Queenら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、86、10
029−10033（1989））が抗体のヒト化に用いられてい
る。上記方法は、多数のヒトIgGサブグループIII H鎖
（Clearyら、Cell、44、97−106（1986））に存在する1
9アミノ酸CDRH2のような大きなCDRsを移相するにも拘ら
ず、手順の中でより少ないオリゴヌクレオチドしか必要
としないという、これらの技法を凌駕する利点を有す
る。例えば、図４に示されるように、第１のPCR生成物
がCDRの中央部で15bp重複するように設計されている場
合には、FR標的配列に対応する15bpの相同性を推測する
と、57bpのCDRの適当なFR上への移送には最大51bpのオ
リゴヌクレオチドが必要となる（Higuchi,Using PCR to
engineer DNA,in“PCR Technology"Ed.H.A.Erlich,Sto
ckton Press（1989））。
また、この発明の技法は、全ての操作を、dsおよびss
ベクター間のサブクローニングを必要とすることなくds
DNAで行ない、その結果、ヒト化生成物の生成に要す
る時間および労力を減少させることができるという、部
位指向変異誘発を凌駕する利点を有する。
ベクター間のサブクローニングを必要とすることなくds
DNAで行ない、その結果、ヒト化生成物の生成に要す
る時間および労力を減少させることができるという、部
位指向変異誘発を凌駕する利点を有する。
以下の例によりこの発明を説明する。
例 １
（ａ）ヒト・バックグランドへのDX48 CDRH1の組換えPC
Rグラフティング この目的は、ラット抗ジゴキシンmAb（DX48）からの
Ｈ鎖CDR1（CDRH1）をヒトIg主鎖にグラフトすることで
あった。組換えPCRに使用されるテンプレートは、予め
ヒト化されたCAMPATH−1H H鎖（Riechmannら、Nature、
332、323−327（1988））、NEWを有するヒトIgG1 H鎖
（Saulら、J.Biol.Chem.、253、585−597（1978））Ｖ
領域、である（配列番号１）。これは、ゲノムの形態か
らcDNAの形態に再操作（re−engineered）し、続いて、
M13において、CAMPATH−1H CDRH2およびCDRH3配列をDX4
8 CDRH2およびCDRH3に置き換えてHUMDXCH.23 ssテンプ
レートを生成させるために、部位変異誘発を行なったも
のである。
Rグラフティング この目的は、ラット抗ジゴキシンmAb（DX48）からの
Ｈ鎖CDR1（CDRH1）をヒトIg主鎖にグラフトすることで
あった。組換えPCRに使用されるテンプレートは、予め
ヒト化されたCAMPATH−1H H鎖（Riechmannら、Nature、
332、323−327（1988））、NEWを有するヒトIgG1 H鎖
（Saulら、J.Biol.Chem.、253、585−597（1978））Ｖ
領域、である（配列番号１）。これは、ゲノムの形態か
らcDNAの形態に再操作（re−engineered）し、続いて、
M13において、CAMPATH−1H CDRH2およびCDRH3配列をDX4
8 CDRH2およびCDRH3に置き換えてHUMDXCH.23 ssテンプ
レートを生成させるために、部位変異誘発を行なったも
のである。
PCR反応（Saikiら、Science、239、487−491（198
8））は、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laborator
y Manual,2nd Edn.,Cold Spring Harbor Laboratory（1
989）の方法によって調製したss HUMDXCH.23テンプレー
トを用いて行なった。反応は、温度サイクル（94℃１分
間、50℃２分間および72℃３分間）25回とそれに続く72
℃での最後の10分間の工程を用いて、プログラム可能な
加熱ブロック（Hybaid）内で行なった。製造者が推すよ
うに、各プライマー１μｇ、テンプレート50ngおよびTa
qポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus）2.5ユニットを反
応緩衝液で最終容積100μｌとして用いた。合成オリゴ
ヌクレオチドは、7500DNAシンセサイザー（Milligen）
で作製した。
8））は、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laborator
y Manual,2nd Edn.,Cold Spring Harbor Laboratory（1
989）の方法によって調製したss HUMDXCH.23テンプレー
トを用いて行なった。反応は、温度サイクル（94℃１分
間、50℃２分間および72℃３分間）25回とそれに続く72
℃での最後の10分間の工程を用いて、プログラム可能な
加熱ブロック（Hybaid）内で行なった。製造者が推すよ
うに、各プライマー１μｇ、テンプレート50ngおよびTa
qポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus）2.5ユニットを反
応緩衝液で最終容積100μｌとして用いた。合成オリゴ
ヌクレオチドは、7500DNAシンセサイザー（Milligen）
で作製した。
用いた方法を図１にまとめる。使用したプライマー
は： A:配列番号２ B:配列番号３ C:配列番号４ D:配列番号５ プライマー対ＡとＢ、およびＣとＤそれぞれを用いて
２つのPCR反応を行なった。プライマーＡおよびＤは、H
UMDXCH.23インサートの５′および３′末端にHind III
部位を取り込んだポジおよびネガ鎖オリゴヌクレオチド
に対応する。図２は、HUMDXCH.23インサートの３つの領
域のヌクレオチド配列を示し、このインサートは;CAMPA
TH−1Hリーダー配列の開始コドンを含むインサートの
５′末端の最初の42bp;CAMPATH−1HからのFRH1の３′27
bp、CDRH1の全長およびFRH2の５′27bp;およびCAMPATH
−1H定常部領域（CH3）末端の停止コドンを含むインサ
ートの３′末端の最後の27bpを取り込んでいる。これら
の配列は、それぞれ117bpおよび1206bpに分離してい
る。プライマーＢは、DX48のCDRH1配列と共に、CAMPATH
−1H CDRH1の代わりに（CAMPATH−1HのPhe27およびThr3
0をNEW FRH1に存在するSer残基に変換し戻す点変異を有
する）CAMPATH−1H FRH1領域の３′末端からのネガ鎖配
列を有している（図２）。プライマーＣは、プライマー
ＢのCDRH1領域に相補的であり、CAMPATH−1H FRH2の
５′末端に入り込むDX48 CDRH1のポジ鎖配列から構成さ
れている（図２）。第１回のABおよびCD PCR反応にお
いて、プライマーＢおよびＤそれぞれからHUMDXCH.23ネ
ガ鎖が合成される（図１）。次のサイクルにおいて、断
片ABおよびCD（各々配列番号６および７）が増幅される
（図１および２）。このように、この２つの反応の生成
物はHUMDXCH.23インサートの全長を構成するが、これは
上述の点変異およびDX48のCDRH1配列で置換されたCampa
th−1H CDRH1を有する。断片ABおよびCDは両者とも、変
性および再アニーリング（reannealing）の際に重複配
列がアニールできるように、DX48 CDRH1配列を有してい
る。
は： A:配列番号２ B:配列番号３ C:配列番号４ D:配列番号５ プライマー対ＡとＢ、およびＣとＤそれぞれを用いて
２つのPCR反応を行なった。プライマーＡおよびＤは、H
UMDXCH.23インサートの５′および３′末端にHind III
部位を取り込んだポジおよびネガ鎖オリゴヌクレオチド
に対応する。図２は、HUMDXCH.23インサートの３つの領
域のヌクレオチド配列を示し、このインサートは;CAMPA
TH−1Hリーダー配列の開始コドンを含むインサートの
５′末端の最初の42bp;CAMPATH−1HからのFRH1の３′27
bp、CDRH1の全長およびFRH2の５′27bp;およびCAMPATH
−1H定常部領域（CH3）末端の停止コドンを含むインサ
ートの３′末端の最後の27bpを取り込んでいる。これら
の配列は、それぞれ117bpおよび1206bpに分離してい
る。プライマーＢは、DX48のCDRH1配列と共に、CAMPATH
−1H CDRH1の代わりに（CAMPATH−1HのPhe27およびThr3
0をNEW FRH1に存在するSer残基に変換し戻す点変異を有
する）CAMPATH−1H FRH1領域の３′末端からのネガ鎖配
列を有している（図２）。プライマーＣは、プライマー
ＢのCDRH1領域に相補的であり、CAMPATH−1H FRH2の
５′末端に入り込むDX48 CDRH1のポジ鎖配列から構成さ
れている（図２）。第１回のABおよびCD PCR反応にお
いて、プライマーＢおよびＤそれぞれからHUMDXCH.23ネ
ガ鎖が合成される（図１）。次のサイクルにおいて、断
片ABおよびCD（各々配列番号６および７）が増幅される
（図１および２）。このように、この２つの反応の生成
物はHUMDXCH.23インサートの全長を構成するが、これは
上述の点変異およびDX48のCDRH1配列で置換されたCampa
th−1H CDRH1を有する。断片ABおよびCDは両者とも、変
性および再アニーリング（reannealing）の際に重複配
列がアニールできるように、DX48 CDRH1配列を有してい
る。
過剰のプライマーは、Centricon 100で選択濾過する
ことによりABおよびCD PCR反応から除去した（Higuchi
ら、Nucl.Acids Res.、16、7351−7367（1988）;Amico
n）。各反応液50μｌをTE（10mMトリス−HCl、pH8、0.1
mM EDTA）2mlに入れ、Centricon 100の上部貯蔵槽にお
いて混合した。製造者のプロトコルでは、続いて固定角
ローター内における1000×Ｇでの25分間の遠心が用いら
れ、PCR生成物を40μｌ濃縮物として回収した。
ことによりABおよびCD PCR反応から除去した（Higuchi
ら、Nucl.Acids Res.、16、7351−7367（1988）;Amico
n）。各反応液50μｌをTE（10mMトリス−HCl、pH8、0.1
mM EDTA）2mlに入れ、Centricon 100の上部貯蔵槽にお
いて混合した。製造者のプロトコルでは、続いて固定角
ローター内における1000×Ｇでの25分間の遠心が用いら
れ、PCR生成物を40μｌ濃縮物として回収した。
Centricon 100濃縮物10μｌに対し、上述の第1PCR反
応で行なった条件と同じ条件を用い、プライマーＡおよ
びＤ（図１）を用いる組換えPCR反応を行なった。断片A
Bのポジ鎖およびCDのネガ鎖はそれらの３′末端に相補
的DX48 CDRH1配列を含んでおり、第1PCRサイクルにおい
て、アニールし、互いのプライマーとして作用する。重
複の伸長は、移植DX48 CDRH1を含有する組換え生成物断
片ADを生成し、これはPCRの次の回でプライマーＡおよ
びＤにより増幅される（図１および２）。断片ABおよび
CDの残りの鎖（それらの５′末端で相補的）は互いに開
始させることはできないが、プライマーＡおよびＤのテ
ンプレートの役割を果たすことができる。これらは、反
応中にプライマーＢおよびＣが欠けているために指数的
な様式で増殖することはないが、より多くの第1PCR生成
物を生成する。
応で行なった条件と同じ条件を用い、プライマーＡおよ
びＤ（図１）を用いる組換えPCR反応を行なった。断片A
Bのポジ鎖およびCDのネガ鎖はそれらの３′末端に相補
的DX48 CDRH1配列を含んでおり、第1PCRサイクルにおい
て、アニールし、互いのプライマーとして作用する。重
複の伸長は、移植DX48 CDRH1を含有する組換え生成物断
片ADを生成し、これはPCRの次の回でプライマーＡおよ
びＤにより増幅される（図１および２）。断片ABおよび
CDの残りの鎖（それらの５′末端で相補的）は互いに開
始させることはできないが、プライマーＡおよびＤのテ
ンプレートの役割を果たすことができる。これらは、反
応中にプライマーＢおよびＣが欠けているために指数的
な様式で増殖することはないが、より多くの第1PCR生成
物を生成する。
ゲル精製PCR生成物を、89mMトリス−ホウ酸塩/2mM E
DTA中の0.8％タイプII:メディウムEEOアガロース（Sigm
a）を含有し、エチジウムブロマイドで染色することに
より可視化されたアガロースゲルで分析した。断片の予
想されたサイズは以下の通りであった:AB、207bp;CD、1
285bp;AD、1471bp。反応ADにおいて他の小さなバンドも
みられたものの、各々の場合に観察された顕著なバンド
は予想されたサイズであった。
DTA中の0.8％タイプII:メディウムEEOアガロース（Sigm
a）を含有し、エチジウムブロマイドで染色することに
より可視化されたアガロースゲルで分析した。断片の予
想されたサイズは以下の通りであった:AB、207bp;CD、1
285bp;AD、1471bp。反応ADにおいて他の小さなバンドも
みられたものの、各々の場合に観察された顕著なバンド
は予想されたサイズであった。
（ｂ）組換えPCR生成物のクローニングおよび配列決定
断片AD（配列番号８）をゲル溶出させ、Hind III（BR
L）で消化してpUC−18（BRL）のHind III部位にクロー
ニングした。組換え分子を含有するクローンのヌクレオ
チド配列を、Sequenase Kit（USB）のプロトコルに従っ
て、プラスミド・プライミング（plasmid priming）、
続くジデオキシ連鎖停止法（dideoxy chain−terminati
on method:Sangerら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、7
4、5463−5467（1977））によって決定した。全1463nt
インサートは適正な配列であり、２組のPCR反応に起因
する取り込みの誤りはないことが見出された。
断片AD（配列番号８）をゲル溶出させ、Hind III（BR
L）で消化してpUC−18（BRL）のHind III部位にクロー
ニングした。組換え分子を含有するクローンのヌクレオ
チド配列を、Sequenase Kit（USB）のプロトコルに従っ
て、プラスミド・プライミング（plasmid priming）、
続くジデオキシ連鎖停止法（dideoxy chain−terminati
on method:Sangerら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、7
4、5463−5467（1977））によって決定した。全1463nt
インサートは適正な配列であり、２組のPCR反応に起因
する取り込みの誤りはないことが見出された。
例 ２
この目的は、YFC51.1.1ラット抗ヒト−CD18 Hおよび
Ｌ鎖のヒト化であった。両鎖の可変部領域のDNAは配列
が決定され、以下に示されている。
Ｌ鎖のヒト化であった。両鎖の可変部領域のDNAは配列
が決定され、以下に示されている。
配列番号９および10−Ｈ鎖、および
配列番号11および12−Ｌ鎖
上述の工程（２）に記載される選択手順を用い、NEWM
H鎖およびREI L鎖のヒト可変部ドメイン・フレームワ
ーク（Kabatら、“Sequences of ptoteins of immunolo
gical interest"U.S.Dept.of Health and Human Servic
es,U.S.Government Printing Office（1987））をヒト
化方法のために選択した。
H鎖およびREI L鎖のヒト可変部ドメイン・フレームワ
ーク（Kabatら、“Sequences of ptoteins of immunolo
gical interest"U.S.Dept.of Health and Human Servic
es,U.S.Government Printing Office（1987））をヒト
化方法のために選択した。
ヒト化ＨおよびＬ鎖を以下の通りに構築した。
（ｉ）Ｌ鎖
Ｌ鎖オリゴヌクレオチド・プライマー
AL:配列番号13
BL:配列番号14
CL:配列番号15
DL:配列番号16
EL:配列番号17
FL:配列番号18
GL:配列番号19
HL:配列番号20
PCR反応は、温度サイクル（94℃１分間、50℃２分
間、および72℃３分間）20回とそれに続く72℃での最後
の10分間の工程を用いて、プログラム可能な加熱ブロッ
ク（Hybaid）内で行なった。製造者よって勧められる通
り、各プライマー１μｇ、特定の量のテンプレート、お
よびTaqポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus）2.5ユニッ
トを反応緩衝液で最終容積100μｌとして用いた。
間、および72℃３分間）20回とそれに続く72℃での最後
の10分間の工程を用いて、プログラム可能な加熱ブロッ
ク（Hybaid）内で行なった。製造者よって勧められる通
り、各プライマー１μｇ、特定の量のテンプレート、お
よびTaqポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus）2.5ユニッ
トを反応緩衝液で最終容積100μｌとして用いた。
PCRの最初のテンプレートは、CAMPATH−1H L鎖（RE1
上のヒト化CAMPATH−1;Page and Sydenham,Biotechnolo
gy ９,64−68,（1991））であった。４通りの初期PCR反
応を、各反応当たりテンプレート10ngを用い、各々プラ
イマー対ALとBL、CLとDL、ELとFLおよびGLとHLを用いて
行なった。これらのPCR反応の生成物、断片ABL、CDL、E
FLおよびGHLを、製造者によって勧められるプロトコル
に従って、Perp−Ａ−Gene（Bio−Rad）を用いて精製し
た。断片ABLとCDLおよびEFLとGHLを各精製生成物の1/4
を用いて結合させ、それぞれプライマーAL、とDLおよび
ELとHLを用いて組換えPCR反応を行なった。これらの反
応の生成物、断片ADLおよびEHL、を上述の通り精製し、
プライマーALおよびHLを用いる組換えPCR反応におい
て、各々の1/4を結合させた。ヒト化Ｌ鎖組換えPCR最終
生成物、AHLを、Croweら（1991）の方法に従い、プライ
マーALおよびHL中のHind III部位を利用してpUC−18（B
RL）のHind III部位にクローニングした。単離プラスミ
ドをジデオキシ連鎖停止法によって配列決定し、適正な
配列のクローンを選択した。
上のヒト化CAMPATH−1;Page and Sydenham,Biotechnolo
gy ９,64−68,（1991））であった。４通りの初期PCR反
応を、各反応当たりテンプレート10ngを用い、各々プラ
イマー対ALとBL、CLとDL、ELとFLおよびGLとHLを用いて
行なった。これらのPCR反応の生成物、断片ABL、CDL、E
FLおよびGHLを、製造者によって勧められるプロトコル
に従って、Perp−Ａ−Gene（Bio−Rad）を用いて精製し
た。断片ABLとCDLおよびEFLとGHLを各精製生成物の1/4
を用いて結合させ、それぞれプライマーAL、とDLおよび
ELとHLを用いて組換えPCR反応を行なった。これらの反
応の生成物、断片ADLおよびEHL、を上述の通り精製し、
プライマーALおよびHLを用いる組換えPCR反応におい
て、各々の1/4を結合させた。ヒト化Ｌ鎖組換えPCR最終
生成物、AHLを、Croweら（1991）の方法に従い、プライ
マーALおよびHL中のHind III部位を利用してpUC−18（B
RL）のHind III部位にクローニングした。単離プラスミ
ドをジデオキシ連鎖停止法によって配列決定し、適正な
配列のクローンを選択した。
（ii）Ｈ鎖
Ｈ鎖オリゴヌクレオチド・プライマー
AH:配列番号21
BH:配列番号22
CH:配列番号23
DH:配列番号24
EH:配列番号25
FH:配列番号26
GH:配列番号27
HH:配列番号28
PCRの最初のテンプレートはCAMPATH−1H H鎖であっ
た。段落（ｉ）に記載の組換えPCR法ではあるがオリゴ
ヌクレオチドプライマーAHないしHHを用いる方法を利用
して、齧歯類動物のCDRsをテンプレート上にグラフトし
た。最終PCR、すなわち断片ADHおよびEHHとプライマーA
HおよびHH、では高い収率で生成物を得ることができな
いので、（断片ADHおよびEFHから）断片AFHを生成さ
せ、断片EHHと共に、プライマーAHおよびHHを用いるPCR
に用いた。オリゴヌクレオチドAHおよびHHは、それぞれ
Hind IIIおよびEcoR Iを用いて、ヒト化可変部領域の初
期クローニングが容易になるように設計し、かつ、次の
可変部領域のクローニングを容易にするために、選択さ
れた適切な定常部領域と共にSpe I部位をオリゴヌクレ
オチドGHのNEWMフレームワーク４（FR4）に導入した。S
pe I部位は、ヒト化Ｈ鎖テンプレートの位置109（前出
のKabatらによるナンバリング）のロイシン残基を変え
ないように選択した。６つのヒトＨ鎖Ｊ−ミニジーン
（Ｊ−minigene）のうちの４つはこの位置にロイシンを
有している（前出のKabatら）。したがって、加工したS
pe I部位の使用は、一般に適用可能である。
た。段落（ｉ）に記載の組換えPCR法ではあるがオリゴ
ヌクレオチドプライマーAHないしHHを用いる方法を利用
して、齧歯類動物のCDRsをテンプレート上にグラフトし
た。最終PCR、すなわち断片ADHおよびEHHとプライマーA
HおよびHH、では高い収率で生成物を得ることができな
いので、（断片ADHおよびEFHから）断片AFHを生成さ
せ、断片EHHと共に、プライマーAHおよびHHを用いるPCR
に用いた。オリゴヌクレオチドAHおよびHHは、それぞれ
Hind IIIおよびEcoR Iを用いて、ヒト化可変部領域の初
期クローニングが容易になるように設計し、かつ、次の
可変部領域のクローニングを容易にするために、選択さ
れた適切な定常部領域と共にSpe I部位をオリゴヌクレ
オチドGHのNEWMフレームワーク４（FR4）に導入した。S
pe I部位は、ヒト化Ｈ鎖テンプレートの位置109（前出
のKabatらによるナンバリング）のロイシン残基を変え
ないように選択した。６つのヒトＨ鎖Ｊ−ミニジーン
（Ｊ−minigene）のうちの４つはこの位置にロイシンを
有している（前出のKabatら）。したがって、加工したS
pe I部位の使用は、一般に適用可能である。
ヒト化Ｈ鎖可変部領域組換えPCR生成物を、Hind III/
EcoR I切断pUC−18（BRL）にクローニングし、適性配列
を有する単離プラスミドを選択した。CAMPATH−1H H鎖
のFR4およびγ１定常部領域を、オリゴヌクレオチド・
プライマーXH（配列番号29）およびYH（配列番号30）を
用いてpUC−18にPCRクローニングした。プライマーXHは
Spe IおよびHind III部位を有し、YHはEcoR I部位を有
する。Hind IIIおよびEcoR I部位をpUC−18へのPCR生成
物のクローニングに用い、適性配列を有する単離プラス
ミドを選択した。続いて、加工FR4 Spe I部位を用い
て、ヒト化可変部領域およびγ１定常部領域クローンか
ら完全Ｈ鎖を再構築した。
EcoR I切断pUC−18（BRL）にクローニングし、適性配列
を有する単離プラスミドを選択した。CAMPATH−1H H鎖
のFR4およびγ１定常部領域を、オリゴヌクレオチド・
プライマーXH（配列番号29）およびYH（配列番号30）を
用いてpUC−18にPCRクローニングした。プライマーXHは
Spe IおよびHind III部位を有し、YHはEcoR I部位を有
する。Hind IIIおよびEcoR I部位をpUC−18へのPCR生成
物のクローニングに用い、適性配列を有する単離プラス
ミドを選択した。続いて、加工FR4 Spe I部位を用い
て、ヒト化可変部領域およびγ１定常部領域クローンか
ら完全Ｈ鎖を再構築した。
配列表
1.配列番号１の情報
ｉ）配列の特色：
（Ａ）配列の長さ:1457
（Ｂ）配列の型 ：核酸
（Ｃ）鎖の数 ：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
ii）配列の種類:cDNA
ix）配列の特徴
（Ａ）特徴を表わす記号:CDS［？コーディング配
列］ （Ｂ）存在位置:1...1457 （Ｄ）他の情報:/生成物＝“可変部領域Ｈ鎖” 標準名＝“HUMDXCH.23" ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:156...182 （Ｄ）他の情報:/機能＝CAMPATH 1H FRH1 ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:183...197 （Ｄ）他の情報:/機能＝CAMPATH 1H CDRH1 ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:198...224 （Ｄ）他の情報:/機能＝CAMPATH 1H FRH2 xi）配列の記載：配列番号１ 2.配列番号２の情報 ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:24塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ii）配列の種類:ssDNA iii）ハイポセティカル配列:No iv）アンチセンス:No xi）配列の記載：配列番号２ 3.配列番号３の情報 ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:45塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ii）配列の種類:ssDNA iii）ハイポセティカル配列:No iv）アンチセンス:Yes xi）配列の記載：配列番号３ 4.配列番号４の情報 ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:45塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ii）配列の種類:ssDNA iii）ハイポセティカル配列:No iv）アンチセンス:No xi）配列の記載：配列番号４ 5.配列番号５の情報 ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:27塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ii）配列の種類:ssDNA iii）ハイポセティカル配列:No iv）アンチセンス:Yes xi）配列の記載：配列番号５ 6.配列番号６の情報 ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:207塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ii）配列の種類:dsDNA xi）配列の記載：配列番号６ 7.配列番号７の情報 ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:1285塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ii）配列の種類:dsDNA xi）配列の記載：配列番号７ 8.配列番号８の情報 ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:1471 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ii）配列の種類:dsDNA ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:CDS （Ｂ）存在位置:1...1471 （Ｄ）他の情報:/生成物＝“可変部領域Ｈ鎖” ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:160...186 （Ｄ）他の情報:/機能＝CAMPATH 1H FRH1 ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:175...177 （Ｄ）他の情報：点変異 ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:184...186 （Ｄ）他の情報：点変異 ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:187...207 （Ｄ）他の情報:/機能−DK48 CDRH1 ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:208...234 （Ｄ）他の情報:/機能 CAMPATH 1H FRH2 xi）配列の記載：配列番号８ （９）配列番号９の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:417塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物名:Rattus rattus （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:CDS （Ｂ）存在位置:1...417 （Ｄ）他の情報:/生成物＝“シグナル配列を有する
可変部領域Ｈ鎖” ／標準名＝“YFC51.1.1" （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc signal （Ｂ）存在位置:1...57 （Ｄ）他の情報:/機能＝“シグナル配列” （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:148...162 （Ｄ）他の情報:/機能＝“CDR1" （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:205...255 （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:352...384 （xi）配列の記載：配列番号９ （10）配列番号10の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:139アミノ酸 （Ｂ）配列の型 ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：蛋白質 （xi）配列の記載：配列番号10 （11）配列番号11の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:375塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物名:Rattus rattus （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:CDS （Ｂ）存在位置:1...375 （Ｄ）他の情報:/生成物＝“可変部領域Ｌ鎖” ／標準名＝“YFC51.1.1" （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc signal （Ｂ）存在位置:1...60 （Ｄ）他の情報:/機能＝“シグナル配列” （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:130...162 （Ｄ）他の情報:/機能＝“CDR1" （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:208...228 （Ｄ）他の情報:/機能＝“CDR2" （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:325...351 （Ｄ）他の情報:/機能＝“CDR3" （xi）配列の記載：配列番号11 （12）配列番号12の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:125アミノ酸 （Ｂ）配列の型 ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：蛋白質 （xi）配列の記載：配列番号12 （ii）配列の種類:cDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （vi）起源： （Ａ）生物名:Rattus rattus （xi）配列の記載：配列番号17 （13）配列番号13の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:30塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列の記載：配列番号13 （14）配列番号14の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:43塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:Yes （xi）配列の記載：配列番号14 （15）配列番号15の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:43塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列の記載：配列番号15 （16）配列番号16の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:41塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:Yes （xi）配列の記載：配列番号16 （17）配列番号17の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:41塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列の記載：配列番号17 （18）配列番号18の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:47塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:Yes （xi）配列の記載：配列番号18 （19）配列番号19の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:47塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列の記載：配列番号19 （20）配列番号20の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:30塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:Yes （xi）配列の記載：配列番号20 （21）配列番号21の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:31塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列の記載：配列番号21 （22）配列番号22の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:36塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:Yes （xi）配列の記載：配列番号22 （23）配列番号23の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:36塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列の記載：配列番号23 （24）配列番号24の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:54塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:Yes （xi）配列の記載：配列番号24 （25）配列番号25の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:54塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列の記載：配列番号25 （26）配列番号26の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:45塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:Yes （xi）配列の記載：配列番号26 （27）配列番号27の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:54塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列の記載：配列番号27 （28）配列番号28の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:36塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:Yes （xi）配列の記載：配列番号28 （29）配列番号29の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:48塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列の記載：配列番号29 （30）配列番号30の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:33塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:Yes （xi）配列の記載：配列番号30
列］ （Ｂ）存在位置:1...1457 （Ｄ）他の情報:/生成物＝“可変部領域Ｈ鎖” 標準名＝“HUMDXCH.23" ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:156...182 （Ｄ）他の情報:/機能＝CAMPATH 1H FRH1 ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:183...197 （Ｄ）他の情報:/機能＝CAMPATH 1H CDRH1 ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:198...224 （Ｄ）他の情報:/機能＝CAMPATH 1H FRH2 xi）配列の記載：配列番号１ 2.配列番号２の情報 ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:24塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ii）配列の種類:ssDNA iii）ハイポセティカル配列:No iv）アンチセンス:No xi）配列の記載：配列番号２ 3.配列番号３の情報 ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:45塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ii）配列の種類:ssDNA iii）ハイポセティカル配列:No iv）アンチセンス:Yes xi）配列の記載：配列番号３ 4.配列番号４の情報 ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:45塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ii）配列の種類:ssDNA iii）ハイポセティカル配列:No iv）アンチセンス:No xi）配列の記載：配列番号４ 5.配列番号５の情報 ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:27塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ii）配列の種類:ssDNA iii）ハイポセティカル配列:No iv）アンチセンス:Yes xi）配列の記載：配列番号５ 6.配列番号６の情報 ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:207塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ii）配列の種類:dsDNA xi）配列の記載：配列番号６ 7.配列番号７の情報 ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:1285塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ii）配列の種類:dsDNA xi）配列の記載：配列番号７ 8.配列番号８の情報 ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:1471 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ii）配列の種類:dsDNA ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:CDS （Ｂ）存在位置:1...1471 （Ｄ）他の情報:/生成物＝“可変部領域Ｈ鎖” ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:160...186 （Ｄ）他の情報:/機能＝CAMPATH 1H FRH1 ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:175...177 （Ｄ）他の情報：点変異 ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:184...186 （Ｄ）他の情報：点変異 ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:187...207 （Ｄ）他の情報:/機能−DK48 CDRH1 ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:208...234 （Ｄ）他の情報:/機能 CAMPATH 1H FRH2 xi）配列の記載：配列番号８ （９）配列番号９の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:417塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物名:Rattus rattus （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:CDS （Ｂ）存在位置:1...417 （Ｄ）他の情報:/生成物＝“シグナル配列を有する
可変部領域Ｈ鎖” ／標準名＝“YFC51.1.1" （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc signal （Ｂ）存在位置:1...57 （Ｄ）他の情報:/機能＝“シグナル配列” （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:148...162 （Ｄ）他の情報:/機能＝“CDR1" （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:205...255 （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:352...384 （xi）配列の記載：配列番号９ （10）配列番号10の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:139アミノ酸 （Ｂ）配列の型 ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：蛋白質 （xi）配列の記載：配列番号10 （11）配列番号11の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:375塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物名:Rattus rattus （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:CDS （Ｂ）存在位置:1...375 （Ｄ）他の情報:/生成物＝“可変部領域Ｌ鎖” ／標準名＝“YFC51.1.1" （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc signal （Ｂ）存在位置:1...60 （Ｄ）他の情報:/機能＝“シグナル配列” （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:130...162 （Ｄ）他の情報:/機能＝“CDR1" （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:208...228 （Ｄ）他の情報:/機能＝“CDR2" （ix）配列の特徴 （Ａ）特徴を表わす記号:Misc feature （Ｂ）存在位置:325...351 （Ｄ）他の情報:/機能＝“CDR3" （xi）配列の記載：配列番号11 （12）配列番号12の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:125アミノ酸 （Ｂ）配列の型 ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：蛋白質 （xi）配列の記載：配列番号12 （ii）配列の種類:cDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （vi）起源： （Ａ）生物名:Rattus rattus （xi）配列の記載：配列番号17 （13）配列番号13の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:30塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列の記載：配列番号13 （14）配列番号14の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:43塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:Yes （xi）配列の記載：配列番号14 （15）配列番号15の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:43塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列の記載：配列番号15 （16）配列番号16の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:41塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:Yes （xi）配列の記載：配列番号16 （17）配列番号17の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:41塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列の記載：配列番号17 （18）配列番号18の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:47塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:Yes （xi）配列の記載：配列番号18 （19）配列番号19の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:47塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列の記載：配列番号19 （20）配列番号20の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:30塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:Yes （xi）配列の記載：配列番号20 （21）配列番号21の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:31塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列の記載：配列番号21 （22）配列番号22の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:36塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:Yes （xi）配列の記載：配列番号22 （23）配列番号23の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:36塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列の記載：配列番号23 （24）配列番号24の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:54塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:Yes （xi）配列の記載：配列番号24 （25）配列番号25の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:54塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列の記載：配列番号25 （26）配列番号26の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:45塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:Yes （xi）配列の記載：配列番号26 （27）配列番号27の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:54塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列の記載：配列番号27 （28）配列番号28の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:36塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:Yes （xi）配列の記載：配列番号28 （29）配列番号29の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:48塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:No （xi）配列の記載：配列番号29 （30）配列番号30の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）配列の長さ:33塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:ssDNA （iii）ハイポセティカル配列:No （iv）アンチセンス:Yes （xi）配列の記載：配列番号30
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ルウイス、アラン・ピーター
イギリス国、ビーアール３・３ビーエ
ス、ケント、ベッケンハム、ラングレ
イ・コート（番地なし)
(56)参考文献 欧州特許出願公開125023（ＥＰ，Ａ
１)
欧州特許出願公開239400（ＥＰ，Ａ
１)
国際公開90／007861（ＷＯ，Ａ１)
Ｒ．Ｍ．ＨＯＲＴＯＮ，Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｇｅｎｅｓ
ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏ
ｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙ
ｍｅｓ：ｇｅｎｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ
ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉ
ｏｎ，Ｇｅｎｅ（1989），ＮＬ，Ｖｏ
ｌ．77，Ｎｏ．１，ｐ．61−68
Ｒ．Ｍ．ＨＯＲＴＯＮ，Ｇｅｎｅ Ｓ
ｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ Ｏｖｅｒｌａｐ
Ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ：Ｔａｉｌｏｒ−
Ｍａｄｅ Ｇｅｎｅｓ Ｕｓｉｎｇ ｔ
ｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉ
ｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ（1990−Ｍａｙ），米国,
Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．５，ｐ．528−535
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/09 - 15/90
C12P 21/08
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (20)
- 【請求項１】抗体鎖もしくはそれらの断片をコードし、
この抗体鎖の断片の可変部領域の相補性決定領域（CDR
s）の少なくとも１つが第１の哺乳動物抗体に由来し、
かつ可変領域のフレームワークが第２の異なる哺乳動物
抗体に由来するものである、下記式で表わされる二本鎖
もしくは一本鎖DNAの製造方法であって、 ５′F1−Ｍ−F2 ３′ ここで、Ｍは第１の抗体のCDRをコードするDNAを含み、
かつF1およびF2はそれぞれＭの側方に位置する5'および
3'配列をコードし、 （ｉ） 下記式で表わされる一本鎖もしくは二本鎖DNA
テンプレートを調製し、 ５′f1−Ｈ−f2 ３′ ここで、ＨはＭとは異なる特異性のCDRをコードするDNA
を含み、かつf1およびf2は各々F1およびF2に実質的に相
同であり、 （ii） DNAオリゴヌクレオチドプライマーＡ、Ｂ、Ｃ
およびＤを得、ここで、 Ａは、F1の5'末端に対応する5'末端を有し、かつ配列F1
の対応長さに等しい配列a1を含み、 Ｈに向かって5'から3'の方向に指向し； Ｂは、配列 ５′b1−b2 ３′ からなり、ここで、 b1はＭの対応長さに相補的であり、かつＭの5'末端に相
補的な3'末端を有する配列を含み、 b2はF1における対応長さの配列に相補的であり、かつF1
の3'末端に相補的なヌクレオチドから始まる5'末端を有
し； Ｃは、配列 ５′c1−c2 ３′ からなり、ここで、 c1は、Ｍの対応長さに等しく、かつＭの3'末端に対応す
る3'末端を有する配列を含み、 c2は、F2における対応長さの配列に等しく、かつF2の5'
末端に対応するヌクレオチドから始まる5'末端を有し； Ｄは、F2の3'末端に相補的な5'末端を有し、かつF2の対
応長さに相補的である配列d1を含み、および Ｈに向かって5'から3'の方向に指向し； 並びに、b1およびc1は、ポリメラーゼ・チェイン・リア
クション（PCR）を実施可能な条件下において、それら
の5'末端を互いにアニールし得るに十分な長さで重複し
ており、（iii）所望の順番で、プライマー対Ａ、Ｂお
よびＣ、Ｄを用いて、上記（ｉ）において調製されるテ
ンプレートに対するPCR反応を行ない、および （iv） 上記（iii）において得られる生成物を混合
し、プライマーＡおよびＤを用いてPCR反応を行なう、 ことを包含する方法。 - 【請求項２】F1およびF2が、各々少なくとも１種のヒト
抗体フレームワーク領域、および任意に、さらにCDRsを
コードする請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】Ｈが、前記第１抗体のCDRをコードする請
求の範囲第１項または第２項記載の方法。 - 【請求項４】Ｍが、非ヒトCDR領域をコードする請求の
範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】Ｍが、ネズミ科動物または齧歯類動物のCD
Rをコードする請求の範囲第４項記載の方法。 - 【請求項６】プライマーＡおよびＢが、それらの5'末端
の10ヌクレオチド内に少なくとも１種の制限エンドヌク
レアーゼ認識部位を含む請求の範囲第１項ないし第５項
のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】プライマーＢおよびＣにおいて、b1および
c1が、その長さにおいて、ヌクレオチドの数が同じであ
る請求の範囲第１項ないし第６項のいずれか１項に記載
の方法。 - 【請求項８】プライマーＡ、Ｂ、ＣおよびＤが、それぞ
れ15ないし30ヌクレオチドの長さである請求の範囲第１
項ないし第７項のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】プライマーＡ、Ｂ、ＣおよびＤ各々のa1、
b1、c1およびd1が、それぞれ15ないし30ヌクレオチドの
長さである請求の範囲第８項記載の方法。 - 【請求項１０】ヒト抗体ＬまたはＨ鎖のCDR領域の少な
くとも１つが請求の範囲第１項ないし第９項に記載の方
法によって置き換えられるヒト化抗体の製造方法。 - 【請求項１１】３つ全てのCDR領域が置き換えられる請
求の範囲第10項記載の方法。 - 【請求項１２】得られたDNAの発現ベクターへの導入を
さらに含む請求の範囲第１項ないし第11項記載の方法。 - 【請求項１３】前記発現ベクターの宿主細胞への導入を
さらに含む請求の範囲第12項記載の方法。 - 【請求項１４】前記宿主細胞がチャイニーズハムスター
卵巣（CHO）細胞またはミエローマ細胞である請求の範
囲第13項記載の方法。 - 【請求項１５】得られたDNAの発現および発現した生成
物の回収をさらに含む請求の範囲第13項または第14項記
載の方法。 - 【請求項１６】下記配列からなる、長さが30ないし110
ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド。 ５′o1−o2 ３′ （ここで、o1は非ヒト起源のCDR領域の少なくとも15ヌ
クレオチドの配列を含み、かつo2はヒト起源のフレーム
ワーク領域の少なくとも15ヌクレオチドを含む） - 【請求項１７】抗体鎖もしくはそれらの断片をコード
し、この抗体鎖の可変部領域の３つの相補性決定領域
（CDRs）が第１の哺乳動物抗体に由来し、かつ可変部ド
メインの４つのフレームワーク領域が第２の異なる哺乳
動物抗体に由来するものである、下記式で表わされる二
本鎖もしくは一本鎖DNAの製造方法であって、 ５′F1−M1−F2−M2−F3−M3−F4 ３′ ここで、M1、M2およびM3は第１の抗体のCDRをコードす
るDNAを含み、かつF1、F2、F3およびF4はCDRs M1、M2
およびM3の側方に位置するフレームワーク配列を含み、 （ｉ） 下記式で表わされる一本鎖もしくは二本鎖DNA
テンプレートを調製し、 ５′f1−H1−f2−H2−f3−H3−f4 ３′ ここで、H1、H2およびH3はM1、M2およびM3とは異なる特
異性のCDRsをコードするDNAを含み、かつ f1、f2、f3およびf4は各々F1、F2、F3およびF4と実質的
に相同であり、 （ii） DNAオリゴヌクレオチドプライマーＡ、Ｂ、
Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨを得、ここで、 Ａは、F1の5'末端に対応する5'末端を有し、かつ配列F1
の対応長さに等しい配列a1を含み、 H1に向かって5'から3'の方向に指向し； Ｂは、配列 ５′b1−b2 ３′ からなり、ここで、 b1はM1の対応長さに相補的であり、かつM1の5'末端に相
補的な3'末端を有する配列を含み、 b2はF1における対応長さの配列に相補的であり、かつF1
の3'末端に相補的なヌクレオチドから始まる5'末端を有
し； Ｃは、配列 ５′c1−c2 ３′ からなり、ここで、 c1は、M1の対応長さに等しく、かつM1の3'末端に対応す
る3'末端を有する配列を含み、 c2は、F2における対応長さの配列に等しく、かつF2の5'
末端に対応するヌクレオチドから始まる5'末端を有し； Ｄは、配列 ５′d1−d2 ３′ からなり、ここで、 d1は、M2の対応長さに相補的であり、かつM2の5'末端に
相補的な3'末端を有する配列を含み、 d2は、F2における対応長さの配列に相補的であり、かつ
F2の3'末端に相補的なヌクレオチドから始まる5'末端を
有し； Ｅは、配列 ５′e1−e2 ３′ からなり、ここで、 e1は、M2の対応長さに等しく、かつM2の3'末端に対応す
る3'末端を有する配列を含み、 e2は、F3における対応長さの配列に等しく、かつF3の5'
末端に対応するヌクレオチドから始まる5'末端を有し； Ｆは、配列 ５′f1−f2 ３′ からなり、ここで、 f1は、M3の対応長さに相補的であり、かつM3の5'末端に
相補的な3'末端を有する配列を含み、 f2は、F3における対応長さの配列に相補的であり、かつ
F3の3'末端に相補的なヌクレオチドから始まる5'末端を
有し； Ｇは、配列 ５′g1−g2 ３′ からなり、ここで、 g1は、M3の対応長さに等しく、かつM3の3'末端に対応す
る3'末端を有する配列を含み、 g2は、F4における対応長さの配列に等しく、かつF4の5'
末端に対応するヌクレオチドから始まる5'末端を有し； Ｈは、F4の3'末端に相補的な5'末端を有し、かつF4の対
応長さに相補的である配列h1を含み、および H3に向かって5'から3'の方向に指向し； 並びに、対b1およびc1、d1およびe1、およびf1およびg1
は、PCRを実施可能な条件下において、それらの5'末端
を互いにアニールし得るに十分な長さで重複しており、
（iii）所望の順番で、プライマー対Ａ、B;C、D;E、Ｆ
およびＧ、Ｈを用いて、上記（ｉ）において調製される
テンプレートに対するPCR反応を行ない、DNA断片AB、C
D、EFおよびGHを得、 （iv） 上記（iii）において得られる断片を結合さ
せ、所望のDNAを得る、ことを包含する方法。 - 【請求項１８】F4が、CDR M3の側方に位置するフレー
ムワーク配列および抗体鎖の接触領域の全てもしくは一
部をコードするDNAを含む請求の範囲第17項記載の方
法。 - 【請求項１９】前記工程（iv）が、 （iv a） 断片ABおよびCDをプライマーＡおよびＤと混
合し、PCRを行なってDNA断片ADを得； （iv b） 上記工程（iv a）の前、その間またはそれに
続いて、断片EFおよびGHをプライマーＥおよびＨと混合
し、PCRを行なってDNA断片EHを得、並びに （iv c） 断片ADおよびEHをプライマーＡおよびＨと混
合し、所望のDNAを得る、 ことにより行なわれる請求の範囲第17項または第18項記
載の方法。 - 【請求項２０】工程（iv）が （iv a） 断片CDおよびEFをプライマーＣおよびＦと混
合し、PCRを行なってDNA断片CFを得、並びに （iv b−１）断片ABおよびCFをプライマーＡおよびＦと
混合し、PCRを行なってDNA断片AFを得、かつ （iv c−１）断片AFおよびGHをプライマーＡおよびＨと
混合し、所望のDNAを得るか、あるいは （iv b−２）断片CFおよびGHをプライマーＣおよびＨと
混合し、PCRを行なってDNA断片CHを得、かつ （iv c−２）断片ABおよびCHをプライマーＡおよびＨと
混合し、所望のDNAを得る、 ことにより行なわれる請求の範囲第17項または第18項記
載の方法。
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