JP3495397B2 - エンドセリン変換酵素阻害剤 - Google Patents
エンドセリン変換酵素阻害剤Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はソーヤサポニン類または
その薬理的に許容しうる塩のエンドセリン変換酵素阻害
剤としての用途、およびこのエンドセリン変換酵素阻害
剤を有効成分とする高血圧などの各種疾患の治療薬に関
するものである。 【０００２】 【従来の技術】エンドセリン（以下ＥＴと略す）は１９
８８年、柳沢らによって発見された内皮細胞由来の血管
平滑筋収縮因子で２１アミノ酸残基からなるペプチドで
ある（Nature, ３３２，４１１−４１５（１９８８）参
照）。ＥＴは強い平滑筋収縮作用、細胞増殖作用を有
し、血管など各種臓器で生産され、生理的に重要な役割
を果していると考えられている。またＥＴはその作用か
ら高血圧、クモ膜下出血後の脳血管れん縮、心筋梗塞、
動脈硬化、腎不全、心不全、喘息等の疾患の成立に関わ
っていると考えられている。また、レイノー患者、パー
ジャー病患者、高安病患者、川崎病患者、シスプラチン
投与時の腎障害患者の血中などにおいてＥＴ濃度が正常
人に比して有為に高いことが知られている。 【０００３】ＥＴはその生合成において、活性の低い前
駆体であるビッグエンドセリン（以下ｂＥＴと略す）か
ら特異的プロテアーゼであるエンドセリン変換酵素（以
下ＥＣＥと略す）により生成される。そしてこの変換は
生体内におけるＥＴの産生に必須であり、従ってＥＣＥ
を阻害しＥＴの生合成を抑える事は上記の各種疾患の治
療及び予防に有効であると考えられ、特異的なＥＣＥ阻
害剤の解明が求められている。これまでにＥＣＥを阻害
する化合物としてはストレプトマイセス・タナシエンシ
ス等の放線菌によって生産されるホスホラミドンが知ら
れていた。しかしながらホスホラミドンは多くの金属プ
ロテアーゼを阻害しＥＣＥに特異的な阻害剤ではない。
実際ホスホラミドンはＥＣＥよりもアンジオテンシン変
換酵素、ニュートラルエンドペプチダーゼ、コラゲナー
ゼ、サーモリシンをより強く阻害し、エンドセリン変換
酵素阻害剤としての望ましい性質を有していない。そし
てＥＣＥに特異的な阻害剤の存在は知られていなかっ
た。 【０００４】 【本発明が解決しようとする課題】かかる状況から、Ｅ
ＣＥのみを特異的に阻害する物質の解明が求められると
ころであり、そしてこのＥＣＥのみを特異的に阻害する
物質の解明によって、ＥＴにより起因する、または起因
すると考えられる各種疾患、例えば高血圧、くも膜下出
血後の脳血管れん縮、心筋梗塞、動脈硬化、腎不全、心
不全、喘息等の治療薬のあらたな開発の可能性が開かれ
ることになる。すなわち本発明は、ＥＣＥのみを特異的
に阻害する物質の解明と、このＥＣＥの特異的阻害物質
に基づいた上記各種疾患の治療薬の開発とを課題とする
ものである。 【０００５】 【課題を解決するための手段】本発明者らはＥＣＥに特
異的な阻害剤を見いだすべく種々の化合物を検索した結
果ソーヤサポニンがＥＣＥを特異的に阻害することを見
いだして本発明を完成したのである。すなわち本発明に
よればソーヤサポニンが著しいＥＣＥ阻害効果を有する
ことおよびこの阻害効果はＥＣＥに対して特異的である
ことから、このソーヤサポニンがＥＣＥ阻害剤として有
用であることが分かった。したがって本発明は、ソーヤ
サポニン類またはその薬理学的に許容し得る塩からなる
エンドセリン変換酵素阻害剤に関する。 【０００６】また本発明は、ソーヤサポニン類またはそ
の薬理学的に許容し得る塩からなるエンドセリン変換酵
素阻害剤を有効成分とする高血圧、くも膜下出血後の脳
血管れん縮、心筋梗塞、動脈硬化、腎不全、心不全、喘
息、レイノー患者、パージャー病患者、高安病患者、川
崎病患者、シスプラチン投与時の腎障害患者の治療薬に
も関する。本発明でいうソーヤサポニンとは、大豆由来
の下記の基本骨格 【化１】 を持つ化合物を指すが、これらを化学的に修飾、または
改変して得られるこれらの誘導体をも含むものとする。 【０００７】さらにソーヤサポニン類としてはは同様の
基本骨格及びエンドセリン阻害活性を有していればその
由来には限定されることなく他の植物由来のものでもよ
い。また合成手段でえられるもの、微生物などによって
産生されたもの等も同様の基本骨格及びエンドセリン阻
害活性を有する限りこのソーヤサポニン類の範囲に含ま
れるものとする。ソーヤサポニン類の例としてはソーヤ
サポニンのアグリコンとして知られるソーヤサポゲノー
ルＡ、ソーヤサポゲノールＢ、ソーヤサポゲノールＣ、
ソーヤサポゲノールＤ、ソーヤサポゲノールＥ等、およ
びサポニンとしては、ソーヤサポゲノールＡをアグリコ
ンとするソーヤサポニンＡ1、ソーヤサポニンＡ2、ソー
ヤサポゲノールＡをアグリコンとし、糖鎖部分がアセチ
ル化されたアセチルソーヤサポニンＡ1、アセチルソー
ヤサポニンＡ2、アセチルソーヤサポニンＡ3、アセチル
ソーヤサポニンＡ4、アセチルソーヤサポニンＡ5、アセ
チルソーヤサポニンＡ6等、ソーヤサポゲノールＢをア
グリコンとするソーヤサポニンＩ、ソーヤサポニンII、
ソーヤサポニンIII、ソーヤサポニンＶ等があげられ
る。これらのソーヤサポニン類がＥＣＥを特異的に阻害
することは今まで知られておらず、本発明者らがその作
用を見いだし発明を完成するに至った。 【０００８】本発明のソーヤサポニン類はその置換基の
種類により必要に応じて薬理学的に許容されうる酸との
付加塩または金属等の陽イオンとの塩に変換することが
でき、これらの塩も本発明の範囲内に含まれる。酸付加
塩としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸な
どの無機酸との塩類、酢酸、コハク酸、シュウ酸、リン
ゴ酸、クエン酸、酒石酸などの有機酸との塩類が、陽イ
オンの塩としてはナトリウム、カリウム、マグネシウ
ム、カルシウムなどの金属塩、またはアンモニウム塩、
有機及び無機の四級アンモニウム塩、ピリジニウム塩、
ピペリジニウム塩などがあげられる。 【０００９】本発明のソーヤサポニンを医薬として使用
する場合には種々の投与形態の製剤とすることができ
る。すなわち、経口的投与の場合に、錠剤、硬カプセル
剤、軟カプセル剤等の固形製剤、溶液、エマルジョンま
たはサスペンジョンなどの液剤の形態で投与することが
できる。また、非経口的投与の場合に、注射溶液、貼付
剤、坐剤などの形態で投与される。これらの製剤の調製
にあたっては製剤化のための慣用の添加剤、例えば賦形
剤、安定剤、防腐剤、溶解剤、湿潤剤、乳化剤、滑沢
剤、甘味剤、着色剤、着色剤、香味剤、張度調製剤、緩
衝剤、酸化防止剤などを用いて製剤化することができ
る。 【００１０】本発明のソーヤサポニン類またはその薬理
学的に許容しうる塩の投与量は患者の年齢、体重、性
別、症状、投与形態などに応じて変化しうるが、一般に
成人一人当たり経口投与では０.５〜１０００mg／kgで
ある。ソーヤサポニン類は安全性が高く、ラット、マウ
スを用いた急性毒性試験でも投与可能な限界量まで投与
を行なっても一般症状の異常は認められないとされてい
る。以下実施例により本発明を詳細に説明するが、これ
らの実施例は本発明を説明するためのものであって本発
明を限定するものと解すべきではない。 【００１１】実施例１ ソーヤサポニンのＥＣＥ阻害活
性の測定 ヒト胎盤ＥＣＥの調製とＥＣＥ活性の測定は特開平５−
１９９８７４号記載の方法を改変して行った。すなわち
ヒト胎盤組織を０.２５Ｍスクロース、１mM フッ化フェ
ニルメチルスルフォニル（ＰＭＳＦ）、１mM Ｎ−エチ
ルマレイミド（ＮＥＭ）、０.１mM Ｅ−６４、０.０１m
MペプスタチンＡ、を含む２５mMヘペス緩衝液（pH７.
４）中で低温下ガラスホモゲナイザーでホモゲナイズ
し、１,０００×ｇで２０分間遠心し、その上清を１０
０,０００×ｇで３０分間遠心し膜画分を沈澱として得
た。膜画分に２％ルブロール液を加えＥＣＥを可溶化し
１００,０００×ｇで３０分間超遠心した上清をヒト胎
盤ＥＣＥとした。ヒト胎盤ＥＣＥ１０μｇとヒトｂＥＴ
−１（ペプチド研製）０.４４μｇを、１mM ＰＭＳＦ、
０.１mMチオルファン、０.０１mMペプスタチンＡ、０.
０１mMベスタチンを含む０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（p
H７.０）中で混合し全量１００μｌとし３７℃、３時間
インキュベートした。ＥＤＴＡを加え（終濃度２５mM）
反応停止後、生成したＥＴ−１を定量することにより酵
素活性を測定した。試験化合物存在下及び非存在下で酵
素活性を測定し、試験化合物のヒト胎盤ＥＣＥ阻害活性
を評価した。 【００１２】ラット肺ＥＣＥの調製とＥＣＥ活性の測定
は以下の方法で行なった。ラット肺を０.１mM Ｅ−６
４、０.１mM フッ化ｐ−（アミジノフェニル）メタン−
スルフォニル（ｐ−ＡＰＭＳＦ）、０.１mMキモスタチ
ン、０.１mMベスタチン、０.１mM ＮＥＭ、５mM ＭｇＣ
ｌ2を添加した２０mM トリス−塩酸緩衝液（pH７.２）
中で低温下ガラスホモゲナイザーでホモゲナイズした。
６００×ｇで１０分間遠心しその上清を１０５,０００
×ｇで３０分間超遠心し膜画分を沈澱として得た。膜画
分に０.５％ＣＨＡＰＳ液を加えＥＣＥを可溶化し１０
５,０００×ｇで３０分間超遠心した上清をラット肺Ｅ
ＣＥとした。ラット肺ＥＣＥ１０μｇとブタｂＥＴ−１
（ペプチド研製）０.１μｇを５０mMりん酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ６.５）１００μｌ中、０.１mM Ｅ−６
４、０.１mM ｐ−ＡＰＭＳＦ、０.１mM ＮＥＭ、０.０
１mMペプスタチンＡ、０.０１mMベスタチン、２μＭキ
モスタチン存在下で３７℃、３時間インキュベートし
た。１０分間煮沸後、生成したＥＴ−１量を定量するこ
とにより酵素活性を測定した（BIOCHEMISTRY INTERNATI
ONAL, ２５(４)，６９７−７０７（１９９１）参照）。 【００１３】試験化合物存在下及び非存在下で酵素活性
を測定し、試験化合物のラット肺ＥＣＥ阻害活性を評価
した。表１に示すようにソーヤサポニンはＥＣＥ活性を
阻害した。 【表１】 【００１４】実施例２ ソーヤサポニンの酵素阻害特異
性試験 ソーヤサポニンのキモトリプシン、サーモリシン、アン
ジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）に対する阻害作用を調
べた。キモトリプシン活性の測定は以下のように行っ
た。すなわちスクシニル−アラニル−アラニル−プロリ
ル−フェニルアラニル−ｐ−ニトロアニリドを０.５Ｍ
塩化ナトリウム、１０％ＤＭＳＯ、０．１％トリトンＸ
−１００を含む０.１Ｍヘペス緩衝液（pH７.５）に０.
５mMに溶解し基質液とした。基質液１００μｌに精製ウ
シキモトリプシン０.５μｇを加えて全量１２０μｌと
し、室温５分間反応した。４０５nmの吸光度をモニター
しその増加速度を酵素活性とした。サーモリシン活性の
測定は文献｛J．Biochem；９３ ４７−５３（１９８
３）｝の方法に従った。すなわち３−（２−フリルアク
リロイル）−グリシル−Ｌ−ロイシンアミドを、１０mM
塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH
７.２）に１mMに溶解し基質液とした。基質液２００μ
ｌにサーモリシン０.１ｎmoleを加え全量２５０μｌと
し室温２０分間反応した。３４０nmの吸光度をモニター
しその減少速度を酵素活性とした。 【００１５】アンジオテンシン変換酵素の測定は文献
｛Anal．Biochem；８４ ３６１−３６９（１９７８）｝
の方法に従った。すなわちヒップリル−ヒスチジル−ロ
イシンを０.６Ｍ塩化ナトリウム、０.１％トリトンＸ−
１００を含む８０mMリン酸カリウム緩衝液（pH８.３）
に３.７５mMに溶解し基質液とした。基質液４００μｌ
に精製したラット肺アンジオテンシン変換酵素を５mＵ
を加え全量５００μｌとし３７℃３０分間反応した。１
０分間煮沸後０.２Ｍリン酸カリウム緩衝液（pH８.３）
３ml、３％塩化シアヌルを含むジオキサン１.５mlを加
え強く撹拌した。１００×ｇ １０分遠心後上清の３８
２nmの吸光度を測定した。酵素を含まない反応液（盲
検）の３８２nmの吸光度との差を酵素活性とした。 【００１６】それぞれの酵素反応を試験化合物存在下及
び非存在下で行い、試験化合物の酵素阻害活性を評価し
た。表２に示すようにソーヤサポニンはこれらの酵素を
阻害せずＥＣＥに対し特異的であった。 【００１７】 【表２】 【００１８】次に本発明のＥＣＥ阻害剤を有効成分とす
る治療薬についてその製剤例を説明する。 各成分を均一に混合し、直打用粉末とする。これをロー
タリー式打錠機で直径７mm、重量１５０mgの錠剤に成形
する。 【００１９】製剤例２ 顆粒剤（１分包あたり） Ａ．ソーヤサポニンＩ １０mg 乳糖 ９０mg トウモロコシデンプン ５０mg 結晶セルロース ５０mg Ｂ．ヒドロキシプロピルセルロース １０mg エタノール ９mg Ａの成分を均一に混合した後、Ｂの溶液を加えて練合
し、押出造粒法で整粒し、ついで５０℃の乾燥機で乾燥
する。乾燥上がり顆粒を粒度２９７μｍ〜１４６０μｍ
にふるい分けたものを顆粒剤とする。１分包量を２００
mgとする。 【００２０】 塩化ナトリウムおよび有効成分を注射用蒸留水を加えて
溶解し、全量を１.０mlとする。 【００２１】 【発明の効果】本発明のソーヤサポニン類またはその薬
理的に許容しうる塩を含有してなるエンドセリン変換酵
素阻害剤はエンドセリン変換酵素のみを特異的に阻害
し、そのためエンドセリンが関与する疾患、高血圧、く
も膜下出血後の脳血管れん縮、心筋梗塞、動脈硬化、腎
不全、心不全、喘息等の治療剤として有用である。
その薬理的に許容しうる塩のエンドセリン変換酵素阻害
剤としての用途、およびこのエンドセリン変換酵素阻害
剤を有効成分とする高血圧などの各種疾患の治療薬に関
するものである。 【０００２】 【従来の技術】エンドセリン（以下ＥＴと略す）は１９
８８年、柳沢らによって発見された内皮細胞由来の血管
平滑筋収縮因子で２１アミノ酸残基からなるペプチドで
ある（Nature, ３３２，４１１−４１５（１９８８）参
照）。ＥＴは強い平滑筋収縮作用、細胞増殖作用を有
し、血管など各種臓器で生産され、生理的に重要な役割
を果していると考えられている。またＥＴはその作用か
ら高血圧、クモ膜下出血後の脳血管れん縮、心筋梗塞、
動脈硬化、腎不全、心不全、喘息等の疾患の成立に関わ
っていると考えられている。また、レイノー患者、パー
ジャー病患者、高安病患者、川崎病患者、シスプラチン
投与時の腎障害患者の血中などにおいてＥＴ濃度が正常
人に比して有為に高いことが知られている。 【０００３】ＥＴはその生合成において、活性の低い前
駆体であるビッグエンドセリン（以下ｂＥＴと略す）か
ら特異的プロテアーゼであるエンドセリン変換酵素（以
下ＥＣＥと略す）により生成される。そしてこの変換は
生体内におけるＥＴの産生に必須であり、従ってＥＣＥ
を阻害しＥＴの生合成を抑える事は上記の各種疾患の治
療及び予防に有効であると考えられ、特異的なＥＣＥ阻
害剤の解明が求められている。これまでにＥＣＥを阻害
する化合物としてはストレプトマイセス・タナシエンシ
ス等の放線菌によって生産されるホスホラミドンが知ら
れていた。しかしながらホスホラミドンは多くの金属プ
ロテアーゼを阻害しＥＣＥに特異的な阻害剤ではない。
実際ホスホラミドンはＥＣＥよりもアンジオテンシン変
換酵素、ニュートラルエンドペプチダーゼ、コラゲナー
ゼ、サーモリシンをより強く阻害し、エンドセリン変換
酵素阻害剤としての望ましい性質を有していない。そし
てＥＣＥに特異的な阻害剤の存在は知られていなかっ
た。 【０００４】 【本発明が解決しようとする課題】かかる状況から、Ｅ
ＣＥのみを特異的に阻害する物質の解明が求められると
ころであり、そしてこのＥＣＥのみを特異的に阻害する
物質の解明によって、ＥＴにより起因する、または起因
すると考えられる各種疾患、例えば高血圧、くも膜下出
血後の脳血管れん縮、心筋梗塞、動脈硬化、腎不全、心
不全、喘息等の治療薬のあらたな開発の可能性が開かれ
ることになる。すなわち本発明は、ＥＣＥのみを特異的
に阻害する物質の解明と、このＥＣＥの特異的阻害物質
に基づいた上記各種疾患の治療薬の開発とを課題とする
ものである。 【０００５】 【課題を解決するための手段】本発明者らはＥＣＥに特
異的な阻害剤を見いだすべく種々の化合物を検索した結
果ソーヤサポニンがＥＣＥを特異的に阻害することを見
いだして本発明を完成したのである。すなわち本発明に
よればソーヤサポニンが著しいＥＣＥ阻害効果を有する
ことおよびこの阻害効果はＥＣＥに対して特異的である
ことから、このソーヤサポニンがＥＣＥ阻害剤として有
用であることが分かった。したがって本発明は、ソーヤ
サポニン類またはその薬理学的に許容し得る塩からなる
エンドセリン変換酵素阻害剤に関する。 【０００６】また本発明は、ソーヤサポニン類またはそ
の薬理学的に許容し得る塩からなるエンドセリン変換酵
素阻害剤を有効成分とする高血圧、くも膜下出血後の脳
血管れん縮、心筋梗塞、動脈硬化、腎不全、心不全、喘
息、レイノー患者、パージャー病患者、高安病患者、川
崎病患者、シスプラチン投与時の腎障害患者の治療薬に
も関する。本発明でいうソーヤサポニンとは、大豆由来
の下記の基本骨格 【化１】 を持つ化合物を指すが、これらを化学的に修飾、または
改変して得られるこれらの誘導体をも含むものとする。 【０００７】さらにソーヤサポニン類としてはは同様の
基本骨格及びエンドセリン阻害活性を有していればその
由来には限定されることなく他の植物由来のものでもよ
い。また合成手段でえられるもの、微生物などによって
産生されたもの等も同様の基本骨格及びエンドセリン阻
害活性を有する限りこのソーヤサポニン類の範囲に含ま
れるものとする。ソーヤサポニン類の例としてはソーヤ
サポニンのアグリコンとして知られるソーヤサポゲノー
ルＡ、ソーヤサポゲノールＢ、ソーヤサポゲノールＣ、
ソーヤサポゲノールＤ、ソーヤサポゲノールＥ等、およ
びサポニンとしては、ソーヤサポゲノールＡをアグリコ
ンとするソーヤサポニンＡ1、ソーヤサポニンＡ2、ソー
ヤサポゲノールＡをアグリコンとし、糖鎖部分がアセチ
ル化されたアセチルソーヤサポニンＡ1、アセチルソー
ヤサポニンＡ2、アセチルソーヤサポニンＡ3、アセチル
ソーヤサポニンＡ4、アセチルソーヤサポニンＡ5、アセ
チルソーヤサポニンＡ6等、ソーヤサポゲノールＢをア
グリコンとするソーヤサポニンＩ、ソーヤサポニンII、
ソーヤサポニンIII、ソーヤサポニンＶ等があげられ
る。これらのソーヤサポニン類がＥＣＥを特異的に阻害
することは今まで知られておらず、本発明者らがその作
用を見いだし発明を完成するに至った。 【０００８】本発明のソーヤサポニン類はその置換基の
種類により必要に応じて薬理学的に許容されうる酸との
付加塩または金属等の陽イオンとの塩に変換することが
でき、これらの塩も本発明の範囲内に含まれる。酸付加
塩としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸な
どの無機酸との塩類、酢酸、コハク酸、シュウ酸、リン
ゴ酸、クエン酸、酒石酸などの有機酸との塩類が、陽イ
オンの塩としてはナトリウム、カリウム、マグネシウ
ム、カルシウムなどの金属塩、またはアンモニウム塩、
有機及び無機の四級アンモニウム塩、ピリジニウム塩、
ピペリジニウム塩などがあげられる。 【０００９】本発明のソーヤサポニンを医薬として使用
する場合には種々の投与形態の製剤とすることができ
る。すなわち、経口的投与の場合に、錠剤、硬カプセル
剤、軟カプセル剤等の固形製剤、溶液、エマルジョンま
たはサスペンジョンなどの液剤の形態で投与することが
できる。また、非経口的投与の場合に、注射溶液、貼付
剤、坐剤などの形態で投与される。これらの製剤の調製
にあたっては製剤化のための慣用の添加剤、例えば賦形
剤、安定剤、防腐剤、溶解剤、湿潤剤、乳化剤、滑沢
剤、甘味剤、着色剤、着色剤、香味剤、張度調製剤、緩
衝剤、酸化防止剤などを用いて製剤化することができ
る。 【００１０】本発明のソーヤサポニン類またはその薬理
学的に許容しうる塩の投与量は患者の年齢、体重、性
別、症状、投与形態などに応じて変化しうるが、一般に
成人一人当たり経口投与では０.５〜１０００mg／kgで
ある。ソーヤサポニン類は安全性が高く、ラット、マウ
スを用いた急性毒性試験でも投与可能な限界量まで投与
を行なっても一般症状の異常は認められないとされてい
る。以下実施例により本発明を詳細に説明するが、これ
らの実施例は本発明を説明するためのものであって本発
明を限定するものと解すべきではない。 【００１１】実施例１ ソーヤサポニンのＥＣＥ阻害活
性の測定 ヒト胎盤ＥＣＥの調製とＥＣＥ活性の測定は特開平５−
１９９８７４号記載の方法を改変して行った。すなわち
ヒト胎盤組織を０.２５Ｍスクロース、１mM フッ化フェ
ニルメチルスルフォニル（ＰＭＳＦ）、１mM Ｎ−エチ
ルマレイミド（ＮＥＭ）、０.１mM Ｅ−６４、０.０１m
MペプスタチンＡ、を含む２５mMヘペス緩衝液（pH７.
４）中で低温下ガラスホモゲナイザーでホモゲナイズ
し、１,０００×ｇで２０分間遠心し、その上清を１０
０,０００×ｇで３０分間遠心し膜画分を沈澱として得
た。膜画分に２％ルブロール液を加えＥＣＥを可溶化し
１００,０００×ｇで３０分間超遠心した上清をヒト胎
盤ＥＣＥとした。ヒト胎盤ＥＣＥ１０μｇとヒトｂＥＴ
−１（ペプチド研製）０.４４μｇを、１mM ＰＭＳＦ、
０.１mMチオルファン、０.０１mMペプスタチンＡ、０.
０１mMベスタチンを含む０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（p
H７.０）中で混合し全量１００μｌとし３７℃、３時間
インキュベートした。ＥＤＴＡを加え（終濃度２５mM）
反応停止後、生成したＥＴ−１を定量することにより酵
素活性を測定した。試験化合物存在下及び非存在下で酵
素活性を測定し、試験化合物のヒト胎盤ＥＣＥ阻害活性
を評価した。 【００１２】ラット肺ＥＣＥの調製とＥＣＥ活性の測定
は以下の方法で行なった。ラット肺を０.１mM Ｅ−６
４、０.１mM フッ化ｐ−（アミジノフェニル）メタン−
スルフォニル（ｐ−ＡＰＭＳＦ）、０.１mMキモスタチ
ン、０.１mMベスタチン、０.１mM ＮＥＭ、５mM ＭｇＣ
ｌ2を添加した２０mM トリス−塩酸緩衝液（pH７.２）
中で低温下ガラスホモゲナイザーでホモゲナイズした。
６００×ｇで１０分間遠心しその上清を１０５,０００
×ｇで３０分間超遠心し膜画分を沈澱として得た。膜画
分に０.５％ＣＨＡＰＳ液を加えＥＣＥを可溶化し１０
５,０００×ｇで３０分間超遠心した上清をラット肺Ｅ
ＣＥとした。ラット肺ＥＣＥ１０μｇとブタｂＥＴ−１
（ペプチド研製）０.１μｇを５０mMりん酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ６.５）１００μｌ中、０.１mM Ｅ−６
４、０.１mM ｐ−ＡＰＭＳＦ、０.１mM ＮＥＭ、０.０
１mMペプスタチンＡ、０.０１mMベスタチン、２μＭキ
モスタチン存在下で３７℃、３時間インキュベートし
た。１０分間煮沸後、生成したＥＴ−１量を定量するこ
とにより酵素活性を測定した（BIOCHEMISTRY INTERNATI
ONAL, ２５(４)，６９７−７０７（１９９１）参照）。 【００１３】試験化合物存在下及び非存在下で酵素活性
を測定し、試験化合物のラット肺ＥＣＥ阻害活性を評価
した。表１に示すようにソーヤサポニンはＥＣＥ活性を
阻害した。 【表１】 【００１４】実施例２ ソーヤサポニンの酵素阻害特異
性試験 ソーヤサポニンのキモトリプシン、サーモリシン、アン
ジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）に対する阻害作用を調
べた。キモトリプシン活性の測定は以下のように行っ
た。すなわちスクシニル−アラニル−アラニル−プロリ
ル−フェニルアラニル−ｐ−ニトロアニリドを０.５Ｍ
塩化ナトリウム、１０％ＤＭＳＯ、０．１％トリトンＸ
−１００を含む０.１Ｍヘペス緩衝液（pH７.５）に０.
５mMに溶解し基質液とした。基質液１００μｌに精製ウ
シキモトリプシン０.５μｇを加えて全量１２０μｌと
し、室温５分間反応した。４０５nmの吸光度をモニター
しその増加速度を酵素活性とした。サーモリシン活性の
測定は文献｛J．Biochem；９３ ４７−５３（１９８
３）｝の方法に従った。すなわち３−（２−フリルアク
リロイル）−グリシル−Ｌ−ロイシンアミドを、１０mM
塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH
７.２）に１mMに溶解し基質液とした。基質液２００μ
ｌにサーモリシン０.１ｎmoleを加え全量２５０μｌと
し室温２０分間反応した。３４０nmの吸光度をモニター
しその減少速度を酵素活性とした。 【００１５】アンジオテンシン変換酵素の測定は文献
｛Anal．Biochem；８４ ３６１−３６９（１９７８）｝
の方法に従った。すなわちヒップリル−ヒスチジル−ロ
イシンを０.６Ｍ塩化ナトリウム、０.１％トリトンＸ−
１００を含む８０mMリン酸カリウム緩衝液（pH８.３）
に３.７５mMに溶解し基質液とした。基質液４００μｌ
に精製したラット肺アンジオテンシン変換酵素を５mＵ
を加え全量５００μｌとし３７℃３０分間反応した。１
０分間煮沸後０.２Ｍリン酸カリウム緩衝液（pH８.３）
３ml、３％塩化シアヌルを含むジオキサン１.５mlを加
え強く撹拌した。１００×ｇ １０分遠心後上清の３８
２nmの吸光度を測定した。酵素を含まない反応液（盲
検）の３８２nmの吸光度との差を酵素活性とした。 【００１６】それぞれの酵素反応を試験化合物存在下及
び非存在下で行い、試験化合物の酵素阻害活性を評価し
た。表２に示すようにソーヤサポニンはこれらの酵素を
阻害せずＥＣＥに対し特異的であった。 【００１７】 【表２】 【００１８】次に本発明のＥＣＥ阻害剤を有効成分とす
る治療薬についてその製剤例を説明する。 各成分を均一に混合し、直打用粉末とする。これをロー
タリー式打錠機で直径７mm、重量１５０mgの錠剤に成形
する。 【００１９】製剤例２ 顆粒剤（１分包あたり） Ａ．ソーヤサポニンＩ １０mg 乳糖 ９０mg トウモロコシデンプン ５０mg 結晶セルロース ５０mg Ｂ．ヒドロキシプロピルセルロース １０mg エタノール ９mg Ａの成分を均一に混合した後、Ｂの溶液を加えて練合
し、押出造粒法で整粒し、ついで５０℃の乾燥機で乾燥
する。乾燥上がり顆粒を粒度２９７μｍ〜１４６０μｍ
にふるい分けたものを顆粒剤とする。１分包量を２００
mgとする。 【００２０】 塩化ナトリウムおよび有効成分を注射用蒸留水を加えて
溶解し、全量を１.０mlとする。 【００２１】 【発明の効果】本発明のソーヤサポニン類またはその薬
理的に許容しうる塩を含有してなるエンドセリン変換酵
素阻害剤はエンドセリン変換酵素のみを特異的に阻害
し、そのためエンドセリンが関与する疾患、高血圧、く
も膜下出血後の脳血管れん縮、心筋梗塞、動脈硬化、腎
不全、心不全、喘息等の治療剤として有用である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 中田 文久
埼玉県入間郡大井町鶴ヶ岡５丁目３番１
号 日清製粉株式会社医薬研究所内
(72)発明者 白根 克則
埼玉県入間郡大井町鶴ヶ岡５丁目３番１
号 日清製粉株式会社医薬研究所内
(72)発明者 北條 直美
埼玉県入間郡大井町鶴ヶ岡５丁目３番１
号 日清製粉株式会社医薬研究所内
(72)発明者 藤巻 寿美
埼玉県入間郡大井町鶴ヶ岡５丁目３番１
号 日清製粉株式会社医薬研究所内
(72)発明者 小松 宏彦
東京都中央区日本橋小網町19番12号 日
清製粉株式会社内
(56)参考文献 特開 昭62−100256（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
A61K 35/78
A61K 31/70
C07J 53/00
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】 大豆由来の下記の基本骨格 【化１】 を有する化合物またはその薬理学的に許容し得る塩から
なるエンドセリン変換酵素阻害剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33472593A JP3495397B2 (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | エンドセリン変換酵素阻害剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33472593A JP3495397B2 (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | エンドセリン変換酵素阻害剤 |
Publications (2)
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|---|---|
| JPH07188033A JPH07188033A (ja) | 1995-07-25 |
| JP3495397B2 true JP3495397B2 (ja) | 2004-02-09 |
Family
ID=18280523
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33472593A Expired - Fee Related JP3495397B2 (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | エンドセリン変換酵素阻害剤 |
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Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN104623449A (zh) * | 2015-03-05 | 2015-05-20 | 于巧媛 | 一种治疗脉络阻滞型脑动脉硬化症的中药组合物 |
-
1993
- 1993-12-28 JP JP33472593A patent/JP3495397B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
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| JPH07188033A (ja) | 1995-07-25 |
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